Bilan des congélation des tissus somatiques et production d'iPSC chez le lapin

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Submitted on 5 Jun 2020

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Bilan des congélation des tissus somatiques et production d’iPSC chez le lapin

Marielle Afanassieff

To cite this version:

Marielle Afanassieff. Bilan des congélation des tissus somatiques et production d’iPSC chez le lapin.

Réunion du WP2.2 de l’infrastructure CRB-Anim, Centres de Ressources Biologiques pour les Ani- maux Domestiques (CRB-Anim). FRA., Jun 2016, Jouy-en-Josas, France. Programme + 30 diaopos.

�hal-02795788�

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Réunion Annuelle WP2.2

Jouy-en-Josas les 23 et 24 Novembre 2016

Organisation : Véronique Duranthon

Jour 1 : Mercredi 23/11 13h-14h : Accueil – Café

14h-16h30 : Session Cellules et Tissus Somatiques Aurélie Fuet : Cellules iPS chez les oiseaux

Alexandra Depincé : Régénération par transfert nucléaire chez la truite

Marielle Afanassieff : Bilan de la congelation de tissus somatiques et production d’iPSC chez le lapin Nathalie Danièle : Tranfert nucléaire chez le lapin: recherché de cellules donneuses

Nathalie Chesnais : Reprogrammation de cellules de nageoire par des extrait sovocytaires 16h30-17h: Pause café

17h-18h30 : Session Embryons et Larves

Maud Caillaud : Cryopréservation de l’embryon équin

Florence Guillot : Cryopréservation d’embryonset de larves d’abeille

Thierry Joly : Avancées de l’utilisation de CRYO3 pour la congelation d’embryon 20h : Repas à Versailles

Jour 2 : Jeudi 24/11

8h-9h30 : Session Cellules Gonadiques

Florence Le Gac : Spermatognies souches de truite Arc-en-Ciel

Marina Govoroun : Différences sexuelles des PGCs derives en culture chez le poulet Michèle Magistrini : Conservation de la voie femelle chez les ânes

9h30h-10h : Pause Café 10h-13h : Session Semence

Isabelle Grasseau : Faisabilité de la cryoconservation de semen de caille Aurore Thélie : Protéase Spink2 = Rôle dans la fertilité des coqs?

Jean-Philippe Perrier : Analyse multi-échelle de la methylation du sperme bovin Maéva Halgrain : Les ânes dans le projet CRB-Anim

Lucie Gavin-Plagne : Utilisation de CRYO3 pour la conservation du sperme Marc Suquet : Avancées sur la conservation de sperme et de larves d’huître 13h-14h : Buffet

Annonce Prochain meeting annuel: Lyon les 3 et 4 octobre 2017

BDR INRA

Domaine de Vilvert 78352 Jouy-en-Josas Cedex

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Bilan de la congéla-on des

-ssus soma-ques et produc-on d’iPSC chez le lapin

Marielle Afanassieﬀ

Ins-tut Cellule Souche et Cerveau INSERM U1208 – INRA USC1361 - LYON Réunion WP2.2 de Novembre 2016

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Objec-fs du projet : 6 tâches

Cellules soma-ques iPSC

Tissu soma-que

Reprogramma-on

Lapin donneur

Microinjec-on dans l’embryon

Transfert embryonnaire

Lapines porteuses

1

2. Déﬁni-on des méthodes de cryopréserva-on du -ssu soma-que

5. Améliora-on des méthodes de cryopréserva-on des iPSC

1. Choix du -ssu soma-que 4. Choix de la technique

de reprogramma-on

3. Ap-tude du -ssu soma-que

cryopréservé à être reprogrammé 6. Op-misa-on de la capacité de colonisa-on embryonnaire

des iPSC

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Tâche 1: Choix du -ssu soma-que à congeler

Biopsie d’oreille ﬁbroblastes de peau

Sang circulant PBMC

2%

60%

Par)e interne (Car)lage)

è Fibroblastes Par)e externe (Peau) è Cellules épithéliales

Culture de 3 jours

è PBMC Culture de 8 jours è CD34+ cells ?

è Biopsie d’oreille (congéla-on directe, fort taux d’infec-on par les virus Sendaï)

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Tâche 2: Déﬁni-on des condi-ons de congéla-on des -ssus soma-ques

Condi-ons testées:

ü  Avec ou sans conserva)on à 4°C pendant 48h avant congéla)on ü  Tissu de la biopsie d’oreille (car)lage interne ou peau externe) ü  Taille des fragments congelés (1 cm² or 3 mm²)

ü  Milieu de congéla)on : sérum ou synthé)que (Stem alpha) ü  Pourcentage de DMSO (4% ou 10%)

Congéla-on contrôlée avec une diminu-on de la température de 1°C/min 4 animaux / condi-on et 3 animaux témoins (C+ sans congéla-on)

Analyses:

è Morphologie des cellules obtenues

è  Taux de dériva-on (obten-on et vitesse)

Biopsie

4°C/48h 1 cm²

Congéla-on Décongéla-on Passage 1 Passage 2 Congéla-on 3 mm²

1 cm² 3 mm²

Non _Temps _Temps

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Aucun eﬀet sta-s-quement signiﬁca-f:

ü  du -ssu u-lisé (peau ou car-lage) ü  de la conserva-on à 4°C

ü  de la taille des fragments ü  du pourcentage de DMSO

Technique de congéla-on privilégiée:

Congéla-on

4°C/48h ^{1 cm}²

Congéla-on Décongéla-on Dériva-on

3 mm² 1 cm²

3 mm²

Non

Sérum

Stem A 4%

10%

Qualité ? Morphologies et vitesse de dériva-on variables

Dériva-on possible quelles que soient les condi-ons sauf…

Biopsie

Tâche 2: Déﬁni-on des condi-ons de congéla-on des -ssus soma-ques

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Tâche 3: Ap-tude des cellules soma-ques à être reprogrammées

Biopsie

4°C/48h 1 cm²

Congéla-on Décongéla-on Passage 1 Passage 2 Congéla-on 3 mm²

1 cm² 3 mm²

Décongéla-on Courbe de croissance

sur 8 passages

Taux de viabilité à la décongéla-on Taux d’infec-on par

le virus Sendaï après un passage

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Tâche 3: Ap-tude des cellules soma-ques à être reprogrammées

Biopsie

4°C/48h 1 cm²

Congéla-on Décongéla-on Passage 1 Passage 2 Congéla-on 3 mm²

1 cm² 3 mm²

Décongéla-on Courbe de croissance

sur 8 passages

Taux de viabilité à la décongéla-on Taux d’infec-on par

le virus Sendaï après un passage Pentes comparables

pas d’entrée en sénescence

Très variable: entre 15 et 96%

moyenne à 67%

(eﬀet de l’animal, eﬀet des cellules)

Entre 70 et 98%:

(qualité des congéla-ons et non des cellules)

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Tâche 4 : Choix de la technique de reprogramma-on

Choix d’une technique non intégra-ve (pas de modiﬁca-ons géné-ques) ü  Virus Sendaï

ü  Vecteurs adénoviraux

ü  Plasmides polycistroniques loxés ü  Episomes

ü  Transfec-on d’ARN ü  Transduc-on protéique

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Choix d’une technique non intégra-ve (pas de modiﬁca-ons géné-ques)

ü  Virus Sendaï

ü  Vecteurs adénoviraux

ü  Plasmides polycistroniques loxés ü  Episomes

ü  Transfec-on d’ARN ü  Transduc-on protéique

ü  Non intégra-f

(dilu-on au cours des divisions) ü  Expression de l’hémagglu-nine

(adhésion des cellules)

ü  Couramment u-lisé chez l’homme

Test sur des ﬁbroblastes avec 6 milieux diﬀérents

Test sur des PBMC

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Test sur des ﬁbroblastes avec 6 milieux diﬀérents

Nombre de cellules ﬂuorescentes GFP+

Intensité de ﬂuorescence RbF-1363

65%

Repiquage 600 clones Aucune lignée

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Plasma PBMC Lymphoprep

Amplification

Infection par VS

Ensemencement sur MEF

CD34 CD36

Polynucléaires et érythrocytes

Repiquage des colonies iPSC

Amplification des iPSC

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Test sur des PBMC humaines

AF 488 (CD34 ou CD36)

AF 555 (CD71)

Amplification

CD34 CD36

(15)

AF 488 (CD34 ou CD36)

AF 555 (CD71)

Intensité de ﬂuorescence

Cellules T-

Cellules infectées hPBMC

7,5%

Amplification

CD34 CD36

(16)

AF 488 (CD34 ou CD36)

AF 555 (CD71)

Cellules T-

Cellules infectées hPBMC

7,5%

Amplification

CD34 CD36

(200 clones)

(10 lignées)

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Test sur des PBMC de lapin

AF 488 (CD34 ou CD36)

AF 555 (CD71)

Cellules de lapin

A : Cellules T- B : Marquage CD34 C : Co-marquage CD36/CD71

Cellules T-

Cellules infectées RbPBMC

0,3%

Amplification

Ensemencement sur MEF

CD34 CD36

Repiquage des colonies iPSC

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Tâche 5 : Améliora-on de la cryopréserva-on des rbiPSC

ü  Pourquoi?

è Cellules fragiles, instables et hétérogènes, cul-vées en KOSR è Forte mortalité à la décongéla-on

è Induc-on de biais avec possibilité de sélec-on de sous-clones

ü  Comment?

è  Test d’un milieu synthé-que (Stem alpha)

è  Comparaison du système de congéla-on (contrôlé et boites Nalgène) è  Diminu-on de la quan-té de DMSO (entre 2,5 et 10%)

ü  Etude de:

è Viabilité (Incorpara)on de iodure de Propidium après décongéla)on) è Croissance (Courbe de croissance sur 6 passages)

è Qualité (qPCR pour 6 gènes de pluripotence)

ü  Déﬁni-on de nouvelles condi-ons de congéla-on des rbiPSCs:

è En milieu synthé-que (Stem alpha) è Avec 4% DMSO

èEn condi-ons contrôlées

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Tâche 6 : Améliora-on de la capacité de colonisa-on embryonnaire des iPSC

Fibroblastes de peau

c-Myc Sox2 Klf4 Oct4

Klf4 Klf2

RbiPSC rEK

(20)

N2B27 +LIF + Feeders

20%KOSR 10%FBS

Rien

+ AC)vine - AC)vine + AC)vine - AC)vine + AC)vine - AC)vine

Condi-on 1 (Base 2i):A

GSK3i (CHIR) 1µM + MEKi (PD032) 1µM Condi-on 2 (Smith 3i): B

GSK3i (CHIR) 1µM + MEKi (PD032) 1µM + PKCi (GÖ6983) 2µM

Condi-on 3 (variante Jaenish 5i):C GSK3i (CHIR) 1µM + MEKi (PD032) 1µM + BRAFi (SB59) 0,5µM + SRCi (WH-4) 1µM + JNKi (SP600) 10µM

Condi-on 0 : 0 Sans inhibiteur

Condi-on 4 (Jaenish 6i):D

GSK3i (CHIR) 1µM + MEKi (PD032) 1µM + BRAFi (SB59) 0,5µM + SRCi (WH-4) 1µM + ROCKi (Y-27632) 2µM + JNKi (SP600) 10µM + FGF2

-FGF2 + FGF2 -FGF2 + FGF2 -FGF2 + FGF2 -FGF2 + FGF2 -FGF2 + FGF2 -FGF2

Test de 60 condi-ons de culture diﬀérentes sur les cellules rEK

rEK

(21)

N2B27 +LIF + Feeders

20%KOSR 10%FBS

Rien

+ Ac)vine - Ac)vine + Ac-vine

- Acivine + Ac)vine

- Ac)vine

Condi-on 1 (Base 2i):A

GSK3i (CHIR) 1µM + MEKi (PD032) 1µM Condi-on 2 (Smith 3i): B

GSK3i (CHIR) 1µM + MEKi (PD032) 1µM + PKCi (GÖ6983) 2µM

Condi-on 3 (variante Jaenish 5i):C

GSK3i (CHIR) 1µM + MEKi (PD032) 1µM + BRAFi (SB59) 0,5µM + SRCi (WH-4) 1µM + JNKi (SP600) 10µM

Condi-on 0 : 0 Sans inhibiteur

Condi-on 4 (Jaenish 6i):D

GSK3i (CHIR) 1µM + MEKi (PD032) 1µM + BRAFi (SB59) 0,5µM + SRCi (WH-4) 1µM + ROCKi (Y-27632) 2µM + JNKi (SP600) 10µM + FGF2

-FGF2 + FGF2 -FGF2 + FGF2 -FGF2 + FGF2 -FGF2 + FGF2 -FGF2 + FGF2 -FGF2

Test de 60 condi-ons de culture diﬀérentes sur les cellules rEK

rEK

è Sélec-on d’une condi-on intéressante: R5i

Feeders +LIF + KOSR + Ac-vine + FGF2 + 5i (condi-on 3)

(22)

rEK R5i

- 1 2 3 4 5 6 7 8 9

J0 J2 J4 J5

Nombre de cellules Millions

Jours de culture

EK9 R5i

R5i

Morphologie +++

Croissance --

(23)

R5i

Transcriptôme: +/-

Colonisa-on : Rien

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0

R5i R4i (-GSK3βi) R4i (-MEKi) R4i (-BRAFi) R4i (-SRCi) R4i (-JNKi)

Expression géné-que rela-ve

Types cellulaires Oct4

Nanog Cdh 1 DPPA 2 Klf4

L’inhibiteur SRCi augmente la croissance mais n’a pas d’eﬀet sur la morphologie

des cellules

- 5 10 15 20 25

J0 J4 J8 J11

Nombres cellules Millions

Jours de culture

R5i R4i (-GSK3βi) R4i (-MEKi)

Eﬀet des

Inhibiteurs +/-

è Necéssité de créer de nouveaux ou-ls rapporteurs

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Conclusions et Perspec-ves

ü  Conclusions:

è Réalisa-on des 6 tâches (Go/NoGo 2015)

è Déﬁni-on d’une méthode de congéla-on des biopsies de peau (WP3)

è Améliora-on de la méthode de congéla-on des iPSC de lapin (ar-cle à faire)

ü  Perspec-ves 2017 pour CRB-Anim:

è Rédac-on d’un ar-cle sur la congéla-on en Stem alpha

è Publica-on des cellules rEK (en révision pour Development) è Poursuite de la reprogramma-on avec les virus Sendaï

ü  Perspec-ves à plus long terme:

è Etude de la pluripotence chez l’embryon précoce (Véronique Duranthon, Labex Revive)

è Créa-on de lapin rapporteur de pluripotence (Crispr/Cas9) (HyPharm, ANR Oryctogène)

è Obten-on chez le lapin et le singe d’iPSC naïves capables de coloniser eﬃcacement un embryon receveur (Infrastructure INGESTEM)