• Aucun résultat trouvé

Increased Ca2+ sensitivity of the ryanodine receptor mutant RyR2R4496C underlies catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Partager "Increased Ca2+ sensitivity of the ryanodine receptor mutant RyR2R4496C underlies catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia."

Copied!
26
0
0

Texte intégral

(1)

HAL Id: inserm-00422019

https://www.hal.inserm.fr/inserm-00422019

Submitted on 5 Oct 2009

HAL is a multi-disciplinary open access

archive for the deposit and dissemination of sci-entific research documents, whether they are pub-lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.

L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

Increased Ca2+ sensitivity of the ryanodine receptor

mutant RyR2R4496C underlies catecholaminergic

polymorphic ventricular tachycardia.

María Fernández-Velasco, Angélica Rueda, Nicoletta Rizzi, Jean-Pierre

Benitah, Barbara Colombi, Carlo Napolitano, Silvia Priori, Sylvain Richard,

Ana María Gómez

To cite this version:

María Fernández-Velasco, Angélica Rueda, Nicoletta Rizzi, Jean-Pierre Benitah, Barbara Colombi, et al.. Increased Ca2+ sensitivity of the ryanodine receptor mutant RyR2R4496C underlies cate-cholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.: Ca2+ handling in RyRR4496C mice cardiomy-ocytes. Circulation Research, American Heart Association, 2009, 104 (2), 201-9, 12p following 209. �10.1161/CIRCRESAHA.108.177493�. �inserm-00422019�

(2)

I

InnccrreeaasseeddCCaa2+2+sseennssiittiivviittyyoofftthheerryyaannooddiinneerreecceeppttoorrmmuuttaannttRRyyRR22R4496CR4496CuunnddeerrlliieessCCPPVVTT..

S

Shhoorrt t ttiittllee:: CCaa2+2+ hhaannddlliinngg iinn RRyyRRR4496CR4496C mmiiccee ccaarrddiioommyyooccyytteess

M

Maarrííaa FFeerrnnáánnddeezz--VVeellaassccoo11,, AAnngélliiccaa RRuueeddaa1,2*1,2*, , Nicoletta Nicoletta Rizzi Rizzi ,3*3*,JeJeaann--PPiieerrrre e BBeenniittaahh11, , BBaarrbbaarraa

C Coolloommbbii33, , CCaarrlloo NNaappoolliittaannoo33, , SSiillvviiaa GG PPrriioorrii33, , SSyyllvvaaiinn RRiicchhaarrdd11, , AAnnaa MMaaríaa Gómmeezz11.. 1 1InInsseerrmm,, UU663377;; UUnniivveerrssiité ddee MMoonnttppeelllliieerr11;; UUnniivveerrssiité ddee MMoonnttppeelllliieerr22;; MMoonnttppeelllliieerr,, FFrraannccee 2 2 DDeeppaarrttaammeennttoo ddee BBiiooqquímmiiccaa,, IInnssttiittuuttoo NNaacciioonnaall ddee CCaarrddiioolloogíaa,, Méxxiiccoo DD..FF..,, Méxxiiccoo.. 3 3MoMolleeccuullaarr CCaarrddiioollooggyy,, IIRRCCCCSS FFoonnddaazziioonnee SSaallvvaattoorree MMaauuggeerri,i, PPaavviiaa,, IIttaallyy.. * *TThheessee aauutthhoorrss ccoonnttrriibbuutteedd eeqquuaallllyy.. A Addddrresesss ooff ccoorrrresesppoonnddeennccee A Annaa MM.. GGóómmeezz I Innsseerrmm,, UU663377 C C..HH..UU.. AA.. ddee VViilllleenneeuuvvee 3 344229955 MMoonnttppeelllliieerr F Frraannccee T Teell:: ++3333--446677441155223377 F Faaxx:: ++3333--446677441155224422 e e--mmaaiill:: ana-maria.gomez@inserm.frana-maria.gomez@inserm.fr S Suubbjjeecctt ccooddeess:: [[113366]] [[113322]] [[113300]]

(3)

A ABBSSTTRRAACCTT C Caarrddiiaacc rryyaannooddiinnee rreecceeppttoorr ((RRyyRR22)) mmuuttaattiioonnss aarree aassssoocciiaatteedd wwiitthh aauuttoossoommaall ddoommiinnaanntt c caatteecchhoollaammiinneerrggiicc ppoollyymmoorrpphhiicc vveennttrriiccuullaarr ttaacchhyyccaarrddiiaa ((CPCPVVTT)),, ssuuggggeessttiinngg tthhaatt aalltteerraattiioonnss iinn CCaa2+2+ h haannddlliinngg uunnddeerrlliiee tthhiiss ddiisseeaassee.. HHeerree wwee aannaallyyzzee tthhee uunnddeerrllyyiinngg CCaa2+2+ rreleleeaassee ddeeffeecctt tthhaatt lleeaaddss ttoo a arrrrhhyytthhmmiiaa iinn ccaarrddiioommyyooccyytteess iissoollaatteedd ffrroomm hheetteerroozzyyggoouuss kknnoocckk--iinn mmiiccee ccaarrrryyiinngg tthhee RRyyRR22R4496CR4496C m muuttaattiioonn.. RRyyRR22R4496CR4496C--//--lilitttteerrmmaatteess ((wwiilldd ttyyppee,, WWTT)) wweerree uusseedd aass ccoonnttrrololss.. [[CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieennttss wweerree o obbttaaiinneedd bbyy ffiieelldd ssttiimmuullaattiioonn iinn fflluuoo--33 llooaaddeedd ccaarrddiioommyyooccyytteess aanndd vviieewweedd uussiinngg ccoonnffooccaall m miiccrroossccooppyy.. IInn oouurr bbaassaall rreeccoorrddiinngg ccoonnddiittiioonnss ((22 HHzz ssttiimmuullaattiioonn rraattee)),, [[CCaa2+2+]] i i ttrrananssiieennttss aanndd s saarrccooppllaassmmiicc rretetiiccuulluumm ((SSRR)) CCaa2+2+ llooaadd wweerree ssiimmiillaarr iinn WWTT aanndd RRyyRR22R4496CR4496C cceellllss.. HHoowweevveerr,, ppaacceedd R RyyRR22R4496CR4496C vveennttrriiccuullaarr mmyyooccyytteess pprreesseenntteedd aabbnnoorrmamall CCaa2+2+ rreelleeaassee dduurriinngg tthhee ddiiaassttoolliicc ppeerriioodd,, v viieewweedd aass CCaa2+2+--wwaavveess,, ccoonnssiisstteenntt wwiitthh tthhee ooccccuurrrreennccee ooff ddeellaayyeedd aafftteerr--ddeeppoollaarrizizaattiioonnss.. TThhee o occccuurrrerennccee ooff tthhiiss aabbnnoorrmmaall CCaa2+2+ rreelleeaassee wwaass eennhhaanncceedd aatt ffaasstteerr ssttiimmuullaattiioonn rraatteess aanndd bbyy ββ- -a addrreenneerrggiicc ssttiimmuullaattiioonn,, wwhhiicchh aallssoo iinndduucceedd ttrriiggggeerreded aaccttiivviittyy.. SSppoonnttaanneeoouuss CCaa2+2+-s-sppaarrksks wweerree mmoorree f frreeqquueenntt iinn RRyyRR22R4496CR4496C mmyyooccytyteess,, iinnddiiccaattiinngg iinnccrreeaasseedd RRyyRR22R4496CR4496C aaccttiivviittyy.. WWhheenn ppeerrmmeeaabbiilliizzeedd c ceellllss wweerree eexxppoosseedd ttoo ddiiffffeerreenntt ccyyttoossoolliicc [[CCaa2+2+]] i i, , RRyyRR22R4496CR4496C sshhoowweedd aa ddrramamaattiicc iinnccrreeaassee iinn CCaa2+2+ s seennssiittiivviittyy.. IIssoopprrototeerreennooll iinnccrreeaasseedd [[CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieenntt aammpplliittuuddee aanndd CCaa2+2+ ssppaarrkk ffrreeqquueennccyy ttoo tthhee s saammee eexxtteenntt iinn WWTT aanndd RRyyRR22R4496CR4496C cceellllss,, iinnddiiccaattiinngg tthhaatt tthhee ββ--aaddrreenneerrggiicc sseennssiittiivviittyy ooff RRyyRR22R4496CR4496C c ceellllss rreemmaaiinneedd uunnaalltteerreded.. TThhiiss eeffffeecctt wwaass iinnddeeppeennddeenntt ooff pprrootteeiinn eexxpprreessssiioonn vvaarriaiattiioonnss ssiinnccee nnoo d diiffffeerreennccee wwaass ffoouunndd iinn tthhee ttoottaall oorr pphhoosspphhoorryyllaatteedd RRyyRR22 eexxpprreessssiioonn lleevveellss.. IInn ccoonncclluussiioonn,, tthhee a arrrrhhyytthhmmooggeenniicc ppootteennttiiaall ooff tthhee RRyyRR22R4496CR4496C mmuuttaattiioonn iiss dduuee ttoo tthhee iinnccrreeaasseedd CCaa2+2+ sseennssiittiivviittyy ooff R RyyRR22R4496CR4496C, , wwhhiicchh iinndduucceess ddiiaassttoolliicc CCaa2+2+ rreleleeaassee aanndd lloowweerrs s tthhee tthhrreesshhoolldd ffoorr ttrriiggggeerreedd aaccttiivviittyy.. K Keeyywwoorrddss: : CCaa2+2+--ssppaarrkkss,, [[CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieennttss,, rryyaannooddiinnee rreecceeppttoorr,, eexxcciittaattiioonn--ccoonnttrraaccttiioonn ccoouupplliinngg,, h heeaarrtt,, CCPPVVTT..

(4)

C

Caatteecchhoollaammiinneerrggiicc ppoollyymmoorrpphhiicc vveennttrricicuullaarr ttaacchhyyccaarrddiiaa ((CCPPVVTT)) iiss aann iinnhheerriitteedd aarrrrhyhytthhmmooggeenniicc d diisseeaassee cchhaarraacctteerriizzeedd bbyy ssttrreessss--iinndduucceedd,, aaddrreenneerrggiiccaallllyy mmeeddiiaatteedd bbiiddiirreeccttiioonnaall oorr ppoollyymmoorrpphhiicc v veennttrriiccuullaarr ttaacchhyyccaarrddiiaa ooccccuurrrriinngg iinn ssttrrucucttuurraallllyy nnoorrmmaall hheeaarrtsts11.. DDuurriinngg eexxeerrcicissee oorr aaccuuttee e emmoottiioonnss,, CCPPVVTT ppaattiieennttss ddeevveelloopp lliiffee--tthhrreeaatteenniinngg vveennttrricicuullaarr aarrrrhhyytthhmmiiaass lleeaaddiinngg ttoo ssyynnccooppee oorr s suuddddeenn ddeeaatthh.. TThhee ffiirrstst RRyyRR22 mmuuttaattiioonn iiddeennttiiffiieedd iinn aa CCPPVVTT ffaammiillyy wwaass RR44449977CC22. . TTooddaayy,, mmoorre e t thhaann 7700 RRyyRR22 mmuuttaattiioonnss hhaavvee bbeeeenn rreeppoorrtteedd ((http://www.fsm.it/cardmoc/)http://www.fsm.it/cardmoc/),, aanndd tthheeyy ccoommpprriissee tthhee m moosstt ccoommmmoonn ggeenneettiicc ssuubbttyyppee ooff CCPPVVTT3-73-7, , aalltthhoouugghh mmuuttaattiioonnss iinn tthhee ccaallsseeqquueessttrriinn ggeennee ccaann aallssoo c caauussee CCPPVVTT8,98,9. . D Diivveerrggiinngg rreessuullttss aanndd ccoonncclluussiioonnss hhaavvee bbeeeenn ggeenneerraatteedd ffrromom eexxpprreessssiioonn ssttuuddiieess ooff R RyyRR22R4496CR4496C iinn hheetteerroollooggoouuss ssyysstteemmss.. JJiiaanngg aanndd ccoollllaabboorraattoorrs s sshhoowweedd tthhaatt RRyyRR22R4496CR4496C ((tthhee m moouussee eeqquuiivvaalleenntt ooff tthhee hhuummaann RRyyRR22R4497CR4497C mmuuttaattiioonn)),, wwhheenn eexxpprreesssseedd iinn hhuummaann eemmbbrryoyonniicc k kiiddnneeyy ((HEHEKK)) cceellllss,, eexxhhiibbiittss iinnccrreeaasseedd bbaassaall aaccttiivviittyy aanndd iinnccrreeaasseedd sseennssiittiivviittyy ttoo lluummiinnaall CCaa2+2+..1010 H Hoowweevveerr, , ootthheerr aauutthhoorrss ffoouunndd nnoo ddiiffffeerreennccee iinn tthhee bbaassaall aaccttiivviittyy ooff RRyyRR22R4497CR4497C, , bbuutt iinnsstteeaadd s shhoowweedd iinnccrreeaasseedd aaccttiivviittyy aanndd ggaattiinngg ffrreeqquueennccyy aafftteerr pprrootteeiinn kkiinnaassee AA ((PPKKAA)) pphhoosspphhoorryyllaattiioonn1111 o orr ssaarrccooppllaassmmiicc rreettiiccuulluumm ((SSRR)) CCaa2+2+ oovveerrloloaadd1212. . TThhee eexxpprreessssiioonn ssttuuddiieess wweerre e ccaarrrriieedd oouutt iinn aa v vaarrieiettyy ooff mmooddeellss,, wwhhiicchh mmaayy eexxppllaaiinn tthhee iinnhhoommooggeenneeoouuss ffiinnddiinnggss.. FFuurrtthheerrmomorree,, hheetteerroollooggoouuss s syysstteemmss llaacckk ccaarrddiiaacc iinnttrraacceelllluullaarr eennvviirroonnmmeenntt wwiitthh aallll tthhee RRyyRR22 aacccceessssoorryy pprrootteeiinnss1313 aanndd mmoosstt C Caa2+2+-h-haannddlliinngg pprrootteeiinnss,, ssoo aannaallyyssiiss iinn nnaattiivvee ccaarrddiiaacc mmyyooccyytteess iiss nnooww ccrrititiiccaall ttoo eelluucciiddaattee tthhee m meecchhaanniissmmss bbyy wwhhiicchh tthhee mmuuttaattiioonn lleeaaddss ttoo ccaarrddiiaacc aarrrrhhyytthhmmiiaa.. R Reecceennttllyy,, aa kknnoocckk--inin mmoouussee--mmooddeell ccaarrrriieerr ooff tthhee RRyyRR22R4496CR4496C mmuuttaattiioonn wwaass ddeevveellooppeedd1414. . T Thheeiirr pphheennoottyyppee pprreesseennttss eexxttrraaoorrddiinnaarryy ssiimmiillaarriittyy wwiitthh tthhee cclliinniiccaall mmaanniiffeessttaattiioonnss ooff ppaattiieennttss c caarrryryiinngg tthhee RRyyRR22R4497CR4497C mmuuttaattiioonn,, iinncclluuddiinngg tthhee ddeevveellooppmmeenntt ooff bbiiddiirreeccttiioonnaall vveennttrriiccuullaarr t taacchhyyccaarrddiiaa.. WWhheenn eexxppoosseedd ttoo aaddrreennaalliinnee aanndd ccaaffffeeiinnee,, tthhee RRyyRR22R4496CR4496C ccaarrddiioommyyooccyytteess ddeevveelloopp d deellaayyeedd aafftteerr--dedeppoollaarrizizaattiioonnss ((DDAADDss))1515, , ssuuggggeessttiinngg tthhaatt ttrrigigggeerreedd aarrrrhhyytthhmmiiaass aarre e eelliicciitteedd bbyy a addrreneneerrgigicc aaccttiivvaattiioonn1616. . HHeerree wwee ddeemmoonnssttrratatee tthhaatt uunnttrreaeatteedd RRyyRR22R4496CR4496C mmyyooccyytteess hhaavvee i innccrreeaasseedd ssppoonnttaanneeoouuss CCaa2+2+ rreelleeaassee iinn ddiiaassttoollee dduurriinngg eelleeccttrriiccaall ppaacciinngg,, dduuee ttoo tthhee eennhhaanncceedd

(5)

C

Caa2+2+ sseennssiittiivviittyy ooff mmuuttaanntt RRyyRR22;; tthhiiss aabbnnoorrmmaalliittyy iiss ffuurrtthheerr aauuggmmeenntteedd bbyy eexxppoossuurree ttoo

i

(6)

M MAATTEERRIIAALLSSAANNDDMMEETTHHOODDSS V Veennttrriiccuullaarr ccaarrddiioommyyooccyytteess ffrroomm mmaallee aanndd ffeemmaallee RRyyRR22R4496CR4496C++//-- mmiiccee ((RyRyRR22R4496CR4496C)) aanndd tthheeiirr w wiilldd ttyyppee RRyyRR22R4496CR4496C--//-- ((WWTT)) lliitttteerrmmaatteess wweerree iissoollaatteedd uussiinngg aa ssttaannddaarrdd eennzzyymmaattiicc ddiiggeessttiioonn1717.. [ [CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieennttss aanndd CCaa2+2+--spspaarrkkss wweerree vviieewweedd iinn iissoollaatteedd mmyyooccyytteess bbyy ccoonnffooccaall mmiiccrroossccooppyy a anndd aannaallyyzzeedd uussiinngg hhoommeemmaaddee rroouuttiinneess.. A A ccoommpplleettee MMeetthhooddss sseeccttiioonn ccaann bbee ffoouunndd iinn tthhee OOnnlliinnee SSuupppplleemmeennttaall MMaatteerriaiall.. R REESSUULLTTSS A AbbnnoorrmmaallCCaa2+2+rreelleeaasseeiinnRRyyRR22R4496CR4496Cmmyyooccyytteess E Elleeccttrroopphhyyssiioollooggiiccaall eexxppeerriimmeennttss iinn RRyyRR22R4496CR4496C mmyyooccyytteess hhaavvee eevviiddeenncceedd DDAADDss aanndd ttrrigigggeerreedd a accttiioonn ppootteennttiiaallss iinn tthhee pprreesseennccee ooff aaddrreenneerrggiicc ssttiimmuullaattiioonn aafftteerr ssttooppppiinngg eelleeccttrriiccaall ssttiimmuullaattiioonn1515. . F Fiigguurree 11 sshhoowwss CCaa2+2+ iimmaaggeess iinn vveennttrriiccuullaarr mmyyooccyytteess ppaacceedd aatt 44 HHzz iinn tthhee pprreesseennccee ooff 11 μμmmooll//LL i issoopprrototeerreennooll.. TThhee WWTT ccaarrddiioommyyooccyyttee sshhoowweedd nnoo ssppoonnttaanneeoouuss CCaa2+2+ rreelleeaassee aafftteerr eelleeccttrriiccaall p paacciinngg iinntteerrrrupupttiioonn ((FiFigg..11AA)).. OOnn tthhee ccoonnttrrararyy,, tthhee RRyyRR22R4496CR4496C cceellll sshhoowweedd CCaa2+2+--wwaavveess eevvookkiinngg t twwoo [[CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieennttss,, jjuusstt aafftteerr ssttiimmuullaattiioonn ssttooppppeedd,, wwhhiicchh wwaass ffoolllloowweedd bbyy sseevveerraall CCaa2+2+-w-waavveess,, c coonnssiisstteenntt wwiitthh ttrrigigggeerreedd aaccttiivviittyy aanndd DDAADDss ((FFiigg..11BB)). . TThheessee ddaattaa ssuuggggeesstt tthhaatt aabbnnoorrmmaall CCaa2+2+ r reelleeaassee uunnddeerrlilieess tthhee eelleeccttrriiccaall aabbnnoorrmmaalliittiieess iinn RRyyRR22R4496CR4496C ccaarrddiioommyyooccyytteess.. SSiinnccee DDAADDss aarree i inniittiiaatteedd bbyy CCaa2+2+--wawavveess tthhaatt aarree iinn ttuurrnn iinniittiiaatteedd bbyy CCaa2+2+--ssppaarrkkss1818,, wwee aannaallyyzzeedd CCaa2+2+-s-sppaarrkkss iinn R RyyRR22R4496CR4496C ccaarrddiioommyyooccyytteess.. [[CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieennttss aanndd wwaavveess cchhaarracactteerriissttiiccss aarree pprreseseenntteedd bbeellooww.. C Caa2+2+--ssppaarrkkssiinnRRyyRR22R4496CR4496Cmmyyooccyytteess F Fiigguurree 22AA sshhoowwss rrepeprreseseennttaattiivvee iimmaaggeess ooff CCaa2+2+-s-sppaarrkkss1919.. CCaa2+2+ ssppaarrkk ffrreeqquueennccyy wwaass ddoouubbllee iinn R RyyRR22R4496CR4496C cceellllss ccoommppaarreded wwiitthh WWTT cceellllss ((pp<<00..000011,, FFiigguurree 22BB)).. TThhiiss ccoouulldd bbee dduuee ttoo aann iinnccrreeaassee i inn ((i)i) tthhee SSRR CCaa2+2+ llooaadd,, ((iiii)) tthhee lleevveell ooff RRyyRR22 eexxpprresesssiioonn aanndd//oorr pphhoosspphhoorryyllaattiioonn,, ((iiiiii)) tthhee ddiiaassttoolliicc [ [CCaa2+2+]] i i oorr ((iviv)) cchhaannggeess iinn tthhee iinnttrrininssiicc cchhaannnneell pprrooppeerrttiieess..

(7)

W Wee eessttiimmaatteedd SSRR CCaa2+2+ llooaadd iinn qquuiieesscceenntt vveennttrriiccuullaarr mmyyooccyytteess.. RRyyRR22R4496CR4496C sshhoowweedd r reedduucceedd SSRR CCaa2+2+ ccoonntteenntt ((FF//FF 0 0: : 77..00±±00..55,, nn==1111 iinn RRyyRR22R4496CR4496Cvvss.. 88..55±±00..55 iinn WWTT,, nn==1100,, pp<<00..0055)),, r ruulliinngg oouutt SSRR CCaa2+2+ oovveerrllooaadd.. NNoo mmaajjoorr aalltteerraattiioonn iinn CCaa2+2+--spspaarrkk cchhaarraacctteerrisisttiiccss wwaass oobbsseerrvveedd ( (OOnnlliinnee TTaabbllee II)).. W Wee ppeerrffoorrmmeedd WWeesstteerrnn--bblloottss ooff ttoottaall aanndd pphhoosspphhoorryyllaatteedd RRyyRR22 iinn hheeaarrttss iinn bbaassaall c coonnddiittiioonnss aanndd ffoolllloowwiinngg iissoopprrootteerreennooll ppeerrffuussiioonn.. NNeeiitthheerr tthhee ttoottaall RRyyRR22 eexxpprreessssiioonn nnoorr tthhee lleevveell o off pphhoosspphhoorryyllaatteedd RRyyRR22 ((PP--SSeerr 22880099)) wwaass ddiiffffeerreenntt bbeettwweeeenn WWTT aanndd RRyyRR22R4496CR4496C ((OnOnlliinnee FFiigg..II)). . W Wee aallssoo ppeerrffoorrmmeedd ffuunnccttiioonnaall eexxppeerriimmeennttss cchhaalllleennggiinngg tthhee cceellllss wwiitthh 11 μμmmooll//LL iissoopprrootteerreennooll.. T Thhiiss pprroocceedduurre e iinnccrreeaasseedd CCaa2+2+-s-sppaarrkk ooccccuurrrreennccee iinn bbootthh WWTT aanndd RRyyRR22R4496CR4496C mmyyooccyytteess ((FFiigg..22BB)) b byy tthhee ssaammee ppeerrcceennttaaggee ((FFiigg..22CC)).. CCaa2+2+--spspaarrkk cchhaarracactteerriissttiiccss iinn tthhee pprreesseennccee ooff iissoopprrootteerrenenooll a arree pprroovviiddeedd iinn OOnnlliinnee TTaabbllee II.. SSiimmiillaarr rreessuullttss wweerree ffoouunndd uussiinngg aa lloowweerr iissoopprrootteerreennooll c coonncceennttrraattiioonn ((110000 nnmmooll//LL)) ((OOnnlliinnee FFiigg..IIIIAA)). . FFuurrththeerrmmoorree,, ttrreeaattmmeenntt ooff RRyyRR22R4496CR4496C mmyyooccyytteess wwiitthh e eiitthheerr aa PPKKAA bblloocckkeerr ((KKTT55772200)) oorr aa CCaaMMKKIIII bblloocckkeerr ((KKNN9933)) ffaaiilleedd ttoo ddeeccrreeaassee CCaa2+2+--spspaarrkk f frreeqquueennccyy ((OOnnlliinnee FFiigg..IIIIII)).. TThheessee ddaattaa rruullee oouutt aann iinnccrreeaassee iinn tthhee ttoottaall RRyyRR22 eexxpprresesssiioonn oorr aa h hiigghheerr lleevveell ooff bbaassaall pphhoosspphhoorryyllaattiioonn aass aann eexxppllaannaattiioonn ffoorr tthhee hhiigghheerr CCaa2+2+--spspaarrk k ooccccuurrrreennccee iinn R RyyRR22R4496CR4496C mmyyooccyytteess.. R Reessttiinngg cycyttooppllaassmmiicc [C[Caa2+2+]] i, i, mmeeaassuurreedd ususiinngg FuFurraa--22,, wawass sisimmiillaarr bbeettwweeeenn WTWT anandd R RyyRR22R4496CR4496C cecellllss ((rraattiiooss:: 0.0.556±00..0022 inin 1616 WTWT mymyooccyytteess,, 0.0.557±00..0011 inin 4545 RyRyRR22R4496CR4496C cecellllss,, p p>>00..0055)).. ThTheerrefefoorree tthhee ininccrreeaasseedd CaCa2+2+-s-sppaarrkk ococccuurrrreennccee iinn ququiieesscceenntt RyRyRR22R4496CR4496C cceellllss wwaass nonott c caauusseedd bbyy ddiiffffeerreenncceess iinn tthhee rreessttiinngg iinnttrraacceelllluullaarr CCaa2+2+. . C Caa2+2+-s-sppaarrkkss aarree prproodduucceedd byby ththee ooppeenniinngg ofof RyRyRR22 clcluusstteerrss.. ThThee ininccrreeaassee inin totottaall CaCa2+2+ s sppaarrkk ffrreeqquueennccyy iinn RRyyRR22R4496CR4496C ccoouulldd bbee dduuee ttoo aa ggrreeaatteerr nnuummbbeerr ooff cclluusstteerrs s ffiirriinngg CCaa2+2+--spspaarrkkss oorr t too tthhee iinnccrreaeasseedd pprrooppeennssiittyy ooff sosommee clcluusstteerrs stoto ffiirree rrepepeettiittiivveellyy,, bbeeccoommiinngg “e“eaaggeerr”” clcluusstteerrss.. WeWe a annaallyyzzeedd ouourr dadattaa didissccrrimimiinnaattiinngg spspeecciiffiicc sisitteess prpreesseennttiinngg mumullttiippllee CaCa2+2+-s-sppaarrkkss dudurriningg ththee r reeccoorrddiinngg titimmee ((aabboouutt 2200 s)s).. FiFirriinngg sisitteess wewerre ecocouunntteedd aass ththee ssiitteess wwhheerree wwee rrececoorrddeedd aatt leleaasstt o onnee CaCa2+2+--ssppaarrkk.. FiFigg..22DD shshoowwss ththaatt ththee RyRyRR22R4496CR4496C mymyooccyytteess prpreesseenntteedd momorree fifirriinngg sisitteess,, aanndd

(8)

t thhaatt iissoopprrootteerreennooll iinnccrreeaasseedd tthhee nnuummbbeerr ooff ssiitteess iinn bbootthh WWTT aanndd RRyyRR22R4496CR4496C cceellllss.. TThhiiss iinnddiiccaatteess t thhaatt tthhee RRyyRR22R4496CR4496C cceellllss pprreesseenntteedd mmoorree CCaa2+2+--ssppaarrkkss dduuee ttoo tthhee eexxiisstteennccee ooff mmoorree aaccttiivvee RRyyRR22 c clluusstteerrss ((FFiigg..22EE)).. WWee aallssoo mmeeaassuurreedd tthhee mmaaxxiimmuumm nnuummbbeerr ooff CCaa2+2+-s-sppaarrksks rreeccoorrddeedd aatt tthhee ssaammee s siittee iinn eeaacchh grgroouupp aanndd fofouunndd tthhaatt ththiiss wawass alalssoo ssiiggnniiffiiccaannttllyy ininccrreeaasseedd inin RyRyRR22R4496CR4496Cmymyooccyytteess a anndd ffuurrtthheerr eennhhaanncceedd bbyy ββ--aaddrreenneerrggiicc ststiimmuullaattiioonn ((FiFigg..22FF)).. TTaakkeenn totoggeetthheerr,, tthheessee ddaattaa ssuuggggeesstt t thhaatt RyRyRR22R4496CR4496Ccecellllss prpreseseenntt mmoorre eCaCa2+2+--spspaarrkkss bebeccaauussee ooff mmoorre eacacttiivvee RyRyRR22ss cclluusstteerrss anandd aa g grreeaatteerr pprroobbaabbiilliittyy ooff rreeppeettiittiivvee ooppeenniinnggss ooff tthheessee cclluusstteerrss iinn tthhee RRyyRR22R4496CR4496C mmyyooccyytteess..

We next explored whether RyR2R4496C presents abnormal Ca2+ sensitivity. We analyzed Ca2+-sparks in permeabilized cells exposed to various cytoplasmic [Ca2+]

i. Figure 3A illustrates

enhanced Ca2+-sparks occurrence in a RyR2R4496C cell at 30 nmol/L [Ca2+]

i. At all tested [Ca2+]i,

Ca2+-sparks were much more frequent in RyR2R4496C than in WT myocytes, consistent with

increased cytosolic Ca2+ sensitivity (Fig.3B). Analysis of the Ca2+-spark characteristics in

permeabilized cells essentially confirmed the results obtained in intact cells (Online Table II). We estimated SR Ca2+ content in permeabilized cells and found that at all tested [Ca2+]

i the

caffeine-evoked [Ca2+]

i transient was significantly decreased in the RyR2R4496C cells (Fig.3C).

Thus the higher Ca2+ spark occurrence in RyR2R4496C myocytes was not due to either a higher

level of Ca2+ stored in the SR or an alteration of calsequestrin level evaluated by Western-blots

(data not shown). Fig.3D shows the luminal Ca2+ dependence of Ca2+-sparks, apparently

consistent with increased luminal Ca2+ sensitivity. However cytosolic and luminal Ca2+ vary

concurrently. The high Ca2+-spark occurrence recorded in RyR2R4496C at very low intracellular

Ca2+ might suggest that, rather than increasing RyR2R4496C Ca2+ sensitivity, this mutation

renders the RyR2 intrinsically active. We repeated the experiments at zero Ca2+ (0.5 mmol/L

EGTA). In this condition, the occurrence of Ca2+-sparks was indistinguishable between WT and

RyR2R4496C cells (Fig.3.E&F, left), indicating that RyR2R4496C hyperactivity requires cytosolic

Ca2+. To ensure that the SR was not depleted in our experimental conditions, we applied

(9)

that there was significant luminal Ca2+ to promote Ca2+-sparks. Altogether, our results show that

the RyR2R4496C mutation increases the Ca2+ sensitivity of the channel. The RyR2 has 2 affinity

Ca2+ binding sites on the cytosolic portion: one of high affinity that activates the channel and one

of low affinity that inactivates it. Since ryanodine binds to open RyRs, we examined the Ca2+

-dependence of [3H]ryanodine binding in heart crude membrane preparations. Bell-shape curves

were obtained for both WT and RyR2R4496C but Ca2+-induced maximal activation of RyR2R4496C

was reached at one order of magnitude lower in RyR2R4496C (Fig.3G), indicating that the

cytosolic Ca2+ sensitivity of RyR2 is greatly increased. We normalized the [3H]ryanodine binding

and fitted data to the Hill equation20 to get the values for Ca2+ affinity to the RyR activation (Ka,

21.9±8.3 μmol/L vs. 4.9±1.0μmol/L, n=4, p<0.003 for WT and RyR2R4496C membranes,

respectively) and inactivation (6.5±0.6 mmol/L vs. 4.8±1.1 mmol/L; p>0.05 for WT and RyR2R4496C membranes) sites. Theses results show a 4.5 fold increase of cytosolic Ca2+

sensitivity for the RyR2R4496C.

[ [CCaa2+2+ ] ]iittrraannssiieennttssiinnRRyyRR22R4496CR4496Cmmyyooccyytteess T Too ddeetteerrmmiinnee wwhheetthheerr tthhee aalltteerraattiioonn ooff ddiiaassttoolliicc CCaa2+2+ ssppaarrkk ffrreeqquueennccyy iinn RRyyRR22R4496CR4496C c caarrdidioommyyooccyytteess hhaass aann iimmppaacctt dduurriinngg ssyyssttoollee,, wwee ccoommppaarreedd [[CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieennttss aanndd cceellll c coonnttrraaccttiioonn aatt ddiiffffeerreenntt ppaacciinngg rraatteess ((2 2 HHzz,, 33 HHzz,, aanndd 44 HHzz)) ((OOnnlliinnee ttaabbllee IIIIII)).. AAtt 22 HHzz,, tthhee [[CCaa2+2+]] i i t trraannssiieenntt aammpplliittuuddee,, iittss ttiimmee ttoo ppeeaakk,, tthhee [[CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieenntt ddeeccaayy ttiimmee aanndd cceelllluullaarr ccoonnttrraaccttiioonn,, w weerree ssiimmiillaarr ((pp>>00..0055)) iinn WWTT aanndd RRyyRR22R4496CR4496C cceellllss,, ccoonnssiisstteenntt wwiitthh nnoorrmmaall hheeaarrt t ffuunnccttiioonn iinn mmiiccee a att rresestt.. AAss ssttiimmuullaattiioonn rratatee iinnccrreeaasseedd,, wweeaakkeerr [[CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieennttss wweerree eevvookkeedd bbootthh iinn WWTT aanndd R RyyRR22R4496CR4496C cceellllss ((FFiigg..44AA)).. HHoowweevveerr, , tthhee ddeeccrreeaassee iinn [[CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieenntt aammpplliittuuddee wwaass mmoorree p prroonnoouunncceedd ((pp<<00..0055)) iinn RRyyRR22R4496CR4496C cceellllss.. TThhiiss rreedduuccttiioonn wwaass aassssoocciiaatteedd wwiitthh bbootthh wweeaakkeerr c ceelllluullaarr ccoonnttrraaccttiioonn ((FFiigg..44BB)) aanndd sslloowweerr ddeeccaayy ttiimmee ((FFiigg..44CC)),, wwiitthh nnoo ddiiffffeerreennccee iinn tthhee ttiimmee ttoo p peeaakk ((FiFigg..44DD)). .

(10)

B Beeccaauussee [[CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieenntt aammpplliittuuddee ddeeppeennddss oonn SSRR CCaa2+2+ llooaadd,, wwee iinnvveessttiiggaatteedd tthhee SSRR C Caa2+2+ ccoonntteenntt.. IImmaaggeess ooff ccaaffffeeiinnee--eevvookkeedd [[CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieennttss eevvookkeedd aafftteerr eelleeccttrriiccaall ssttiimmuullaattiioonn aatt 44 H Hzz aarree sshhoowwnn iinn FFiigguurree 44EE.. AAss sshhoowwnn iinn FFiigguurre e 44FF,, ccaaffffeeiinnee--eevvookkeedd [[CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieennttss wweerre e s siiggnniiffiiccaannttllyy ssmmaalllleerr ((bbyy 2244..77%%)) aafftteerr ppaacciinngg tthhee cceellll aatt 44 HHzz iinn RRyyRR22R4496CR4496C ccoommppaarreedd ttoo WWTT m myyooccyytteess,, wwhhiillee nnoo ssiiggnniiffiiccaanntt ddiiffffeerreennccee wwaass oobbsseerrvveedd aatt lloowweerr ffrreeqquueenncciieess.. PPlloottttiinngg tthhee ppeeaakk [ [CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieenntt vvss. . tthhee SSRR CCaa2+2+ llooaadd ffoorr tthhee tthhrreeee ddiiffffeerreenntt ppaacciinngg rraatteess ((FFiigg..44GG)) pprroovviiddeedd s siimmiillaarr ccoorrrreellaattiioonnss iinn WWTT aanndd RRyyRR22R4496CR4496C mmyyooccyytteess.. TThheessee rreessuullttss ssuuggggeesstt tthhaatt aa ddeeccrreeaassee iinn S SRR CCaa2+2+ llooaadd aaccccoouunnttss ffoorr tthhee rreedduuccttiioonn iinn ssyyssttoolliicc [[CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieennttss aanndd tthhee aassssoocciiaatteedd lloowweerr c coonnttrraaccttiioonn oobbsseerrvveedd aatt tthhee hhiigghheesstt ppaacciinngg rraatteess iinn bbootthh cceellll ggrroouuppss.. IInntteerreessttiinnggllyy,, tthhee ddeeccrreeaassee i inn SSRR llooaadd wwiitthh iinnccrreeaassiinngg ppaacciinngg rraattee wwaass aacccceennttuuaatteedd iinn RRyyRR22R4496CR4496C mmyyooccyytteess.. TToo ggeett aann iiddeeaa o off hhooww mmuucchh CCaa2+2+ iiss rreelleeaasseedd aatt eeaacchh ttwwiittcchh wwiitthh rresesppeecctt ttoo tthhee ttoottaall aammoouunntt ooff CCaa2+2+ ssttoorreded,, wwee e evvaalluuaatteedd tthhee ffrraaccttiioonnaall rreelleeaassee bbyy nnoorrmamalliizziinngg tthhee eelleeccttrricicaallllyy--evevookkeedd [[CCaa2+2+]] i i ttrrananssiieenntt ttoo tthhee c caaffffeeiinnee--eevvookkeedd [[CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieenntt iinn eeaacchh cceellll tteesstteedd.. WWee ffoouunndd nnoo ddiiffffeerreennccee bbeettwweeeenn WWTT aanndd R RyyRR22R4496CR4496C cceellllss.. FFoorr eexxaammppllee,, aatt 44 HHzz,, ffrracacttiioonnaall rreleleeaassee wwaass 00..880±00..0044 iinn WWTT cceellllss ((nn==88)) aanndd 0 0..8822±±00..0066 iinn RRyyRR22R4496CR4496C mmyyooccyytteess ((nn==2211)).. AAllttooggeetthheerr,, tthheessee eexxppeerrimimeennttss uunnmmaasskk rratatee- -d deeppeennddeenntt ssyyssttoolliicc CCaa2+2+--rerelleeaassee ddeeffeeccttss iinn RRyyRR22R4496CR4496C cceellllss iinn rreellaattiioonn wwiitthh iimmppaaiirreedd rreeccoovveerryy ooff S SRR CCaa2+ 2+loloaadd,, wwhhiicchh mmiigghhtt bbee sseeccoonnddaarryy ttoo ddiiaassttoolliicc CCaa2+2+ lleeaakk.. H Hoowweevveerr, , tthhee rreelleevvaannccee ooff tthhiiss ssyyssttoolliicc ddeeffeecctt mmaayy bbee lliimmiitteedd iinnvviivvo,o, ssiinnccee iinnccrreeaasseedd h heeaarrtt rraattee iiss uussuuaallllyy aassssoocciiaatteedd wwiitthh hhiigghh ssyymmppaatthheettiicc ddrriivvee,, tthhuuss iinnccrreeaasseedd ccoonnttrracacttiilliittyy.. WWee n neexxtt aannaallyyzzeedd [[CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieennttss uunnddeerr ββ--adadrreneneerrgigicc ssttiimmuullaattiioonn.. IImmaaggeess ooff [[CCaa2+2+]]ii ttrrananssiieennttss e evvookkeedd bbyy ffiieelldd ssttiimmuullaattiioonn aatt 44 HHzz aarree sshhoowwnn iinn FFiigguurree 55AA,, ttoopp.. TThhee iinnccrreeaassee iinn [[CCaa2+2+]] i i ttrraannssiieenntt a ammpplliittuuddee iinndduucceedd bbyy iissoopprrootteerreennooll wwaass ssiimmiillaarr iinn WWTT aanndd RRyyRR22R4496CR4496C cceellllss,, ((FFiigg..55AA,, bboottttoomm,, O Onnlliinnee FFiigg..IIIIBB,, OOnnlliinnee TTaabbllee IIIIII)).. WWee aallssoo ffoouunndd aa ssiimmiillaarr eeffffeecctt ooff iissoopprrototeerreennooll oonn SSRR CCaa2+2+ llooaadd i inn bbootthh eexxppeerriimmeennttaall ggrrououppss ((FFiigg..55BB)). . AAllttooggeetthheerr,, tthheessee ddaattaa ssuuggggeesstt tthhaatt tthhee ssyyssttoolliicc d dyyssffuunnccttiioonn aatt hhiigghh ppaacciinngg rratateess ppeerrssiissttss dduurriinngg ssyymmppaatthheettiicc ssttiimmuullaattiioonn ((pp<<00..0011)),, aanndd tthhaatt tthhee i innccrreemmeennttaall eeffffeecctt ooff ββ--aaddrreenneerrggiicc ssttiimmuullaattiioonn iiss iiddeennttiiccaall iinn WWTT aanndd RRyyRR22R4496CR4496C. .

Références

Documents relatifs

- Dans la troisième Partie nous présenterons les résultats sur la séparation et l'analyse des protéines des extraits de plantes de niébé (diffusats) traités ou non par

J’espère de tout mon cœur que l’un n’ira pas sans l’autre, autant pour le bien de l’humanité que pour celui de notre bien malade planète et de tous ces mondes que nous

As the carcinogenicity of DEPs is assumed to be due to a non-genotoxic pathway (particulate core) and a genotoxic path- way (adsorbed organics, mainly PACs), the total

Most of the vein minerals have major and trace element compositions that are comparable with the host-rock minerals, and vein and host-rock zircons have similar Hf

In Section IV-A, we extend these results to the problem of robust analysis of switched linear systems and prove that if such a system is stable under arbitrary switching, then it

First it means enhanced with respect to the time step ∆t, that is we do not want the error estimate to be spoiled by a ∆t 1 which is very often encountered in the numerical analysis

From the studies in this laboratory which have been summarized above, it is considered justifiable to conclude that, with proper air-entrainment, concretes made with the

The earliest explicit coupling schemes with unfitted meshes have been reported in [6, 36], using the immersed boundary method, and in [16, 35], using unfitted Nitsche