Caractérisation cinétique et moléculaire du biomarqueur acétylcholinesterase chez l'abeille, Apis mellifera

HAL Id: tel-02824286

https://hal.inrae.fr/tel-02824286

Submitted on 6 Jun 2020

HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.

L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

Caractérisation cinétique et moléculaire du biomarqueur acétylcholinesterase chez l’abeille, Apis mellifera

Alexandra Badiou

To cite this version:

Alexandra Badiou. Caractérisation cinétique et moléculaire du biomarqueur acétylcholinesterase chez

l’abeille, Apis mellifera. Sciences du Vivant [q-bio]. Université d’Avignon et des Pays de Vaucluse,

2007. Français. �tel-02824286�

AIX-MARSEILLE III

THESE

présentée pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PAUL CEZANNE Spécialité : Nutrition - Aspects cellulaires et Moléculaires

Présentée et soutenue publiquement le 23 octobre 2007 par Alexandra Badiou

Caractérisation Cinétique et Moléculaire du Biomarqueur Acétylcholinestérase chez l’Abeille,

Apis mellifera

Composition du jury :

Alain ROBICHON DR, CNRS Sophia-Antipolis Rapporteur Michèle ROMĒO CR, INSERM Sophia-Antipolis Rapporteur

Patrick MASSON DR, CRSSA Grenoble Examinateur

Gilles BOCQUENĒ CR, Ifremer Nantes Examinateur

Luc P. BELZUNCES DR, INRA Avignon Directeur

Thierry GIARDINA CR, Université Aix-Marseille III Président

A Mon Père,

Remerciements

Je voudrais remercier monsieur Luc P. Belzunces, mon directeur de thèse qui m’a permis de réaliser cette thèse dans les meilleures conditions. Je tiens à lui manifester toute ma gratitude pour l’occasion qu’il m’a donné de continuer ma formation. Que ces quelques lignes puissent lui témoigner toute ma reconnaissance pour la confiance et l’autonomie qu’il m’a toujours accordé.

Je souhaite remercier les membres de mon jury, à commencer par le Dr Michèle Roméo et le Dr Alain Robichon pour m’avoir fait l’honneur d’évaluer ce travail. Je tiens à les remercier de me consacrer de leur temps que je sais précieux. Je suis très sensible à l’honneur que me font, le Dr Gilles Bocquené et le Dr Thierry Giardina en participant à ce jury. Qu’ils trouvent ici le témoignage de mes sentiments respectueux. Je souhaite aussi remercier le Dr Patrick Masson qui m’a permis d’aborder une nouvelle approche de mon travail. Je souhaite lui témoigner mes plus vifs remerciements pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire, accordé sa confiance et avoir partagé ces compétences avec beaucoup d’humilité. Merci aussi pour l’intérêt qu’il n’a cessé de porter à cette étude et pour son art des contrepèteries.

J’adresse mes sincères remerciements au Pr Didier Fournier qui a su me poser les questions fondamentales, et qui a su éveiller mon esprit critique. Un grand merci pour ces précieux conseils. Je tiens également à remercier Frédérique Renault qui s’est rendu disponible et qui a mis toutes ses compétences et sa bonne volonté au service de mes expérimentations, ainsi que Marie Thérèse Froment pour sa bonne humeur, ses encouragements, sa disponibilité et ses bons conseils.

J’aimerai remercier toutes les personnes de l’unité qui m’ont aidées et encouragées durant l’accomplissement de cette thèse et particulièrement à Jean Luc pour ses qualités humaines.

Une pensée spéciale est adressée à Marianne qui a toujours été présente et avec qui j’ai partagé des moments de fous rires inoubliables.

Je tiens à remercier tout particulièrement pp pour sa générosité, sa patience et pour le soutien

inconditionnel qu’il a su m’apporter durant ces trois dernières années. Sans oublier, bosse et

Marlène qui ont su m’épauler dans les moments difficiles. Voyez y l’expression de ma plus

profonde affection. Enfin un grand merci à maman. Tes encouragements et ton réconfort

m’ont permis d’avancer. Trouve dans ces quelques mots le gage de toute ma tendresse.

SOMMAIRE

AVANT PROPOS ...1

CHAPITRE 1. INTRODUCTION...4

1.1 L

E SYSTEME NERVEUX DE L

’

^ABEILLE

... 4

1.1.1 Organisation... 4

1.1.2 Les neurones : siège de l’organisation nerveuse... 4

1.1.3 La transmission synaptique de type chimique ... 6

1.1.4 L’AChE et le contrôle de la transmission nerveuse... 7

1.2 L’

ACETYLCHOLINESTERASE

(AC

H

E) ... 8

1.2.1 Des enzymes estérasiques à l’AChE : classification... 8

1.2.2 Polymorphisme de l’AChE chez l’insecte ... 9

1.2.3 Structure tridimentionnelle comparée ... 11

1.2.4 Le site actif et son mécanisme catalytique... 13

1.2.5 Le site périphérique (PAS) et son rôle dans la flexibilité conformationnelle ... 14

1.3 C

INETIQUE ENZYMATIQUE A L

’

ETAT STATIONNAIRE

... 16

1.3.1 Théorie de Michaelis-Menten ... 16

1.3.2 Cinétique d’inhibition par les organophosphates et les carbamates... 19

1.4 L’

HYSTERESIS

... 21

1.4.1 Evolution des théories sur la diversité conformationnelle... 21

1.4.2 Etude de l’état pré-stationnaire et le concept d’hystérésis... 22

1.4.3 Analyse du comportement d’hystérésis... 23

1.4.5 Mécanismes proposés pour l’hystérésis ... 26

1.5 L

ES MARQUEURS BIOLOGIQUES DE L

’

ENVIRONNEMENT

... 27

1.5.1 Le concept de bioindication... 27

1.5.2 L’importance de l’espèce bioindicatrice ... 28

1.5.4 La variabilité biologique ... 29

1.5.5 Le biomarqueur AChE et les pyréthrinoïdes ... 30

CHAPITRE 2. MATERIELS ET METHODES...32

2.1 M

^ATERIELS

... 32

2.2 M

ETHODES

... 32

2.2.1 Identification et purification de l’AChE cérébrale d’Apis mellifera ... 32

2.2.1.1 Extraction de l’AChE ... 32

2.2.1.2 Dosage de l’activité de l’AChE ... 33

2.2.1.3 Dosage des protéines ... 33

2.2.1.4 Sédimentation sur gradient de saccharose ... 34

2.2.1.5 Partition de phase au Triton X-114... 34

2.2.1.6 Chromatographie d’échange d’ions ... 35

2.2.1.7 Chromatographie d’affinité ... 35

a. Synthèse du gel... 35

b. Mise en œuvre de la chromatographie... 36

2.2.1.8 Régénération des gels ... 36

a. Gel d’échange d’ions... 36

b. Gel d’affinité ... 36

2.2.1.9 Préparation des échantillons avant analyse... 36

a. Dialyse... 36

b. Dessalage et échange de tampons... 37

c. Concentration ... 37

2.2.1.10 Pontage covalent de l’AChE et des protéines présentes dans son environnement proche ... 37

a. Obtention de l’extrait membranaire... 37

b. Réalisation du pontage covalent... 38

2.2.2 Caractérisation moléculaire des formes membranaires d’AChE purifiées ... 38

2.2.2.1 Electrophorèse native ... 38

2.2.2.2 Electrophorèse SDS-PAGE ... 38

2.2.2.3 Coloration des gels ... 39

a. Coloration de l’AChE selon la méthode de Karnovsky et Roots... 39

b. Coloration des protéines au bleu de Coomassie ... 39

c. Coloration des protéines au nitrate d’argent ... 40

2.2.2.4 Analyse d’isoélectrofocalisation (IEF) ... 40

2.2.3 Caractérisation cinétique des formes d’AChE purifiés ... 41

2.2.3.1 Cinétique à l’état stationnaire ... 41

a. Détermination des constantes de vitesse et d’affinité ... 41

b. Titration au site actif ... 41

c. Stabilité thermique de l’AChE... 41

d. Sensibilité de l’AChE aux organophosphates et carbamates ... 42

2.2.3.2 Cinétique à l’état pré-stationnaire... 42

a. Cinétique d’hydrolyse du NMIA en fonction de la nature du tampon d’échantillon ... 42

b. Effet de la présence de co-solvant sur la cinétique d’hydrolyse du NMIA... 43

c. Détermination des énergies d’activation... 43

d. Cinétique d’hydrolyse du NMIA en fonction de la nature du tampon de dosage ... 44

2.2.4 Application de l’AChE en tant que biomarqueur d’exposition aux pesticides ... 45

2.2.4.1 Les abeilles et leur dispositif expérimental... 45

2.2.4.2 Traitements des abeilles... 45

2.2.4.3 Extraction de l’AChE ... 46

2.2.4.4. Procédures analytiques ... 46

2.2.4.5 Quantification des formes membranaires et soluble d’AChE ... 46

2.2.4.6 Cinétique enzymatique in vitro... 46

a. Action d’un pyréthrinoïde, la deltaméthrine, sur l’activité de l’AChE ... 46

b. Cinétique avec un carbamate : le pirimicarbe... 47

CHAPITRE 3. IDENTIFICATION DES FORMES D’ACHE D’ APIS MELLIFERA ... 48

3.1 A

NALYSE DE SEDIMENTATION

... 48

3.2 A

NALYSE CHROMATOGRAPHIQUE DES FORMES D

’AC

H

E

CONTENUES DANS LES AGREGATS

13S

ET

11S .... 49

3.3 M

ISE AU POINT D

’

UNE NOUVELLE METHODE D

’

OBTENTION DES FORMES D

’AC

H

E... 50

3.4 P

ROPRIETES CHROMATOGRAPHIQUES DES

AC

H

E

S MEMBRANAIRES

... 51

3.5 M

ODULATION DES PROPRIETES IONIQUES DES FORMES D

’AC

^H

E

PAR LE DETERGENT

T

^RITON

X-100... 53

3.6 M

ODULATION DES PROPRIETES IONIQUES D

’

UNE FORME MEMBRANAIRE D

’AC

^H

E... 54

3.7 E

XPERIENCES DE PONTAGE COVALENT

... 55

3.8 M

ISE EN EVIDENCE D

’

UNE CONVERSION DE L

’AC

H

E

ELUEE A

350

M

M... 58

3.9 D

ISCUSSION

... 59

CHAPITRE 4. PURIFICATION ET CARACTERISATION MOLECULAIRE DES FORMES D’ACHE D’ APIS MELLIFERA ... 64

4.1 M

ISE AU POINT DES CONDITIONS OPERATOIRES

... 64

4.2 P

URIFICATION DE L

’AC

H

E

PAR CHROMATOGRAPHIE D

’

AFFINITE

... 66

4.3 R

ECAPITULATIF DE LA PURIFICATION

... 68

4.4 A

NALYSE ELECTROPHORETIQUE

SDS

DES DIFFERENTES FORMES D

’AC

H

E... 69

4.5 A

CTIVITES

AC

H

E «

VRAIES

»... 69

4.6 S

TABILITE DES FORMES D

’AC

H

E

MEMBRANAIRES AU COURS DU TEMPS

... 70

4.7 S

TABILITE THERMIQUE DES FORMES MEMBRANAIRES D

’AC

^H

E... 71

4.8 E

FFET DU P

H

SUR L

’

ACTIVITE DES FORMES MEMBRANAIRES

... 72

4.9 P

OINT ISOELECTRIQUE DES FORMES MEMBRANAIRES

... 73

4.10 D

ISCUSSION

... 74

CHAPITRE 5. CARACTERISATION CINETIQUE DES FORMES D’ACHE...79

5.1 C

INETIQUE A L

’

ETAT STATIONNAIRE

... 79

5.1.1 Cinétique d’hydrolyse de l’AcSCh par les formes d’AChE membranaires ... 79

5.1.2 Détermination des constantes de Michaelis-Menten et d’inhibition par excès de substrat ... 80

5.1.3 Titration des sites actifs et détermination du turnover ... 82

5.1.4 Sensibilité des formes membranaires aux organophosphates et aux carbamates ... 83

5.2 C

INETIQUE A L

’

ETAT PRE

-

STATIONNAIRE

... 86

5.2.1 Hystérésis des formes d’AChE d’Apis mellifera et de Drosophila melanogaster... 86

5.2.1.1 Cinétique en tampon d’échantillon Bis Tris ... 86

5.2.1.2 Cinétique en tampon d’échantillon phosphate ... 88

5.2.2 Paramètres cinétiques de l’hystérésis... 89

5.2.2 1 Relation entre la constante hystérétique (k = τ

^-1

) et la concentration en NMIA ... 89

5.2.2.2 Détermination des paramètres cinétiques de l’hystérésis... 92

5.2.3 Effet du co-solvant méthoxyéthanol... 93

5.2.3.1 Effet de la concentration en méthoxyéthanol sur le temps d’induction (τ

^-1

=k)... 93

5.2.3.2 Effet de la concentration en méthoxyéthanol sur la vitesse finale ... 96

5.2.4 Modulation du temps d’induction par le phosphate et le Bis Tris ... 98

5.2.5 Analyse énergétique de l’hydrolyse du NMIA par l’AChE d’Apis mellifera et de Drosophila

melanogaster ... 100

5.3 D

ISCUSSION

... 102

CHAPITRE 6. L’ACHE D’ABEILLE EN TANT QUE BIOMARQUEUR DE L’ENVIRONNEMENT ...108

6.1 E

FFET DES TRAITEMENTS INSECTICIDES SUR L

’

ACTIVITE DE L

’AC

H

E ... 108

6.2 E

FFET DE LA DELTAMETHRINE ET DU PIRIMICARBE SUR LES FORMES D

’AC

^H

E

^{S IN VIVO}

... 110

6.3 E

FFET DE LA DELTAMETHRINE ET DU PIRIMICARBE SUR LES FORMES D

’AC

H

E

IN VITRO

... 112

6.4 D

ISCUSSION

... 113

CONCLUSION GENERALE... 117

ANNEXE... 122

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 123

Publications

Brunet JL, Badiou A, Belzunces LP. In vivo metabolic fate of [14C]-acetamiprid in six biological compartments of the honeybee, Apis mellifera L. Pesticide Management Science, 2005, 61 (8): 742-748.

Badiou A, Brunet JL, Belzunces LP. Existence of two membrane bound acetylcholinesterases in the honey bee, Apis mellifera. Archives of insects Biochemistry and Physiology, 2007, 66 (3): 122-134.

Badiou A, Meled M, Belzunces LP. Honeybee Apis mellifera Acetylcholinesterase - a biomarker to detect deltamethrin exposure. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2008, 69: 246-253.

Hysteresis behaviour of acetylcholinesterase in insects (Apis mellifera and Drosophila melenogaster) (en preparation).

Communications

Badiou A., Belzunces L.P. Existence of two membrane bound acetylcholinesterases in the honey bee. (2004) Poster présenté au 8

^ème

colloque international sur les cholinestérases, Perugia, Italie.

Badiou A., Belzunces L.P. Utilisation de l’acétylcholinestérase en tant que biomarqueur des pyréthrinoïdes. (2006) Présentation orale au colloque de l’union internationale pour l’étude des insectes sociaux - section française, Avignon, France.

Badiou A., Meled M., Belzunces L.P. (2007) Honeybee Apis mellifera acetylcholinesterase – a biomarker to detect deltamethrin exposure. Poster présenté au 9

^ème

colloque international sur les cholinestérases, Suzhou, Chine.

Badiou A., Fournier D., Froment M.T., Masson P., Belzunces, L.P. (2007) Hysteresis of

insect Acetylcholinesterase. Poster présenté au 9

^th

colloque international sur les

cholinestérases, Suzhou, Chine.

Liste des abréviations

ACh : acétylcholine

AChE : acétylcholinestérase

AChE

m1

, AChE

m2

, AChE

sol1

: AChE purifiées, membranaires 1 et 2 ou soluble 1

AcSCh : acétylthiocholine

APS : persulfate d’ammonium

BuCh : butyrylcholine

BuChE : butyrylcholinestérase

BW 284C51 : dibromure 1,5-bis-(4-allyldiméthylammonium phényl) pentane-3-one

DEAE : diéthyl aminoéthyl

DL 50 : Dose Létale 50, dose induisant la mortalité de 50% des individus

DMSO : diméthyle-sulfoxide

DTNB : dithiobis-succinimidyl propionate

DmAChE : acétylcholinestérase de Drosophila melanogaster EDC : N-(3-diméthylaminopropyl)-N’-éthylcarbodiimide EDTA Na

2

.H

2

O : acide éthylène diaminetétraacétate disodique EEDQ : 2-éthoxy-1-éthoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline

GPI : glycosyl phosphatidylinositol

IEF : isoélectrofocalisation

Iso-OMPA : tétraisopropyl pyrophosphoramide

LS : tampon de basse force ionique, 10 mM NaCl, 15 mM

phosphate pH 7,3

LST : tampon de basse force ionique contenant du Triton X-100

NMIA : N-méthylindoxyl acétate

PAS : « peripheral anionic site », site périphérique anionique PI-PLC : phospholipase C spécifique du phosphatidylinositol

MR : milieu réactionnel

SDS : sodium dodécyl sulfate

TcAChE : acétylcholinestérase de Torpedo californica TEMED : N,N,N’,N’-tétraméthyléthylènediamine

UI : unité internationale (1µmol de substrat hydrolysé/min)

Liste des figures

Figure 1 : Représentation schématique de la conduction nerveuse au travers des neurones 5 Figure 2 : Hydrolyse de l’acétylcholine par l’AChE au niveau de la synapse cholinergique 7 Figure 3 : Présentation de la formation des micelles de protéines d’après Simons et al., 1978 10 Figure 4 : Superposition de l’AChE de Drosophila melanogaster et Torpedo californica d’après 12

Harel et al., 2000.

Figure 5 : Mécanisme d’hydrolyse de l’acétylcholine par l’AChE d’après Eldefrawi (1985) et 14 Gallivan et Dougherty (1999)

Figure 6 : Hydrolyse des esters de choline par les cholinestérases 16 Figure 7 : Structures générales des organophosphates et carbamates 19 Figure 8 : Schéma général d’inhibition de l’AChE par les organophosphates et les carbamates 20 Figure 9 : Vision comparée des théories sur la dynamique des protéines d’après James et Tawfik (2003) 22 Figure 10 : Cinétique d’hydrolyse de la BuChE présentant un lag ou un burst d’après Masson P., 24

Proceedings of the 8

^th

international meeting on cholinesterases, Perugia, Italy, 26-30 september 2004

Figure 11 : Modèle général de Frieden (Modèle 1) 26

Figure 12 : 1

^er

modèle simplifié de Frieden (Modèle 2) 26

Figure 13 : 2

^e

modèle simplifié de Frieden (Modèle 3) 27

Figure 14 : Réaction d’hydrolyse de l’acétylthiocholine par l’AChE 33 Figure 15 : Réaction d’hydrolyse du N-méthylindoxyl acétate par l’AChE 43

Figure 16 : Analyse par sédimentation d’un extrait total d’AChE 48

Figure 17 : Analyse électrophorétique en présence de détergent des pics 7, 11 et 13S obtenus 49 en analyse de sédimentation

Figure 18 : Analyse chromatographique des formes d’AChE membranaires isolées par analyse 50 de sédimentation

Figure 19 : Analyse d’un extrait d’AChE par chromatographie d’échange d’ions 50

Figure 20 : Analyse chromatographique de l’AChE membranaire 52

Figure 21 : Analyse des pics d’activité P1 et P2 par chromatographie d’échange d’ions 52 Figure 22 : Analyse chromatographique des formes membranaires et soluble d’AChE 53 Figure 23 : Analyse chromatographique de l’AChE membranaire par une élution séquentielle 54

en détergent

Figure 24 : Analyse électrophorétique non dénaturante des pics 220, 220T et 350T 55 Figure 25 : Analyse chromatographique de l’AChE membranaire après pontage covalent 56

Figure 26 : Analyse chromatographique de l’AChE non pontée 57

Figure 27 : Analyse chromatographique d’échange d’anions de l’AChE extraite de membrane 57 après pontage covalent

Figure 28 : Analyse chromatographique des pics P2 et 220T selon différentes conditions en 59 détergent

Figure 29 : Effet dose de la procaïnamide sur l’activité de l’AChE 64 Figure 30: Analyse chromatographique par affinité d’un extrait d’AChE élué au décaméthonium 65 Figure 31 : Elution des protéines contaminantes à différentes concentrations en NaCl 66 Figure 32 : Purification par chromatographie d’affinité de l’AChE membranaire 1 et 2 : élution 67

1 M NaCl

Figure 33 : Purification par chromatographie d’affinité de l’AChE membranaire 1 et 2 : élution 67 2 M NaCl

Figure 34 : Analyse SDS-PAGE des formes d’AChE purifiées 69

Figure 35 : Cinétique d’inhibition des formes membranaires d’AChE 69 Figure 36 : Evolution de l’activité des formes d’AChE 1 et 2 brute au cours du temps 70 Figure 37 : Stabilité thermique des formes d’AChE membranaires purifiées ou non à différentes 71

températures

Figure 38 : Effet de la présence de détergent, Triton X-100 sur l’inactivation thermique 72

Figure 39 : pH dépendance des formes membranaires d’AChE 73

Figure 40 : Analyse d’isofocalisation des formes d’AChEs membranaires purifiées 74 Figure 41 : Effet de la concentration en substrat sur la vitesse d’hydrolyse 79 Figure 42 : Graphique en double inverse – représentation de Lineweaver et Burk de l’hydrolyse 80 de l’AcSCh par les formes membranaires

Figure 43 : Détermination de la constante d’inhibition par excès de substrat 80

Figure 44 : Graphique de Lineweaver-Burk des formes d’AChE 81

Figure 45 : Titration des sites actifs des différentes formes d’AChE d’Apis mellifera et de 82 Drosophila melanogaster

Figure 46 : Sensibilité des AChEs membranaires d’Apis mellifera à deux organophosphates, 83 l’ométhoate et le dichlorvos

Figure 47 : Sensibilité des AChEs membranaires d’Apis mellifera à trois carbamates, l’aldicarb, 84 le carbaryl et le pirimicarbe

Figure 48 : Cinétique d’hydrolyse du NMIA par les différentes formes d’AChE en tampon Bis Tris 86 Figure 49 : Cinétique d’hydrolyse du NMIA par les différentes formes d’AChE en tampon phosphate 88 Figure 50 : Dépendance de la constante hystérétique et de la concentration en NMIA des formes 90

d’AChE membranaires d’Apis mellifera

Figure 51 : Dépendance de la constante hystérétique et de la concentration en NMIA des formes 91 d’AChE solubles d’Apis mellifera et de Drosophila melanogaster

Figure 52 : Dépendance du temps d’induction et de la concentration en solvant organique des formes 94 d’AChE membranaires

Figure 53 : Dépendance du temps d’induction et de la concentration en solvant organique des formes 95 d’AChE solubles d’Apis mellifera et de Drosophila melanogaster

Figure 54 : Effet de la concentration en solvant organique sur la vitesse finale d’hydrolyse des formes 96 d’AChE membranaires

Figure 55 : Effet de la concentration en solvant organique sur la vitesse finale d’hydrolyse des formes 97 d’AChE solubles d’Apis mellifera et de Drosophila melanogaster

Figure 56 : Effet du phosphate sur l’hydrolyse du NMIA par l’AChE de Drosophila melanogaster 98 Figure 57 : Effet du Bis Tris sur l’hydrolyse du NMIA par l’AChE de Drosophila melanogaster 100 Figure 58 : Energie d’activation de l’hydrolyse du NMIA par l’AChE d’Apis mellifera et de 101

Drosophila melanogaster

Figure 59 : Modèles simplifiés de Frieden 106

Figure 60 : Effet des traitements à la dose 1X de deltaméthrine et pirimicarbe, seul ou en association 108 sur l’activité de l’AChE

Figure 61 : Effet des traitements à la dose 0,5X de deltaméthrine et pirimicarbe, seul ou en association 109 sur l’activité de l’AChE

Figure 62 : Effet des traitements à la dose 0,5X de deltaméthrine et pirimicarbe, seul ou en association 110 sur l’activité des formes solubles et membranaires de l’AChE

Figure 63 : Effet de la deltaméthrine sur les formes d’AChE 112

Figure 64 : Cinétique d’inhibition par le pirimicarbe des formes d’AChEs 112

Liste des tableaux

Tableau 1 : Composition du gel SDS-PAGE 38

Tableau 2 : Les différentes étapes de coloration au nitrate d’argent 40

Tableau 3 : Réglage de températures du spectrophotomètre 44

Tableau 4 : Récapitulatif des différentes étapes de purification des formes d’AChE chez Apis mellifera 68 Tableau 5 : Constante bimoléculaire (K

i

) d’inhibition aux organophosphates et carbamates 85

des deux formes d’AChE membranaires d’Apis mellifera

Tableau 6 : Paramètres moyens obtenus pour les cinétiques en tampon Bis Tris après modélisation 87 par l’équation de Frieden (1970)

Tableau 7 : Paramètres moyens obtenus pour les cinétiques en tampon phosphate après modélisation 89 par le modèle de Frieden (1970)

Tableau 8 : Paramètres cinétiques de l’hystérésis des formes d’AChE 92 Tableau 9 : Constantes de Michaelis-Menten de l’AChE pour le NMIA en fonction du tampon 93

d’échantillon (mM)

Tableau 10 : Activités des formes solubles et membranaires d’AChE des abeilles traitées à la dose 111

0,5X de deltaméthrine et pirimicarbe, seul ou en association (nmol/min/g de tissu)

Avant propos

Les progrès dans la protection des végétaux ont grandement contribué à l’augmentation des

rendements et à la régularité de la production. Au lendemain de la seconde guerre mondiale,

l’agriculture française était dans un état désastreux et il fallut mobiliser la science et la

technologie pour répondre aux besoins de la société en développant une agriculture

d’abondance. La France a mis en place une politique de développement agronomique selon un

modèle productiviste où les produits phytopharmaceutiques jouent un rôle central. Facile

d’accès et d’emploi, relativement peu chers, les produits phytopharmaceutiques se sont

révélés très efficaces et fiables. Aujourd’hui, la France est le troisième consommateur

mondial de produits phytopharmaceutiques, derrière les Etats-Unis, avec une utilisation

proche des 75.000 tonnes de substances actives appliquées annuellement. Cette orientation

n’a pas été sans conséquence tant aux niveaux des populations de ravageurs que de

l’environnement. Un des aspects importants à évoquer est la faible spécificité des produits

phytopharmaceutiques entraînant d’importants déséquilibres et la disparition de nombreuses

espèces utiles non cibles, telles que l’abeille. Les pesticides tuent les ravageurs mais aussi

leurs prédateurs et leurs parasites. Si bien qu’au bout de quelques années, les ravageurs

débarrassés de leurs ennemis se mettent à proliférer. Il est alors nécessaire d’appliquer des

doses encore plus fortes induisant l’apparition d’organismes résistants à certains traitements

qu’il est alors nécessaire de changer. Ainsi, au début des années 90, plus de 500 espèces

d’arthropodes, 270 espèces de mauvaises herbes et 150 autres espèces pathogènes étaient

devenues résistantes à au moins un pesticide (CEMAGREF, 2007). Parallèlement, la

contamination des écosystèmes s’est accentuée jusqu’à atteindre une situation alarmante

concernant la biodiversité des écosystèmes et la survie de certaines espèces animales,

menaçant à terme la santé de l’homme. Face à ces problèmes d’envergure, les pouvoirs

publics ont mis en place des procédures réglementaires et législatives visant à limiter

l’utilisation des produits phytopharmaceutiques (Directives 91/414/CEE relative à la

procédure d’autorisation de mise sur le marché des produits phytopharmaceutiques ; Directive

cadre sur l’eau ; plan interministériel « Pesticides » et « Plan National Santé-

Environnement »). Plusieurs rapports d’experts ont été réalisés, à l’initiative des pouvoirs

publics, comme l’expertise scientifique collective INRA-Cémagref (2005) et le rapport de

l’Institut français de l’environnement (Ifen) (2006), faisant le point sur les connaissances

disponibles concernant l’emploi et les moyens de limitation des pesticides ainsi que sur le

degré de contamination de l’environnement. Le rapport Ifen intitulé « les pesticides dans les

eaux », fait état d’un niveau de contamination par les pesticides atteignant 49% pour les eaux de surface et 27% pour les eaux souterraines. Les références scientifiques et les données de contamination sont nettement plus nombreuses pour le milieu aquatique, en général, que pour les autres compartiments de l'environnement. Dès le début des années 1990, en particulier sous l’impulsion donnée par la directive CEE 80-778 relative à l’eau potable, des dispositifs de surveillance de la qualité des eaux ont été mis en place (Galgani et Bocquené, 1990 ; Forget et al., 2003). Aujourd’hui, la préservation de notre environnement est omniprésente dans toutes les strates de l’écosystème, et de nombreux travaux scientifiques ont été entrepris pour évaluer la qualité de l’environnement. Certes, les analyses chimiques des différents compartiments de l'environnement (eau, sol, sédiments) renseignent sur la présence ou l'absence d'un contaminant chimique et sur son cycle biogéochimique. Mais ces informations sont néanmoins insuffisantes pour connaître l'impact réel d’une substance toxique sur les organismes. C’est pourquoi la surveillance de la qualité de l’environnement repose largement sur l’évaluation de l’impact écotoxicologique des polluants au travers d’espèces sentinelles ou de marqueurs biologiques qui ont fait l’objet depuis une vingtaine d’années, d’importants efforts de recherche et de développement.

Dans ce contexte, l’acétylcholinestérase (AChE, E.C. 3.1.1.7) se révèle être un marqueur

biologique de choix rendant compte de l’exposition de contamination environnementale chez

des espèces cibles de façon précoce et à des seuils d’apparition des effets très faibles

(Bocquene et Galgani, 1991). L’AChE est un sujet d’étude depuis de nombreuses années en

raison de son importance biologique. Elle est impliquée dans de nombreux autres problèmes

majeurs de santé publique comme la maladie d’Alzheimer, les intoxications aux insecticides

et aux gaz neurotoxiques, aux venins de serpents, etc. On comprend que cette enzyme du

système nerveux soit au cœur d’enjeux économiques et sociétaux importants en raison de sa

position cible. Le travail présenté dans cette thèse a été réalisé dans le but d’approfondir, au

travers d’une approche biochimique, les connaissances de l’AChE de l’abeille Apis mellifera,

cible principale des insecticides organophosphates et carbamates et cible modulée par divers

autres contaminants. L’étude du polymorphisme de l’AChE a été réalisée dans le but

d’identifier de nouvelles formes d’AChE de sensibilité distinctes aux toxiques. L’existence de

plusieurs formes d’AChE pourrait rendre compte de la sensibilité différentielle des abeilles à

certains toxiques. La purification et l’étude des propriétés cinétiques et moléculaires, des deux

formes membranaires et de la forme soluble majoritaire d’AChE seront présentées. Leur

caractérisation cinétique à l’état stationnaire et pré-stationnaire renseignera sur les propriétés

catalytiques de l’enzyme ainsi que sur sa dynamique conformationnelle. La mise en évidence

d’un phénomène enzymatique particulier sera présenté pour les formes d’AChE d’Apis

mellifera et étendu à l’AChE de Drosophila melanogaster. Enfin une étude comparée (in vivo

/ in vitro) de l’effet de la deltaméthrine (pyréthrinoïde) sur les différentes formes de l’AChE

sera exposée, proposant une nouvelle perspective d’utilisation de l’AChE en tant que

biomarqueur.

Chapitre 1. Introduction

1.1 Le système nerveux de l’abeille 1.1.1 Organisation

Le système nerveux des insectes est utilisé comme modèle pour beaucoup de recherches parce qu’il est plus simple que celui des autres espèces animales. L’abeille possède un système nerveux très simplifié comparativement aux vertébrés mais elle révèle un répertoire comportemental très riche ce qui fait d’elle un outil de choix des études cognitives (Giurfa, 2007; Menzel et Giurfa, 2006). L’élément principal du système nerveux des insectes est une double chaîne nerveuse ventrale qui possède des paires de centres nerveux ou ganglions, innervant le thorax et l’abdomen. La position ventrale est une caractéristique des invertébrés, contrairement aux vertébrés, chez qui la moelle épinière est en position dorsale. Le cerveau de l’abeille, plus gros que celui de la plupart des invertébrés, compte un peu moins d’un million de neurones. Il est constitué par trois ganglions fusionnés et reçoit les informations des nerfs sensitifs en provenance principalement des yeux et des antennes. L’information est ensuite redistribuée aux pièces buccales et aux autres organes. Le système nerveux sympathique, en relation avec des organes sécrétant des hormones joue un rôle très important en intervenant dans des évènements comme le développement ou la communication (Le Conte et al., 2001;

Pankiw et Garza, 2007; Slessor et al., 2005).

1.1.2 Les neurones : siège de l’organisation nerveuse

Le système nerveux est responsable de l’ensemble des activités végétatives et motrices de

l’organisme. Il se compose de centres nerveux, qui sont chargés de recevoir, d’intégrer et

d’émettre des informations, et de voies nerveuses qui sont chargées de conduire ces

informations. Ainsi il intègre l’ensemble des informations intrinsèques et extrinsèques

recueillies par un individu pour en assurer son bon fonctionnement. L’unité structurale et

fonctionnelle du système nerveux est le neurone, soutenu et nourri par les cellules gliales au

sein du tissu nerveux. La structure du neurone se décompose en quatre régions différentes

assurant chacune une fonction précise, le corps cellulaire, les dendrites, l’axone et les

terminaisons axonales (Fig. 1). C’est au travers de cette unité hautement spécialisée que la

transmission nerveuse va avoir lieu. Le corps cellulaire contenant principalement le noyau et

les organites cellulaires (les mitochondries etc.), est le siège de la vie cellulaire et présente

arborisés du corps cellulaire et ont pour rôle de transmettre à ce dernier les signaux issus des cellules sensorielles ou des terminaisons de l'axone d'autres neurones, en impulsions électriques. L’axone prend naissance au niveau du corps cellulaire et se termine par des terminaisons axonales très arborisées et assure la propagation de l’influx nerveux vers les autres cellules.

Figure 1 : Représentation schématique de la conduction nerveuse au travers des neurones d’après http://www.lacim.uqam.ca/~chauve/Enseignement/BIF7002/Rapports/Simon-

Beaulne/neurones_fichiers/image004.gif [en ligne, visualisé le 3 septembre 2007].

En résumé, le corps cellulaire du neurone reçoit des informations grâce à ses dendrites où un potentiel d’action se créé si la sommation des stimuli atteint un potentiel seuil. Le potentiel d’action va se propager le long de l’axone jusqu’aux terminaisons axonales ou synaptiques.

Comme on peut le constater, le neurone est une entité polarisée où l’influx nerveux ne peut

aller que dans un seul sens, des dendrites vers l’axone. La polarisation de la membrane

neuronale provient d’une différence de potentiel électrique entre son milieu intérieur et

extérieur que l’on nomme potentiel de repos membranaire qui est négatif. Au repos le milieu

intérieur du neurone contient beaucoup plus d'ions potassium et beaucoup moins d'ions

sodium et chlore que le milieu extérieur. Ces gradients de concentration sont entretenus par

des pompes à ions qui consomment de l'énergie fournie sous la forme d'ATP par les

mitochondries de la cellule. La membrane du neurone possède des tunnels à ions ouverts,

spécifiques d’un certain type d'ions. Etant donné que le nombre de tunnels à ions K

⁺

ouverts

dépasse celui des tunnels à ions Na

⁺

et à ions Cl

^-

ouverts, il y a plus d'ions K

⁺

qui sortent de la

cellule que d'ions Na

⁺

ou Cl

^-

qui y entrent. La face interne de la membrane acquiert ainsi une

charge nette négative par rapport à sa face externe. La membrane neuronale peut ainsi propager l’influx nerveux sous forme de signaux électriques d’un bout à l’autre par modification de son potentiel de membrane. L’arrivée d’un potentiel d’action provoque la fermeture des canaux sodium et potassium dépendant du voltage et l’ouverture des canaux sodium provoquant l’entrée massive de sodium dans la cellule et une charge localement positive. L’inactivation des canaux sodium et l’ouverture des canaux potassium permettent au potentiel de membrane de revenir au repos en attente d’un nouveau potentiel d’action.

1.1.3 La transmission synaptique de type chimique

Pour réaliser la communication entre les neurones, les cellules nerveuses établissent entre elles des connexions, les synapses. Des milliards de ces synapses contribuent au traitement d'un seul stimulus. Il existe deux types de synapses, électriques ou chimiques. Chez les vertébrés comme chez les invertébrés, la synapse chimique est la plus couramment rencontrée. La conduction de l’influx nerveux jusqu’à la terminaison axonique aboutit à la libération de neuromédiateur nécessaire pour le franchissement de l’espace inter-neuronal. Ce neuromédiateur est libéré par fusion membranaire grâce à l’ouverture des canaux calcium dépendant du voltage présents sur la membrane pré-synaptique induisant l’entrée massive d’ions calcium dans la partie terminale du neurone. Ces neuromédiateurs se fixent sur des récepteurs de la membrane post-synaptique entraînant la génération de potentiels post- synaptiques activateurs (PPSA) ou inhibiteurs (PPSI). Si la sommation des potentiels est supérieure aux potentiels seuil alors un nouveau potentiel d’action est crée, sinon la transmission nerveuse s’arrête. Différentes molécules jouent le rôle de neuromédiateurs dans la transmission synaptique chez les insectes comme des amines, l’acétylcholine (ACh), la dopamine, l’octopamine, la sérotonine, l’histamine ou encore l’acide γ-aminobutyrique, des acides aminés comme le glutamate ou encore des neuropeptides comme la proctoline (Osborne, 1996). Ces molécules sont spécifiques de certains types de synapses chimiques.

Dans le muscle des insectes, le neuromédiateur des synapses excitatrices est le glutamate tandis que celui des synapses inhibitrices est l’acide γ-aminobutyrique (Eldefrawi, 1985).

Chez l’abeille, le neuromédiateur majoritaire du système nerveux central est l’acétylcholine

(Satelle, 1980). Elle est formée à partir de choline et acétylCOA au niveau de la terminaison

axonale. Elle se fixe sur deux types de récepteurs de la membrane post-synaptique,

différenciés par le mécanisme de transduction du signal associé. Les récepteurs nicotiniques,

qui appartiennent à la famille des récepteurs ionotropiques, induisent une modification du

potentiel. Les récepteurs muscariniques appartenant à la famille des récepteurs métabotropiques sont couplés à des protéines G et provoquent l’activation ou l’inhibition en cascades d’enzymes spécifiques (Eldefrawi et Eldefrawi, 1997). Chez l’insecte, les deux types de récepteurs ainsi que des récepteurs mixtes ont été identifiés. Cependant ce sont les récepteurs nicotiniques qui assurent la transduction du signal induit par l’ACh, dans le cerveau d’insectes (Osborne, 1996).

1.1.4 L’AChE et le contrôle de la transmission nerveuse

Pour assurer une transmission brève et efficace au niveau du système cholinergique, l’organisme a besoin d’un contrôle très précis et efficace assurant l’élimination rapide de l’ACh. Plusieurs processus d’inactivation complémentaires sont employés par la cellule. Des phénomènes de diffusion et/ou de recapture du neuromédiateur sont utilisés mais restent secondaire en raison de la rapidité nécessaire au bon fonctionnement du système. L’action principale est réalisée par une enzyme, l’acétylcholinestérase responsable de l’hydrolyse de l’ACh (Massoulié et al., 1993). L’hydrolyse conduit à la formation de choline, pouvant être récupéré par la membrane pré-synaptique par l’intermédiaire du HACU (High Affinity Choline Uptake) et d’acétate (Fig. 2).

Figure 2 : Hydrolyse de l’acétylcholine par l’AChE au niveau de la synapse cholinergique

L’AChE termine ainsi, la transmission de l’influx nerveux et restaure l’excitabilité des

synapses. On comprend que la rapidité de la transmission nerveuse dépend de la rapidité de

l’AChE à hydrolyser l’ACh. C’est pour cette raison que l’AChE exprimée au sein des

synapses cholinergiques se trouve plus particulièrement localisée sur la membrane post- synaptique à côté des récepteurs de l’ACh (Koelle, 1963; Koelle et al., 1974). De plus, l’AChE se trouve parmi les enzymes les plus rapide de la nature avec une efficacité d’hydrolyse (turnover) de 1000 à 20 000 molécules / secondes selon l’espèce.

1.2 L’acétylcholinestérase (AChE)

1.2.1 Des enzymes estérasiques à l’AChE : classification

Les enzymes sont classés selon le type de réaction qu’elles catalysent. Ils existent 6 grandes familles, dont la nomenclature est indiquée entre parenthèses, à savoir les oxydoréductases (1.), les transférases (2.), les hydrolases (3.), les lyases (4.), les isomérases (5.), et les ligases (6.). Les estérases (3.1) appartiennent à la famille des hydrolases. Les estérases possèdent une faible spécificité et elles hydrolysent un grand nombre d’esters différents à des vitesses variables (Chadwick, 1963). Il a été suggéré qu’elles puissent dériver d’un ancêtre commun qui, au cours de l’évolution, aurait acquis des spécificités différentes avec de petits changements dans le mécanisme réactionnel (Hartley et al., 1965; Walsh et Neurath, 1964).

Ces estérases sont sub-divisées en deux groupes, les carboxylestérases et les cholinestérases.

La reconnaissance de ces différents types d’estérases est basée sur la spécificité vis-à-vis de différents substrats et de leur sensibilité à différents inhibiteurs. Le substrat 4-nitrophényl acétate est souvent utilisé pour détecter l’activité estérasique globale par exemple. Il est aussi bien hydrolysé par l’acétylcholinestérase que par des enzymes protéolytiques comme la chymotrypsine. Les cholinestérases hydrolysent plus rapidement les esters de choline et sont généralement inhibées par excès de substrat (Marcel et al., 1998; Stojan et al., 2004). De plus, les cholinestérases sont inhibées par les insecticides de types organophosphates et carbamates contrairement aux aliestérases (3.1.1.1), qui sont inhibées seulement par les organophosphates et aux arylestérases (3.1.1.2) qui ne sont pas inhibés par ces insecticides. La sensibilité à la concentration de 1.10

^-5

M d’ésérine (famille des carbamates) est aussi une caractéristique des cholinestérases (Toutant, 1989). Tous ces types d’estérases ont été identifiés chez l’insecte, c’est pourquoi, pour pouvoir identifier correctement l’acétylcholinestérase, plusieurs critères de spécificités aux substrats et d’inhibition doivent être réunis.

Chez les vertébrés, deux types de cholinestérase coexistent, l’acétylcholinestérase (AChE,

3.1.1.7) et la butyrylcholinestérase (BuChE, 3.1.1.8). Chez les insectes, seule l’AChE est

présente. Elle réalise l’hydrolyse de la butyrylcholine (BuCh), substrat de la BuChE mais à un

degré moindre que l’hydrolyse de l’ACh. Le rapport d’hydrolyse BuCh/ACh peut varier d’un

facteur 100 selon l’espèce considérée (Gnagey et al., 1987). Les critères utilisés pour distinguer les 2 cholinestérases chez les vertébrés ont été repris pour identifier l’activité d’une AChE « vraie » chez les invertébrés. Ces critères sont, principalement, l’inhibition par l’ésérine à la concentration de 1.10

^-5

M et de 1.10

^-5

M de dibromure 1,5 bis (4- allyldiméthylammonium phényl) ou BW 284C51 (inhibiteur spécifique de l’AChE) et l’absence d’inhibition par le tétraisopropyl pyrophosphoramide ou iso-OMPA (inhibiteur spécifique des BuChE). Concernant l’hydrolyse de l’ACh, l’AChE présente une inhibition par excès de substrat caractéristique contrairement à la BuChE et aux autres estérases (Melanson et al., 1984).

1.2.2 Polymorphisme de l’AChE chez l’insecte

L’AChE se présente sous différentes formes structurales qui peuvent être différenciées par

leur nombre et leur type de sous-unités. Ces différentes formes correspondent à diverses

structures quaternaires et type d’ancrage à la membrane. Chez les vertébrés, l’AChE se

présente sous des formes asymétriques ou globulaires. Les formes asymétriques sont

constituées d’un, deux ou trois tétramères catalytiques attachés à la membrane par une queue

collagénique ou une protéine hydrophobe (Inestrosa et al., 1987; Krejci et al., 1997). Les

formes globulaires sont constituées de monomères, dimères et tétramères hydrophiles ou

amphiphiles (Gorenstein et al., 1991). Les différentes formes d’AChE d’une espèce sont

généralement identifiées par une analyse de sédimentation par gradient de saccharose. Chez

les invertébrés, il y a essentiellement des formes de type globulaire qui peuvent être

hydrophile (soluble) et amphiphile (membranaire). Le coefficient de sédimentation de ces

formes se trouve souvent aux environs de 4,5 S pour les formes monomériques, de 6-7 S pour

les dimériques et de 9 à 11 S pour les tétramériques (Massoulié et al., 1993). Chez Torpedo

marmorata, l’AChE se présente sous forme d’agrégats de dimères de protéines sédimentant à

8 S (Bon et Massoulie, 1980). Le polymorphisme de l’AChE d’abeille, solubilisé en présence

et en absence de détergent a révélé la présence d’une forme soluble sédimentant à 7,2 S et

d’une forme membranaire sédimentant à 5 ou 6 S en fonction de la densité du milieu

(Belzunces et al., 1988b). Leur migration électrophorétique est différente puisque la forme

soluble possède une migration rapide contrairement à celle de la forme membranaire qui est

lente. Après une partition de phase au Triton X-114, les formes soluble et membranaire se

retrouvent dans les phases aqueuse et détergent, respectivement. Des études chez Musca

domestica ou Drosophila melanogaster ont montré que les AChEs membranaires et solubles

se présentaient sous forme de dimères qui pouvaient être converties en dimères et monomères soluble après des traitements protéolytiques ménagés ou par autolyse (Fournier et al., 1987;

Toutant et al., 1988). De plus, la réduction des formes membranaire et soluble au moyen de dithiothréitol a mis en évidence des formes monomériques témoignant de la présence de dimères reliés par des ponts disulfures.

Le caractère amphiphile des formes globulaires de l’AChE d’insectes a été déterminé par la capacité d’interaction de cette dernière avec des détergents (Brodbeck, 1986). Pour les formes amphiphiles, lorsque la solubilisation s’effectue en absence de détergent, la présence d’agrégats de protéines (Fig. 3) et la présence éventuelle d’éléments non catalytique peuvent affecter la constante de sédimentation.

Figure 3 : Présentation de la formation des micelles de protéines d’après Simons et al., 1978

Les formes amphiphiles s’agrègent en absence de détergent et leur migration

électrophorétique dépend de la présence, de la nature et de la concentration en détergent. En

revanche la sédimentation des formes solubles n’est généralement pas affectée par le

détergent puisque celles-ci ne possèdent pas de zones hydrophobes (Lenoir-Rousseaux et al.,

1988). Lors d’une électrophorèse en condition native, les détergents non ioniques comme le

Triton X-100 induisent une réduction de la migration des formes membranaires probablement

à cause de la liaison de la région hydrophobe de la protéine avec le détergent (Borsum et

Bjerrum, 1986). En revanche les détergents anioniques, comme le SDS, utilisés lors des

électrophorèses dénaturantes, se fixent à la protéine et induisent une charge globale négative,

ainsi ces détergents ne ralentissent pas l’AChE et cette dernière migre uniquement en fonction

de son poids moléculaire. L’extraction d’AChE membranaire est le plus souvent réalisée au

moyen du Triton X-100 (Gnagey et al., 1987).

Chez les insectes, les 2 types de formes globulaires solubles et membranaires sont généralement présents, la forme membranaire étant souvent majoritaire (Arpagaus et al., 1992; Talesa et al., 1995; Toutant et al., 1988). Les formes globulaires solubles et amphiphiles, sont souvent isolées en différentes proportions chez de nombreuses espèces (Fournier et al., 1987; Talesa et al., 2001). Chez l’abeille, les formes membranaires représentent environ 95% de l’activité totale alors que la forme soluble est minoritaire (Belzunces et al., 1988b). Le type d’ancrage des formes membranaires chez beaucoup d’invertébrés, comme Drosophila melanogaster et Musca domestica (Fournier et al., 1988), Platyhelminth (Bentley et al., 2003) et Apis mellifera (Belzunces et al., 1988a) est un ancrage de type glycosylphosphatidylinositol (GPI). Cet ancrage de type GPI est attaché de façon covalente à un segment hydrophobe de la partie C-terminale de l’AChE. Le processus d’addition de l’ancrage GPI ou glypiation implique le clivage du peptide en C-terminal et l’attachement d’une molécule de phosphatidylinositol au niveau de la région C-terminale de chaque sous-unité catalytique. Chez Leptinotarsa decemlineata la forme minoritaire est un dimère membranaire totalement insensible à l’action de la PI-PLC laissant supposer un ancrage légèrement différent (Zhu et Clark, 1994). Chez l’abeille, des sensibilités partielles à l’action de la PI-PLC ont aussi été révélées (Belzunces et al., 1990). Cette résistance peut varier en fonction de la saison pour atteindre un maximum de 90 à 95% de l’activité membranaire l’hiver. Cette résistance n’est pas interprétée comme une absence d’ancrage GPI mais par l’interaction éventuelle de l’AChE avec d’autres molécules pouvant masquer le site de clivage. Elle peut provenir d’un domaine membranaire essentiellement protéique (Inestrosa et Perelman, 1989) ou d’un ancrage glycolipidique modifié par acylation de l’inositol (Toutant, 1989).

1.2.3 Structure tridimensionnelle comparée

La première structure tridimensionnelle résolue a été celle de l’AChE du poisson torpille Torpedo californica (TcAChE) avec une résolution de 2,8 Ǻ (Sussman et al., 1991). Cette structure est celle d’un dimère membranaire ancrée in situ par un ancrage de type GPI qui a été rompu par une PI-PLC pour les besoins de la cristallographie. Chaque monomère est constitué de 15 hélices α et de 11 feuillets β. Les deux monomères sont reliés par 4 hélices α et les cystéines C-terminales de chaque monomère établissent entre elles un pont disulfure.

Cette structure a révélé une position enfouie du site actif au fond d’une gorge profonde

d’environ 20 Ǻ et très étroite (5 Ǻ). Plus tard, la résolution des structures d’AChE de

différentes espèces a confirmé ce résultat (Bourne et al., 1995; Harel et al., 2000). La première structure 3D d’AChE d’insecte fût celle de Drosophila melanogaster (DmAChE) résolue à 2,7 Ǻ. Elle montre une forte similitude de repliement avec la structure de TcAChE malgré la faible homologie de séquence entre les deux (36%) (Fig. 4). La comparaison des sites actifs, plus particulièrement de la triade catalytique, du trou oxyanion et du site de liaison anionique montrent un recouvrement très proche. Les différences principales se situent au niveau de la boucle externe et de l’inclinaison de l’hélice en C-terminal. La gorge du site actif est plus étroite pour DmAChE et la trajectoire de la gorge est légèrement déviée. A l’origine de ces différences se trouve le remplacement de certains acides aminés. Par exemple, chez DmAChE, les résidus 328 et 371 sont respectivement une leucine et une phénylalanine (Phe288 et Phe331 chez TcAChE) et induisent la perte d’une interaction π-π rigide rendant la Phe371 plus mobile, modifiant les propriétés catalytiques. La mutation de ce même résidu (Phe295Leu) chez l’AChE humaine induit une augmentation de l’activité d’hydrolyse de la BuCh d’un facteur 100 (Ordentlich et al., 1993).

Figure 4 : Superposition de l’AChE de Drosophila melanogaster et Torpedo californica d’après Harel et al., 2000. La structure de DmAChE est représentée en rouge, celle de TcAChE en vert.

La découverte de l’enfouissement du site catalytique au fond d’une gorge de 20 Ǻ a rendu

difficile la compréhension de la rapidité du mécanisme catalytique. Cet enfouissement semble

difficilement compatible avec la vitesse de catalyse, sachant que 1000 à 20 000 molécules

d’ACh et tout autant d’acétate et de choline transitent chaque seconde. De plus, la structure

présente un étranglement (3 Ǻ) à mi-hauteur de la gorge rendant le site actif quasiment

inaccessible aux molécules d’ACh. Beaucoup de travaux se sont consacrés à la

compréhension de cette curiosité mais il semble incontournable qu’une flexibilité

conformationnelle de l’enzyme intervienne. Des chemins alternatifs de sortie des produits appelé « back door » (Alisaraie et Fels, 2006; Bartolucci et al., 1999; Marchot et al., 1993) ont aussi été envisagés pour répondre à la problématique. Cette porte de sortie permettrait une élimination rapide des produits et un accès libre pour l’entrée des molécules de substrat. A ce jour, les expériences de mutagénèse dirigée n’ont pas permis de conclure sur la réelle existance de cette porte de sortie dans la cinétique enzymatique (Karlsson et al., 1985;

Ordentlich et al., 1993).

1.2.4 Le site actif et son mécanisme catalytique

Le site actif, région particulière de l’enzyme où se déroule la réaction enzymatique, possède une taille restreinte par rapport à la taille globale de l’enzyme. Le site actif de l’AChE possède un site catalytique qui peut être décomposée en 2 parties, le sous-site estérasique et anionique (Fig. 5). Le sous-site anionique est responsable de la stabilisation du substrat lors de catalyse par fixation de l’ammonium quaternaire de la partie choline de l’ACh. Il était admis, jusque dans les années 1990, que cette liaison se faisait par interaction électrostatique entre la charge positive de l’ammonium et la charge négative d’un groupement carboxyle libre de l’enzyme (Rosenberry, 1975). Cette interaction est stabilisante, mais en réalité un transfert de charge entre la charge positive de l’ammonium quaternaire de l’ACh et les électrons π du noyau indole du Tryptophane (Trp) l’est beaucoup plus (Gallivan et Dougherty, 1999). Ce sous-site est composé d’une majorité de résidus aromatiques et il est estimé que plus de 50% de l’énergie de stabilisation provient de ce dernier. Le sous-site estérasique contenant la triade catalytique Ser200, His440 et Glu327 (numérotation d’après la séquence de l’AChE de Torpedo californica) constitue le lieu de la catalyse (Eldefrawi, 1985). Dans un premier temps, la partie acétyle de la molécule d’ACh se fixe et forme un intermédiaire tétrahédrique.

Le trou oxyanion favorise la formation de cette intermédiaire en accueillant l’oxygène

négativement chargé du carbonyle de l’ACh. L’His440 joue un rôle important en se

comportant comme un catalyseur pour la formation et la décomposition de l’intermédiaire. Au

sein du sous-site estérasique se trouve une petite cavité hydrophobe appelée, poche acyle, qui

stabilise le groupement méthyle de la partie acétate et confère un rôle de sélectivité du

substrat. La mutagenèse dirigée a montré que le remplacement des résidus impliqués dans la

poche acyle induisait une spécificité plus large de substrat. L’hydrolyse de l’ACh implique la

participation du N de l’imidazole de l’histidine qui va attirer le proton de l’hydroxyle de la

sérine du site actif, le rendant plus mobile et favorisant l’interaction de l’oxygène de la sérine

avec le centre électrophile de l’ACh. Une fois le complexe intermédiaire non covalent enzyme substrat formé (k+1), l’AChE est acétylée par estérification de l’hydroxyle de la sérine active (k

2

) et la partie choline est libérée. L’enzyme est régénérée (k

3

) lorsque l’atome d’oxygène d’une molécule d’eau, électronégatif, attaque le site électrophile du carbonyle du groupement acétyle produisant de l’acide acétique.

H

₃

C O

CH

₂

CH

₂

N CH

₃

CH

₃

CH

₃

C +

N

^{N :}

^....

^H-O +

site anionique site estérasique

acétylcholine site actif de l'AChE

O

trou oxyanion

k

₊₁

k

_-1

N

N + H-O

C O -

CH

₃

CH

₂

CH

₂

O

H

₃

C + N CH

₃

H

₃

C

Complexe intermédiaire

poche acyle

N

O

CH

₃

H

₃

C C

k

₂

N : O + ^{HO CH}

²

^CH

²

^{N + CH}

³

CH

₃

Choline AChE acétylée

O

N

k

₃

H-O

N :

....

+ ^H

³

^{C C}

H

₂

O

OH

acide acétique AChE déacétylée

Figure 5 : Mécanisme d’hydrolyse de l’acétylcholine par l’AChE d’après Eldefrawi (1985) et Gallivan et Dougherty (1999)

1.2.5 Le site périphérique (PAS) et son rôle dans la flexibilité conformationnelle

Etant donné l’étranglement observé à mi-hauteur de la gorge, donnant lieu à un diamètre de 3

Ǻ et autorisant l’accès juste à une molécule d’eau, il est bien clair que l’AChE présente une

flexibilité conformationnelle lors de la catalyse ne serait-ce que pour permettre l’entrée de

substrat. Le PAS joue un rôle important dans cette flexibilité. Il se situe à l’entrée de la gorge

conduisant au site actif et se trouve constitué par un grand nombre de résidus aromatiques

dont le Trp, hautement conservé entre les espèces. Différents ligands peuvent se lier sur ce site, induire des régulations de la catalyse au site actif et changer le profil cinétique (Changeux, 1966; Karlsson et al., 1985). La fasciculine est un ligand spécifique du PAS et sa fixation n’abolit pas le passage du substrat au site actif. Elle permet d’étudier l’influence du PAS sur la catalyse (Radic et al., 1995). Sa fixation au PAS entraîne une inhibition de la catalyse enzymatique par une modification allostérique de la chaine latérale du Trp conduisant à la base de la gorge. Des modifications électrostatiques affectant l’entrée du substrat dans la gorge sont aussi montrées. En réalité, la fixation de ce ligand à l’entrée de la gorge contrôle la configuration entière du site actif (Shafferman et al., 1992) et doit probablement modifier l’affinité du ligand pour le site actif. Le PAS est responsable des phénomènes cinétiques d’activation de l’hydrolyse de l’ACh aux faibles concentrations en substrat et de son inhibition aux fortes concentrations (Marcel et al., 1998; Ordentlich et al., 1995) conférant à l’enzyme une complexité cinétique. Il est établi que ces cinétiques résultent bien d’une seule forme enzymatique, régulée par le substrat (Estrada-Mondaca et al., 1998).

Chez les invertébrés, deux sites de fixation bien distincts sont présents et rendent compte de ces deux phénomènes. Dans le but d’étudier le phénomène d’activation, il a été utilisé le Triton X-100, un détergent non ionique, très utilisé pour solubiliser les protéines membranaires. Il est considéré comme inhibiteur compétitif de l’activation. Son action résulte dans l’inhibition de l’activité de l’AChE mais son mode d’action reste incertain. Agit-il par encombrement stérique de la molécule empêchant l’entrée des molécules de substrat ou par modification conformationnelle de l’enzyme ? Selon Szegletes et al. (1998), le rôle premier du PAS est d’accélérer la catalyse à faible concentration. Ainsi Marcel et al. (1998) ont suggéré que l’inhibition induite par le détergent était due à une compétition entre ce dernier et la fixation du substrat au site d’activation. Ainsi, la fonction du site d’activation est d’attirer et de fixer les molécules de substrat qui sont correctement orientées pour atteindre par la suite le site catalytique (Mallender et al., 2000). De plus, le PAS peut induire l’accélération de la vitesse de déacylation de l’ACh au site actif, étape limitante de la catalyse (Brochier et al., 2001) par fixation d’ACh sur son site d’activation. Le second site présent au PAS est un site responsable de l’inhibition par le substrat. Ce site a été mis en évidence par des expériences de mutagénèse dirigée et des expériences utilisant des ligands spécifiques (Radic et al., 1991;

Shafferman et al., 1992). Plusieurs hypothèses ont été avancées pour expliquer ce phénomène.

L’inhibition de l’étape de déacétylation a été une des premières hypothèses suggérées

(Krupka et Laidler, 1961). Szegletes et al. (1998) ont postulé que l’inhibition par le substrat

proviendrait d’un encombrement stérique dû à la sortie de produit lorsqu’une autre molécule

est lié au PAS. Chez Drosophila melanogaster, les deux mécanismes sont en cause, l’un à très fortes concentrations en substrat et l’autre aux concentrations en substrat juste au dessus de la concentration optimale en substrat, respectivement (Stojan et al., 2004). En conséquence, il est possible de penser que le PAS pourrait jouer un rôle de régulateur de la concentration en neurotransmetteur présente dans les synapses cholinergiques en ajustant l’activité enzymatique aux fluctuations en ACh, grâce à des phénomènes de coopération entre les deux sites, actif et périphérique.

1.3 Cinétique enzymatique à l’état stationnaire 1.3.1 Théorie de Michaelis-Menten

L’hydrolyse des esters de choline par les Cholinestérases (AChE, BuChE) peut être schématisé selon la figure 6.

2

2

3

3

Figure 6 : Hydrolyse des esters de choline par les cholinestérases

E correspond à l’enzyme libre, EA à l’enzyme acétylée, SE correspond à la fixation du substrat au PAS, k

2

représente la constante bimoléculaire d’acylation et k

3

la constante de déacylation, les coefficients a et b représentent l’effet de l’occupation du PAS par une molécule de substrat sur les vitesses d’acylation et de déacylation, respectivement. K

s

et K’

s

représentent l’affinité du substrat pour le PAS.

L’hydrolyse se déroule en 2 étapes : après la formation du complexe enzyme substrat,

l’enzyme est acylée, suivi de sa déacylation par une molécule d’eau. Le substrat peut se fixer

au site actif et donner le complexe EA qui correspond à l’enzyme acétylée, et au PAS donnant

le complexe SE et engendrer une activation ou une inhibition de l’hydrolyse du substrat au

site actif en fonction de la concentration en substrat (voir paragraphe 1.2.5). Chez les

vertébrés, l’AChE est inhibée par un excès de substrat et la BuChE est activée à faible

concentration en substrat alors que Drosophila melanogaster combine les 2 comportements

suggérant l’existence de 2 sites indépendants d’activation et d’inhibition par le substrat

(Marcel et al., 1998). Chez l’insecte, l’hydrolyse du substrat, suivi par l’augmentation de

l’apparition du produit, suit généralement une courbe en cloche. Cette courbe en cloche est

caractéristique. Chez Drosophila melanogaster l’hydrolyse est suivie dans une gamme de

concentration large allant de 2 µM à 200 mM, la phase d’inhibition par excès de substrat survenant vers 1 mM. La cinétique d’hydrolyse complexe est triphasique et pourrait être expliquée par la présence d’une seule enzyme régulée par la concentration en substrat ou par l’existence de deux formes enzymatiques avec un comportement cinétique différent. Estrada- Mondaca et al. (1998) ont établit que cette cinétique complexe provenait d’une seule et même enzyme grâce à l’expression de l’enzyme in vitro. L’AChE n’est pas une enzyme michaelienne mais la partie intermédiaire de sa courbe d’hydrolyse (succédant la phase d’activation et précédant la phase d’inhibition) peut être décrite et traitée selon le modèle de Michaëlis-Menten. Ce modèle rend compte d’une cinétique hyperbolique ascendante où le substrat est progressivement hydrolysé jusqu’à atteindre un plateau, correspondant à la vitesse maximale d’hydrolyse, Vmax. Deux paramètres enzymatiques essentiels en sont déduits, la Vmax et la constante de Michaëlis-Menten ou Km. Le Km représente l’inverse de l’affinité de l’enzyme pour le substrat. C’est la concentration en substrat donnant une vitesse maximale/2.

L’équation de Michaëlis-Menten (1913) (Equation 1) est fondamentale pour toutes les études cinétiques parce qu’elle rend possible le calcul quantitatif des caractéristiques de l’enzyme. Il faut mentionné que Briggs et Haldane (1925) ont contribué au développement de cette équation en la généralisant (Cornish-Bowden, 2004). Ils ont montré qu’il ne s’établissait pas forcément un équilibre rapide entre les formes libres d’enzyme et de substrat (E et S) et le complexe enzyme-substrat (ES), mais après un certains temps correspondant à l’état pré- stationnaire, c’est la concentration en ES qui demeure constante, cette concentration est à l’état stationnaire. La démonstration de l’équation 1 est présentée ci-dessous.

1. Le taux de formation du complexe ES est :

2. Le taux de rupture du complexe ES est :

3. Lorsque le taux de formation du complexe ES est égal à son taux de rupture, la concentration en ES est constante et le système est à l’état stationnaire :

4. Le réarrangement et la simplification des constantes permettent d’écrire :

et

Soit

Soit

L’équation pour ES peut être résolue :

Après la combinaison des constantes :

5. La vitesse initiale (vo) peut être déterminée à partir de l’équation ci-dessus avec :

Sachant que le Km et la Vmax peuvent être écrits respectivement : ;

L’équation finale de Michaëlis-Menten est de la forme :

Equation 1

Cette équation peut être transformée en d’autres formes plus pratiques pour représenter les

données expérimentales. La transformation la plus connue est issue de la réciproque de

chaque terme de l’équation de Michaëlis-Menten. C’est l’équation de Lineweaver et Burk qui

représente un graphe de 1/v en fonction de 1/s avec à l’intersection de l’axe des ordonnées,

-1/Vm et à l’intersection de l’axe des abscisses, -1/Km. D’autres représentations peuvent être

utilisées comme celle de Hanes, Eadie et Hofstee en fonction du phénomène cinétique à

étudier.