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Caractérisation de l’évolution des tumeurs urothéliales de la voie excrétrice urinaire supérieure après néphrourétérectomie totale

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Academic year: 2021

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Caractérisation de l’évolution des tumeurs urothéliales

de la voie excrétrice urinaire supérieure après

néphrourétérectomie totale

Thomas Seisen

To cite this version:

Thomas Seisen. Caractérisation de l’évolution des tumeurs urothéliales de la voie excrétrice urinaire supérieure après néphrourétérectomie totale. Urologie et Néphrologie. Sorbonne Université, 2018. Français. �NNT : 2018SORUS486�. �tel-02614224�

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Ecole doctorale ED 394

Groupe de Recherche Clinique GRC N°5, Institut Universitaire de Cancérologie, Médecine Sorbonne Université, Hôpital Tenon, Bâtiment Recherche

CARACTÉRISATION DE L’ÉVOLUTION DES TUMEURS UROTHÉLIALES DE LA VOIE EXCRÉTRICE URINAIRE SUPÉRIEURE APRÈS

NÉPHROURÉTÉRECTOMIE TOTALE

Par Thomas Seisen

Thèse de doctorat de Sciences

Dirigée par le Pr Morgan Rouprêt

Présentée et soutenue publiquement le 05/12/2018

Devant un jury composé du :

Pr Marc-Olivier Bitker, PU-PH, Président du jury Pr Stéphane Oudard, PU-PH, Rapporteur

Pr Arnaud Méjean, PU-PH, Rapporteur Pr Eva Compérat, PU-PH, Membre Pr Morgan Rouprêt, PU-PH, Invité

(3)

REMERCIEMENTS

A MON PRESIDENT DE JURY

Monsieur le Professeur Marc-Olivier Bitker

Professeur des Universités - Praticien Hospitalier Service d’Urologie et de Transplantation Rénale Hôpital de la Pitié Salpêtrière, AP-HP

Médecine Sorbonne Université

Vous me faites l’honneur de présider le jury de cette thèse Vous êtes à l’origine de ma vocation alors que je n’étais encore qu’étudiant sur les bancs de la faculté de médecine de la Pitié Salpêtrière Je vous remercie pour votre attention de tous les instants concernant mes différents projets, votre écoute, et votre patience à prodiguer des conseils pertinents durant tout mon internat et clinicat Veuillez trouver ici l'expression de ma reconnaissance et de mon profond respect

A MES AUTRES JUGES

Monsieur le Professeur Arnaud Méjean

Professeur des Universités - Praticien Hospitalier Service d’Urologie et de Transplantation Rénale Hôpital Européen Georges Pompidou, AP- HP Université Paris 5, René Descartes

Vous me faites l’honneur de juger ce travail Vous êtes pour moi un modèle de rigueur scientifique et chirurgicale Je suis admiratif de votre immense carrière professionnelle ainsi que de tout ce que vous représentez pour l’urologie en France et par-delà les frontières

Veuillez trouver ici l'expression de mes respectueux remerciements

Monsieur le Professeur Stéphane Oudard

Professeur des Universités - Praticien Hospitalier Service d’Urologie et de Transplantation Rénale Hôpital Européen Georges Pompidou, AP-HP Université Paris 5, René Descartes

Vous me faites l’honneur de juger ce travail Vous faites parti des plus grands professeurs de cancérologie et votre nom rayonne dans notre communauté urologique Vos qualités de chercheur sont mondialement reconnues et je suis admiratif de votre réussite professionnelle tant sur le plan clinique que scientifique Veuillez trouver dans ce travail l’expression de mon immense respect

(4)

Madame le Professeur Eva Compérat

Professeur des Universités - Praticien Hospitalier Service d’Anatomopathologie

Hôpital Tenon, AP-HP

Médecine Sorbonne Université

Tu me fais l’honneur de juger ce travail Tu as été présente depuis le tout début de ma formation et tu m’as fait découvrir

l’anatomopathologie des tumeurs urologiques L’étendue de tes connaissances dans ce domaine est sans limite Tes qualités intellectuelles et relationnelles ont été indispensables à la réalisation de ce travail Je te dois beaucoup J'espère sincèrement me montrer digne de la confiance que tu m'accordes depuis le commencement

A MON DIRECTEUR DE THESE

Monsieur le Professeur Morgan Rouprêt

Professeur des Universités - Praticien Hospitalier Service d’Urologie et de Transplantation Rénale Hôpital de la Pitié Salpêtrière, AP-HP

Faculté de Médecine Paris 6

Tu m'as fait l'honneur de diriger cette thèse Je te remercie de tes précieux conseils, pour ton accueil chaleureux à chaque fois que j'ai sollicité ton aide ainsi que pour tes multiples encouragements Tu es mon maître à penser, celui à qui je dois tout ce que je suis devenu sur le plan professionnel Ta bienveillance à mon égard est pour moi une source perpétuelle de motivation J’espère avoir été digne de ta confiance et continuer à suivre ton exemple de rigueur

(5)

A CONSTANCE

Tu fais parti de ma vie depuis seulement 2 ans mais c’est comme si tu avais toujours été là. Ton soutient inconditionnel de tous les instants a été un élément essentiel à la réalisation de ce travail que je te dédis. La route est encore longue mais avec toi à mes côtés, je suis prêt à affronter toutes les épreuves.

A MA FAMILLE

Mes parents, ma sœur et mon grand-père, qui je l’espère, sont fiers de moi

Mes cousins, cousines, oncles et tantes qui ont chacun participé à ma culture

Tous ceux qui ne sont plus là pour voir ce que je suis devenu mais qui occupe une place particulière dans mon cœur

Bernadette et Jean-Marc qui ne font pas tout à fait partie de ma famille mais presque après tous ces étés passés en Corse

A MES AMIS

François et Jonathan avec qui on roule notre bosse depuis les bancs du lycée

Maxime, Laurent, Louis, Alexandre, Camille, et Claire pour ces fantastiques années d’externat et cette amitié qui nous unie depuis tout ce temps

Sébastien, Edouard et Loris que j’ai rencontré en première année de médecine et qui sont restés des amis fidèles

Nathalie, Sarah, Sophie, Antoine, Marie et Louis qui font également parti de mes amis très proches

Mathieu, et Maxime dont les aléas de la vie nous ont éloignés mais que j’ai toujours autant de plaisir à revoir même si c’est une fois par an

(6)

SOMMAIRE

I. GÉNÉRALITÉS ET OBJECTIF………p8

A. Epidémiologie des tumeurs urothéliales de la voie excrétrice urinaire supérieure………..p8 B. Carcinogénèse des tumeurs urothéliales de la voie excrétrice

urinaire supérieure………..p8 1. Oncogènes et gènes suppresseur de tumeur………p8 1.1. Principaux proto-oncogènes………p8 1.2. Gènes suppresseur de tumeur………..p10 1.3. Autres gènes candidats………...p12 1.3.1 Identifiés en immuno-histochimie……….p12 1.3.2 Identifiés par étude de méthylation………..p13 2. Hérédité génétique………..p13 2.1. Hérédité monogénique : syndrome HNPCC………p13 2.2. Hérédité multifactorielle………..p17

2.2.1 Généralités………p17 2.2.2 Principaux polymorphismes génétiques…………..p17 C. Bases moléculaires des risques évolutifs après néphrourétérectomie totale……….p18 1. Récidive intra-vésicale et développement clonal………p18 1.1. Monoclonalité : théorie de la dispersion intraluminale avec implantation cellulaire………..p19 1.2. Oligoclonalité : théorie de la cancérisation par plages de l’urothélium ………p19 1.3. Coexistence de la mono- et de l’oligoclonalité…………..p20 2. Récidive systémique………...p21 2.1. Envahissement locorégional………p21 2.2. Envahissement lymphatique………p22 2.3. Envahissement métastatique………...p23 D. Objectif………p23

II. RÉCIDIVE INTRA-VÉSICALE………p24

A. Epidémiologie et méta-analyse des facteurs prédictifs de récidive intra-vésicale après néphrouréterectomie totale………..p24

(7)

B. Recherche de la mutation FGFR3 sur l’ADN urinaire pour la prédiction du risque de récidive intra-vésicale………..p36 1. Introduction………..p36 2. Matériel et méthode………p37

2.1. Patients………p37 2.2. Prélèvements et préparation des échantillons…………..p38 2.3. Extraction de l’ADN urinaire………...p38 2.4. Quantification de l’ADN au NanoDrop®………..p39 2.5. Procédure de génotypage de FGFR3 selon la technique de taille de fragments……….p40 2.5.1. PCR Multiplex……….p41 2.5.2. Analyse des fragments d’ADN au séquenceur..p43 2.6. Analyse anatomopathologique de la pièce opératoire…p46 2.7. Suivi………..p47 2.8. Analyses statistiques………...p47 3. Résultats……….p48

3.1. Population………...p48 3.2. Analyse de la survie sans récidive intra-vésicale……….p50 3.3. Facteur prédictifs de récidive intra intra-vésicale………p50 4. Discussion………..p53 5. Conclusion.……….p54 III. RÉCIDIVE LOCOREGIONALE ET MÉTASTATIQUE………p56

A. Intérêt de la sous-stratification des tumeurs urothéliales pT3 de la voie excrétrice urinaire supérieure………...p56 B. Efficacité de la chimiothérapie adjuvante après néphrourétérectomie totale pour le traitement des tumeurs urothéliales de la voie excrétrice urinaire supérieure localement avancées………..p86 C. Caractérisation immunologique des tumeurs urothéliales de la voie excrétrice urinaire supérieure………..p101 1. Hétérogénéité des méthodologies évaluant l’expression de

(8)

2. Validation de la méthodologie permettant d’évaluer le statut PD1/PDL1des tumeurs de la voie excrétrice urinaire supérieure………...p107 2.1. Introduction………p107 2.1.1. Facteurs impliqués dans la variabilité des résultats

disponibles dans la littérature………p107 2.1.1.1. Le matériel tissulaire utilisé…………p107 2.1.1.2. Les anticorps utilisés………p108 2.1.2. Objectif de l’étude……….p110 2.2. Matériel et méthode………..p110 2.2.1. Sélection des échantillons……….p110 2.2.2. Construction des TMA………p111 2.2.3. Immunohistochimie……….p112 2.2.4. Interprétation des résultats………...p113 2.2.5. Analyses statistiques………..p113 2.3. Résultats……….p114 2.3.1. Caractéristiques de la population……….p114 2.3.2. Interprétation des marquages………p115 2.3.2.1. Interprétation et hétérogénéité du marquage anti PD-L1 (E1L3N et 28.8)...p116 2.3.2.2. Anticorps anti PD-1 (NAT105)…… …p119 2.3.3. Taux d'échantillons positifs pour les marquages de PD-L1 et PD-1……….p120 2.3.4. Analyse de la concordance des résultats des marquages PD-1 / PD-L1……….p121 2.3.4.1. En fonction du matériel utilisé………p121 2.3.4.2. En fonction des anticorps utilisés pour PD-L1……….p123 2.3.5. Association entre le statut PD-1 / PD-L1 et le stade

tumoral……….p124 2.4. Discussion………..p124 2.5. Conclusion...p129

(9)

IV. CONCLUSIONS………..p131

V. RÉFÉRENCES………p132

VI. TABLES DES ILLUSTRATIONS……….p144 VII. TABLES DES TABLEAUX………...p146 VIII. RÉSUMÉ………..p148

(10)

I. GÉNÉRALITÉS ET OBJECTIFS

A. Epidémiologie des tumeurs urothéliales de la voie excrétrice urinaire supérieure

Les carcinomes urothéliaux représentent la 4ème localisation tumorale chez l’homme en termes de fréquence, après le cancer de la prostate, le cancer du poumon et le

cancer colorectal [1]. La plupart d’entre eux sont des cancers de la vessie puisque

les tumeurs de la voie excrétrice urinaire supérieure (TVEUS) représentent seulement

5 à 10% des carcinomes urothéliaux [2]. Les TVEUS sont donc des tumeurs très rares,

avec une incidence annuelle estimée en France à 1 ou 2 nouveaux cas pour 100 000

habitants [3]. Il existe une prédominance masculine nette avec un rapport

homme/femme compris entre 3 et 4.

Ces tumeurs se développent à partir de l’urothélium des cavités pyélocalicielles ou de

l’uretère pour évoluer vers l’infiltration pariétale et la dissémination par voie

lymphatique ou hématogène. Il existe également un risque de dissémination dans

l’ensemble de la voie excrétrice urinaire, notamment responsable de localisations

vésicales synchrones ou asynchrones.

B. Carcinogénèse des tumeurs urothéliales de la voie excrétrice urinaire supérieure

1. Oncogènes et gènes suppresseur de tumeur 1.1. Principaux proto-oncogènes

Les proto-oncogènes codent pour des protéines qui régulent la prolifération cellulaire.

En cas de mutation activatrice, d’une translocation ou d’une amplification génique, ils

deviennent des oncogènes hyperactifs et sont responsables de la prolifération

cellulaire anarchique classiquement retrouvée au cours du développement d’un

cancer.

(11)

FGFR3 qui code pour le récepteur des facteurs de croissance fibroblastique. Ainsi,

une mutation de ce gène est retrouvée dans 40 à 50% des tumeurs de vessie et des

TVEUS [4]. À ce jour, huit mutations principales sur trois exons de ce gène (exons 7,

10 et 15) ont été identifiées et sont à l’origine d’une activation constitutionnelle du

récepteur FGFR3 indépendante de son ligand [5,6]. Un marquage positif pour FGFR3

en immunohistochimie a d’ailleurs été observé dans 61,5 % des TVEUS [7]. Comme

pour les tumeurs de la vessie, ces mutations sont plus fréquentes en cas de TVEUS

de bas grade (71 %) ou non invasive (53 %) [4]. De même, elles sont plus fréquentes

dans les tumeurs urétérales (50%) plutôt que pyélocalicielles (34 %) [4]. Enfin, un

risque de progression et, surtout, de mortalité spécifique réduite a été rapporté chez

les patients avec une TVEUS FGFR3 mutée en accord avec les données publiés dans

les tumeurs de la vessie [4,8,9]. La présence de ces mutations peut être recherchée

à partir de l’ADN extrait de l’urine des patients et constituerait donc un marqueur

intéressant pour confirmer le diagnostic initial ou détecter les récidives [10].

La famille des proto-oncogènes human epidermal growth factor receptor (HER) codant

pour des récepteurs transmembranaires à activité tyrosine kinase est également

impliquée dans la carcinogenèse des TVEUS. Ainsi, 50% des TVEUS seraient

positives pour EGFR (HER1) en immunohistochimie ; cette expression serait associée

non seulement aux stades et grades avancés, mais également, à la présence de

certains sous-types histologiques de mauvais pronostic comme l’inflexion épidermoïde

ou glandulaire. D’autre part, un marquage positif pour ERBB2 (HER2) a été observé

dans 39—53 % des TVEUS mais seuls 7—17 % d’entre elles présentaient une

surexpression de ce récepteur. Ceci également serait associé à des stades et grades

avancés, l’envahissement ganglionnaire et potentiellement aux récidives

(12)

Le dernier proto-oncogène impliqué dans le développement des TVEUS est le gène

PIK3CA qui code pour la sous-unité alpha de la phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate

3-kinase. Des mutations activatrices de ce proto-oncogène ont été mises en évidence

dans 13,6 % des tumeurs pyéliques. Ainsi une dérégulation de la voie de signalisation

PI3K/AKT (Figure 1) pourrait jouer un rôle dans la carcinogenèse des TVEUS [13].

Figure 1 : Fonctionnement du récepteur FGFR-3 par la voie PI3K/AKT

1.2. Principaux gènes suppresseur de tumeur

Un gène suppresseur de tumeur est un régulateur négatif de la prolifération cellulaire.

En cas de mutation ou de délétion de la région chromosomique contenant ce gène, la

perte ou l’altération de la fonction de sa protéine qui en résulte conduit à une levée

d’inhibition du cycle cellulaire, et donc, à une prolifération tumorale.

Le principal gène suppresseur de tumeur impliqué dans la carcinogenèse urothéliale

(13)

des altérations de l’ADN, l’induction de l’apoptose cellulaire et l’inhibition du cycle

cellulaire par l’inactivation du complexe enzymatique Cycline D/CDK4 chargé de

catalyser la phosphorylation de la protéine pRb responsable de la transition entre les

phases G1 et S (Figure 2). Certaines mutations de ce gène ont été identifiées dans

les TVEUS [14,15] dont notamment celles résultant de l’exposition à l’acide

aristolochique responsable d’un profil mutationnel très spécifique avec des

transversions de bases Adénine à Thymine [16]. La protéine p53 mutée est plus stable

que la protéine normale, ce qui pourrait donc expliquer la surexpression (plus de 10 à

20 % de cellules marquées) paradoxalement observée au cours des analyses en

immunohistochimie. Cette augmentation de l’expression de p53 serait corrélée à

l’apparition de TVEUS de stade ou de grade élevés tout comme dans la carcinogenèse

urothéliale vésicale [17], mais sa valeur pronostique reste encore discutée et n’a pu

être démontrée même au cours de plusieurs méta-analyses [18,19].

Le gène PTEN, situé en 10q23 et codant pour une phosphatase membranaire, est un

autre gène suppresseur important. En effet, une perte d’hétérozygotie et/ou une perte

d’expression de ce gène a été observée dans 25 à 37% des TVEUS, ce qui pourrait

conduire à une stimulation de la voie de signalisation PI3K/AKT (Figure 1) et donc à

(14)

Figure 2 : Voie de signalisation aboutissant à l’inactivation des protéines du rétinoblastome (pRB) responsable la phase gap 1 (G1) vers la phase synthesis (S) du cycle cellulaire

1.3. Autres gènes candidats

1.3.1. Identifiés en immuno-histochimie

L’expression de nombreuses protéines impliquées dans différentes voies de

signalisation ont permis d’identifier des biomarqueurs utilisables pour le pronostic des

TVEUS. Les protéines en question régulent le cycle cellulaire (p27, NFkB, Aurora A,

Stathmine, Caveoline-1, PTMA), le transport cellulaire (LAT1, GRP78), la signalisation

intracellulaire (AhR, COX2), l’angiogenèse (HIF), l’adhésion cellulaire (E-cadherine,

Parvivin , MMPs, UPIII) ou la transition épithélio-mésenchymateuse (Snail) [20]. À ce

jour, aucune mutation d’un des gènes correspondants n’a été rapportée dans les

(15)

régulation par d’autres gènes altérés au cours de la carcinogenèse. Une analyse

exhaustive de l’ensemble de ces biomarqueurs serait nécessaire afin de déterminer le

panel susceptible d’avoir une valeur pronostique indépendante.

1.3.2. Identifiés par étude de méthylation

L’épigénétique décrit l’ensemble des mécanismes moléculaires régulant l’expression

des gènes dont notamment la méthylation d’îlots dinucléotides Cytosine-Guanine

(CpG) situés dans les régions promotrices des gènes qui peut parfois être responsable

de leur inactivation. La méthylation des promoteurs des gènes hMLH1, RARB, p16,

p14, RASSF1A, MINT31 et E-cadhérine est décrite plus fréquemment dans les TVEUS

que dans les tumeurs de la vessie [21]. La méthylation du promoteur du gène DAPK

favorisait davantage la récidive des TVEUS alors que celle du gène MINT31 était

associée à la progression et à la mortalité des TVEUS.

Cependant, un taux élevé de méthylation du promoteur de trois autres gènes (GDF15,

TMEFF2 et VIM) a également été retrouvé dans les TVEUS comme ce qui avait été

précédemment observé dans les tumeurs de la vessie [22]. Un faible taux de

méthylation du gène VIM pourrait être responsable d’une diminution de la survie

spécifique des TVEUS.

2. Hérédité génétique

2.1. Hérédité monogénique : syndrome HNPCC

Le risque génétique de développer une TVEUS dans un contexte de prédisposition

héréditaire a été établi dans le syndrome hereditary non polyposis colorectal

carcinoma (HNPCC), autrement connu sous le nom de syndrome de Lynch). Les

TVEUS sont la 3e localisation tumorale par ordre de fréquence (5%) après les cancers

du côlon (63 %) et de l’endomètre (9 %) [23]. Dans une famille HNPCC, le risque relatif

pour un individu de développer une TVEUS varie de 14 à 22 [23,24].

(16)

un mode de transmission autosomique dominant. Le syndrome HNPCC est lié à une

mutation germinale de l’un des 6 gènes du système de réparation des

mésappariements de l’ADN (système MMR): hMSH2, hMSH3, hMSH6, hMLH1,

hPMS1, hPMS2 [23]. Ce type de mutation est responsable de l’apparition d’un

phénotype tumoral instable que l’on peut détecter à l’aide de l’expression d’instabilité

des microsatellites (MSI). En l’absence de système MMR fonctionnel les cellules

tumorales accumulent des erreurs de réplication notamment au niveau des séquences

nucléotidiques non codantes (microsatellites) dont la taille des répétitions varie d’une

cellule à l’autre. Le phénotype MSI traduit simplement l’existence de cet

épiphénomène génétique reflet indirect d’un dysfonctionnement du système MMR

[23]. En présence d’un statut MSI élevé, il faut évoquer une prédisposition héréditaire

au cancer. La confirmation diagnostique se fera par séquençage de l’ADN germinal à

la recherche d’une mutation des gènes hMSH2 (muté dans 60 %), hMLH1 (muté dans

30 %) et hMSH6 (muté dans 5 à 8%) [23]. Les mutations des autres gènes hMSH3,

hPMS1 et hPSM2 sont moins fréquente. La technique de séquençage longue et

coûteuse, peut être au préalable orientée par la recherche en immunohistochimie de

(17)

Figure 3 : Arbre décisionnel de la prise en charge d’une TVEUS dans un contexte de suspicion de syndrome de Lynch

(18)

Les critères de Bethesda révisés permettent d’identifier les patients susceptibles de

bénéficier d’un diagnostic génétique par séquençage de l’ADN [25] (Figure 5). Une

fiche de recueil spécifique au TVEUS dans ce cadre a été éditée par Audenet et al.

afin de sensibiliser la communauté urologique à la détection de ce syndrome [26]. Une

fois le diagnostic de syndrome HNPCC établi, le patient et sa famille doivent être

orientés vers une consultation d’onco-génétique pour le dépistage des autres tumeurs

du spectre HNPCC.

Figure 4 : Critères d’Amsterdam et de Bethesda pour le diagnostic du syndrome de Lynch

(19)

2.2. Hérédité multifactorielle 2.2.1. Généralités

Le développement d’un cancer est le fruit d’interactions complexes entre les facteurs

génétiques d’un individu et certains facteurs environnementaux ; on évoque ainsi

l’hérédité multifactorielle ou les polymorphismes génétiques (variations de séquences

nucléotidiques). Cette susceptibilité génétique expose davantage un individu ou un

groupe d’individus (variations ethno-géographiques) aux effets génotoxiques des

carcinogènes environnementaux. La plupart des produits chimiques impliqués dans le

développement des carcinomes urothéliaux comme ceux présents dans le tabac, sont

métabolisés dans le rein en catabolites génotoxiques interagissant avec l’ADN.

2.2.2. Principaux polymorphismes génétiques

Il existe des facteurs génétiques communs au risque de développer une TVEUS et

une tumeur de la vessie, mais également des polymorphismes propres aux TVEUS.

Ainsi, le génotype TT du polymorphisme rs9642880, situé en 8q24, qui avait

initialement été identifié comme associé à un risque élevé de tumeur de la vessie, a

été également associé à une augmentation de risque de TVEUS, en particulier, dans

sa forme agressive [27]. De même, une étude portant sur deux polymorphismes (−460

T/C et +936 C/T) du gène codant pour le vascular endothelial growth factor (VEGF)

impliqué dans l’angiogenèse, a établi dans la population taiwanaise que les individus

fumeurs, fortement exposés à l’arsenic et porteurs de l’un ou de ces deux génotypes

à avaient des risques respectifs de développer une tumeur de la vessie et une TVEUS

de 6,6% et de 9,9% [28].

Le premier polymorphisme génétique spécifique aux TVEUS concerne un gène codant

pour une sulfotransférase (enzyme cytosolique ubiquitaire impliquée dans la

détoxification des composés chimiques) [29]. Ce polymorphisme génétique de l’exon

(20)

acide aminé Arginine (allèle SULTA1*1) par une Histidine (allèle SULT1A1*2) au

codon 13 de la protéine correspondante (Arg213His). En présence de l’allèle

SULT1A1*2, la protéine SULT1A1 a une activité enzymatique plus faible et le risque

de développer une TVEUS est dès lors majoré [29,30].

De la même façon, le polymorphisme G870A de CCND1, gène codant pour une

protéine impliquée dans la régulation du cycle cellulaire, a un impact différent entre le

haut et le bas appareil urinaire. Le génotype GG est associé à un risque moins

important de tumeur de la vessie mais n’avait pas cet effet protecteur s’agissant des

TVEUS. Le génotype AG de ce marqueur était associé à un risque moins important de

tumeur de vessie infiltrant le muscle, alors que le génotype GG était associé à un

risque 5,88 fois plus important de développer une TVEUS invasive [31].

Enfin, une seule étude a rapporté l’association entre certains polymorphismes

génétiques et le pronostic des TVEUS. La présence de variants génétiques seuls

(polymorphisme Lys939Gln du gène XPD) ou en combinaison (au moins 3 variants)

de cinq gènes de réparations de l’ADN (gènes XPC, XPD, XPG, XRCC1 et XRCC3)

amélioraient la survie des patients [32,33].

C. Bases moléculaires des risques évolutifs après néphrourétérectomie totale

1. Récidive intra-vésicale et développement clonal

Le développement des TVEUS à partir de l’urothélium des cavités pyélocalicielles ou

de l’uretère peut être unifocal mais ces tumeurs sont plus souvent à même de proliférer

sur plusieurs sites de l’arbre urinaire de fa ̧con synchrone ou métachrone. Ceci

explique que de nombreuses TVEUS soient multifocales au moment du diagnostic

initial. Des hypothèses s’opposent afin d’expliquer ce phénomène (mono- et

(21)

localisation dans l’arbre urinaire [34].

1.1. Monoclonalité : théorie de la dispersion intraluminale avec implantation cellulaire

La théorie de la dispersion intraluminale avec implantation cellulaire, dite intraluminal

seeding and implantation est en faveur d’un développement monoclonal du cancer

[34]. Les localisations multiples et les récidives carcinologiques seraient liées à la

migration intraluminale puis à la greffe de cellules tumorales dans la paroi de l’arbre

urinaire, ou à l’expansion intra-épithéliale de cellules provenant d’une tumeur primitive.

Le caractère antégrade de la dissémination tumorale ainsi que la fréquence des

greffes tumorales au niveau des zones de stase plaident en faveur de cette hypothèse.

Le reflux vésico-urétéral primitif ou iatrogène expliquerait les localisations de la voie

excrétrice supérieure en cas de tumeur vésicale primitive [35]. Ainsi Mazeman et al.

ont rapporté un taux de récidive de 25 % dans le haut appareil après résection

trans-urétrale de vessie chez des patients porteurs d’un reflux contre seulement 4% en

l’absence de reflux [36].

1.2. Oligoclonalité : théorie de la cancérisation par plages de l’urothélium

La théorie de la cancérisation par plages, dite du field change or field defect est

expliquée par la présence d’agents mutagènes dans les urines au contact de

l’urothélium [37]. Les cellules seraient ainsi susceptibles de dégénérer sur plusieurs

sites, et donc d’initier le développement de plusieurs clones tumoraux. En effet,

chaque cellule urothéliale peut acquérir des altérations génétiques distinctes en

rapport avec le développement synchrone ou métachrone de différentes tumeurs

uniques sur le plan mutationnel. Ce phénomène est une caractéristique de

l’oligoclonalité tumorale. Les récidives tumorales dans les voies excrétrices

(22)

néphro-urétérectomie totale plaident en faveur de cette hypothèse. Par ailleurs, la description

de formes bilatérales de TVEUS en l’absence de tumeur vésicale renforce ce postulat.

1.3. Coexistence de la mono- et de l’oligoclonalité

La clonalité du carcinome urothélial a été décrite notamment grâce au profil

d’inactivation du chromosome X ou la perte d’hétérozygotie et l’hétérogénéité des

mutations du gène TP53. Certains auteurs ont démontré une implication prédominante

de la monoclonalité dans la carcinogenèse vésicale [38–41], alors que d’autres ont mis

en évidence des arguments en faveur de l’oligoclonalité [42,43]. La multifocalité des

TVEUS serait quant à elle principalement liée au phénomène de cancérisation par

plages de l’urothélium [44–47], mais des travaux récents n’excluaient pas la possibilité

d’une origine monoclonale et concluaient à une probable coexistence des deux

mécanismes [48] (Figure 5). L’hétérogénéité ou l’oligoclonalité serait ainsi expliquée

par la divergence clonale et la sélection de différentes sous-populations cellulaires

dérivées d’une cellule tumorale initiale commune. Peterson et al. ont rapporté,

l’existence d’une mutation de TP 53 identique entre une tumeur pyélique et urétérale

chez un patient et, d’autre part, l’existence d’une mutation de TP 53 différente entre

une tumeur pyélique et vésicale dans une seconde observation [49]. La différence de

topographie anatomique entre les cavités pyélocalicielles et la vessie préviendrait ainsi

(23)

Figure 5 : Les deux théories de la dissémination locale des tumeurs de la voie excrétrice supérieure : la dissémination intraluminale avec implantation et/ou la cancérisation de l’urothélium « par plage »

2. Récidive systémique

2.1. Envahissement locorégional

L’extension locorégionale des TVEUS est liée aux lésions de haut grade, mais elle

dépend également de la localisation tumorale. Au niveau urétéral, après le

franchissement des deux ou trois couches de la musculeuse et de l’adventice,

l’invasion tumorale s’effectue dans la graisse rétropéritonéale et des organes de

voisinage [50]. En cas de localisations pyéliques, l’extension se poursuit par-delà

l’adventice vers la graisse péripyélique puis hilaire, les structures lymphatique et

veineuse du hile ainsi que le parenchyme rénal. Enfin, l’extension des tumeurs

calicielles s’effectue directement vers le parenchyme rénal et débute initialement par

(24)

au-delà de 5 mm de profondeur [51]. Le parenchyme rénal a un rôle de barrière

anatomique protectrice contre la dissémination locale de ces tumeurs [52]. Toutefois

le débat vis-à-vis du pronostic des différentes localisations n’est pas clos [53–56].

2.2. Envahissement lymphatique

Le drainage lymphatique de la la voie excrétrice supérieure varie en fonction du côté

et de la localisation anatomique. Du côté gauche, les cavités pyélocalicielles et la

partie proximale de l’uretère se drainent dans le réseau lymphatique dont les ganglions

hilaires gauches puis latéro-aortique sont le relais. L’uretère distal se draine dans les

chaînes lymphatiques iliaques gauches. Du côté droit, les cavités pyélocalicielles et

l’uretère proximal sont drainés par le réseau lymphatique dont les ganglions hilaires

droit puis latéro- et rétro-cave sont le relais. L’uretère distal se draine dans les chaînes

lymphatiques iliaques droites [57,58]. Lorsque les cellules tumorales ont envahi les

premiers relais ganglionnaire, l’extension se poursuit le long des gros vaisseaux

prévertébraux vers le canal thoracique, le médiastin et les ganglions sus-claviculaires.

Outre le grade et le stade, l’envahissement ganglionnaire serait directement en rapport

avec la lymphoangiogenèse et la densité de tissu lymphatique péri-tumorale [59].

Certains auteurs ont également rapporté une origine monoclonale des métastases

ganglionnaires au cours de la carcinogenèse urothéliale. Ainsi, le potentiel

métastatique des TVEUS serait lié à la prolifération et à la dissémination d’une

population clonale unique à partir de la tumeur primitive [60]. L’envahissement

vasculaire tumoral précède l’apparition de métastases ganglionnaires [61]et constitue

un facteur pronostique postopératoire majeur des TVEUS localisées [62–64]. Une

augmentation du nombre de copie d’ADN sur différentes régions chromosomiques et

la surexpression de Pak1 modulé par l’activité de Rac1 sont des éléments

déterminants de l’envahissement vasculaire tumoral et du développement de

(25)

2.3. Envahissement métastatique

Rarement révélatrices de la maladie, les métastases extra-ganglionnaires des TVEUS

sont les localisations pulmonaires (52 %), hépatique (33 %) et osseuses (26 %)

[66,67]. Elles surviennent le plus souvent au cours de la surveillance après chirurgie

d’exérèse mais ne concerneraient que 16 à 26 % des patients. Comme pour

l’extension ganglionnaire, le grade, le stade tumoral et l’envahissement vasculaire

tumoral ont un rôle prépondérant dans l’apparition des métastases qui expriment une

certaine clonalité [68]. Par ailleurs, les métastases pulmonaires sont plus fréquemment

observées au cours de l’évolution des tumeurs des cavités pyélocalicielles [69].

D. Objectif

L’objectif de ce travail était de caractériser l’évolution des TVEUS aussi bien sur le

plan de la récidive intra-vésicale que sur celui de la récidive locale et métastatique,

avec la recherche de facteurs prédictifs cliniques, anatomopathologiques et

(26)

II. RÉCIDIVE INTRA-VÉSICALE

A. Epidémiologie et méta-analyse des facteurs prédictifs de récidive intra-vésicale après néphrourétérectomie totale

(27)
(28)
(29)
(30)
(31)
(32)
(33)
(34)
(35)
(36)
(37)
(38)

B. Recherche de la mutation FGFR3 sur l’ADN urinaire pour la prédiction du risque de récidive intra-vésicale

1. Introduction

Malgré l’existence de certaines différences, la carcinogénèse des TVEUS et des

tumeurs de vessie semblent présenter d’importantes bases communes [70]. Le

principal proto-oncogène impliqué dans la carcinogénèse urothéliale est le gène

FGFR3 qui code pour le récepteur des facteurs de croissance fibroblastique (Figure

2). Ce gène est situé sur le bras court (p) du chromosome 4 à la position 16.3 allant

de la paire de bases 1.793.298 à 1.808.871 (Figure 6).

Figure 6 : Localisation du gène FGFR3

Ainsi, selon les études, une mutation de ce gène est retrouvée dans 40 à 50 % des

tumeurs de vessie et des TVEUS [4]. A ce jour, huit principales mutations touchant

trois exons de ce gène (exons 7, 10 et 15) ont été identifiées et conduiraient à une

activation constitutionnelle du récepteur FGFR3 indépendante de son ligand [5,6].

Cependant, seule 4 d’entre elles situées sur les exons 7 (R248C, S249C) et 10 (G372C

et Y375C) représentent 95% des cas de mutations.

Par immunohistochimie, un marquage positif pour FGFR3 a été observé dans 61,5%

des TVEUS [7]. Comme pour le cancer de vessie, les mutations sont retrouvées avec

(39)

(53 %) [7]. De même, elles sont plus fréquentes dans les TVEUS localisées au niveau

de l’uretère (50%) que celles situées dans les cavités pyélocalicielles (34% ) [7]. Enfin,

plusieurs études ont rapporté un risque de progression et, surtout, de mortalité

spécifique moins important chez les patients présentant une TVEUS avec une

mutation de FGFR3 confirmant ainsi les résultats préalablement rapportés dans le

domaine du cancer de la vessie [7–9].

D’un point de vue clinique, la présence de ces mutations peut être recherchée à partir

de l’ADN extrait de l’urine des patients puisqu’il semble exister une excellente

corrélation entre la présence de cette mutation sur l’ADN urinaire et tumorale

[6,46,71,72]. La mutation de FGFR3 détectée à partir de l’ADN urinaire pourrait donc

constituer un marqueur intéressant pour confirmer le diagnostic initial de TVEUS [10]

mais également pour évaluer le risque de récidive de la maladie et notamment au

niveau vésical.

L’objectif de cette étude était donc d’analyser l’intérêt de rechercher la mutation de

FGFR3 sur l’ADN urinaire afin d’évaluer simplement le risque de récidive intra-vésicale

après néphrourétérectomie totale pour le traitement d’une TVEUS.

2. Matériel et méthode 2.1. Patients

Entre 2004 et 2006, 46 patients ont été traités par néphrourétérectomie totale à

l’hôpital Tenon pour une TVEUS localisée. La néphrourétérectomie totale était réalisée

par voie ouverte ou laparoscopique avec l’exérèse systématique d’une collerette

vésicale par voie extra-vesicale ou endoscopique. Aucun patient n’avait reçu de

chimiothérapie ou radiothérapie néo-adjuvante et les autres données cliniques péri

opératoires ou de suivi ont été recueillies dans une base de données anonymisée.

Tous les patients sélectionnés ont reçu une information claire, loyale et appropriée

(40)

2.2. Prélèvements et préparation des échantillons

Les urines de chaque patient sélectionné ont été prélevées en début d’intervention

après la pose de la sonde vésicale. Les échantillons urinaires de 50 cc ont été

conservés à température ambiante et acheminés vers le laboratoire de recherche

génétique afin d’être préparés. Après une centrifugation à 1600 rotations par minute

(RPM) pendant 5 minutes, le surnageant a été éliminé et le culot urinaire a été

transféré dans un microtube pour être à nouveau centrifugé à 5000 RPM pendant 2

minutes. Le surnageant a été une nouvelle fois éliminé avant d’ajouter un tampon de

PBS qui permet un lavage. Le culot urinaire a alors été conservé à -20°C.

2.3. Extraction de l’ADN urinaire

L’extraction de l’ADN urinaire a été réalisée selon le protocole du Kit « QIAamp DNA »

de Qiagen®. Après une centrifugation à 5000 rotations par minute, le surnageant a été

éliminé pour ajouter dans chaque tube, 200 µL de tampon ATL qui permet la lyse

cellulaire et 20 µL de protéinase K qui permet de digérer les protéines et d’enlever les

contaminants. Après une incubation pendant 2 heures à 56°C au bain-marie, 200 µL

du tampon AL et 20 µL de protéinase K ont été rajoutés une nouvelle fois afin de

finaliser la digestion enzymatique pendant 10 minutes à 64 ° C au bain-marie.

Après les 10 minutes d’incubation, 200 µL d’éthanol 100 % permettant de précipiter

l’ADN ont été rajoutés et le mélange a été transféré sur des colonnes de purification

(Figure 7). Le principe de ces colonnes est l’interaction spécifique entre des

phosphates négativement chargés de l’acide nucléique et les molécules de surface

positivement chargées du substrat. Ces colonnes retiennent donc les molécules

chargées négativement comme l’ADN et le tube collecteur doit être changé après

(41)

Figure 7 : Colonne de purification avec tube collecteur (A=membrane)

Une première centrifugation à 8000 RPM a été réalisée pendant 1 minute. Les étapes

de lavage ont ensuite été réalisées en ajoutant d’abord 500 µL de AW1 dans chaque

tube avant une nouvelle centrifugation à 8000 RPM pendant 1 minute, puis en ajoutant

500 µL de AW2 dans chaque tube avant une nouvelle centrifugation à 12000 RPM

pendant 3 minutes. Les colonnes de purification ont ensuite été transférées sur des

microtubes. Après avoir ajouté 70 µL du tampon de dilution AE afin de dépolariser la

membrane de chaque colonne de purification et décrocher l’ADN, les prélèvements

ont été laissés reposer pendant 5 minutes. Une nouvelle centrifugation à 8000 RPM a

été réalisée pendant 1 minute. Enfin les éluâts ont été prélevés dans les microtubes

pour être redéposés sur les colonnes de purification afin d’être centrifugés une

dernière fois à 8000 RPM pendant1 minute.

2.4. Quantification de l’ADN au NanoDrop®

Le spectrophotomètre NanoDrop® a été utilisé afin de quantifier l’ADN extrait de

chaque prélèvement (Figure 8). Plus de 40 ng d’ADN était disponible pour chaque

prélèvement, ce qui était amplement suffisant pour rechercher une mutation de

(42)

Figure 8: NanoDrop®

2.5. Procédure de génotypage de FGFR3 selon la technique de taille de fragments

Le génotypage des principales mutations de FGFR3 a été réalisé à l’aide de primers

spécifiques des mutations [73]. La PCR est une PCR multiplex où sont réunis les

primers pour amplifier chacune des mutations. Les mutations recherchées

appartiennent à 2 exons (Tableau 1) : l’exon 7 (codon 248 : R248C : CGC -> TGC ;

codon 249 : S249C : TCC -> TGC) et l’exon 10 (codon 372 : G372C : GGC -> TGC ;

codon 375 : Y375C : TAT -> TGT)

Tableau 1 : Séquence des exons 7 et 10 (Exon en rouge, Intron en noir, mutations surlignées en jaune) Exon Séquence 7 GTGAGGGCCCTGGGGCGGCGCGGGGGTGGGGGCGGCAGTGGCGGTGGTGGTGAGG GAGGGGGTGGCCCCTGAGCGTCATCTGCCCCCACAGAGCGCTCCCCGCACCGGCCC ATCCTGCAGGCGGGGCTGCCGGCCAACCAGACGGCGGTGCTGGGCAGCGACGTGGA GTTCCACTGCAAGGTGTACAGTGACGCACAGCCCCACATCCAGTGGCTCAAGCACGTG GAGGTGAATGGCAGCAAGGTGGGCCCGGACGGCACACCCTACGTTACCGTGCTCAAG GTGGGCCACCGTGTGCACGTGGGTGCCGCCGCTGGGGCTCCTGGGCTGGCCCCAAG GGTGCCCCTTGGCTGCGGGTTGCGTGAGGA 10 CTGAGGTTCTGAGCCCCCTTCCGCTCCCAGTGGTGCCTGCGGCTCTGGGCCAGGGGC ATCCATGGGAGCCCCGTGGGGGGGGGGGCCAGGCCAGGCCTCAACGCCCATGTCTT TGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCA TCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCT CTGCCGCCTGCGCAGCCCCCCCAAGAAAGGCCTGGGCTCCCCCACCGTGCACAAGAT CTCCCGCTTCCCGCTCAAGCGACAGGTAACAGAAAGTAGATACCAGGTTCTGAGCTGC CTGCCCGCCAGGCCTCCTGGAGCCCCACCTCGG

(43)

2.5.1. PCR Multiplex

L’ADN extrait des prélèvements a été dilué à une concentration de 4 ng/ µl dans un

volume minimal de 10 µl. Deux mélanges de PCR multiplex distinct ont été préparés

puisque les primers pour les codons 248 et 249 d’une part et 372 et 375 d’autre part,

présentent de grandes similitudes. Cependant, il est possible de mélanger les primers

pour les codons 248 et 372 d’une part et 249 et 375 d’autre part. Des primers de

globine ont été ajoutés au mélange afin d’utiliser ce gène comme témoin

d’amplification et valider ainsi la manipulation. Chaque primer était marqué avec un

fluorochrome différent (Tableau 2).

Tableau 2: Séquences des primers des codons 248, 249, 372, 375 et de la globine

Codon Primers 248-249 - FGFR3-F248-9 : 6-FAM-CAG-TGG-CGG-TGG-TGG-TGA-GG - FGFR3-R248 : ATG-GGC-CGG-TGC-GGG-GAC-CA - FGFR3-R249 : CAG-GAT-GGG-CCG-GTG-CGA-GC 372-375 - FGFR3-F372-375 : HEX-ATG-TCT-TTG-CAG-CCG-AGG-AGG-AG - FGFR3-R372 : AGC-TGA-GGA-TGC-CGG-CAT-ACA-CAC-TGC-A - FGFR3-R375 : ACC-CCG-TAG-CTG-AGG-ATG-CCT-TGA-C Globine - GLO-F : NED-CCT-TTG-GGG-ATC-TGT-CCA-CTC-CTG-A

- GLO-R : GTT-GTC-CAG-GTG-AGC-CAG-GCC-AT

En plus des primers spécifiques, chaque mélange contenait un tampon buffer, du

MgCl2 neutralisant les charges négatives des groupements phosphates au niveau de

l’ADN, du DMSO permettant d’améliorer les rendements et les spécificités de la PCR,

des dNTP (mélange des 4 désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP))

permettant d’allonger les brins d'ADN néosynthétisés, de l’eau et la polymérase

permettant la synthèse de nouveaux brins d'ADN complémentaire de la séquence cible

(44)

Tableau 3 : Mélange de la PCR afin de rechercher les mutations des codons 248 et 372

[INITIALE] [FINALE] Volume/puit (µl)

Tampon Buffer II 10 X 1 X 2 MgCl2 25 mM 2,5 mM 2 DMSO 100% 5% 1 dNTP 10 mM 0,2 mM 0,4 Primer 248 F 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer 248 R 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer 372 F 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer 372 R 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer GLO F 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer GLO R 20 µM 0,2 µM 0,2 Polymérase 5 UI/µl 2 UI 0,4 H20 qsp 15 µl 8

Tableau 4 : Mélange de la PCR afin de rechercher les mutations des codons 249 et 375

[INITIALE] [FINALE] Volume/puit (µl)

Tampon Buffer II 10 X 1 X 2 MgCl2 25 mM 2 mM 1,6 DMSO 100% 10% 2 dNTP 10 mM 0,2 mM 0,4 Primer 249 F 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer 249 R 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer 375 F 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer 375 R 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer GLO F 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer GLO R 20 µM 0,2 µM 0,2 Polymérase 5 UI/µl 2 UI 0,4 H20 qsp 15 µl 7,4

Sur la plaque de PCR, 15µl d’un des 2 mélanges et 5µl d’ADN à 4 ng/ µl ont été placés

dans des puits séparés. Chaque échantillon a donc été amplifié avec les 2 mélanges.

Des échantillons témoins provenant de patients présentant chacune des 4 mutations

ont également été utilisés afin de valider les primers. Par ailleurs, un blanc d’extraction

et un échantillon contenant de l’eau ont permis de s’assurer de l’absence de

contamination lors de l’extraction ou au moment de la PCR, respectivement. Le

(45)

Tableau 5: Protocole de PCR multiplex

Température Durée d’1 cycle Nombre de cycles Durée totale

95°C 5 mn 1 cycle 1h15 95°C 15 sec 35 cycles 61°C 15 sec 72°C 15 sec 72°C 7mn 1 cycle 4°C ∞ 1cycle

2.5.2. Analyse des fragments d’ADN au séquenceur

Après amplification, les échantillons étaient trop concentrés pour être envoyés

directement en analyse au séquenceur. Les produits de PCR ont donc été dilués au

1/25ème. Un mélange de formaldéhyde et de marqueur de taille (Genescan 55) a ensuite été préparé afin d’être ajouté au produit de dilution de la PCR. Chaque puit de

la plaque du séquenceur contenait donc 15µl de mélange formaldéhyde et marqueur

de taille ainsi que 5µl d’ADN. Une plaque de séquenceur était donc composée de 16

puits à remplir puisque le séquenceur était composé de 16 capillaires de 50cm. Il

s’agissait d’un séquenceur utilisant un système d’électrophorèse capillaire avec une

grande rapidité de migration et une bonne automatisation. Après la migration des

fragments sur les capillaires, les données de fluorescence étaient récupérées au

niveau d’une cellule de détection et transmises vers une caméra CCD pour être

analysées par une plate-forme PC qui commandait également le remplissage des

capillaires et l’injection des échantillons (Figure 9).

(46)

L’analyse des résultats a été réalisée grâce au logiciel GeneMapper. Le fragment

correspondant à la globine était à environ 110 pb (fluorescence noire). Une mutation

du codon 248 donnait un fragment à 76 pb (fluorescence bleue, Figure 10).

Figure 10 : Mutation du codon 248 (R248C)

Une mutation du codon 249 donnait un fragment à 79 pb (fluorescence bleue, Figure

11).

(47)

Une mutation du codon 372 donnait un fragment à 72 pb (fluorescence verte, Figure

12).

Figure 12: Mutation du codon 372 (G372C)

Une mutation du codon 375 donnait un fragment à 76 pb (fluorescence verte, Figure

13).

(48)

Afin de vérifier l’absence de contamination lors des manipulations, les échantillons

correspondant au blanc d’extraction ou à l’eau ont été contrôlés (Figure 14)

Figure 14 : Absence de mutation décelée sur le blanc d’extraction ou l’eau

2.6. Analyse anatomopathologique de la pièce opératoire

L’analyse anatomopathologique des pièces de néphrourétérectomie totale a été

effectuée selon des procédures standardisées. La stadification tumorale était réalisée

selon la classification TNM publiée en 2002 par l’union internationale contre le cancer

[74] et le grade tumoral était définit selon la classification publiée en 1998 par la société

internationale d’uro-pathologie [75]. La localisation tumorale était définit comme

pyélocalicielle ou urétérale [53]. La multifocalité tumorale était définit comme la

présence synchrone de plus de 2 localisations tumorales (pyélocalicelle ou urétérale)

[76]. L’envahissement lymphovasculaire était définit comme la présence visible de

cellules cancéreuses dans les vaisseaux lymphatiques ou sanguins [77].

Une analyse immunohistochimique de la pièce opératoire a été systématiquement

(49)

inclus dans cette étude ne présentait de perte d’expression de hMSH2, hMLH1 et

hMSH6 [23].

2.7. Suivi

Les patients étaient suivis tous les trois à quatre mois pendant la première année après

la néphrourétérectomie totale, tous les 6 mois de la deuxième année à la cinquième

année, puis annuellement. Le suivi consistait en un examen clinique complet, un bilan

sanguin, une cytologie urinaire, un scanner thoraco-abdomino-pelvien régulier et une

évaluation cystoscopique régulière des parois de la vessie. La scintigraphie osseuse

et le scanner cérébral étaient réalisés uniquement sur signes d’appel.

La récidive intra-vésicale était définit comme la survenue d’une tumeur de vessie non

infiltrant ou infiltrant le muscle dans les suites d’une néphrourétérectomie totale pour

le traitement d’une TVEUS. Seules les récidives prouvées histologiquement étaient

considérées comme récidive intra-vésicale.

2.8. Analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été réalisées grâce au logiciel R (version 3.1.0; R

Foundation for Statistical Computing, Vienne, Autriche). Les résultats étaient rapportés

sous forme de moyenne [IQR] pour les variables continues et sous forme de

pourcentage pour les variables catégorielles. Le test de Shapiro-Wilk a été utilisé pour

évaluer la distribution des variables. Les tests de Student et Mann-Whitney ont été

utilisés pour comparer les variables continues avec une distribution normale et

non-normale, respectivement. Le test du chi-squared a été utilisé pour comparer les

variables catégorielles. La significativité était définit par une valeur de p < 0,05.

La survie sans récidive intra-vésicale en fonction du statut mutationnel FGFR3 a été

analysée grâce à la méthode de Kaplan Meier. Le test du log-rank a permis de

comparer les courbes de survie sans récidive intra-vésicale des patients mutés et

(50)

Les facteurs de risque cliniques et anatomopathologiques de récidive intra-vésicale

après néphrourétérectomie totale pour le traitement d’une TVEUS ainsi que le statut

mutationnel FGFR3 ont été étudiés en analyse univariée. Seule les variables

significatives ont été inclues dans un modèle multivarié de Cox afin de déterminer les

facteurs prédictifs indépendants de récidive intra-vésicale.

3. Résultats

3.1. Population

Une mutation du gène FGFR3 était retrouvée sur l’ADN urinaire de 21 (46%) patients

parmi les 46 inclus dans cette étude. La répartition des différentes mutations du gène

FGFR3 sont présentées dans le Tableau 6.

Tableau 6 : Répartition des différentes mutations du gène FGFR3

Exon 7 10 7 10

Codon 249 375 248 372

Mutation S249C Y375C R248C G372C

n (%) 13 (61%) 4 (19%) 2 (10%) 2 (10%)

Les caractéristiques cliniques et anatomopathologiques de la population d’étude en

fonction du statut mutationnel FGFR3 sont rapportées dans le Tableau 7. Les

proportions d’hommes (81% vs 52% ; p=0,04) et de TVEUS localisées au niveau de

l’uretère (57% vs 40 ; p=0,04) étaient significativement plus importantes chez les

patients présentant une mutation du gène FGFR3 sur l’ADN urinaire. De même, sur le

plan anatomopathologique, les proportions de tumeurs superficielles (81% vs 36% ;

p<0,001), de bas grade (67% vs 8% ; p<0,001), sans CIS concomitant (10% vs 40% ;

p<0,001) et sans envahissement lymphovasculaire (5% vs 60% ; p<0,001) étaient plus

importantes chez les patients mutés. Il n’existait aucune autre différence significative

en termes de caractéristiques cliniques et anatomopathologiques entre les groupes de

(51)

Au total, 13 (28%) patients ont présenté une récidive intra-vésicale après un délai

médian de 19,9 [15-27] mois. Le taux de récidive intra-vésicale était significativement

plus élevé dans le groupe de patient présentant une mutation de FGFR3 (43% vs 16% ;

p=0,04) mais le délai de récidive était plus court dans le groupe de patients sauvages

bien qu’il s’agissait d’une différence non significative (21,7 mois vs 16 mois ; p=0,33).

Tableau 7 : Caractéristiques cliniques et anatomopathologiques de la population d’étude en fonction du statut mutationnel FGFR3

Caractéristiques Population totale FGRFR3 sauvage FGFR3 muté p

Nombre de patients (%) 46 (100) 25 (54) 21 (46) -

Age médian [IQR] 64 [53-77] 66 [55-79] 63 [52-74] 0,21 Sexe - Homme (%) - Femme (%) 30 (65) 16 (35) 13 (52) 12 (48) 17 (81) 4 (19) 0,04 Statut tabagique - Fumeur - Non-fumeur 18 (39) 28 (61) 11 (44) 14 (66) 7 (33) 14 (77) 0,38 Antécédent de tumeur de vessie 11 (24) 4 (16) 7 (33) 0,17 Cytologie urinaire préopératoire

- Positive - Négative 30 (65) 16 (35) 18 (72) 7 (38) 12 (57) 9 (43) 0,07 Localisation tumorale - Cavités pyélocalicielles (%) - Uretère (%) 24 (52) 22 (48) 15 (60) 10 (40) 9 (43) 12 (57) 0,04 Multifocalité tumorale 21 (46) 12 (48) 9 (43) 0,94 Néphroureterectomie - Ouverte (%) - Laparoscopique (%) 12 (26) 34 (74) 5 (20) 20 (80) 7 (33) 14 (77) 0,29 Exérèse de la collerette vésicale

- Extra vésical (%) - Endoscopique (%) 38 (83) 8 (17) 19 (76) 6 (24) 19 (90) 2 (10) 0,75 Stade T - Superficiel (%) - Infiltrant (%) 26 (57) 20 (43) 9 (36) 16 (64) 17 (81) 4 (19) <0,001 Stade N - pN+ (%) - pNx/N0 (%) 5 (11) 41 (89) 5 (20) 20 (80) 0 (0) 21 (100) 0,36 Grade - Haut (%) - Bas (%) 30 (65) 16 (35) 23 (92) 2 (8) 7 (33) 14 (67) <0,001 CIS concomittant (%) 12 (26) 10 (40) 2 (10) < 0,001 Envahissement lymphovasculaire (%) 16 (35) 15 (60) 1 (5) < 0,001

Récidive intra vésicale (%) 13 (28) 4 (16) 9 (43) 0,04

Délia médian avant récidive vésicale [IQR] 19,9 [15-27] 16 [15-17] 21,7 [18-27] 0,33 Suivi [IQR] 65,7 [13-118] 62,1 [12-105] 69,7 [19-124] 0,41

(52)

3.2. Analyse de la survie sans récidive intra-vésicale

Les courbes de survie sans récidive intra-vésicale en fonction du statut mutationnel

FGFR3 sont présentées sur la Figure 15. La probabilité de survie sans récidive

intra-vésicale à 2 ans après la néphrourétérectomie totale était de 74% et 82% dans le

groupe des patients mutés et sauvages, respectivement. La probabilité de survie sans

récidive intra-vésicale à 5 ans après la néphrourétérectomie totale était de 52% et 82%

dans le groupe des patients mutés et sauvages, respectivement. Cependant, cette

différence n’était pas significative (p=0,12).

Figure 15 : Courbes de survie de Kaplan Meier en fonction du statut mutationnel FGFR3

3.3. Facteur prédictifs de récidive intra-vésicale

Les résultats des analyses uni et multivariées des facteurs prédictifs de récidive

(53)

(HR2,93 ; IC 95%=[1,74-9,31] ; p=0,004), l’antécédent de tumeur de vessie (HR=2,35 ;

IC 95%=[1,87-4,78] ; p=0,001), la cytologie urinaire préopératoire positive (HR=2,61 ;

IC 95%=[1,19 ; IC 95%=[1,22-6,45] ; p=0,001), la localisation tumorale urétérale

(HR=1,74 ; IC 95%=[1,23-2,36] ; p=0,003), la multifocalité tumorale (HR=2,97 ; IC

95%=[1,51-4,96 ] ; p<0,001), l’exérèse extra vésicale de la collerette vésicale au cours

de la néphrourétérectomie totale (HR=1,19 ; IC 95%=[1,03-1,57] ; p=0,04), le stade

tumoral infiltrant (HR=1,91 ; IC 95%=[1,18-2,98] ; p=0,002), le haut grade tumoral

(HR=1,32 ; IC 95%=[1,02-1,99] ; p=0,03) et la présence d’une mutation FGFR3 sur

l’ADN urinaire (HR=2,72 ; IC 95%=[1,57-8,66] ; p=0,04) étaient des facteurs prédictifs

significatifs de récidive intra-vésicale.

En analyse multivariée, le tabagisme actif (HR=2,42 ; IC 95%=[1,67-5,80] ; p=0,006),

l’antécédent de tumeur de vessie (HR=2,14 ; IC 95%=1,66-4,34] ; p<0,001), la

cytologie urinaire préopératoire positive (HR= 2,25 ; IC 95%=[1,38-4,09] ; p<0,001), la

localisation tumorale urétérale (HR=1,55 ; IC 95%=[1,19-2,47] ; p=0,002) , la

multifocalité tumorale (HR=2,69 ; IC 95%=[1,31-4,72] ; p<0,001) et le stade tumoral

infiltrant (HR=1,78 ; IC 95%=[1,11-2,19] ; p=0,004) étaient des facteurs prédictifs

indépendants de récidive intra-vésicale. Cependant, la mutation du gène FGFR3

n’était plus significativement corrélée à la récidive intra-vésicale (HR=2,39 ; IC

(54)

Tableau 8 : Analyses uni et multivariée des facteurs prédictifs de récidive intra-vésicale après néphrourétérectomie totale

Variables Analyse univariée Analyse multivariée HR [IC 95%] p HR [IC 95%] p Age 1,07 [0,67-2,46] 0,75 - - e - Homme 1 1,08 [0,74-1,81] 0,19 - - Statut tabagique - Non-fumeur - Fumeur 1 2,93 [1,74-9,31] 0,004 1 2,42 [1,67-5,80] 0,006 Antécédent de tumeur de vessie - Absent - Présent 1 2,35 [1,87-4,78] 0,001 1 2,14 [1,66-4,34] <0,001 Cytologie urinaire préopératoire - Négative - Positive 1 2,61 [1,22-6,45] 0,001 1 2,25 [1,38-4,09] <0,001 Localisation tumorale - Cavités pyélocalicielles - Uretère 1 1,74 [1,23-2,36] 0,003 1 1,55 [1,19-2,47] 0,002 Multifocalité tumorale - Absente - Présente 1 2,97 [1,51-4,96] <0,001 1 2,69 [1,31-4,72] <0,001 Néphrouréterectomie - Ouverte - Laparoscopique 1 1,22 [0,91-2,79] 0,11 - - Exérèse de la collerette vésicale - Endoscopique - Extra vésicale 1 1,19 [1,03-1,57] 0,04 1 1,12 [0,83-1,46] 0,28 Stade T - Superficielle - Invasive 1 1,91 [1,18-2,98] 0,002 1 1,78 [1,11-2,19] 0,004 Stade N - pN+ - pNx/N0 1 1,09 [0,72-1,84] 0,32 - - Grade - Bas - Haut 1 1,32 [1,02-1,99] 0,03 1 1,05 [0,65-1,38] 0, 67 CIS concomitant - Présent - Absent 1 1,13 [0,78-1,86] 0,44 - - Envahissement lymphovasculaire - Présent - Absent 1 1,04 [0,64-1,35] 0,16 - - Mutation FGFR3 - Absente - Présente 1 2, 72 [1,57- 8,66] 0,04 1 2,39 [0,78-6,98] 0,09

(55)

4. Discussion

Le développement des TVEUS à partir de l’urothélium des cavités pyélocalicielles ou

de l’uretère est parfois unifocal mais ces tumeurs sont plus souvent capables de

proliférer de façon synchrone ou métachrone sur plusieurs sites de l’arbre urinaire

expliquant ainsi leur fréquente multifocalité au diagnostic initial ou l’existence de

récidive dans le haut comme le bas appareil urinaire. Comme dans le domaine du

cancer de la vessie, les hypothèses de la mono et oligo clonalité s’opposent afin

d’expliquer ce phénomène caractéristique du carcinome urothélial quelle que soit sa

localisation [34].

Les résultats de notre étude ont également mis en évidence des arguments cliniques

en faveur de l’implication des mécanismes de la mono et oligoclonalité dans la récidive

intra-vésicale après néphrourétérectomie totale pour le traitement des TVEUS.

L’implication de la multifocalité tumorale dans l’augmentation du risque de récidive

intra-vésicale illustrait d’ailleurs la coexistence de ces deux théories. Cependant, la

présence de cellules tumorales dans la voie excrétrice urinaire, détectée grâce à la

cytologie urinaire pré opératoire, ou la fragilité de l’adhésion intercellulaire des tumeurs

infiltrantes favorisant la dissémination intraluminale des cellules tumorales étaient

plutôt en faveur de la première hypothèse. L’augmentation du risque de récidive

intra-vésicale liée à la localisation urétérale des TVEUS postulait également en faveur de la

théorie de la monoclonalité compte tenu de la proximité anatomique entre l’uretère et

la vessie.

Il semblait également exister certains arguments cliniques en faveur du mécanisme de

cancérisation par plage. En effet, le contact répété des métabolites du tabac avec

l’urothélium pouvait alors expliquer selon cette hypothèse, le risque accru de récidive

intra-vésicale chez les patients présentant un tabagisme actif. De même, l’implication

(56)

confirmé que les localisations tumorales urothéliales métachrones se développant à

partir du bas comme du haut appareil urinaire pouvaient être secondaire à différentes

cellules tumorales ayant acquises des altérations génétiques distinctes.

Cette étude est la première à analyser le rôle de la mutation FGFR3 dans l’apparition

d’une récidive intra-vésicale après néphrourétérectomie totale pour le traitement d’une

TVEUS. Nous avons démontré que les patients porteurs d’une mutation FGFR3 sur

l’ADN urinaire présentaient une diminution importante de la survie sans récidive

intra-vésicale. Cependant, la différence avec les patients non mutés était non significative.

Par ailleurs, la présence d’une mutation FGFR3 était significativement corrélée à une

augmentation du risque de récidive intra-vésicale en analyse univariée mais elle n’était

pas un facteur de risque indépendant en analyse multivariée. La taille réduite de notre

population d’étude ainsi que le faible nombre de patients ayant récidivés pourraient

expliquer l’absence de différence significative entre les 2 groupes mais il semble

toutefois exister une forte tendance en faveur d’une augmentation du risque de récidive

intra-vésicale chez les patients mutés. Ces résultats postulent également en faveur de

la théorie de la dispersion intraluminale puisque la détection de cellules tumorales avec

certaines anomalies génétiques pourrait être responsable de l’augmentation du risque

de récidive intra-vésicale.

La détection d’une mutation de FGFR3 sur l’ADN urinaire avait déjà démontré un

intérêt dans la prédiction du risque de récidive intra-vésicale des tumeurs de vessie

non infiltrant le muscle [78]. En effet, la présence de cette mutation semble être

significativement corrélée au risque de développer une récidive intra-vésicale après la

résection endoscopique de tumeur de vessie.

5. Conclusion

Les facteurs de risque clinique de récidive intra-vésicale après néphrourétérectomie

(57)

mono et oligoclonalité. La détection de la mutation FGFR3 dans les urines pourrait

constituer un élément supplémentaire en faveur de la dissémination intraluminale d’un

clone tumoral unique. Cependant, il faudrait analyser les résultats d’une plus grande

cohorte de patients afin de pouvoir éventuellement mettre en évidence une différence

significative entre le risque de récidive intra-vésicale des patients mutés et non mutés.

En cas de résultats positifs, la détection de la mutation de FGFR3 sur l’ADN urinaire

pourrait servir de biomarqueur afin de dépister les patients les plus à risque de récidive

intra-vésicale et qui doivent donc se voir proposer des instillations intra vésicales post

(58)

III. RÉCIDIVE LOCOREGIONALE ET MÉTASTATIQUE

D. Intérêt de la sous-stratification des tumeurs urothéliales pT3 de la voie excrétrice urinaire supérieure

(59)

(60)

(61)

(62)

(63)

(64)

(65)

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