III. Interdépenda nce des modifications de la protéine Tax
1) La phosphorylation sur les résidus sérine en position 300/301 contrôle
l ¶ ubiquitination de Tax et sa translocation vers le noyau ainsi que la translocation simultanée de la sous-unité RelA du facteur NF- κ B
Des travaux antérieurs dans le laboratoire ont montré que Tax était une protéine phosphorylée et que le double mutant présentant des substitutions des résidus sérines en position 300 et 301 en une leucine et une alanine respectivement (mutant F2), perdait la capacité d ¶ être phosphorylé. Ce mutant est incapable d ¶ activer l ¶ expression des gènes par les deux voies ATF/CREB et NF- κ B alors que l ¶ introduction d ¶ acides aspartiques, qui miment les sérines phosphorylées, à la place des sérines critiques pour la phosphorylation (mutant F9) restaurait partiellement les activités transcriptionnelles (Fig. 25A). Dans de nombreux exemples, la phosphorylation de protéines spécifiques contrôle leur localisation intracellulaire et/ou leur capacité d ¶ être modifiées par ubiquitination, sumoylation ou acétylation
39,111,116. Dans un premier temps, nous avons étudié si la phosphorylation de Tax affectait sa capacité d ¶ être modifié par ubiquitination, sumoylation et/ou acétylation. Dans ce but, des cellules 293T ont été transfectées avec les vecteurs d ¶ expression de la protéine Tax-6His sauvage ou des mutants F2-6His et F9-6His en présence ou non du vecteur d ¶ expression de HA-SUMO-1.
Ces cellules ont été lysées dans des conditions hautement dénaturantes et les protéines ont été
purifiées par la technique de Ni-NTA pulldown. Les protéines ainsi purifiées ont été analysées
par Western Blot avec un anticorps dirigé contre Tax, un anticorps dirigé contre les lysines
acétylées ( α -Ac), un anticorps dirigé contre l¶ubiquitine ( α -Ub) ou un anticorps dirigé contre
l ¶ épitope HA pour détecter SUMO-1 (Fig. 25B).
Figure 25 : La phosphorylation de Tax est nécessaire pour son acétylation, son ubiquitination et sa sumoylation. (A) Représentation schématique des mutants F2 et F9 de Tax ainsi que leurs activités transcriptionnelles telles que déterminées précédemment (Bex, 1997). (B) Des cellules 293T ont été transfectées avec les vecteurs d¶expression de la protéine Tax-6His sauvage ou mutée F2-6His et F9-6His en combinaison ou non du vecteur d¶expression de HA-SUMO-1. Les extraits cellulaires ont été purifiés par la technique de Ni-NTA pulldown et les protéines ont été analysées par Western Blot en utilisant des anticorps polyclonaux de lapin dirigé contre Tax ou contre l¶épitope HA et des anticorps monoclonaux de souris dirigé contre l¶ubiquitine (α- Ub) ou contre les lysines acétylées (α-Ac). La quantification des formes modifiées de Tax a été calculée en rapportant les quantités de ces formes mesurées sur les membranes correspondantes à la quantité de la forme de 40 kDa détectée sur la membrane anti-Tax.
Le mutant non-phosphorylé F2 n ¶ est ni ubiquitiné, ni sumoylé, ni acétylé. Par contre le
mutant F9, dont les résidus sérines sont substitués par des acides aspartiques qui miment les
sérines phosphorylées, est ubiquitiné et acétylé comme la protéine Tax sauvage alors qu¶il ne
récupère que très partiellement la capacité d ¶ être sumoylé (15% par rapport au taux de
sumoylation de la protéine Tax sauvage). Ce résultat indique que la phosphorylation de Tax
est nécessaire pour son ubiquitination, son acétylation et dans une moindre mesure pour sa
sumoylation.
Nous avons ensuite étudié par immunocytochimie la localisation intracellulaire des
mutants F2 et F9 et leur capacité d ¶ induire la translocation de RelA vers le noyau. Nous avons
inclus dans cette expérience l ¶ analyse de la fusion F2-Ub afin d ¶ analyser les conséquences de
la restauration de l ¶ ubiquitination sur ce mutant. Des cellules HeLa on été transfectées avec
les vecteurs d ¶ expression de Tax sauvage, ou des mutants F2, F2-Ub ou F9, puis marquées par
immunofluorescence double avec des anticorps anti-Tax et anti-RelA et analysées par
microscopie confocale (Figure 26).
Figure 26 : La phosphorylation de Tax est nécessaire pour son passage dans le noyau et pour la translocation de RelA du cytoplasme vers le noyau.Des cellules HeLa ont été transfectées avec les vecteurs d¶expression de la protéine Tax sauvage ou mutées F2 et F9, ou la fusion à l¶ubiquitine du mutant F2 (F2-Ub).
Ces cellules ont été analysées par marquage immunocytochimique double avec un anticorps monoclonal de souris anti-Tax et un anticorps polyclonal de lapin anti-RelA et microscopie confocale.
Comme décrit précédemment, en l ¶ absence de l ¶ expression de Tax, la protéine RelA est
localisée de manière diffuse dans le cytoplasme. L ¶ expression de la protéine Tax sauvage,
induit la disparition de RelA du cytoplasme et son apparition dans le noyau où elle est
concentrée dans les corps à Tax. Le mutant F2 est uniquement présent de manière diffuse dans le cytoplasme et est incapable d ¶ induire la translocation de RelA dans le noyau. Le mutant F9 est présent à la fois dans le cytoplasme et dans le noyau où il forme des petits corps et est capable d ¶ induire la translocation de RelA dans le noyau. Il est important de noter que la fusion F2-Ub présente un phénotype identique au mutant F2 non fusionné à l ¶ ubiquitine.
Rappelons que la fusion de l ¶ ubiquitine à l ¶ extrémité carboxy-terminale du mutant non ± ubiquitiné K4-8R déterminait la restauration de la capacité de ce mutant d ¶ induire la translocation de RelA vers le noyau (Fig. 22).
Ces résultats indiquent que la phosphorylation de Tax est nécessaire pour son transport du cytoplasme vers le noyau. D ¶ autre part, ces résultats suggèrent fortement que le défaut de sumoylation et d¶acétylation du mutant F2 résulte de son incapacité de migrer vers le noyau.
En effet, nous avons montré dans les chapitres précédents que les forme sumoylées et acétylées de Tax sont essentiellement nucléaires. De plus, l¶acétyltransférase p300 qui acétyle Tax est une enzyme nucléaire et les composants des complexes de sumoylation sont associés aux pores nucléaires
126. Enfin, le fait que le mutant F2 non ubiquitiné n ¶ induit pas la translocation de RelA vers le noyau est en accord notre observation que l ¶ ubiquitination de Tax est requise pour cette fonction. Il est cependant surprenant d ¶ observer que la fusion de l ¶ ubiquitine à l ¶ extrémité carboxy-terminale du mutant F2 ne restaure pas la capacité d ¶ induire la translocation de RelA vers le noyau, contrairement à la fusion de l ¶ ubiquitine au mutant K4-8R.
Les fusions F2-Ub et K4-8R-Ub diffèrent par une propriété essentielle : K4-8R-Ub est présent dans le noyau des cellules, comme son équivalent non fusionné K4-8R (Fig. 15 et 22) alors que ni la fusion F2-Ub, ni son équivalent F2 ne sont présents dans le noyau (Fig. 26).
Afin de mieux comprendre les différences de comportement des fusions F2-Ub et K4-8R-Ub,
nous avons étudié l ¶ état de phosphorylation du mutant K4-8R. Des cellules 293T ont été
transfectées avec les vecteurs d ¶ expression de la protéine Tax sauvage ou du mutant K4-8R et
cultivées dans du milieu contenant soit de la [
35S] méthionine et de la [
35S] cystéine soit du
[
32P] orthophosphate. Le mutant F2 a été inclus dans cette expérience comme contrôle négatif
pour la phosphorylation. Les protéines ont été immunoprécipitées avec un anticorps
monoclonal dirigé contre Tax et analysées par autoradiographie (Fig. 27).
Figure 27 : La phosphorylation de Tax ne nécessite pas l¶ubiquitination, la sumoylation ou l¶acétylation.
Des cellules 293T ont été transfectées avec les vecteurs d¶expression de la protéine Tax sauvage ou mutée K4-8R et F2 et cultivées dans du milieu contenant soit de la [35S] méthionine et de la [35S] cystéine soit du [32P]
orthophosphate. Les protéines Tax ont été immunoprécipitées avec un anticorps monoclonal dirigé contre Tax et analysées par autoradiographie
Le mutant K4-8R est phosphorylé comme la protéine Tax sauvage et contrairement au mutant F2. Le marquage au
35S montre que les protéines Tax sauvage ou mutées F2 et K4-8R sont exprimées de manière équivalente. Cette observation est en accord avec l ¶ idée que la phosphorylation est nécessaire pour permettre la migration de Tax vers le noyau. L ¶ incapacité de la fusion F2-Ub d ¶ induire la translocation de RelA dans le noyau pourrait donc résulter de l ¶ incapacité de cette fusion de migrer elle-même vers le noyau. Nos résultats sont donc en accord avec l ¶ idée que, Tax et RelA sont co-transloqués dans le noyau. En d ¶ autre termes, l ¶ induction de la translocation de RelA vers le noyau par Tax nécessiterait la phosphorylation de Tax sur les sérines 300/301 pour deux raisons indépendantes : (1) l ¶ ubiquitination de Tax qui permettrait l ¶ activation des kinases IKK et (2) la translocation de Tax vers le noyau qui permettrait la translocation simultanée de RelA.
Afin de tester l ¶ hypothèse que le défaut d ¶ acétylation du mutant F2 est la conséquence
de son incapacité de migrer vers le noyau où est localisée l ¶ acétyltransférase p300, nous avons
analysé la capacité de ce mutant de former des complexes avec p300 in vivo par co-
immunoprécipitation. Des cellules 293T ont été transfectées avec les vecteurs d¶expression de
la protéine Tax sauvage ou des mutants F2 et F9 en combinaison avec le vecteur d ¶ expression
de la protéine p300-HA. Les extraits cellulaires ont été immunoprécipités avec un anticorps
monoclonal dirigé contre Tax et les complexes ainsi obtenus ont été analysés par Western
Blot avec un anticorps polyclonal de lapin anti-HA pour détecter la présence de p300 dans ces
complexes. Les extraits totaux ont été analysés avec des anticorps polyclonaux de lapin anti- Tax et anti-HA (Fig. 28).
Figure 28 : La phosphorylation de Tax est nécessaire pour former des complexes avec p300.Des cellules 293T ont été transfectées avec des vecteurs d¶expression de la protéine Tax sauvage ou mutée en combinaison avec un vecteur d¶expression de p300-HA. Les extraits cellulaires ont été immunoprécipités avec un anticorps monoclonal de souris dirigé contre Tax. Les complexes immunoprécipités ont été analysés par Western Blot avec un anticorps polyclonal de lapin anti-HA pour détecter p300. Les extraits totaux ont été analysés par Western Blot avec des anticorps polyclonaux de lapin dirigé contre Tax ou contre HA. Les chiffres sous la membrane représentent le pourcentage de p300-HA immunoprécipité, calculé par la quantification de p300-HA présent dans les complexes immunoprécipités et normalisation de celle-ci à des quantités égales de p300-HA et de Tax dans les extraits totaux.
Nous observons que le mutant F2 est incapable de former des complexes avec p300, contrairement au mutant F9. Ce résultat supporte l ¶ idée que l ¶ acétylation de Tax requiert sa phosphorylation suivie de sa translocation dans le noyau pour permettre la formation de complexes nucléaires Tax/p300 compétents pour l ¶ acétylation.
2) La sumoylation de Tax favorise son acétylation.
Nous avons établit précédemment que la sumoylation de Tax est essentielle à la
formation de corps nucléaires (§ II.2) où Tax colocalise avec p300 (Fig. 6). Nous nous
sommes donc demandé si la sumoylation de Tax favorisait son acétylation en analysant le
taux d ¶ acétylation de divers mutants non sumoylés. Dans ce but, des cellules 293T ont été
transfectées avec les vecteurs d ¶ expression de la protéine Tax-6His sauvage ou des mutants
non-sumoylé et non-ubiquitiné K4-8R-6His, ubiquitiné mais non-sumoylé R4-6K-6His et à la
fois ubiquitiné et sumoylé R7-8K-6His par restauration des deux lysines K7 et K8 dans la cadre du mutant K4-8R. Le mutant K10R a été introduit dans cette analyse comme contrôle négatif de l ¶ acétylation. Les cellules ont été lysées dans des conditions hautement dénaturantes et purifiées par Ni-NTA pulldown comme décrit précédemment. Les protéines purifiées ont été analysées par Western Blot avec un anticorps dirigé contre Tax et contre les lysines acétylées ( α -Ac) (Fig. 29). La quantification des formes acétylées a été effectuée en rapportant l ¶ intensité de la bande de 40 kDa détectée avec l ¶ anticorps dirigé contre les lysines acétylées à celle de la bande de 40 kDa détectée avec l ¶ anticorps anti-Tax. La valeur obtenue a été arbitrairement fixée à 100 % pour la protéine Tax sauvage.
Figure 29 : La sumoylation de Tax favorise son acétylation.Des cellules 293T ont été transfectées avec les vecteurs d¶expression de la protéine Tax-6His sauvage ou mutée. Les extraits cellulaires ont été purifiés par la technique de Ni-NTA pulldown et les protéines analysées par Western Blot utilisant un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre Tax ou un anticorps monoclonal de souris dirigé contre les lysines acétylées (α-Ac). La quantification des formes acétylées a été calculée en rapportant la quantité des espèces détectées sur la membrane anti-lysines acétylées à la quantité de la forme de 40 kDa détectée sur la membrane anti-Tax.
Le mutant K4-8R, qui n ¶ est ni ubiquitiné ni sumoylé, présente un taux d ¶ acétylation de 11% par rapport à la protéine Tax sauvage. La réintroduction des lysines K4 à K6 dans le contexte du mutant K4-8R (mutant R4-6K), qui restaure l ¶ ubiquitination mais pas la sumoylation, n ¶ accroît le taux d ¶ acétylation que d ¶ un facteur 2 (11 et 26 % respectivement).
Par contre, la restauration de l ¶ ubiquitination et de la sumoylation dans le mutant R7-8K,
induit un taux d ¶ acétylation comparable à celui de la protéine Tax sauvage (78%). Ce résultat
indique que la sumoylation favorise l ¶ acétylation de Tax tandis que l ¶ ubiquitination
n ¶ influence que peu l ¶ acétylation de Tax.
Pour confirmer l ¶ importance de la sumoylation pour assurer l ¶ acétylation de Tax, nous avons comparé les taux d ¶ acétylation du mutant non-sumoylé R4-6K fusionné ou non avec SUMO-1. Des cellules 293T ont été transfectées avec les vecteurs d ¶ expression de la protéine Tax sauvage ou mutée R4-6K fusionnées ou non à SUMO-1. Les cellules ont été lysées dans des conditions hautement dénaturantes et les protéines purifiées par Ni-NTA pulldown. Les protéines ont été analysées par Western Blot avec un anticorps polyclonal de lapin anti-Tax et un anticorps monoclonal de souris dirigé contre les lysines acétylées ( α -Ac) (Fig. 30).
Figure 30 : La fusion de SUMO-1 à Tax favorise son acétylation.Des cellules 293T ont été transfectées avec les vecteurs d¶expression de la protéine Tax-6His sauvage ou mutée R4-6K-6His, fusionnée ou non à SUMO-1.
Les extraits cellulaires ont été purifiés par la technique de Ni-NTA pulldown et les protéines analysées par Western Blot utilisant un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre Tax ou un anticorps monoclonal de souris dirigé contre les lysines acétylées (α-Ac). La quantification des formes acétylées a été calculée en rapportant la quantité des espèces détectées sur la membrane anti-lysines acétylées à la quantité de la forme correspondante détectée sur la membrane anti-Tax.
La quantification des taux d¶acétylation (effectuée comme à la figure 28) de ces mutants indique que la fusion de SUMO-1 à l ¶ extrémité carboxy-terminale de la protéine Tax sauvage ou du mutant R4-6K permet d¶augmenter d¶un facteur 2 leur taux d¶acétylation. Nous concluons donc que la sumoylation de Tax favorise son acétylation.
La diminution du taux d ¶ acétylation observée avec le mutant K4-8R pourrait être le
reflet d ¶ un défaut dans la capacité de ce mutant de former des complexes avec p300. Pour
tester cette hypothèse, nous avons cotransfecté les vecteurs d¶expression de la protéine Tax
sauvage ou des mutants K4-8R et R7-8K avec le vecteur d¶expression de p300-HA. Les
cellules ont été lysées dans des conditions douces et les extraits cellulaires ont été
immunoprécipités avec un anticorps monoclonal dirigé contre Tax. Les complexes
immunoprécipités ont été analysés par Western Blot avec un anticorps anti-HA pour mettre en évidence la présence de p300 dans ces complexes (Fig. 31). Les quantités immunoprécipitées de p300 ont été quantifiées comme précédemment (cf. Fig. 28).
Figure 31 : La sumoylation de Tax n¶est pas nécessaire pour former des complexes avec p300.Des cellules 293T ont été transfectées avec les vecteurs d¶expression de la protéine Tax sauvage ou mutée en combinaison avec un vecteur d¶expression de la protéine p300-HA. Les extraits cellulaires ont été immunoprécipités avec un anticorps monoclonal de souris dirigé contre Tax. Les complexes immunoprécipités ont été analysés par Western Blot avec un anticorps polyclonal de lapin anti-HA pour détecter p300. Les extraits totaux ont été analysés par Western Blot avec des anticorps polyclonaux de lapin dirigé contre Tax ou contre l¶épitope HA. Les chiffres sous la membrane représentent le pourcentage de p300-HA immunoprécipité, calculé par la quantification de p300- HA présent dans les complexes immunoprécipités et normalisation de celle-ci à des quantités égales de p300-HA et de Tax dans les extraits totaux.
Les mutants K4-8R et R7-8K ont tous les deux la capacité de former des complexes avec p300 comme la protéine Tax sauvage. Ce résultat indique donc que la sumoylation de Tax n ¶ est pas requise pour permettre la formation des complexes Tax/p300 mais bien pour stimuler l ¶ acétylation de Tax.
Enfin, nous avons étudié les corrélations entre sumoylation, formation des corps
nucléaires où Tax colocalise avec p300 et acétylation de Tax en analysant des cellules 293T
exprimant les mutants K4-8R, R4-6K, R7-8K ainsi que les fusions WT-SUMO-1 et R4-6K-
SUMO-1 par marquage immunocytochimique double avec un anticorps anti-Tax et un
anticorps dirigé contre la protéine p300 endogène (Fig. 32). Les pourcentages de corps
nucléaires formés par ces différents mutants (NB) déterminés à la figure 15, ainsi que le taux
d ¶ acétylation de chaque mutant (Ac), déterminés dans les figures 29 et 30, sont également
repris sur la figure 32.
Figure 32 : Il existe une corrélation entre la sumoylation de Tax, la formation des corps nucléaires dans lesquels p300 est concentré et l¶acétylation de Tax.Des cellules 293T ont été transfectées avec les vecteurs d¶expression de la protéine Tax sauvage ou mutée, fusionnée ou non à SUMO-1. Ces cellules ont été analysées par marquage immunocytochimique double avec un anticorps monoclonal de souris IgG2a anti-Tax et un anticorps monoclonal de souris IgG1 anti-p300 et microscopie confocale. Les pourcentages de corps nucléaires formés, déterminés à la figure 15, ainsi que le taux d¶acétylation de chaque mutant, déterminés dans les figures 29 et 30, sont également repris.
L ¶ analyse de cette figure indique que les mutants R4-6K-SUMO et R7-8K, qui sont
sumoylés et capables de former des corps nucléaires dans lesquels p300 est concentré, ont des
taux d¶acétylation comparables à celui de la protéine Tax sauvage. Nous observons également
que la fusion de SUMO à la protéine Tax sauvage ou au mutant R4-6K accroît fortement leur
capacité de former des corps nucléaires qui incluent p300 ainsi que leur taux d ¶ acétylation. Il
existe donc une corrélation entre la capacité de Tax d ¶ être sumoylé, sa capacité de former des corps nucléaires et d ¶ y colocaliser avec p300 et son taux d ¶ acétylation
Ayant démontré que la sumoylation de Tax accroît son acétylation, nous avons testé si l ¶ acétylation des Tax influençait son taux de sumoylation ou d ¶ ubiquitination. Dans ce but, des cellules 293T ont été transfectées avec les vecteurs d ¶ expression de la protéine Tax sauvage et du mutant K10R en combinaison avec un vecteur d ¶ expression du gène de HA- ubiquitine ou de HA-SUMO-1. Les extraits cellulaires ont été purifiés par Ni-NTA pulldown et les protéines purifiées ont été analysées par Western Blot avec des anticorps anti-Tax, anti- HA pour la détection de l ¶ ubiquitine ou de SUMO-1 ou anti-lysines acétylées (Fig. 33).
Le mutant non acétylé K10R est ubiquitiné et sumoylé comme la protéine Tax sauvage, indiquant que l ¶ acétylation de Tax ne contrôle pas son ubiquitination, ni sa sumoylation. Le fait que le mutant K1-10R, où toutes les lysines ont été substituées par des résidus arginine, est phosphorylé comme la protéine Tax sauvage indique en outre que l ¶ acétylation, l ¶ ubiquitination et la sumoylation ne contrôlent pas la phosphorylation de Tax (résultat non montré).
Les fonctions de Tax sont donc contrôlées par une hiérarchie de modifications parmi lesquelles la phosphorylation occupe le sommet. Cette phosphorylation contrôle d ¶ une part
Figure 33 : Le mutant K10R est ubiquitiné et sumoylé. Des cellules 293T ont été transfectées avec les vecteurs d¶expression de la protéine Tax sauvage ou du mutant K10R en combinaison avec les vecteurs d¶expression de HA-ubiquitine ou HA-SUMO-1. Les extraits cellulaires ont été purifiés par la technique de Ni-NTA pulldown et les protéines analysées par Western Blot en utilisant un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre l¶épitope HA ou un anticorps monoclonal dirigé contre Tax..
l ¶ ubiquitination de Tax et l ¶ activation des kinases IKK et, d ¶ autre par la migration de Tax vers le noyau. Le transport de RelA activé vers le noyau se ferait conjointement au transport de Tax. Au cours de sa migration à travers les pores nucléaires, Tax serait sumoylé et cette modification permettrait la formation de corps nucléaires et le recrutement dans ces corps d ¶ un ensemble de facteurs de transcription parmi lesquels RelA et p300. La sumoylation de Tax et la formation consécutive des corps nucléaires contenant p300 contrôleraient l ¶ acétylation de Tax. Cette acétylation aurait pour fonction de contrôler l ¶ étape de cytokinèse en fin de mitose et la multiplication incontrôlée des cellules exprimant la protéine Tax.
3) Analyse des mutants M148 et M47 de Tax.
Les mutants M148 (G148V) et M47 (L319R, L320S) sont des mutants sélectivement incapables d ¶ activer respectivement l ¶ expression des gènes par la voie NF- κ B (M148) ou ATF/CREB (M47)
11(Fig.34A). Des études antérieures dans le laboratoire ont montré que le mutant M148 n¶interagit pas avec p300 contrairement au mutant M47, suggérant que la région centrale de Tax incluant la glycine 148 constituait un domaine d ¶ interaction avec p300 et que cette interaction était importante pour l ¶ activation de l ¶ expression des gènes par la voie NF- κ B. Dans le cadre de l ¶ étude de l ¶ acétylation de Tax, nous avons voulu approfondir la caractérisation de ces deux mutants. Comme la phosphorylation de Tax est requise pour permettre les autres modifications (§III.1.), nous avons tout d ¶ abord analysé le taux de phosphorylation de ces deux mutants par marquage métabolique. Des cellules 293T ont été transfectées avec les vecteurs d ¶ expression de la protéine Tax sauvage ou des mutants M148 et M47. Le mutant F2 a été inclus comme contrôle négatif. Ces cellules ont été cultivées dans du milieu contenant soit de la [
35S] méthionine et de la [
35S] cystéine soit du [
32P]
orthophosphate (Fig. 34B).
Figure 34 : Les mutants M148 et M47 présentent des taux de phosphorylation réduits par rapport à la protéine Tax sauvage. (A) Représentation schématique des mutants M148 et M47 de Tax. (B) Des cellules 293T ont été transfectées avec les vecteurs d¶expression de la protéine Tax sauvage ou mutée M148, M47 ou F2 et cultivées dans du milieu contenant soit de la [35S] méthionine et de la [35S] cystéine soit du [32P]
orthophosphate. Les protéines Tax ont été immunoprécipitées avec un anticorps monoclonal dirigé contre Tax et analysées par autoradiographie.
Les mutants M148 et M47 présentent des taux de phosphorylation réduits par rapport à la protéine Tax sauvage. Le mutant M148 est le plus affecté puisqu ¶ il ne présente que 14.5 % de phosphorylation tandis que le mutant M47 maintient un taux de phosphorylation de 48%
par rapport à celui de la protéine Tax sauvage.
Puisque la phosphorylation contrôle non seulement le transport de Tax vers le noyau
mais aussi sa capacité d ¶ être sumoylé et de former les corps nucléaires nous avons décidé
d ¶ étudier tout d ¶ abord la localisation intracellulaire de ces deux mutants. La phosphorylation
de Tax contrôle aussi son ubiquitination et sa capacité d ¶ induire la translocation de RelA dans
le noyau. Nous avons donc inclus dans cette étude l¶analyse des localisations intracellulaires
relatives de Tax avec les protéines RelA et p300 endogènes. Des cellules 293T transfectées
avec des vecteurs exprimant la protéine Tax sauvage ou les mutants M148 et M47 on été
marquées par immunofluorescence triple avec des anticorps dirigés contre Tax, p300 et RelA
et analysées par microscopie confocale (Figure 35).
Figure 35 : Localisation intracellulaire des mutants M47 et M148.Des cellules 293T ont été transfectées avec les vecteurs d¶expression de la protéine Tax sauvage ou mutées M148 et M47. Ces cellules ont été analysées par marquage immunocytochimique triple avec un anticorps monoclonal de souris IgG2a anti-Tax, un anticorps monoclonal de souris IgG1 anti-p300 et un anticorps polyclonal anti-RelA et microscopie confocale.
En l ¶ absence d ¶ expression de la protéine Tax, les protéines RelA et p300 endogènes présentent respectivement des distributions exclusivement cytoplasmique et nucléaire.
L ¶ expression de Tax détermine la formation de corps nucléaires où Tax colocalise avec RelA et p300 dans la majorité des cellules. Le mutant M148 est distribué de manière diffuse principalement dans le cytoplasme mais aussi dans le noyau sans formation de corps nucléaires. Ce mutant est capable d ¶ induire la translocation de RelA vers le noyau dans 50%
des cellules. Par contre le mutant M47 présente une distribution très semblable à la protéine Tax sauvage et colocalise avec RelA et p300 dans des corps nucléaires.
Nous avons ensuite étudié les modifications par acétylation, ubiquitination et
sumoylation de ces mutants. Les vecteurs d ¶ expression de la protéine Tax-6His et des mutants
M148-6His et M47-6His ont été transfectés dans des cellules 293T en combinaison ou non des vecteurs d ¶ expression de HA-ubiquitine ou de HA-SUMO-1. Les extraits cellulaires ont été purifiés par Ni-NTA pulldown et les protéines purifiées ont été analysées par Western Blot avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-Tax ou anti-HA ou un anticorps monoclonal de souris anti-lysines acétylées. (Fig. 36)
Figure 36 : Modifications post-traductionnelles des mutants M47 et M148. Des cellules 293T ont été transfectées avec les vecteurs d¶expression de la protéine Tax-6His sauvage ou les mutants M47-6His ou M148- 6His seuls (A) ou en combinaison avec les vecteurs d¶expression de HA-ubiquitine (B) ou de HA-SUMO-1(C).
Les extraits cellulaires ont été purifiées par la technique du Ni-NTA pulldown et les protéines purifiées ont été analysées par Western Blot avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-Tax ou anti-HA ou un anticorps monoclonal de souris anti-lysines acétylées.
Le mutant M148 présente un taux d ¶ acétylation de 11% par rapport à la protéine Tax sauvage tandis que le taux d ¶ acétylation du mutant M47 est comparable (122%) à celui de la protéine Tax sauvage. De plus, le mutant M148 est fortement affecté dans sa capacité d ¶ être ubiquitiné et sumoylé contrairement au mutant M47.
Nous avons ensuite étudié la capacité de ces mutants d¶interagir avec p300 in vivo par
co-immunoprécipitation. Des cellules 293T ont été cotransfectées avec les vecteurs
d ¶ expression de la protéine Tax sauvage ou des mutants M148 et M47 et le vecteur
d ¶ expression de la protéine p300-HA. Les cellules ont été lysées comme décrit précédemment
et les lysats ont été immunoprécipités avec un anticorps monoclonal dirigé contre Tax. Les
protéines immunoprécipitées ont été analysées par Western Blot avec un anticorps dirigé
contre l¶épitope HA pour détecter la présence de p300 dans les complexes. Les extraits
cellulaires totaux ont été révélés avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-HA ou anti-Tax.
Les quantifications des complexes immunoprécipités ont été effectuées comme décrit plus haut. (Fig. 37)
Figure 37 : Le mutant M148 forme peu de complexes avec p300. Des cellules 293T ont été transfectées avec des vecteurs d¶expression de la protéine Tax sauvage ou mutée en combinaison avec un vecteur d¶expression de la protéine p300-HA. Les extraits cellulaires ont été immunoprécipités avec un anticorps monoclonal de souris dirigé contre Tax. Les complexes immunoprécipités ont été analysés par Western Blot avec un anticorps polyclonal de lapin anti-HA. Les extraits totaux ont été analysés par Western Blot avec des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre Tax ou contre l¶épitope HA. Les chiffres sous la membrane représentent le pourcentage de p300-HA immunoprécipité, calculé par la quantification de p300-HA présent dans les complexes immunoprécipités et normalisation de celle-ci à des quantités égales de p300-HA et de Tax dans les extraits totaux.
