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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Penninckx, M. (1976). L'affinité de l'arginase pour l'ornithine carbamoyltransférase chez Saccharomyces cerevisiae (Unpublished doctoral dissertation).
Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
FACULTE DES SCIENCES
»
SERVICE DE MICROBIOLOGIE
L'Affinité de l'Arginase
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I Ornithine Carbantoylfransférase chez
Saccliaromyces cerevisiae
THESE PRESENTEE POUR l'OBTENTION OU GRADE LEGAL DE DOCTEUR EN SCIENCES CHIMIOUES
PENNINCKX MICHEL
1976
Un potentiel catalytique enzymatique important est à
rechercher dans la stabilisation d'états dipolaires transitoires
par des interactions du type ion-dipole.
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FACULTE DES SCIENCES SERVICE DE MICRDBIOLDGIE
L'Affitiité de l'Arginase
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I OrMithine Carbatnoyltvatisférase chez
Saccharotttyces cerevisiae
THESE PRESEKTEE POUR L'OBTENTION OU GRAOE LEGAL DE DOCTEUR EN SCIENCES CHIMIOUES
PENNINCKX MICHEL
1976
de Microbiologie de la Faculté des Sciences de l'Université Libre de Bruxelles. Il est de nombreuses choses inoubliables et notamment les témoignages de sa confiance.
J'exprime également ma gratidue envers A. Piérard, professeur associé et à A. Watillon, professeur de chimie colloïdale pour leurs conseils adéquats.
Un acte scientifique résulte d'une activité qui, en dernière analyse, procède comme toutes les autres d'une fraternité humaine garante de la survivance et de l'espoir de jours encore plus fertiles. Ces pensées je voudrais les exprimer en bloc et à divers titres à C. Legrain, P. et V.
Stalon, E. Degryse, D. Gigot, J.P. ten Hâve, F. Messenguy, J. Frenkel, J. Deschamps, K. Broman, et enfin et non le moindre à tous ceux que je n'ai pas cités.
Je réserve une ligne spéciale à J.P. Simon qui a
souvent mangé à un pain commun au cours de ces années passées.
Je remercie l'Institut pour l'Encouragement de la
Recherche Scientifique dans l'Agriculture et l'Industrie
(1RS IA) .
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pages
Remerciements
Prologue 1-3
Introduction 4-45
- Introduction générale 4-39
- Introduction spécifique au problème 4o - 45
But du travail 46 - 4y
Matériel et Méthodes 48 - 59
Résultats expérimentaux
Chapitre 1 : Etude de la structure
60 - 122
quaternaire de l'arginase 60 - 91 Chapitre 2 : Le site effecteur de l'arginine 92 - 111 Chapitre 3 : L'affinité de l'arginase pour
l'ornithine carbamoy 1 transférase 112 - 122
Conclusions et Discussion générale 123 - 136
Références 137 - l46
Figures et Légendes l4? - 185
PROLOGUE
Beaucoup admettent actuellement comme évident que les phénomènes vitaux obéissent aux lois physicochimiques et sont assujetis dans tous leurs aspects à des mécanismes de régulation d'une grande finesse.
La physiologie est une discipline qui, dans ses développements actuels les plus profonds, traite de relations intermoléculaires.
La première moitié de ce sièce a vu le développement de cet élément dynamique sous l'impulsion de chercheurs tel Hopkins (1913). Leur thèse principale était que dans l'étude des processus intermédiaires du métabolisme, on n'avait pas affaire à des substances complexes échappant aux méthodes chimiques ordinaires, mais à des molécules simples manipulées par des réactions compréhensibles. Cette idée, incontestée à l'heure actuelle, avait été énoncée pour la première fois par Liebig (l837) pour qui, la chimie organique naissante
allait être un aspect fondamental dans le développement de la biologie.
La découverte de la bios^jnthèse du lien amlde de l'acide
hippurique est un exemple témoin significatif de cette évolution de pensée. Ure avait constaté une augmentation d'excrétion d'acide hippurique chez l'homme après injection d'acide benzoïque. WOhler pensait de son côté que l'acide benzoïque était excrété comme tel mais il revint cependant sur sa position après que Liebig eut fait une claire distinction entre les deux acides (v. Hopkins, 1913)*
L'idée de manipulation chimique d'une substance simple par
l'organisme apparut alors. Elle contredisait évidemment la doctrine vitaliste qui venait de rejeter les conclusions de Wôhler ( 1827 ) sur la synthèse chimique de l'urée.
Wohler et Relier (1842) établirent que l'acide benzoïque ingéré par ün organisme était potentiellement convertible sur grande échelle en acide hippurique.
Bertagnini, administrant de l'acide nitrobenzoïque, observe l'excrétion d'acide nitrohippurique et démontre ainsi que détait la même molécule qui réapparaissait en combinaison.
A la suite d'un travail préliminaire de Kiihne et Hallwachs (l857)»
Bunge et Schmiedeberg ( 1877 ) localisèrent, par la méthode d'exclusion,
le rein comme siège principal de la synthèse chez le chien.
Dès cette époque, ces auteurs pensèrent que le taux d'acide hippurique était contrôlé par un système enzymatique. L'obtention d'un extrait dépourvu de cellules et capable de synthétiser l'acide devait se heurter à de nombreuses déconvenues (Bunge et Schmiedeberg, l877 5 Spiro, 1899 ); Abelous et Ribaut, 19 OO).
En 1947 , Borsook et Dubnoff montrent que la synthèse doit être soumise à couplage énergétique et ils obtiennent celle-ci après adjonction de phosphate ou d'ATP à un extrait de foie.
Chantrenne (1948, 1951) obtient une synthèse non enzymatique à pH neutre et température ambiante et à partir de benzoylphosphate et de glycine. De plus, il a des indications que l'intermédiaire activé physiologiqu serait un composé du coenzyme A. Par la suite, on a établi que la synthèse du lien amide de l'acide hippurique précède l'intermédiaire du benzoyl CoA (Schachter et Taggart, 1954).
Cet exemple montre combien par essence une étude productive de biologie cellulaire nécessite ce que l'on peut appeler par souci systématique une approche globale.
Tout comme auparavant, certains concepts guidant la biologie moléculaire actuelle ont été énoncés sous forme d'hypothèses
révolutionnaire qui ont choqué des tenants d'une méthode de pensée plus spectatrice de la nature que dynamique (Chargaff, 1963 5 Barr,
1962 ).
Au moment de leur publication, des hypothèses comme la structure des acides nucléiques (Watson et Crick, 1953) et des mécanismes d'expression génétique (Monod et Jacob, 1961 ) n'avaient pas toutes les bases substantielles actuellement acquises.(Rosenberg et al., 1973 ; Riggs et al., 1970 a et b). La double hélice, par exemple, est le résultat d'un héritage de connaissances patiemment accumulées pendant des décennies (Chargaff, 1963 5 Davidson, 1957) mais aussi de conceptions hardies utilisant ces mêmes données.
En fait, la modélisation hypothétique est une démarche de pensée
nécessaire pour stimuler les efforts tendant à la compréhension
d'un système : le test substantiel des prédictions du modèle en
découle. Une logique génétique convenablement appliquée peut
aboutir à donner d'un système régulateur un portrait élaboré.
peut susciter de nouvelles indications.
Finalement, la biologie s'occupe de substances chimiques
obéissant à des contraintes atomiques précises. L'oubli de ce principe peut aboutir à une vision cellulaire abstraite partant à faux sur de nombreux points.
La crainte de la réapparition d'une biologie démolécularisée (Chargaff, 1975) est à notre avis plus scolaire que réelle.
Depuis que Lavoisier a fait une corrélation entre la respiration et la combustion, la biologie a acquis une dimension trop concrète pour qu'elle s'en départisse tout en gardant sa crédibilité.
Le travail que nous présentons est une étude de contraintes moléculaires régissant une interaction régulatrice entre deux enzymes.
Il sera précédé d'une introduction traitant globalement des
conséquences régulatrices des interactions entre macromolécules.
INTRODUCTION AUX PHENOMENES DE REGULATION
Un organisme sain maintient son milieu interne dans des limites compatibles avec la vie en dépit de nombreuses réactions chimiques de son métabolisme et d'altérations continuelles de son environnement. Ce concept, l'homéostasie, intialement développé par Claude Bernard lors de la mise en évidence de la
fonction glycogénique du foie (voir C. Bernard, 1878 ), s'applique à toutes les formes de vie et est le fruit de la sensibilité de mécanismes régulateurs spécifiques. Des indices de régulation du métabolisme chez les microbes furent observés à la fin du
19ème siècle. Wortman ( 1882 ) établit une relation entre la présence d'amidon dans une culture et l'apparition d'amylase.
Dienert (1900), étudiant "l'accoutumance" de la levure au
galactose jette les fondements de ce qui allait aboutir soixante années après au modèle de régulation de l'activité des gènes de Jacob et Monod ( 1961 ).
L'activité enzymatique : nature, fonction et régulation
Les premières notions sur l'existence ainsi que sur l'action des enzymes, remontent à une époque fort lointaine. Réaumur et Spalanzani,au l 8 ème siècle, expliquaient la digestion par une activité dissolvante et transformatrice des sucs de l'estomac
(voir par exemple, J. Effront, 1899 ). Kirchoff ( 1816 ) observe que
le gluten frais peut agir dans certaines conditions sur l'amidon,
( 1823 ) démontra que l'activité du gluten était due à la présence d'une faible quantité de substance active provenant des grains de malt cru. Payen et Persoz (l833) précipitent la substance ac.tive de l'infusion de malt par l'alcool et constatent que le précipité
obtenu conserve toutes les propriétés du liquide. Berzelius ( 1838 ) étend le concept de catalyse à l'action de la diastase. L'idée ne put être appréciée à sa juste valeur que lorsque l'on eu défini précisément le phénomène (voir par exemple, Jencks, 1969 )•
L'obtention d'un extrait de levure, dépourvu de cellules et capable de provoquer la fermentation alcoolique (Büchner, l897) permit de metttre fin à la controverse Pasteur-Liebig au sujet des ferments organisés et non organisés (Pasteur, l875)• Cette observation a eu une conséquence fondamentale dans la perception de la participation des enzymes en tant qu'éléments intégrés au métabolisme.
Beaucoup de préparations enzymatiques, peu définines, présentaient les réactions des protéines
Sümner (1926) cristallise l'uréase et démontre sa nature protéique.
Par cette découverte, il montra aussi que l'activité d'un enzyme ne dépendait pas nécessairement de groupements prosthétiques.
L'idée de spécificité enzymatique inscrite uniquement dans un
enchaînement d'amino acides a été sévèrement attaquée par R. Will-
statter (1927). La patiente récolte de données sur la composition
chimique d'enzymes purs a néanmoins donné, par la suite, raison
au point de vue défendu par Sümner. Après qu'un nombre suffisant
d'étapes individuelles du métabolisme furent décrites, il devint
alors clair que certaines réactions sont groupables en séquences
et cycles métaboliques (voir par exemple, Krebs, 1943).
6 .
La caractérisation des enzymes catalysant ces séquences réaction
nelles a jeté les bases pour l'étude des mécanismes régulateurs.
Les enzymologistes avaient mis en évidence l'existence d'actions inhibitrices de molécules parentes des substrats sur l'activité des enzymes (voir par exemple Segal, 1959)• Certains pensaient déjà que les inhibitions par substrats et produits pouvaient être
fonctionnelles pour le contrôle du métabolisme. (Parks et al., 1957 j Crâne et Sols, 1957 ; Purich et Fromm, 1972).
Le phénomène d'inhibition d'un enzyme intégré dans une séquence métabolique, par un produit de celle-ci, mais dont la structure
est éloignée du composé produit par la réaction catalysée par l'enzyme, a été mis en évidence par Dische (19^0). Celui-ci a montré que la phosphorylation du glucose dans l'érythrocyte est spécifiquement inhibée par le phosphoglycérate. Il eut l'intuition que cette inhibition avait une fonction régulatrice. Son travail passa néanmoins inaperçu. En 1956, Umbarger mit en évidence
l'inhibition de l'activité du premier enzyme d'une chaîne bio
synthétique par le métabolite final. L'étude de l'inhibition de la thréonine déaminase par l'isoleucine amena à la formulation du modèle allostérique de régulation de l'activité enzymatique
(Monod et al., 1965 ).
Les enzymes soumis aux phénomènes de régulation d'activité semblent assez généralement être composés de plusieurs chaînes polypeptidiques maintenues entre elles par des liens dont la
stabilité obéit aux critères des interactions non covalentes.
Ce fait a relancé l'intérêt d'anciennes observations sur l'exis
tence de ce niveau de structure dite quaternaire (Klotz et al..
1970 ) chez les protéines.
Structure quaternaire des protéines: La notion.
Avant l'introduction de l'ultracentrifugation, on pensait que les protéines étaient des particules colloïdales polydisperses (voir par exemple H.R. Kruyt, 1951). Svedberg, premier,
grâce à cette technique, établit la paucidispersité des protéines solubles. Ces particules sont, en effet, caractérisables par un poids moléculaire défini. Peu de temps après ses premières études, Svedberg (l93(t) émit l'hypothèse que les poids moléculaires des protéines sont distribués en nombres limitées de classes dont le
plus petit commun dénominateur est un poids moléculaire de 1 ?. 600 . Une écriture isomérique du motif protéique de base (^N-CHR-C(OH)^)
(Wrinch, 1937) permettait des polycondensations aboutissant à des structures planaires fermées polyhexagonales (cyclols) comprenant
2
72 n résidus. L'hypothèse prédisait un nombre limité de classes de poids moléculaires. Son auteur imaginait également des
structures polyédriques provenant de la condensations de cyclols.
Elle pensait ainsi expliquer la nature globulaire des protéines.
Ces hypothèses furent rapidement battues en brèche. L'analyse statistique de la distribution des poids moléculaires des
protéines connues, ne montrait pas de situations préférentielles (Bull, 19(^1 ) • La généralisation ne fut pas non plus acceptée au point de vue théorique. L'examen des forces interatomiques
connues est en contradiction avec une relation entre une stabilité thermodynamique plus importante pour un poids moléculaire privilégie
(Pauling et Niemann, 1939)»
En 19^0, Pedersen découvre que le poids moléculaire du cytochrome C
est d'environ 12.000. Par la suite, Wright (19&2) a encore proposé
que tous les enzymes étaient dérivés d'un des trois précurseurs
protéiques de poids moléculaire 12 . 000 , l 6.000 et 19-000 daltons.
L'examen de nombreuses protéines a nénamoins montré qu'il n'y avait pas de base réelle pour croire qu'il existe un nombre très restreint de types de sous-unités (Reithel, 1963)• Klotz (1975) a compilé des informations sur la composition en sous-unités de
plusieurs centaines de protéines. Cet auteur entend par sous-unité, le polypeptide de poids moléculaire minimum obtenu sans clivage de liens covalents (liens peptidiques et disulfures).
Les poids moléculaires de la majorité des sous-unités identifiées s'étagent de 12.000 à 60.000 daltons. Des cas moins nombreux de sous-unités de 100.000 à 200.000 daltons sont signalés. Par exemple, la dissociation de l'aspartate transcarbamylase de Pseudomonas
fluorescens (P.M. 36 O.OOO) donne naissance à un seul type de polypeptide dont le poids moléculaire est de 180 .OOO daltons.
(Adair et Jones, 1972). La possibilité reste néanmoins ouverte dans quelques cas semblables, que l'on n'ait pas pu obtenir, par les méthodes de dissociation employées, la sous-unité ultime.
Stoechiométrie des sous-unités :
La première étape dans l'étude de la structure quaternaire des protéines est la détermination du nombres de sous-unités.
La méthode de comparaison des poids moléculaires de protéines natives et de ceux obtenus après dissociation par un détergent, a connu une grande fortune ces dernières années. Les causes essen
tielles en sont la siplicité et la sensibilité (Shapiro et al.,
1967 ; Weber et Osborn, 1969 ).
De l'examen des tables de compilation de Klotz, il ressort que la majorité des protéines connues sont des dimères, des tétramères et des bexamères composés de sous-unités de tailles identiques.
Peu de protéines contenant un nombre impair de sous-unités sont renseignées. Quelques cas de trimères, bien établis, ont cependant été mis en évidence ces dernières années. Les ornithine carbamoyl- transférases de foie d_e boeuf (Marshall et Cohen, 1971 ), et
d*Escherichia coli (Legrain et al.,1973 ), 1'hemerythrine (Liberatore et al., 197^) et les carboxylestérases de foie de
mammifères (Junge et al., 197^) appartiennent à cette classe d'oligomères.
Il existe aussi des protéines construites à partir de sous-unités de poids moléculaires différents. La carbamoylphosphate synthétase d*Escherichia coli est, par exemple, composée d^une sous-unité de P.M. 130.000 et d'une de 42.000.
Les protéines virales peuvent être composées d'un nombre très élevé de sous-unités. La protéine du virus de la mosaïque du tabac
(P.M. 40.000. 000 ) est composée de plus de 2.000 sous-unités de 17.500 daltons.
Implications biologiques générales de l'existence d'un niveau de structure quaternaire.
Les mécanismes de biosynthèse des protéines permettent en théorie, d'élaborer une chaîne polypeptidique de grande taille.
On s'attend néanmoins à ce que l'existence d'une structure
quaternaire, construite à l'aide d'un certain nombre de sous-
unités de faible poids moléculaire, puisse minimiser l'effet des
erreurs apparaissant dans les mécanismes d'expression du matériel
génétique. Dans le cas de la transcription, on a estimé que la
ARN polymérase ADN dépendante de E. coli, incorporait des nucléotides non complémentaires avec une fréquence de moins de 1 sur 2000
(Springgate et Loeb, 1975). La traduction du code génétique est normalement aussi un processus très fidèle (Gorini, 1969 et 1970).
Néanmoins, pour une chaîne polypeptidique de très haut poids moléculaire une fréquence d'erreur, même faible, est susceptible d'avoir des répercussions graves. Une incorporation erronée
d'un acide aminé sur 2000 aboutirait à la synthèse d'une population homogène de molécules modifiées, dans le cas d'un polypeptide
composé de ce nombre d'amino acides. Si l'oligomère est à base de 4 sous-unités de 500 acides aminés, la proportion de molécules illégitimes sera réduite. Ces molécules peuvent être éliminées par des mécanismes de dégradation physiologique, spécifiques des protéines anormales.
Schimke et ses collègues (l973) ont montré que, plus le poids moléculaire des sous-unités de protéine du foie de rat est élevé, celles-ci avaient un temps de demi-vie cellulaire faible.
Une explication de ce phénomène serait la présence d'un nombre d'erreurs plus élevé dans la séquence des sous-unités lourdes
(Goldberg et Dice, 1974).
La structure en sous-unité d'une protéine permet également une économie substantielle de matériel génétique si une séquence de celui-ci est utilisée répétitivement (Crick et Watson, 1956).
Dans certains cas, il est possible que l'existence d'une
structure quaternaire très élaborée soit un avantage pour des
raisons purement physiques. L'hémocyanine de crabe a un poids
moléculaire de 940.000 daltons. Ce transporteur d'oxygène, non
coopératif, est dissociable en sous-unités de 76.000 et 83.000
daltons (Carpenter et Van Holde, 1973)* L'hypothèse fut émise que l'existence de cette structure quaternaire est en relation directe avec le problème de l'obtention d'une concentration élevée du transporteur dans son liquide physiologique, tout en ne produisant pas une presssion colloïdo-osmotique trop élevée.
Le problème aurait trouvé sa solution chez les organismes peu évolués par l'agrégation de sous-unités, porteuses de sites de fixations pour l'oxygène, en polymères de tailles respectables.
Chez les organismes ^us évolués, les pigments respiratoires se sont concentrés dans des cellules spécialisées (Baglioni, 1964).
Les modes d'arrangements spatiaux des sous-unités sont fonction directe de leur nombre. Cette évidence est en toute probabilité, à la base de nombreuses caractéristiques fonctionnelles.
L'association de sous-unités ne conduit pas nécessairement à une structure rigide. Haurowitz (1936) avait déjà signalé que les formes cristallines des déoxy- et oxydémoglobines n'étaient pas identiques. De nombreuses études réalisées sur les enzymes allostériques, ont montré que ces protéines voyaient leurs activités modifiées par des changements de conformation, sans que leur taille ne subisse nécessairement une altération.
Ce type de régulation appartient à la classe des interactions entre protéines, si l'on considère chaque chaîne polypeptidique comme entité mécanistique. Elle a fait l'objet de très nombreuses revues (voir par exemple Frieden, 1971)*
Nous traiterons ici de deux aspects de la corrélation structure
quaternaire et fonction physiologique. Le premier est celui des
complexes multienzymatiques dont l'association des constituants
résiste aux opérations traditionnelles de purification. Le
deuxième aspect inclura les associations énergétiquement moins
11 .
favorables et celles soumises à régulation. L'avantage de cette classification réside essentiellement dans son sens pratique.
Corrélation structure quaternaire et fonction
Préliminaires :
L'extraction d'une activité enzymatique hors de son milieu naturel, et les manipulations destinées à l'obtention d'une espèce homogène, sont susceptibles d'être accompagnées de changements important au niveau de l'interaction entre sous-unités.
association entre chaînes polypeptidiques peut être rompue par simple dilution du contenu cellulaire très concentré, si
l'affinité entre chaînes est relativement faible (principe de Le Chatelier). D'autre part, une association contrôlée par des
effecteurs physiologiques disparaît,si la dilution de ceux-ci est trop importante.
Un transfert du contenu cellulaire dans un milieu tamponné iji vitro peut également perturber gravement une association. Certaines observations sur la voie du P-cétoadipate chez Pseudomonas putida, suggéraient la compartimentation physique du P-carboxymuconate, intermédiaire, dans un complexe multienzymatique, non détectable lors d'une purification. Ce complexe a néanmoins été montré, in vitro, à condition que l'extrait acellulaire n'ait subi aucun traitement salin (Meagher ^et al., 1972 ).
La conclusion à ce paragraphe est qu'un examen de l'évolution de paramètres enzymatiques, à concentration physiologique des protéines, et dans des circonstances de milieu favorables, peut être la base de la découverte de propriété insoupçonnée
(Béchet et Wiame, 1965 ; Serrano et Gancedo, 1973).
Complexes multienzyraatiques stables
Généralités :
Beaucoup d'associations décrites ont été rencontrées
accidentellement en cours d'opérations de purification (Reed et
Cox, 1970 ).
En fait, on s'attend à ce que dans une cellule, il n'y ait pas de vraie indépendance des éléments d'un même compartiment.
Le cytosol est une solution dont la concentration en protéines est de l'ordre de 1 mM pour la plupart des êtres vivants. Dans une cellule musculaire, la distance moyenne entre deux chaînes
O
polypeptidiques est d*environ 17 A , c'est-à-dire à peu près sept couches monomoléculaires d ' (Sols et Marco, 1970 ;
Srere, 1967 )« Il n'est donc pas irraisonable de penser que la plupart des macromolécules d*une cellule ont une sorte d'organisation. Dixon (19^9) faisait remarquer que le proto
plasme, avec son réseau de réactions métaboliques, forme réellement un complexe multienzymatique.
Il faut néanmoins insister sur le fait que le sens du mot
organisation est à comprendre dans un qontexte plus diffusionnel que d'assemblages par création de liens chimiques. Une rencontre entre macromolécules est en moyenne possible tous les 30 nano
secondes, compte tenu de l'énergie d'agitation thermique et de
la viscosité cellulaire (Hess et Boiteux, 1972). De bonnes
raisons existent cependant pour penser que la plupart des chocs
sont improductifs ou impossibles. A la force ionique cellulaire
élevée, de nombreuses répulsions électrostatiques à rayon d'action
appréciable, sont encore susceptibles d'exister. L'absence de
surfaces exactement stéréocomplémentaires entre macromolécules est également un facteur enthalpiquement t rès défavorable pour une association dans le milieu cellulaire solvaté (voir page 36 Pollard ( 1963 ) avait conclu, par l'application de lois élémen
taires de la théorie des collisions, qu'une cellule aux
dimensions supérieures au micron devrait avoir un ordre submicro
scopique, pour que les éléments réactifs à basse concentration, soient suffisamment proches pour permettre le déroulement des processus métaboliques aux vitesses observées. Une concentration suffisamment élevée d'enzymes annule cependant le besoin
d'organisation physique dans ce type de cellule.
Hess et Boiteux (1972) ont calculé que la concentration cellulaire chez la levure, des monomères d'enzymes de la glycolyse est de 1,3 niM. La distance moyenne entre ces molécules est de l'ordre
O
de 40 - 50 A. Le temps de transfert d'un produit d'un enzyme au centre actif de l'enzyme suivant, dans une séquence métabolique, est de l'ordre de la microseconde. Ce temps de transit est suffisamment court pour être négligeable dans un système composé d'enzymes ayant un nombre de rotation moléculaire de l'ordre de 100 par seconde. Ceci est le cas pour les enzymes de la glycolyse, en fait, suffisamment concentrés pour exclure tous problèmes de transport par diffusion.
Des études par ultracentrifugation, réalisées à concentration physiologique des protéines, sont en faveur de l'absence de
I
complexes multienzymatiques dans ce cas (De Duve, 1970). La raison
de l'existence de complexes multienzymatiques reste, néanmoins,
probablement surtout liée à des problèmes de diffusion.
Nous illustrerons deux avantages liés à l'existence de complexes stables entre protéines.
1 ° Augmentation de la concentration effective des substrats par effet de proximité :
Une association d'enzymes est précieuse pour surmonter les problèmes de diffusion. La limitation à un microenvironnement
de molécules d'intermédiaires à faible concentration, est un mécanisme efficace qui diminue l'espace de diffusion des espèces
au cours d'une séquence réactionnelle : la proximité des enzymes réduit le temps de transit (Dixon, 19^9)•
La synthèse des acides gras, chez la levure, est un processus en plusieurs étapes catalysées par au moins six activités
enzymatiques. La réaction globale est représentée par l'équation générale suivante :
acetylCoA + n malonylCoA + 2 n NADPH + 2 n
CH„(CH CH ) CO-CoA + n CO + 2 n NADP'*' + n H„0
3 2 2 n 2 2
Lynen ( 1961 ) montre que cet ensemble de réactions est catalysé par un enzyme dont le poids moléculaire est de 2 . 3 OO.OOO.
Les tentatives de mise en évidence d'intermédiaires étaient sans succès. En fait, la transformation d'un malonyl CoA passe par des intermédiaires liés d'une manière covalente à des groupes thiols. Une micrographie électronique de la protéine montre des
O
partias ovales de 210 - 250 A de diamètre. La synthétase est apparemment composée de trois sous-complexes de 700.000 daltons
(Lynen, 1967 )• Le sous-complexe pourrait être équivalent à
l'enzyme de foie de rat qui a un poids moléculaire de 5 ^ 0.000 (Burton et al., 1968 ). La synthétase de levure est dissociable en sous-unités de 200.000-250.000 daltons. Après dissociation, l'activité de l'enzyme de condensation et les deux activités réductases disparaissent. Les activités des autres enzymes du complexe sont sauvegardées. On peut réassocier les sous-unités avec regain des activités (Sumper et al., 1969 ).
Un autre cas de complexe multienzymatique est celui de la pyruvate déshydrogénase, composé de trois enzymes qui gardent
leurs activités une fois séparés.
Un exemple très intéressant d'enzyme mono fonctionnel, catalysant une réaction unique du métabolisme et ayant les caractéristiques de complexe multienzymatique, est œlui de
la transcarboxylase (méthylmalonylCoA pyruvate carboxytransferase) de Propionibacterium shermanii (Wood et al., 1975)*
L'enzyme est réversiblement dissociable. Trois sous-unités
périphériques (6 SP) sont attachées à une face d'un cylindroïde central (12 SC). Les modes de dissociation de l'enzyme et la stoechioraétrie des sous-unités sont indiqués ci-dessous.
Les coefficients de sédimentation sont donnés avec les indications et ^ désignant respectivement les sous-unités centrales et
périphériques.
18 S-Transcarboxylase PM 790.000
PO^ (pH 6 . 5 ) _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _9k T---
pH 8
1 sous-unité 12 SC PM 360.000
ET
3 sous-unités 6 SP
PM 144.000
3 sous-unités 6 SP
pH 9 6 sous-
3 sous-unités 5 SP PM 120.000
SDS unités 2,5 SP
sous-unités 12 SC ______ 3 sous-unités 6 SC pH 9 PM 120.000
6 sous-unités 2,5 SC
L'enzyme catalyse deux réactions partielles auxquelles participent les diverses sous-unités.
2“ Effet de régulation produit par une association avec une chaîne polypeptidique non enzymatique :
Ce cas est classiquement exemplifié par l'aspartate
transcarbamylase d'E. coli (PM 307-000). Gerhardt et Pardee ( 1962 ) ont montré la présence de sous-unités catalytiques
et régulatrices distinctes. Cet enzyme est composé de six chaînes polypeptidiques catalytiques et de six chaînes régulatrices. Les
sous-unités catalytiques sont arrangées sous forme de deux trimères
cycliques (PM IO 3 .OOO) espacés par trois dimères (33-700) régula
teurs (Rosenbusch et Weber, 1971 ).
CH^CH(C00")C0SCoA + 1,3 SP v 1,3 SP - biotine-cf° i->
+ CH CH COSCoA 3 2
OOCCH COCOO
2
L'activité catalytique de l'enzyme est inhibée par le
nucléotide CTP, produit final de la séquence métabolique dont la transcarbamylase est le premier catalyseur. Les molécules de CTP se lient aux sous-unités régulatrices.
La ribulose"l“5-diphosphate carboxylase de feuilles d'épinards est composée de deux types de sous-unités A et B, avec une
formule de composition
a8
b8 . A 8 , obtenu artificiellement, retient l'activité catalytique tout en perdant les propriétés allostériques de l'enzyme natif. Ces propriétés dépendraient d'une conformation particulière requérant la présence des petites sous-unités B (Nishimura et Akazawa, 1973)*
D'autres avantages physiologiques que péuvent avoir les complexes multienzymatiques stables ont été passés en revue (voir par exemple Srere et Mosbach, 197^)•
Le maintien d'un intermédiaire dans un environnement
limité minimise la compétition éventuelle avec d'autres séquences métaboliques.
Un environnement spécifique peut être créé par un complexe pour favoriser un type de réaction particulier ou stabiliser un intermédiaire labile (Coleman, 1973)*
Interactions entre chaînes polypeptidiques s'accompagnant d'un changement de structure quaternaire : énergies d'association faibles, régulation par polypeptides indépendants :
Nous soulignerons les effets régulateurs de ces types
d'association en examinant deux classes de phénomènes.
1° Enzymes en auto-association :
De très nombreuses protéines sont soumises à ce type de phénomène (Klotz et al., 1970). Dans quelques cas, il semble y avoir une signification physiologique.
Les Cori (19^5) ont découvert que la phosphorylase du
glycogène existait sous deux formes interconvertibles (a^ et . L'interconversion est commandée par une phosphatase et une kinase
(Krebs et Fischer, 1956). La forme dimère de 200.000 daltons, est essentiellement inactive en absence d'AMP. La phosphorylase a^ est un tétramère de 400.000 daltons actif en absence de
l'effecteur (voir revue de Fischer et al., 1971)
b Q
La thréonine deshydratase biodégradative d'^. coli est soumise à une inactivation catabolique par le pyruvate.
L'enzyme est dissocié en sous-unités de 65.000 daltons par le pyruvate qui s'y lie d'une manière covalente.
La fonction physiologique de ce processus serait liée à l'inutilité de l'enzyme lorsque le glucose est utilisé préférentiellement comme source énergétique en anaérobiose
(Feldman et Datta, 1975).
L'isopropylmalate synthase de Salmonella, premier enzyme
de la biosynthèse de la leucine, et soumise à une rétroinhibition
par cet amino-acide. Les données expérimentales de sédimentation
sont réconciliables avec une situation de coexistence d ' équi 1 ibre
d'isomérisation, polymérisation et dissociation à partir d'un
monomère de 50.000 daltons.
Substrats ---►
AA
A AA
Leucine t
\ U Leucine
B
< --- Leucine
BB BB
(Leary et Kohlhaw, 1972).
La N-acétyl- glutamate 5-phosphotransferase de Pseudomonas aeruginosa, deuxième enzyme de la biosynthèse de l'arginine, est rétroinhibée par l'arginine. L'enzyme, composé de sous-unités de 29.000 daltons, a un poids moléculaire de 230.000 daltons en absence d'effecteurs et en présence d'acétyl-glutamate.
En présence de l'effecteur arginine, et de MgATP, des formes de plus bas poids moléculaire (minimum 65.000) sont détectées
(Haas et Leisinger, 1975).
La glutamate déshydrogénase de boeuf, enzyme mitochondrial, a comme structure de base un hexamère, construit par l'empilement en étoile de deux trimères cycliques (Josephs, 1971), composés de
sous-unités de 53.500 daltons (Eisenberg et Tomkins, 1968 ). Cette structure peut former un polymère linéaire contenant environ dix molécules d'enzymes (Josephs, 1972). Les polymères eux-mêmes s'associent en superstructures hélicoïdales (Josephs et Borisy, 1972 ). L'association obéit à une loi d'équilibre ouvert simple.
Mi + Mh ^ Mi + h, i et h ^ 1 (MS hexamère) dont les étapes sont caractérisées par une constante d'équilibre unique
La stabilité de l'association est d'origine entropique aux
basses températures et dépend d'un changement favorable
d'enthalpie dans la zone de température physiologique.
été mise en évidence (Markau et al., 1971 ).
Les propriétés cinétiques de l'enzyme diffèrent suivant son état de polymérisation. Le phénomène d'agrégation est
probablement important au niveau physiologique car la concen
tration de l'enzyme dans certains tissus peut être élevée ( 10“^M) .
L'état de polymérisation est contrôlable par de nombreux effecteurs. NADH, GTP et ATP diminuent la tendance à la
polymérisation tandis que l'ADP l'augmente. Des sites effecteurs spécifiques existent sur les sous-unités de l'enzyme.
NADH GTP ATP
I ---
(Hexamère) hexamère X hexamère Y
ADP
L'hexamère X catalyse l'oxydation de l'acide glutamique tandis que l'hexamère Y a une activité supplémentaire vis-à-vis de l'alanine. Le rôle physiologique précis de l'enzyme dans les tissus animaux n'est néanmoins pas encore précisé (Goldin et Frieden, 1971 » McGivan et Chappell, 1975)*
En guise de conclusion, une remarque d'intérêt général est utile à faire pour le cas des enzymes en auto-association ;
Les cas d'association-dissociation avec changements d'activités sont souvent détectés, in vitro, à concentration d'enzyme faible par rapport à la concentration cellulaire. Un affaiblissement, même minime, de l'énergie libre d'interaction entre chaînes poly
peptidiques sous contrôle d'un effecteur, est susceptible de se
traduire par une dépolymérisation non physiologique, explicable
par le principe de Le Chatelier. La situation d'équilibre
artificiel, ainsi atteinte, peut mener à des conclusions erronées sur la signification physiologique de l'action d'un intermédiaire métabolique. La réalité physiologique d'un changement de
structure quaternaire de la phosphorylase du glycogène a été , par exemple, récemment mise en doute (Fischer et al^., 1971) •
2“ Associations entre protéines différentes :
Quelques cas typiques seront examinés. Les lecteurs
intéressés par d'autres exemples récents pourront se référer à la petite revue suivante :
a) Inhibiteurs d'enzymes
- Interaction réversible des sous-unités de la protéine kinase I d'érythrocyte (Tao, 1971)
- Inhibiteur de la chymotrypsine de pommes de terre (Melville et Ryan, 1972)
- Inhibiteur de la tyrosinase de champignons (Mahosing et Sundberg, 197^)
- Inhibiteur de la catalase de maïs (Sorensen et Scandalus, 1975) - Inhibiteur de la carboxypeptidase de pommes de terre (Ryan et al., 1974)
Streptokinase - Plasminogène (Summaria et al., 1974) - Inhibiteur de la protéine kinase du rat en croissance (Skala et al., 1974)
- Inhibiteur de la RNA polymérase d'E. coli infecté par le phage T7 (Hesselbach et al., 1974)
- inhibiteur de la phosphorylase phosphatase de foie de lapin (Brandt et al., 1975)
- Inhibiteur de la phospholipase A de Bacillus sübtilis (Krag et
b) Récepteurs protéiques membranaires
- Toxine du naja - récepteur cholinergique (Gordon et al., 1974) - Le récepteur du facteur de croissance nerveux (Banerjee et -al., 1975)
- L'égasine, protéine membranaire réceptrice de la P-glucoronidase microsomale (Tamini et Paigen, 1975)
c) Divers
- L'interaction du composant acide et basique de la toxine du cobra (Hendon et Fraenkel, Conrat, 197l)
- Neurophysine - Oxytocine (Alazaric, 1974)
- Interaction de la troponine, tropomyosine et actine (Potter et Gergely, 1974 - Eisenberg et Kiellery, 1974)
Les inhibiteurs de protéases :
Historique ; Les inhibiteurs naturels :
En 1903» Weinland découvre que des extraits du parasite intestinal Ascaris sont antipeptiques et antitrypsiques.
Mendel et Blood (1910) observent l'absence d'inhibition de la papaïne par de tels extraits. Collier (l94l) montre que l'inhibiteur a les propriétés d'un polypeptide et qu'il agit instantanément en milieu neutre et acide. Northrop (1925) indique que la loi d'action de masse est applicable é l'inter
action entre la pepsine et l'inhibiteur d'Ascaris.
Le vers est digéré vivant par des solutions diluées de papaïne
et de flclne (Robbins et Lamson, 1934), ce que ne font ni la
trypsine ni la pepsine. La fonction physiologique de l'inhibiteur
apparaît être liée aux mécanismes de survivance du parasite dans
l'intestin (Harned et Nash, 1932). Par la suite, Kunitz et Northrop (1936) cristallisent une protéine pancréatique inhibant
la trypsine. Herriot il9kl) cristallise l'inhibiteur de la pepsine et Bowman (1944) découvre l'inhibiteur du soja.
Le système de contrôle des protéases par les inhibiteurs polypep
tidiques font de nos jour l'objet d'*études détaillées (voir par exemple Laskowski et Sealock, 1971) tant pour leur importance physiologique que comme modèles d'interactions entre polypeptides.
Inhibiteurs de la trypsine :
La trypsine joue un rôle central dans l'activation de nombreux zymogènes pancréatiques. Les cellules acinaires du pancréas synthétisent deux sortes d'inhibiteurs qui fonctionnent comme dispositifs de sécurité contre toute activation accidentelle du trypsinogène. Celui-ci est normalement activé par 1'entérokinase duodénale, insensible aux inhibiteurs de la trypsine (Greene et al., 1966 ; Maroux et al., 1971)* Le premier inhibiteur (Kunitz) reste dans les cellules pancréatiques tandis que le second (Kazal) est secrété avec le jus pancréatique où sa masse est capable d'inhiber
1 % de la trypsine potentielle.
L'inhibiteur de Kunitz :
Green et Work (1953) qui furent les premiers à étudier quantitativement l'interaction, observèrent que la constante de dissociation du complexe trypsine-inhibiteur était inférieure à 10 Actuellement chacun des partenaires est bien caractérisé.
On connaît leur structure covalente, tridimensionnelle et un
travail considérable a été consacré à l'étude de leur centre actif.
(Neurath et al., 1970).
L'association est quasi irréversible. La constante de
"* l4 dissociation du complexe uni-uni moléculaire est de 6 x 10 M
(pH 8 et 23”C). Cette grandeur est comparable A celle du complexe _ 13
opérateur-répresseur Lac chez E. coli, qui est de 10 M dans des conditions semblables (Riggs et al., 1970).
La constante de vitesse d'association kl est de 1,1 x 10 M 6 -1 -1 -8 -1
sec et celle de dissociation, k 2 de 6,6 x 10 sec (temps de demi-vie 17 semaines) (Vincent et Lazdunski, 1972).
La stabilité du complexe est d'origine entropique.
L'analyse intime de celui-ci par radio cristallographie a mis en évidence l'existence d'un lien ester entre la sérine active de la trypsine et l'atome de carbone d'une fonction carbonyle de
1 'inhibiteur.
L'examen aux rayons X n'a pas confirmé l'hypothèse de l'existence de ponts disulfures entre le* deux protéines.
Le lien covalent ester n'a qu'une influence minime sur la stabilité du complexe, qui semble gouvernée par sept liens hydrogène et environ 200 contacts Van der Vaals et hydrophobes potentiels (Blow et al., 1972 | Rühmann et al., 1973 I Vincent et
al,, 197<k).
(Schwartz et al., 1973)>
La constante de dissociation du complexe avec la trypsine est de 3 X lO"^^ M (pH 8 et 25®C) t kl vaut 6,8 x 10^ M’^aec"^ et kS
mL .1
2,2x X 10 sec . L'explication de la stabilité plus faible de
ce complexe, comparée à celui formé par l'inhibiteur de Kunite est
donc liée à la constante de vitesse de dissociation. L'association
légèrement exothermique (èH* > -1,4 keal mole~^), est surtout
gouvernée par un changement d'entropie favorable (AS° = + 4,36 u.e.).
Les donnée cinétiques sont similaires à celles obtenues pour
d'autres systèmes comme, par exemple, l'interaction entre l'insuline et son récepteur (Cuatrecasas, 1972 ).
Les inhibiteurs de protéases de levures :
Dernby (1917) fut le premier à détecter l'existence d'une
activité protéolytique dans un autolysat de levure. Depuis lors, un nombre important de travaux ont été consacrés à ce sujet (voir par exemple Matsubara et Feder, 1971).
Lenney et Dalbec (1969) démontrent clairement l'existence d'un inhibiteur de protéases de levure.
A ce jour, deux systèmes de régulation où interviennent
protéas»ea et inhibiteurs spécifiques ont été bien caractérisés chez la levure.
1° Le système chitine synthétase de S. cerevisiae (Cabib et al.1974)
La chitine est le composé spécifique du septum qui se forme entre une cellule mère et une cellule fille. Des expériences en croissance synchrone ont montré que la formation de la chitine n'est possible que pendant une portion limitée du cycle cellulaire. La
chitine synthétase existe sous forme de zymogène, activable par un facteur protéolytique (Cabib et Ulane, 1973)» contenu dans des
vésicules se concentrant au lieu de formation du bourgeon.
Un polypeptide cytoplasmique (PM 8.500) a la propriété d'inhiber
la protéase activatrice de la prochitine synthétase (Ulane et Cabib,
1971). Son rôle serait d'empêcher une activation à tout autre site, au
cas où des molécules de protéases seraient déversées accidentellement
dans le cytoplasme (Cabib et Farkas, l97l)«
2° Le système d'inactivation de la tryptophane synthase de S. cerevisiae :
Manney a découvert en 1968 que la tryptophane synthase de levure est rapidement inactivée dans certaines conditions de croissance.
Holzer et ses collaborateurs (Katsunuma et al., 1972) ont purifié
deux protéases inactivant l'enzyme (inactivase I et II) Des protéines inhibitrices des facteurs d'inactivation ont été également purifiées.
Protéases et Inhibiteurs apparaissent en fin de croissance exponen
tielle (Holzer et al., 1972 ; Hasllik et Holzer, 1973)*
Les facteurs d'inactivation seraient impliqués dans un mécanisme général de recyclage des amlno acides, provenant de la dégradation d'enzymes anabollques, devenus inutiles en fin de croissance.
La localisation vacuolaire des protéases et cytoplasmiques des inhibiteurs implique une opération de transfert entre compartiments cellulaires dans les conditions physiologiques où la régulation est opératives (Matern et al., 1974).
Modification de spécificités enzymatiques par interactions protéine-protéine
1* Le système lactose synthase de la glande mammaire (Brew, 1970) :
Cet enzyme catalyse l'étape ultime de la biosynthèse du lactose UDP-»GalfD-Glucose--- Lactose + UDP. L'enzyme apparaissait labile è la plupart des procédés de purification (Babad et Haasld, 1966) jusqu'à ce que Brodbeck et Ebner ( 1966 ) découvrent qu'une fraction partiellement purifiée, contenant l'enzyme, pouvait être résolue en deux composants de nature protéique par filtration su gel» Ceux-ci,
(A et B) étalent, pensait-on, les sous-unités de l'enzyme, actif
B fut identifié à 1 'a-lactalbumine, protéine nfajeure du lait, dépourvue d'activité enzymatique, mais parente d'un enzyme
bactériolytique, le lyzozyme. La protéine A possède une activité intrinsèque de N-acétyllactosamine synthétase, impliquée dans la biosynthèse des glycoprotéines de tissus de mammifère.
L'intégration physiologique du système lactose synthase est due à Hill et son école (Turkington et al., 1968 ; Turkington et Hill, 1969)*
Au moment de la lactation, le niveau d'a-lactalbumine augmente considérablement et permet une synthèse accrue de sucre de lait, tout en provoquant une extinction de l'activité NAL-synthétase.
La progestérone, dont le taux plasmatique diminue au moment de la parturition, est impliquée spécifiquement dans la régulation de la production d'a-lactalbumine. Cette protéine, synthétisée au niveau des ribosomes attachés au réticulum endoplasmique, serait exportée vers la zone de Golgi, riche en protéine A. Le sucre synthétisé, et les protéines spécifiques, sont ensuite secrétés hors des cellules grâce à un dispositif vacuolaire. L'énergétique d'interaction entre les protéines A et B a été étudiée. Il apparaît néanmoins que cette énergie est faible ( 7 kcal/mole ; Kd s 10 ^M)
2® Le complexe Transarainase-Glutamate deshydrogénase mitochondriales (Fabien et Smith, 197^)»
La forme hexamère de la glutamate déshydrogénase (a-cétoglutarate + NH^ + NADPH --- glutamate + NADP) se lie à la glutamate oxalo- acétate transaminase (glutamate + oxaloacétate --- aspartate + a-cétoglutarate).
Les expériences de cinétique enzymatique et de filtration sur gel montrent que la constante de dissociation du cor»plexe enzyme-enzyme
est beaucoup plus faible que celles des substrats pour les enzymes libr
Ce système serait capable de catalyser une déshydrogénation efficace de l'aspartate dans des organes comme le cerveau, le foie et le rein, où le niveau mitochondrial de ces enzymes est suffisamment élevé pour
former le complexe.
Un avantage de la catalyse par le complexe, vis-à-vis de la transami
nation avec l'aspartate, suivie d'une déshydrogénation du glutamate, est l'absence d'inhibition de l'activité du complexe par de faibles doses d'oxaloacétate, inhibiteur puissant de la transaminase libre.
Aspects énergétiques de l'interaction entre chaînes polypeptidiques
L'étude de la nature et de l'intensité des forces mises en jeu dans ces processus est foncièrement indissociable de la discipline physiologique qui tente de comprendre le fonctionnement d'organismes vivants, modelées en fait à partir d'atomes usuels.
Implication de la fonction entropique dans les associations entre macromolécules
L'association de deux molécules s'accompagne d'une perte d'entropie de translation et de rotation. De nombreux processus biologiques d'associations spontanées sont néanmoins endothermiques :
l'état structuré du système est favorisé par un accroissement de
température (Lauffer, 1975). L'évolution de tels systèmes vers
l'énergie libre minimale ne peut paradoxalement donc qu'être
d'origine entropique. L'accroissement de cette fonction doit
provenir d'une source dont la mise en activité est coïncidente
de l'association
Les chimistes des colloïdes connaissaient depuis longtemps des phénomènes similaires.
En 1924, Szegvari observe sur une suspension de nitrocellulose, une transition réversible sol-gel par augmentation de température.
Heyman (1935) rapporte un phénomène semblable pour une suspension colloïdale aqueuse de méthylcellulose. Cet auteur note également une augmentation de volume lors de gélation.
Freundlich (1937) explique ces observations par une libération d'eau liée aux particules colloïdales, lors de la création des gels struc
turés : l'accroissement d'entropie en découlant. Cette théorie fut
vérifiée par Stevens et Lauffer ( 1965 ) qui parvinrent même à peser directement l'eau libérée par la polymérisation endothermique de la protéine du virus de la mosaïque du tabac.
Exemples de processus endothermiques et d'origine entropique en biologie :
1® Polymérisation des sous-unités de protéines
- La protéine du virus de la mosaïque du tabac est réversiblement dissociable. La sous-unité de base, impliquée dans la polymérisation, est un trimère cyclique composé de monomères de 17.500 daltons.
La polymérisation linéaire jusqu'à un poids moléculaire de 6.000.000 de daltons est caractérisée par un AH® = + 187 kcal/mole et AS® = 708 u.e. Pour la formation d'un double disque hexamère, AH® = 30 kcal/mole et AS? = + 124 u.e. (Banjee et Lauffer, 1966 ; Smith et
Lauffer, 1967 ).
- Le monomère de la phycocyanine de l'algue bleue Plectonema calo-
thricoïdes a un poids moléculaire de 30.000 daltons. Il existe en
équilibre avec des formes trimériques, hexamériques et dodécamériques.
La transition entre la forme trimérique et la forme hexamérique est caractérisée par AH° a + 24 kcal/mole et AS° a + 100 u.e.
L'hexamère serait probablement la forme physiologique de cet
important photopigment qui peut représenter 40 % du poids des protéines cellulaires (Scott et Berns, 1965).
- Le flagelle de Salmonella est de nature protéique . La flagelline, sous-unité de 40.000 daltons, est repolymérisable en flagelle avec une enthalpie Van t' Hoff de 4 40 kcal/mole. La réaction est donc d'origine entropique (Gerber et al., 1973)*
2° Interactions avec une protéine régulatrice
Le tableau suivant illustre quelques cas
Complexe AH°association Kcal/mole
AS“associâtion u.e.
Constante de disso
ciation nM
Conditions
trypsine-inhib.
de Kazal I « 0,2
(Schweitz et al.,1973) - 1>4 + 43,6 0.03 pH 8 actine-myosine
(Szent-Gyorgi, 1948) + 57 + 207 (*)
opérateur-répresseur Lac
(Riggs et al., 1970) + 8,5 + 90
1
O I » 0,05 pH 7,4
rieurotoxine de Naja- récepteur cholinergique
(Fulpius et al., 1972) + 9,7
1
+ 74 pH 7,4
Il s'agit de l'étude in vitro de la superprécipitation du complexe
myoslne-actine F sous contrôle de l'ATP. Szent-Gyorgi (1948) a
démontré que le processus était thermodynamiquement réversible.
Les résultats sont éventuellement extrapolables in vivo, si l'on considère d'anciennes données de Brown (193^) sur la relation pression-tension-température dans le muscle cardiaque.
N.B. Actuellement, on ne connaît quasi pas d'exemple d'associations d'origine enthalpique. La formation du complexe entre l'insuline et son récepteur membranaire protéique en est un cas AH® ■ -28 kcal/
mole AS® ■ - 45 u.e. Ce qui permet une constante de dissociation de 0,1 nM à pH et 37 “ C (Cuatrecasas 1974).
Nature des forces impliquées dans les associations endothermiques
Introduction
La surface d'une protéine en solution aqueuse est composée d'un ensemble de groupes polaires, susceptibles de former des liens
hydrogènes avec l'eau ou d'être ionisés, et de résidüs non polaires.
L'énergie libre d'interaction avec le solvant est la somme des énergies d'interactions individuelles. L'établissement de contacts entre sous- unités est essentiellement un transfert de résidus d'une phase polaire vers une phase organique (Lauffer, 1975). La tendance à la polymé
risation dépendra des valeurs relatives des énergies d'interaction des résidus avec la phase polaire et organique. Par l'intermédiaire du facteur entropique de l'expression de l'énergie libre, la tempéra
ture influencera l'état d'agrégation des systèmes.
Une polymérisation endothermique doit être conditionnée par un type
de force dont l'intensité est plus grande à température ambiante
qu'à 0®C
L'étude des propriétés de petites molécules d'hydrocarbures par Kauzman (I959)j stimulé par les travaux classiques de Frank et Evans
( 19 ^ 5)1 permis d'éclaircir considérablement cette question.
Les forces hydrophobes :
Le transfert spontané du méthane d'une solution aqueuse vers une phase organique est endothermique. La force dominant le processus est un large accroissement d'entropie due à une libération de molécules d'eau arrangées en structure rigide autour des molécules d'hydro
carbures .
Par extension, on peut penser qu'un résidu protéique non polaire subira un sort similaire lors de son transfert dans une aire de contact entre sous-unités. Le mode d'association des protéines, dû à Kauzmann, visualise les aires d'association comme des paquets de résidus agglomérés à la manière des chaînes hydrocarbonées des
micelles lipidiques (l959)-
Cette situation, couramment référée comme résultat en une "liaison hydrophobe" pourrait n'être, selon la théorie de Klotz (1958 ; I960) qu'un compromis thermodynamique., La structuration de l'eau, accom
pagnée de la création de nouveaux liens hydrogènes, autour de chaines de solutés non polaires se comprend comme l'évolution la plus logique
du système vers son énergie libre minimum 5 ceci compte tenu de
l'absence de forces significatives entre les molécules de solutés et
le solvant. Ce processus exothermique, est néanmoins endergonique
en bilan à cause du facteur entropique défavorable. La situation la
plus favorable pour les chaînes non polaires est une association de
celles-ci sans qu'il y ait nécessairement d'interactions de dispersion
entre elles. Le bilan thermodynamique sera inverse de la situation
précédente et donc entropiquement favorable.
En d'autres termes, pour une association entre protéines, l'entropie gagnée par l'eau, due à ce que la surface accessible au solvant est plus faible lors de la formation du complexe, est suffisante pour surmonter la perte des degrés de libertés des molécules formant le complexe.
Bien qu'étant aussi axé principalement sur les effets sur la structure de l'eau, le modèle de Scheraga ( 1963 ) assigne une certaine importance aux interactions de dispersion potentielles solutés-solutés et
solvant-solutés.
La création d'un pont salin est un autre type de force entièrement conditionnée par un changement favorable d'entropie, liée à la levée de l'électrostriction de l'eau autour des charges.
Schellman (1953) a fait néanmoins remarquer que la situation des groupes protéiques chargés dans des cavités moins polaires que l'eau, avait comme conséquence de rendre le paramètre enthalpique négatif et diminuer le paramètre entropique.
Rappelons qu'une libération d'eau a pu être montrée dans le cas de la polymérisation endothermique du virus de la mosaïque du tabac.
Par extension, on peut raisonnablement estimer que la déshydratation est la source majeure d'entropie dans les processus équivalents.
Les structures en "icebergs" statiques n'ont pas encore été clairement montrées par l'analyse aux R.X. de l'eau liée aux cristaux de protéines
(Liljas et Rossman, 1974).
L'examen des aires de liaison connues entre chaînes polypeptidiques
est en accord avec l'idée d'une primauté des interactions entre
chaînes non polaires dans le conditionnement des associations entre
protéines. Le tableau suivant^ la remarque qui le suit, résument
quelques faits concernant la nature chimique d'interfaces entre
chaînes polypeptidiques associées (Chotia et Janin, 1975 ).
Interface Contribution des différents de l'interface (déduit
atomes de l'aire par R.X.)
Non polaires
%
Polaires
%
Chargés
%
Oxyhémoglobine a-P 68 16 16
Trypsine-Inhibiteur Kunitz 56 32
•1 1 ) 12
Insuline (dimère) 74 22 4
L'argininosuccinase de foie de boeuf, enzyme dimérique, est inactivable par dissociation au froid. Le processus est parfaitement réversible par chauffage. L'analyse de la composition en amino acides de
l'enzyme révèle que le pourcentage de résidus peu polaires est élevé (Lusty let Ratner, 1972). Ces observations sont réconciliables, avec l'existence d'une interface peu polaire.
Pauling (1945) pensait que l'énergie d'association des protéines résultait de la complémentation des structures et de la coopération de multiples forces faibles (Van der Waals et liens hydrogènes), dues à l'existence d'un nombre élevé d'atomes dans l'interface.
Il apparaît néanmoins que ces forces ne peuvent contribuer d'une manière significative aux bilans thermodynamiques des associations.
Ces bilans tiennent en effet compte des interactions favorables que les résidus avaient contractées avec le solvant avant leur intégration dans la phase organique. Les interactions hydrophobes, du type de celles décrites par Klotz et Scheraga sont par essence, plus adaptées à supporter ces bilans.
Chotia et Janin (l975) ont estimé les énergies libres requises pour expliquer les constantes de dissociation de quelques complexes
protéine-protéine . Ils tiennent compte de l'énergie libre due à la
perte d'entropie de translation et de rotation lors de la formation d'un complexe. La contribution hydrophobe à l'énergie d'interaction est ensuite estimée pour l'interface à l'aide d'une relation empirique
° 2
établissant une contribution de 25 calories par A de résidus (Reynolds e^ a_l., 19?4 c ; Chotia, 1974).
Energie libre d'association entre chaînes polypeptidiques
Complexe dimère de
1 'insuline
trypsine- Kunitz
a-|3 hémoglobine
Constante de dissocia
tion (M)
IA O
io“^^ O
1 C30AG"dissociation
(kcal mole"^) 7 18 11
Energie libre due
àla perte d'entropie
(kcal mole"l) 23 27 27
Energie libre requise pour l'association
(kcal mole 30 45 38
Aire de l'interface
0 O
