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Analyse anatomique et moléculaire de la croissance et de la différenciation du bois chez le peuplier en réponse à
des flexions répétées de la tige
Jérôme Peyrot
To cite this version:
Jérôme Peyrot. Analyse anatomique et moléculaire de la croissance et de la différenciation du bois chez le peuplier en réponse à des flexions répétées de la tige. 2013, 15 p. + annexes. �hal-01269068�
Rapport de stage Master 1 spécialité :
Génomique, Ecophysiologie et Production Végétale
Analyse anatomique et moléculaire de la croissance et de la
différenciation du bois chez le peuplier en réponse à des flexions
répétées de la tige
Présenté par :Jérôme Peyrot le 2 septembre 2013
Responsables de stage : Éric Badel et Mélanie Decourteix
Membres du jury: Julie Boudet ; Aurélie Gousset et Jean-Louis Julien
Remerciements
Je tiens à remercier Jean-Louis Julien (Directeur de l'Unité Mixte de recherche Physique et Physiologie Intégrative de l'Arbre Fruitier et Forestier) de m'avoir accueilli dans son unité.
Je remercie également mes maîtres de stages, Eric Badel et Mélanie Decourteix, d'avoir dirigé ce travail. Leurs conseils, leur professionnalisme et leur motivation ont été très importants pour moi.
Merci à Stéphane et Brigitte pour leur convivialité et l'aide importante qu'ils m'ont apportée lors de mon passage à Crouël.
Merci à Nicole et Sylvaine pour leur gentillesse et leur aide précieuse qu'elles m'ont apportée lors de mon passage aux Cézeaux.
Je tiens aussi à dire un grand merci aux membres de l'unité du PIAF chercheurs et techniciens du site des Cézeaux et de Crouël pour leur accueil chaleureux.
Enfin je remercie Boris et sa troupe de stagiaire pour les barbecues et la bonne ambiance qu'ils ont su créer.
Résumé
Dans un contexte actuel de changement climatique, on observe une augmentation du nombre de tempêtes ainsi que de leur intensité. Comprendre comment les arbres s'adaptent et répondent à ces épisodes de vents forts pourrait permettre de sélectionner des plantes plus à même de résister à ces fortes perturbations.
Plusieurs études ont montré les réponses morphologiques des arbres (augmentation de la croissance radiale, diminution de la croissance en hauteur etc ...) ainsi que la réponse transcriptomique de certains gènes et notamment ceux en rapport avec la réponse à l'éthylène.
L'ensemble de ces réponses est regroupé sous le terme de « thigmomorphogénèse ». Afin de mieux comprendre les réponses des arbres suite à des sollicitations mécaniques mimant les effets d'un vent fort, une étude morphologique, anatomique, et moléculaire a été menée sur le bois de peuplier formé suite à des flexions : le bois de flexion.
Les premiers résultats de cette étude montrent que le bois de flexion possède des caractéristiques similaires au bois de tension observé en cas de stress gravitropique, à savoir la présence de cellules à couche G, ainsi que des vaisseaux moins nombreux et présentant un plus faible diamètre. Cette étude montre aussi une tendance à l'ovalisation des tiges dans la direction de la sollicitation mécanique ainsi qu'une augmentation de l'expression de gènes des voies de biosynthèse et de réponse à l'éthylène dans les zones subissant les plus fortes déformations.
Mots clefs : vent ; réponses morphologiques ; réponse transcriptomique ; éthylène ; thigmomorphogénèse ; bois de flexion ; cellules à couche G ; ovalisation ; croissance secondaire ; peuplier
Abstract
In the current context of the forecast of increasing storms frequency and intensity due to Global Climatic Changes, a better knowledge of how trees can adapt and respond to strong wind events could help us to select plants more adapted to mechanically challenging weathers.
In plants, many studies showed the morphological (increase of radial growth, decrease of longitudinal growth, etc…) and some the transcriptomic responses to mechanical sollicitations, especially those related to the ethylene response. All these phenomena are grouped under the term
"thigmomorphogenesis". To gain a better understanding of how trees react to a mechanical stress mimicking the effect of a strong wind, a morphological, anatomical, and transcriptomic study was conducted on poplar wood formed after stem bendings : the flexure wood.
The first results of this study show that flexure wood has similar characteristics to the tension wood formed in response to a gravitropic stimulation : G layer cells., smaller and fewer vessels. This study also shows an ovalization trend for poplar stems in the direction of the mechanical stress, and an increased expression of ethylene biosynthetic and signalling genes in the zones where strong deformations occur.
Key words: wind; morphological response; transcriptomic response; ethylene;
thigmomorphogenesis; G layer cells; ovalization; secondary growth; flexure wood; poplar.
Sommaire
Présentation de la structure d'accueil ...Page 1
I. Introduction …...Page 2 I.1.Mécanoperception chez les plantes ….....Page 2
I.1.1.Perception des sollicitations …......Page 2 I.2.La réponse de croissance …...Page 2
I.2.1.Modifications quantitatives de la croissance primaire …...Page 2
I.2.2.Modifications quantitatives de la croissance radiale …...Page 3 I.3.Modifications qualitatives de la structure anatomique du bois formé …...Page 3 sous contraintes mécaniques
I.4.Les acteurs de la réponse aux sollicitations mécaniques …...Page 4
I.4.1.L'éthylène …...Page 4
I.4.2.Les xyloglucanes endotransglycosylases/hydrolases (XET et XTH) …...Page 5 I.5.Objectifs du stage et stratégie adoptée …...Page 5
II. Matériels et Méthodes …...Page 6 II.1. Matériel végétal utilisé …...Page 6 II.2. Flexions contrôlées …...Page 6 II.3. Mesures de la croissance …...Page 7 II.4. Analyses cytologiques …...Page 7 II.5. Analyse des réponses moléculaires …...Page 8
II.5.1. Extraction d'ARNs …...Page 8
II.5.2. Synthèse d'ADNc …...Page 8
II.5.3. PCR Quantitative relative avec SybrGreen …...Page 9
III.Résultats …...Page 10 III.1.Étude de l'effet de flexions répétées sur la croissance de tiges de peuplier …...Page 10
III.1.1. Observation d'un arrêt de croissance …...Page 10
III.1.2. Mise en évidence de l'ovalisation de la tige suite à des flexions répétées …...Page 10
III.1.3.Étude de l'activité du cambium dans les différentes parties de la tige …...Page 11
III.2. Étude de l'effet de flexions répétées sur la différenciation cellulaire au sein …...Page 11 du bois d'une tige de peuplier
III.2.1.Étude de l'effet de flexions répétées sur la paroi cellulaire …...Page 11
III.2.2.Étude de l’effet des flexions répétées sur le nombre et les diamètres des vaisseaux ….Page 12 III.3. Réponses moléculaires dans la zone de croissance secondaire de tiges …...Page 13 de peuplier après une série de flexions
III.3.1 Étude de l'expression du gène ACO4 dans la zone de croissance …...Page 13
secondaire de tiges de peuplier après une série de flexions
III.3.2 Étude de l'expression du gène ERF1 dans la zone de croissance …...Page 13
secondaire de tiges de peuplier après une série de flexions
Conclusion et perspectives …...Page 14
Réflexion personnelle …...Page 15
Présentation de la structure d'accueil
L'unité mixte de recherche Physique et Physiologie Intégratives de l'Arbre Fruitier et Forestier (PIAF) associe l'université Blaise Pascal à l'Institut National de la Recherche Agronomique (INRA). Les recherches du PIAF, axées autour de la réponse des arbres à leur environnement, s'insèrent dans le département Environnement et Agronomie et le département Écologie des Forêts, Prairies et milieux Aquatiques de l'INRA. Le PIAF est composé de 53 agents permanents et accueille environ 20 étudiants par an (master, doctorants, post-doctorants) répartis dans trois équipes de recherche : (1) Hydraulique et résistance à la sécheresse des arbres (HYDRO), (2) Micro-Environnement et Arbre (MEA) et (3) Contraintes Mécaniques et Activité des zones en croissance (MECA). L'équipe MECA, au sein de laquelle j'ai effectué mon stage, réunit des biomécaniciens, des écophysiologistes et des physiologistes moléculaires, dans le cadre d’une approche pluridisciplinaire.
Les modèles de prédiction climatique prévoient une augmentation de la fréquence et de la violence des tempêtes avec toutefois une intensité des vents courants plus faible. Dans ce contexte de changement climatique, l’une des thématiques de l'équipe MECA est l'acclimatation des arbres à un environnement climatique particulièrement changeant. Elle s'attache notamment à comprendre comment un arbre peut conserver un port érigé sur le long terme alors qu’il est soumis à des événements de vents forts, brusques et peu fréquents. Ces études sont réalisées à différentes échelles allant de la cellule à la plante entière. Pour ces recherches, l'équipe MECA utilise principalement le peuplier qui montre une croissance rapide et pour lequel de nombreux outils de biologie moléculaire sont disponibles. C'est par ailleurs, le premier arbre dont le génome a été complètement séquencé (Tuskan et al., 2006).
Figure 1 : Effet du vent sur la croissa nce longitu dinale de Medica go sativa.
Le mouve ment lié au vent des plants de luzerne au centre a été limité pas l’apposition d’un grillage. Une augmentation de près de 50 % de la croissance a été observée (Moulia et Combes, 2004).
Figure 2 : Effet de touche rs répété s sur la croissa nce longit udinal e des hampe s florale s d'Arabidopsis thaliana. Les plantes touchées deux fois par jour pendant plusieurs jours (à droite) présentent des hampes florales dont la croissance longitudinale a été diminuée par rapport aux plantes non sollicitées (à gauche) (Braam, 2005).
I. Introduction
I.1.Mécanoperception chez les plantes
Les arbres sont en permanence soumis à des sollicitations mécaniques auxquelles ils doivent répondre afin de conserver leur port érigé et survivre. Il existe deux types de sollicitations mécaniques : les sollicitations internes dues à la croissance et au développement de l'arbre, et les sollicitation externes telles que le vent et la gravité. Ce sont ces dernières qui nous intéressent et en particulier l'effet du vent.
I.1.1.Perception des sollicitations
Lorsqu'un arbre est soumis à des vents forts, il subit de nombreuses flexions sur différentes parties (feuillage, tige, apex). Les flexions génèrent des contraintes de tension et de compression qui induisent des déformations des tissus. Il a été montré à l’échelle de la tige que des réponses moléculaires étaient proportionnelles à l’intensité de la déformation (Coutand et al., 2009).
La variable mécanique perçue est donc la déformation et non les forces de tension et de compression exercées sur la tige (Coutand et al., 2009).
I.2.La réponse de croissance
La réponse des arbres aux sollicitations mécaniques externes se manifeste par des modifications de leur croissance. Ce phénomène est appelé thigmomorphogénèse (Jaffe, 1973), et se traduit par une diminution de la croissance en hauteur, une augmentation de la croissance radiale et une augmentation de la biomasse racinaire.
I.2.1.Modifications quantitatives de la croissance primaire
Il a été observé que des plantes soumises à des vents de faible vitesse (<30 km/h) présentent une réduction forte de leur croissance en hauteur (figure 1, Moulia et Combes, 2004). D'autres expériences réalisées en laboratoire se sont attachées à reproduire de manière contrôlée les déformations dues au vent pour en étudier les effets sur la croissance primaire des plantes. Ainsi, chez les arbres, il a été démontré que des flexions sur de jeunes tiges de merisier induisaient une augmentation de la croissance racinaire ainsi qu'une augmentation du diamètre de la tige (Coutand et al., 2008). Il a été également démontré que la réalisation d’une flexion bidirectionnelle journalière de la tige de jeunes noyers (Juglans regia) pendant une semaine entraîne une diminution de leur croissance longitudinale (Leblanc-Fournier et al., 2008). L’effet des sollicitations mécaniques peut être très marqué chez certaines plantes telles qu’Arabidopsis thaliana. En effet,
des plants d’Arabidopsis thaliana touchés deux ou trois fois par jour pendant plusieurs jours
Figure 3 : Effet de flexions répétées sur la croissance radiale d'un jeune noyer. Les noyers âgés de 3 semaines ont été soumis à une flexion bidirectionnelle par jour pendant une semaine. Une augmentation localisée du diamètre des plantes est visible à la base de la zone sollicitée (flèche rouge) (Crouzet, 2002 ; Leblanc-Founier et al., 2008).
Figure 4: Photographie de microscopie électronique de fibres de bois de peuplier. (A) Zone de bois opposé. (B) Zone de bois de tension dont les cellules comportent une couche G (Pilate et al., 2004).
présentent des hampes florales beaucoup plus petites que des plants non traités (figure 2, Braam, 2005).
I.2.2.Modifications quantitatives de la croissance radiale
Même si l'intensité de la réponse varie selon les expérimentations, une autre conséquence des sollicitations mécaniques externes est une modification de la croissance radiale des tiges des plantes. Chez les espèces ligneuses, la plupart des travaux montrent une augmentation de la croissance radiale des tiges (Telewski et Pruyn, 1998 ; Pruyn et al., 2000 ; Coutand et al., 2009 ; Leblanc-Fournier et al., 2008). L’application d’un traitement journalier de 20 flexions pendant deux mois sur deux hybrides de jeunes peupliers se traduit par une augmentation significative de leur diamètre par rapport aux témoins non sollicités (Pruyn et al., 2000). De jeunes noyers fléchis une fois par jour pendant une semaine présentent un diamètre trois fois plus grand, au niveau de la zone sollicitée, que celui des individus non traités (Leblanc-Fournier et al., 2008 ; figure 3, Crouzet, 2002). Enfin, de récents travaux, menés au laboratoire PIAF, semblent montrer que, lors de flexions unidirectionnelles répétées, la croissance radiale est stimulée dans la direction des sollicitations maximales de la tige.
I.3.Modifications qualitatives de la structure anatomique du bois formé sous contraintes mécaniques
Le bois est en partie formé de fibres qui sont des cellules mortes à paroi lignifiée. Ce sont ces parois formées de plusieurs couches que nous avons observées. Chaque paroi est formée d'une paroi primaire constituée en grande partie de cellulose et d'une paroi secondaire qui est lignifiée dans les cellules du bois. Une autre strate peut être ajoutée par la cellule en position « s3 » pour répondre à des stress particuliers, la couche G (figure 4, Pilate et al., 2004).
Chez les arbres, et en particulier chez le peuplier, de nombreuses études ont montré l'apparition d'une couche composée essentiellement de cellulose dans les parois des cellules du bois en cas de stress gravitropique. Cette couche gélatineuse, appelée couche G, a un angle de microfibrilles de cellulose très fermé, ce qui signifie qu’elles s'alignent dans l'axe longitudinal.
Cette couche, particulièrement riche en cellulose, semble avoir pour fonction mécanique de permettre le redressement de l'arbre. Dans le cas du gravitropisme, chez les angiospermes, cette couche G apparaît dans le bois situé sur la face supérieure de la tige inclinée (figure 4, Pilate et al., 2004).
Contrairement au bois de tension, la formation de couche G et autres modifications anatomiques sont très mal connues dans le cas du bois de flexion produit sous sollicitations temporaires.
Figure 5: L'éthylène stimule la croissance radiale des tiges. Le bois formé après traitement à
l'éthylène (flèche) semble posséder moins de vaisseaux (Love et al., 2009). (P) désigne le phloème et (X) le xylème.
Figure 6 : Coupes transversal es de tige de peuplier soumises à un stress gravitropiq ue. (B) coupe d'un arbre témoin : on remarque la présence de bois de tension (TW) et
une excentricité de la moelle. (C) coupe d'un arbre traité avec un inhibiteur de la réponse à
l'éthylène (1-MCP) : on n'observe pas d'excentricité de la moelle mais il y a toujours la présence de bois de tension (TW) (Love et al., 2009)
TW= bois de tension et OW= bois opposé au bois de tension.
I.4.Les acteurs de la réponse aux sollicitations mécaniques
Telewski a proposé une synthèse de l’action chronologique des acteurs majeurs de la réponse des plantes aux stress mécaniques (Telewski, 2006). Dans un premier temps, ce sont les ions Ca2+ et les Espèces Oxygénées Réactives qui interviennent. Au bout de 30 min, l’expression de plusieurs gènes est modifiée. Parmi ceux-ci, on peut citer un gène codant le facteur de transcription PtaZFP2 chez le peuplier, les gènes TOUCHs dont certains codent des calmodulines (TCH2 et TCH3) et d’autres des xyloglucan endotransglucosylases/hydrolases, ou encore un gène codant une ACC synthase, enzyme de la voie de biosynthèse de l’éthylène (Botella et al., 1995) Par la suite on observe une reprise de la croissance longitudinale de la tige. Entre 1 à 9 h après la sollicitation, il y a une augmentation du taux d’éthylène dans les cellules végétales. Pour l’heure, la réponse moléculaire des plantes aux sollicitations mécaniques est encore mal caractérisée. Il existe peu d’études globales sur la réponse des plantes aux sollicitations mécaniques. Chez les herbacées, une étude transcriptomique a été menée chez la plante modèle Arabidopsis, pour des sollicitations mécaniques de type « toucher » (Lee et al., 2005). Chez les arbres, l’équipe MECA a récemment mis en place une étude transcriptomique de la cinétique de réponse de jeunes tiges de peuplier à des flexions mimant l’effet du vent (données non publiées).
Dans le cadre de l’étude de la différenciation du bois en réponse à un stimulus gravitropique, on observe aussi une quantité élevée de xyloglucan endotransglucosylases/hydrolases (XET/XTH/XTR), enzymes responsables de modifications pariétales dans les fibres G du bois de tension (Nishikubo et al., 2007).
L'éthylène et les XETs semblent donc jouer un rôle important dans les réponses biologiques face aux stress mécaniques.
I.4.1.L'éthylène
L’éthylène, hormone gazeuse impliquée dans les manifestations physiologiques des plantes en situation de stress, intervient également dans la réponse à des sollicitations mécaniques. Des travaux menés chez le haricot commun (Phaseolus vulgaris) ont montré que l’ajout exogène d’ethrel®, une molécule métabolisée en éthylène par les plantes, induisait des changements morphologiques identiques à ceux obtenus en réponse à une sollicitation mécanique (Erner et Jaffe, 1983). La voie de biosynthèse de l’éthylène fait intervenir deux enzymes clés : l’ACC synthase et l’ACC oxydase qui transforment respectivement le précurseur S-adénosylméthionine en acide 1- aminocyclopropane-1-carboxylique (ACC), puis l’ACC en éthylène. Suite à la flexion de feuilles de Vigna radiata, Botella et al. (1995) ont observé une accumulation rapide (10 min) des ARNm de l’ACC synthase. Chez la tomate, le vent et le toucher déclenchent l’accumulation rapide et
transitoire
Figure 7 : Visualisation in-situ en microscopie à fluorescence de l'activité des XET dans les fibre G en développement par l'incorporation de XXXG-SR (substrat artificiel des XET). (A) Image en fluorescence. (B) Image en lumière blanche. (C) Image en fluorescence du contrôle négatif avec un tissu bouilli. Dans l'image des jeunes fibres (f) G en développement (côté droit), la paroi cellulaire montre une incorporation de XXXG-SR et donc une activité des XET (pointe de flèche). Plus tard dans le développement seule la couche G fluoresce (flèche). Les parois des cellules des rayons (r) et les vaisseaux (v) ne montrent aucune activité. Le cambium se trouve vers la droite (en dehors du champ).
Figu re 8 : Sché mas mont rant les diffé rente s zone s de défor mati ons et zone
s de contraintes au sein d'une tige suite à une flexion unidirectionnelle.
de gènes codant différentes isoformes d’ACC synthase (Tatsuki et Mori, 1999). L’expression des gènes codant l’ACC oxydase est aussi régulée par des sollicitations mécaniques. Chez le noyer, une accumulation de transcrits d’ACC oxydase est observée dès 30 minutes après la flexion d’une tige (Crouzet, 2002). Plus récemment, des études ont montré le rôle de l'éthylène dans l'augmentation de la croissance radiale en réponse à un stimulus gravitropique (figure 5, Love et al., 2009). Cette même étude a également montré l'implication de l'éthylène dans la mise en place du bois de tension observé lors d'un stress gravitropique (figure 6, Love et al., 2009).
I.4.2.Les xyloglucanes endotransglycosylases/hydrolases (XET et XTH) Des travaux ont montré que les xyloglucanes sont des composants importants de la couche G qui apparaît dans le bois de tension qui se forme sur la face supérieure des axes inclinés (stress gravitropique) chez les ligneux (Nishikubo et al., 2007). Ce bois se caractérise en effet par la formation de fibres particulières, plus longues, appelées fibres G, présentant sur leur face interne une couche très épaisse d’aspect gélatineux pouvant remplir tout le lumen de la fibre (couche G).
Une étude suggère que les xyloglucanes joueraient un rôle de cohésion entre la couche G et la couche sous-jacente S2 (figure 4) (Mellerowicz et al., 2008). Dans cette zone de contact entre les couches G et S2, on peut observer un important dépôt de xyloglucanes, associé à une forte activité des XETs, qui participerait au renforcement des connections entre ces deux couches (figure 7, Nishikubo et al., 2007). Pour l’instant, aucune étude n’a montré la formation d’un tel bois suite à des flexions transitoires (cas des sollicitations dues au vent). On peut donc se poser la question de son existence dans le cas de telles sollicitations.
I.5.Objectifs du stage et stratégie adoptée
Le premier objectif de ce stage était de réaliser des investigations exploratoires sur l’impact de sollicitations mécaniques contrôlées et répétées sur le fonctionnement quantitatif et qualitatif du cambium, siège de la production du bois.
Pour mener à bien le premier objectif, un suivi de la croissance secondaire a été réalisé sur de jeunes peupliers dont les tiges ont été soumises à des flexions répétées pendant 2 mois.
Pour l’étude du volet qualitatif nous avons cherché à savoir ce qui différenciait, du point de vue anatomique, un bois formé sous contrainte d’un bois formé librement. Pour cela des coupes cytologiques des tiges ont été réalisées afin de mesurer certains caractères comme la taille, le nombre de vaisseaux, l’épaisseur de paroi ou la présence de couche G.
Enfin, par une approche de type « gène candidat », nous avons cherché à mettre en relation, à un niveau spatial très localisé, ces réponses de fonctionnement cambial avec l’expression de gènes connus pour être impliqués dans la croissance. Notre choix s'est porté sur des gènes impliqués dans
Figure 9 : Photographie d'une flexion d'une tige de peuplier réalisée à l'aide d'un gabarit (photo INRA).
Figure 10 : Photographie de la section fraîchement coupée d'une tige de peuplier. Ce type de photographie a été utilisé pour calculer une éventuelle excentricité de la moelle.
la réponse de croissance via l'éthylène (Erner et Jaffe, 1983) (Love et al., 2009), ici ACO4 (impliqué dans la voie de biosynthèse de l'éthylène) et ERF1 (Ethylene Response Factor 1), un facteur de transcription dont l’expression est augmentée par l'éthylène. Pour cela, nous avons mesuré l'expression relative de ces gènes (en condition stressé et non stressé) par q-PCR.
Les déformations dans la tige fléchie n’étant pas homogènes, ces investigations ont été menées à une échelle locale afin de garantir sur nos échantillons, une homogénéité de la déformation subie par le tissu considéré.
II. Matériels et Méthodes
II.1. Matériel végétal utilisé
Douze peupliers hybrides (Populus tremula x alba), clone 717-1B4) (Figure 9), issus de microbouturage, ont été cultivés en serre (INRA-Clermont Ferrand-site de Crouël) à partir du mois de mars sans éclairage artificiel et avec une ventilation activée à partir de 21°C. Deux lots de six plants chacun ont été disposés sur une tablette (Figure 9) : un lot d'arbres « sollicités » et un lot de plants « témoins ».
II.2. Flexions contrôlées
La stimulation mécanique a débuté quand les arbres avaient atteint une hauteur d'environ 45 cm. Un tracé au marqueur a été fait sur la génératrice des plants pour indiquer la zone en compression maximale. Chaque semaine, trois jours de suite, trois flexions successives ont été réalisées manuellement à l'aide de gabarits (Figure 9). Afin d'éviter tout contact dans la zone de flexion, des gabarits possédant une fenêtre de 80 mm en leur milieu ont été utilisés. Ils possèdent de plus un rayon de courbure régulier, ce qui permet de contrôler le niveau de déformation appliqué à la tige. La flexion d'une tige induit dans sa section un champ de déformations longitudinales dont le maximum (εmax ) est situé en périphérie de la tige et peut être calculé géométriquement au moyen de la formule suivante : εmax = R/(ρ+R)
où R= rayon de la tige et ρ= rayon du gabarit utilisé.
Pour l'expérience cette déformation maximum a été limitée à 1 à 1,5% dans le but de ne pas causer de blessure aux arbres.
Figure 11 : Schéma d'une coupe transversale de tige de peuplier montrant les trois zones d'intérêt pour l’étude anatomique.
II.3. Mesures de la croissance
La hauteur des arbres a été mesurée chaque semaine à l'aide d'un mètre. Les diamètres ont été mesurés de manière hebdomadaire et automatisée à l'aide d'un robot équipé d'un laser. Ce dispositif, tournant autour de la tige, a ainsi permis une mesure sans contact de diamètres selon différentes directions, en particulier la direction de sollicitation mécanique et sa perpendiculaire.
Ces mesures vont entre autre permettre de calculer l'ovalisation de la tige (rapport du diamètre qui va dans la même direction que la flexion sur le diamètre perpendiculaire à la direction de la sollicitation mécanique).
Après 10 semaines de sollicitations mécaniques, les arbres ont été coupés. Différents tronçons de la tige ont été rapidement prélevés dans la partie centrale de flexion contrôlée à des fins d'analyses anatomiques ou moléculaires.
II.4. Analyses cytologiques
Sur chaque tige un tronçon de 20 mm a été prélevé dans la zone sollicitée sans contact. Un état de surface par microtome a été réalisé et une photographie de la section possédant encore son écorce a été enregistrée (Figure 10) en présence d’une échelle graduée. Un second tronçon de 20 mm a été prélevé à des fins d'analyses anatomiques.
Plusieurs étapes ont été nécessaires pour réaliser les coupes. Les échantillons ont rapidement été imprégnés sous vide au PEG (Polyéthylène glycol) en passant par trois bains successifs de trois heures minimum. Des coupes cytologiques de 18µm d'épaisseur ont ensuite été réalisées à l'aide d'un microtome à rotation (Leica RM2165). Enfin, un protocole de double coloration Safranine / Bleu Astra a été appliqué afin d'identifier respectivement la lignine (colorée en rose) et la cellulose (colorée en bleu). Les coupes ont été imagées sous microscope optique (Leica Laborlux K).
Une série de photographies de chaque zone de bois (zone sollicitée en tension, en compression et la ligne neutre) (figure 11) a été réalisée. Ces photographies ont ensuite été assemblées à l'aide du logiciel paint.NET de manière à former un panorama et à obtenir une seule image par zone.
Une série de photographies complémentaires a été prise avec un grossissement x40 dans le but de mesurer les épaisseurs de parois cellulaires.
Après calibration spatiale, le nombre de vaisseaux, leur surface, l'épaisseur des parois cellulaires et de la couche G ont été mesurés dans chaque zone d'intérêt par analyse d'image à l'aide du logiciel ImageJ et de macros spécifiquement développées au laboratoire.
Figure 12: Schéma d'une coupe transversale de tige de peuplier montrant les trois zones d'intérêt pour l'analyse moléculaire. Ici seules les parties proches du cambium (et donc théoriquement en croissance) ont été utilisées car elles correspondent à des niveaux de déformations maximales.
II.5. Analyse des réponses moléculaires
Tous les arbres stressés, six au total, ont été fléchis le jour du premier prélèvement. Deux tronçons de 20 mm ont été prélevés sur six arbres (3 fléchis + 3 témoins), 2h après flexion. Le second prélèvement a eu lieu 72h après flexion. Ces temps ont été définis sur la base des résultats d’une étude transcriptomique de la cinétique de réponse de jeunes tiges de peuplier à des flexions mimant l’effet du vent (communication personnelle Nathalie Leblanc-Fournier, données non publiées).
L'écorce des côtés sollicités respectivement en tension et en compression ainsi que celle de la partie subissant les déformations les plus faibles (ligne neutre) a été immédiatement prélevée et stockée dans l'azote liquide. Le reste du tronçon a ensuite été complètement débarrassé de son écorce et stocké dans l'azote liquide.
Les échantillons ont ensuite été conservés a -80°C. Dans un deuxième temps les tronçons ont été redécoupés afin de conserver séparément les différentes zone de bois d’intérêt (figure 12 : zone en tension, en compression, et ligne neutre)
II.5.1. Extraction d'ARNs
Après broyage dans l'azote liquide, les analyses d'expression génique ont été effectuées à partir d'une extraction d'ARN selon la méthode CTAB utilisant le LiCl (Chang et al., 1993) pour précipiter spécifiquement les ARNs. Ces derniers sont ensuite dosés au NanoDrop. La qualité des ARNs a été vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose à 2%, à raison de 0,5µg d'ARN par échantillon déposé.
II.5.2. Synthèse d'ADNc
La synthèse d'ADNc a été réalisée à partir du kit Superscript III Reverse transcriptase (Invitrogen). 1mg d'ARNs totaux sont incubés en présence d'oligodéoxythymines (50µM) et de désoxyribonucléotides (10mM). Après dénaturation des ARNs pendant 5 minutes à 65°C, la synthèse d'ADNc est réalisée en incubant les ARNs en présence de 50U de reverse transcriptase pendant 1 heure à 50°C, la réaction est stoppée par une étape à 85°C durant 5 minutes. Les fragments d'ARNs totaux sont éliminés par l'ajout de 2U de RNase et incubés à 37°C pendant 20 minutes. La qualité des ADNc est contrôlée par électrophorèse sur gel d'agarose à 1%.
Nom du gène étudié Sens de l'amorce
SND1 Sens
Antisens
CGA CAT GAC CTC ATC CTC AAT G ACT CGC ATT TGG GTC AGT AC ERF34 (ou PtaERF72) Sens
Antisens
TGT GAC TCT GTG GAC CCA AT CAC AAC TAT GTT CGG CAA CC
ACO1 Sens
Antisens
CTT CCT AAA GAG CCA AGG TTC G GCA AAC ACA TGG ATA GAC CCG
Tableau 1 : Amorces dessinées lors du stage.
II.5.3. PCR Quantitative relative avec SybrGreen
Pour chaque gène étudié 2 µL des ADNc dilués au 40ème ont été ajoutés à un Master mix 2X (Eurogentec) (dNTPs, polymérases et fluorochrome) et au couple d'amorces sens/antisens 10µM. Le volume final de la réaction est de 25 µL.
L'amplification a été réalisée grâce au thermocycleur Biorad-iQ5. Les gènes ciblés ici ont été ACO1, ACO4, ERF34, ERF1, SND1 et le gène de référence était EF1α. Les amorces ciblant les gènes SND1, ACO1 et ERF34 ont été dessinées lors de ce stage (Tableau 1) mais n'ont pas pu être utilisées car elles possédaient une efficacité trop faible. Les amorces ciblant ACO4, ERF1 et EF1α ont été dessinées en amont au laboratoire (par Ludovic Martin).
Figure 14 : Courbe de croissance en hauteur des 12 arbres de l'expérience (en bleu la courbe des arbres stressés, et en rose celle des témoins).
Figure 15 : Courbe représentant l'ovalisation moyenne des tiges d'arbres stressés (en bleu) et l'ovalisation des tiges d'arbres témoins (en rose). Une ovalisation relative de 0 % équivaut à une tige parfaitement ronde.
Figure 16 : Courbes représentant le diamètre moyen correspondant à la direction de flexion de la tige (graphique de gauche) et le diamètre moyen dans la direction perpendiculaire à la direction de flexion (Graphique de droite).
07/03/13 27/03/13 16/04/13 06/05/13 26/05/13 15/06/13 05/07/13
0 2 4 6 8 10 12
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6
2
1 0 0 0 0
Date
Croissance en %
III.Résultats
III.1.Étude de l'effet de flexions répétées sur la croissance de tiges de peuplier III.1.1. Observation d'un arrêt de croissance
Malgré la culture des arbres en serre et non à l'extérieur, un inattendu arrêt de croissance est survenu sur l’ensemble des arbres, aussi bien les fléchis que les témoins. A partir du 8 avril, soit trois semaines après le début des flexions, les arbres ont cessé de croître en hauteur (croissance primaire). Dans le même temps, la croissance secondaire (en diamètre) a été très fortement réduite (Figure 14). Pour le moment les facteurs responsables de cet arrêt de croissance restent indéterminés.
III.1.2. Mise en évidence de l'ovalisation de la tige suite à des flexions répétées
Des expériences réalisées au sein du laboratoire ont indiqué que lors d'une flexion contrôlée unidirectionnelle, on observe une croissance différentielle de la tige donnant à terme une ovalisation de cette tige avec une plus forte croissance des zones subissant les déformations maximales. Dans notre étude, nous avons mesuré l'ovalisation des tiges des arbres sollicités et des arbres témoins en mesurant le diamètre perpendiculaire à la ligne neutre et le diamètre au niveau de la ligne neutre (zone où les déformations sont minimales) grâce à un capteur LASER.
La figure 15 montre le taux d'ovalisation (rapport du diamètre passant dans les zones comprimées et tendues sur le diamètre de la ligne neutre) des arbres ayant subi des flexions (en bleu) et le taux d'ovalisation des arbres témoins (en rose). Le taux d'ovalisation des tiges des arbres fléchis augmente au cours du temps tandis que celui des tiges témoins semble rester aux environs de 1% (soit une tige ronde).
L'ovalisation devient significative chez les arbres fléchis par rapport aux témoins après un mois de traitement (test t avec α=5%). Cette ovalisation est due à une croissance secondaire plus importante dans la direction de flexion de la tige (diamètre N/S). Par contre, on n'observe pas de différence significative entre les arbres témoins et les plants fléchis dans la direction perpendiculaire à la direction de flexion (diamètre E/O) (Figure 16).
Figure 17: Schéma de la disposition des différentes zones de bois du côté en tension. La zone B est la seule zone possédant des cellules à couche G.
Figure 18 : Photogr aphie de la zone B d'un arbre stressé.
Une couche G s'est formée dans les fibres de ce bois.
Figure 19 : Photographie de la partie en tension d'un arbre stressé (avec le cambium à gauche). La zone B est la seule à présenter des fibres G.
III.1.3.Étude de l'activité du cambium dans les différentes parties de la tige
Précédemment, nous avons observé que l'ovalisation des tiges des arbres stressés était due à une augmentation de la croissance secondaire dans la direction de la flexion. Néanmoins les mesures d'ovalisation sont obtenues en mesurant le diamètre d'un bord à l'autre. Pour étudier une potentielle différence d'activité cambiale dans les zones subissant des déformations similaires mais des contraintes différentes, nous avons mesuré l'excentricité de la moelle. Cette nouvelle série de mesures a pour but de tester l'hypothèse selon laquelle l'augmentation de croissance pourrait être plus importante du côté en tension que du côté en compression.
Les mesures effectuées montrent qu'il n’y a pas d’excentricité de la moelle sur les arbres après 10 semaines de sollicitations mécaniques (test T avec α=5%). Cela nous montre donc qu’il n'y a pas de différence significative d'activité cambiale entre le côté en tension et le côté en compression.
III.2. Étude de l'effet de flexions répétées sur la différenciation cellulaire au sein du bois d'une tige de peuplier
III.2.1.Étude de l'effet de flexions répétées sur la paroi cellulaire
Des études préliminaires menées au sein de l’équipe MECA ont montré la mise en place d’un bois particulier au sein des tiges de peupliers fléchis. Le but de cette étude cytologique était donc de confirmer ces résultats et d’affiner la caractérisation de ce bois. Ceci passe notamment par une analyse prenant en compte les différentes zones de niveau de déformations.
Chez les arbres fléchis trois zones ont été définies dans la partie en tension du bois (figure 17). La zone A qui correspond au bois formé en période d'arrêt de croissance. La zone B qui est constituée du bois formé durant les flexions (avant l'arrêt de croissance). Et enfin la zone C (la plus ancienne) dont le bois à été formé avant le début des flexions. L'analyse de la zone B du côté sollicité en tension montre la formation importante de couche G au sein des fibres (Figure 18). Du côté opposé, partie sollicitée en compression, aucune trace de couche G n'a pu être observée dans la zone ayant été formée pendant la même période. De même, pendant cette même période de croissance secondaire, le bois des arbres témoins ne montre pas de formation de couche G, quelque soit la direction étudiée.
La formation de cellules à couche G ne semble que transitoire (Figure 19). En effet, l'étendue radiale de la zone comportant des cellules à couche G est limitée. Cet arrêt soudain de production de couche G concorde avec la date d'inflexion des courbes de croissance des arbres.
Contrairement à la zone sollicitée en compression, un faible nombre de cellules à couche G ont été observées sur tous les arbres dans le bois formé avant le début des flexions. Ces zones de cellules à couche G proches de la moelle sont très transitoires et sont apparues quand la tige était très fine, et donc soumise à des contraintes mécaniques telles que le poids des feuilles. La couche G présente dans ces zones n'est donc pas due à des flexions et est significativement plus fine que la couche G observée dans les zones en tension.
III.2.2.Étude de l’effet des flexions répétées sur le nombre et les diamètres des vaisseaux
Dans la zone B des arbres fléchis, correspondant au début de la période de stimulation mécanique, la densité moyenne de vaisseaux (1,4.10-4.µm-²) et le diamètre moyen des vaisseaux (2,1.10-4.µm-2) sont significativement plus faibles que dans la zone C formée juste avant le début des flexions. Ces deux résultats conduisent à une surface cumulée moyenne de vaisseaux par µm2 significativement inférieure pour le bois formé sous stress mécanique (0,10µm² de vaisseaux pour 1µm² de bois) par rapport au bois formé avant flexion (0,22µm² de vaisseaux par µm² de bois).
Figure 20 : Niveau d'expression relative du gène ACO4 dans la partie en croissance secondaire de tiges de peupliers deux heures après une série de trois flexions unidirectionnelles. Le QR est l'expression relative du gène considéré.
Figure 21 : Niveau d'expression relative du gène ERF1 dans la partie en croissance secondaire de tiges de peupliers deux heures après une série de trois flexions unidirectionnelles. Le QR est l'expression relative du gène considéré.
III.3. Réponses moléculaires dans la zone de croissance secondaire de tiges de peuplier après une série de flexions
Il a été démontré que l’éthylène est un inducteur de la croissance secondaire (Love et al., 2009). Dans le but d'établir une possible relation entre l'ovalisation des tiges et l'éthylène, l'expression de deux gènes, ACO4 impliqué dans la voie de biosynthèse de l'éthylène et ERF1 impliqué dans la réponse précoce à l'éthylène, a été mesuré.
III.3.1 Étude de l'expression du gène ACO4 dans la zone de croissance secondaire de tiges de peuplier après une série de flexions
Les mesures d'expression relative d'ACO4 réalisées au sein de tiges de peupliers fléchis ont montré que les niveaux d'expression relatifs de ce gène étaient différents selon la déformation appliquée dans la zone de prélèvement. La figure 20 nous montre qu'au bout de deux heures l'expression d’ACO4 est augmentée dans la zone en compression et dans la zone en tension par rapport à la ligne neutre. Le niveau d'expression d'ACO4 dans la zone comprimée semble relativement proche du niveau d'expression observé dans la zone tendue.
III.3.2 Étude de l'expression du gène ERF1 dans la zone de croissance secondaire de tiges de peuplier après une série de flexions
Les niveaux d'expression relative d’ERF1 étaient différents selon la déformation appliquée dans la zone de prélèvement. La figure 21 nous montre qu'au bout de deux heures l'expression d'ERF1 est augmentée dans la zone en compression et dans la zone en tension par rapport à la ligne neutre. Le niveau d'expression d'ERF1 dans la zone comprimée semble relativement proche du niveau d'expression observé dans la zone tendue.
Conclusion et perspectives
Il a été démontré dans la littérature que des flexions répétées de la tige de peuplier provoquent une augmentation locale de la croissance en diamètre (Martin et al., 2010). La variable perçue dans le cas d’une sollicitation mécanique de type flexion est la déformation. Or, au sein d’une section de tige, ces déformations ne sont pas homogènes. Un des objectifs du stage visait donc à affiner notre connaissance de la réponse de croissance en diamètre face aux flexions, en mettant en relation le niveau de déformation et la production de bois. Nous avons pu mettre en lumière une ovalisation des sections de tige qui confirme une activité cambiale accrue dans les zones où la déformation longitudinale imposée par la flexion est la plus forte. Pour aller plus loin dans l'analyse de l'ovalisation des tiges fléchies, un comptage du nombre de cellules cambiales dans la zone en tension, dans la zone neutre et dans la zone en compression pourrait être intéressant.
Malgré leur caractère préliminaire, nos résultats moléculaires sont encourageants et semblent indiquer que l’ovalisation peut être mise en parallèle avec l’expression de certains gènes.
En effet, les analyses d'expression génique par q-PCR ont montré une augmentation de l'expression d'un gène de la voie de biosynthèse de l’éthylène et d'un gène de la voie de réponse à l’éthylène deux heures après la stimulation mécanique (ACO4 et ERF1) dans le bois sollicité en tension et en compression par rapport à la zone ne subissant pas de déformation (ligne neutre). Dans la littérature, on a pu voir que l'éthylène joue un rôle important dans le contrôle de la croissance secondaire des tiges (Love et al., 2009). On peut donc penser que l’éthylène est impliqué dans l’ovalisation de la tige. Il serait maintenant intéressant de répéter puis de confirmer ces résultats par des quantifications locales des concentrations en ACC et par l’utilisation de peupliers transgéniques dont la sensibilité à l’éthylène est modifiée.
En plus d’une augmentation de la croissance radiale, les plantes répondent aux sollicitations mécaniques par une diminution de la croissance longitudinale. Malheureusement, nos résultats ne nous permettent pas de conclure sur cet aspect du fait d’un arrêt de croissance inexpliqué observé chez tous les arbres (fléchis et témoins).
D’après Pruyn (1997, cité par Kern et al., 2005), le bois de flexion mis en place en réponse à des flexions bidirectionnelles présenterait des caractéristiques communes avec le bois de tension formé sur la face supérieure des axes soumis à un stress gravitropique et en cours de réorientation.
L'un des objectifs de ce travail était de mettre en lumière les modifications anatomiques du bois mis en place sous contraintes de flexions répétées unidirectionnelles. Nous avons mis en évidence la formation de couche G dans les zones de bois soumis à des déformations de tension. Ce caractère semble là-aussi commun avec le bois de tension. En revanche, nous avons pu observer une absence
de cellules à couche G dans le bois côté comprimé. Étant donné que les déformations sont d’intensité égale dans la zone en compression et dans la zone en tension, on peut alors se poser la question de l’existence d’un signal particulier dans la zone en tension, lequel régulerait la différenciation du bois. L'étude anatomique a également montré que la mise en place des fibres G survient très rapidement après une série de flexions. En effet, la zone d'apparition de la zone à fibres G correspond au bois mis en place dès les premières flexions. Les comptages et mesures de dimension des vaisseaux ont quant à eux montré une réduction significative de la densité de vaisseaux et de leurs dimensions dans la zone du bois tendu contenant des fibres G par rapport à la zone de bois formé avant les flexions. Une comparaison avec le bois des arbres témoins (pas de sollicitation) aurait dû être réalisée mais les arbres ont tous subi un arrêt de croissance inexpliqué qui a rendu cette comparaison impossible, le nombre et la taille des vaisseaux alors formés ayant été particulièrement affectés par la très faible croissance. Lors de ce fort ralentissement de la croissance, les arbres fléchis ont cessé de former des fibres G pour former le même bois que chez les témoins (eux aussi en très faible croissance). L'un des résultats marquants est donc que pour les arbres stimulés mécaniquement, la capacité de formation de couche G dans la zone tendue semble dépendante du dynamisme de l'activité cambiale.
Pour conclure, nous avons mis en évidence que l’activité cambiale de jeunes peupliers semble répondre quantitativement aux déformations subies lors de flexions de la tige. Même si nos analyses de la différenciation du bois ont été rendues difficiles au niveau anatomique et impossible au niveau moléculaire par un arrêt de croissance de l’ensemble des arbres, ils indiquent l’existence d’une signalisation différente entre le côté tendu et le côté comprimé d’une tige de peuplier. Il serait intéressant de répéter et compléter nos mesures sur des arbres en pleine croissance (donc avec un cambium ayant un fonctionnement normal).
L'arrêt de croissance des arbres a posé de nombreux problèmes lors de ce stage mais il a aussi permis de se rendre compte que les arbres ne produisent plus de fibre G en cas d’arrêt de croissance alors qu'ils continuent l'ovalisation de la tige si les flexions sont toujours appliquées.
Réflexion personnelle
Contrairement à la formation universitaire que j'ai reçus ces quatre dernières années, ce stage m'a permit de prendre conscience de la quantité de travail à fournir pour obtenir quelques résultats sur un projet. Pendant ces deux mois j'ai également pu me rendre compte de ce que représente le métier de chercheur et du temps à consacré à chaque projet (publication, expérience, stagiaire, cours, ect...). Malgré tous ces points qui semble négatif cette expérience professionnelle m'a motivée à continuer dans cette voie car j'ai également eu l'occasion de travailler avec des chercheur dans une ambiance très conviviale, chose qu'on ne peut observer qu'une fois sur place.
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