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Caractérisation de l’évolution des tumeurs urothéliales
de la voie excrétrice urinaire supérieure après
néphrourétérectomie totale
Thomas Seisen
To cite this version:
Thomas Seisen. Caractérisation de l’évolution des tumeurs urothéliales de la voie excrétrice urinaire supérieure après néphrourétérectomie totale. Urologie et Néphrologie. Sorbonne Université, 2018. Français. �NNT : 2018SORUS486�. �tel-02614224�
Ecole doctorale ED 394
Groupe de Recherche Clinique GRC N°5, Institut Universitaire de Cancérologie, Médecine Sorbonne Université, Hôpital Tenon, Bâtiment Recherche
CARACTÉRISATION DE L’ÉVOLUTION DES TUMEURS UROTHÉLIALES DE LA VOIE EXCRÉTRICE URINAIRE SUPÉRIEURE APRÈS
NÉPHROURÉTÉRECTOMIE TOTALE
Par Thomas Seisen
Thèse de doctorat de Sciences
Dirigée par le Pr Morgan Rouprêt
Présentée et soutenue publiquement le 05/12/2018
Devant un jury composé du :
Pr Marc-Olivier Bitker, PU-PH, Président du jury Pr Stéphane Oudard, PU-PH, Rapporteur
Pr Arnaud Méjean, PU-PH, Rapporteur Pr Eva Compérat, PU-PH, Membre Pr Morgan Rouprêt, PU-PH, Invité
REMERCIEMENTS
A MON PRESIDENT DE JURY
Monsieur le Professeur Marc-Olivier Bitker
Professeur des Universités - Praticien Hospitalier Service d’Urologie et de Transplantation Rénale Hôpital de la Pitié Salpêtrière, AP-HP
Médecine Sorbonne Université
Vous me faites l’honneur de présider le jury de cette thèse Vous êtes à l’origine de ma vocation alors que je n’étais encore qu’étudiant sur les bancs de la faculté de médecine de la Pitié Salpêtrière Je vous remercie pour votre attention de tous les instants concernant mes différents projets, votre écoute, et votre patience à prodiguer des conseils pertinents durant tout mon internat et clinicat Veuillez trouver ici l'expression de ma reconnaissance et de mon profond respect
A MES AUTRES JUGES
Monsieur le Professeur Arnaud Méjean
Professeur des Universités - Praticien Hospitalier Service d’Urologie et de Transplantation Rénale Hôpital Européen Georges Pompidou, AP- HP Université Paris 5, René Descartes
Vous me faites l’honneur de juger ce travail Vous êtes pour moi un modèle de rigueur scientifique et chirurgicale Je suis admiratif de votre immense carrière professionnelle ainsi que de tout ce que vous représentez pour l’urologie en France et par-delà les frontières
Veuillez trouver ici l'expression de mes respectueux remerciements
Monsieur le Professeur Stéphane Oudard
Professeur des Universités - Praticien Hospitalier Service d’Urologie et de Transplantation Rénale Hôpital Européen Georges Pompidou, AP-HP Université Paris 5, René Descartes
Vous me faites l’honneur de juger ce travail Vous faites parti des plus grands professeurs de cancérologie et votre nom rayonne dans notre communauté urologique Vos qualités de chercheur sont mondialement reconnues et je suis admiratif de votre réussite professionnelle tant sur le plan clinique que scientifique Veuillez trouver dans ce travail l’expression de mon immense respect
Madame le Professeur Eva Compérat
Professeur des Universités - Praticien Hospitalier Service d’Anatomopathologie
Hôpital Tenon, AP-HP
Médecine Sorbonne Université
Tu me fais l’honneur de juger ce travail Tu as été présente depuis le tout début de ma formation et tu m’as fait découvrir
l’anatomopathologie des tumeurs urologiques L’étendue de tes connaissances dans ce domaine est sans limite Tes qualités intellectuelles et relationnelles ont été indispensables à la réalisation de ce travail Je te dois beaucoup J'espère sincèrement me montrer digne de la confiance que tu m'accordes depuis le commencement
A MON DIRECTEUR DE THESE
Monsieur le Professeur Morgan Rouprêt
Professeur des Universités - Praticien Hospitalier Service d’Urologie et de Transplantation Rénale Hôpital de la Pitié Salpêtrière, AP-HP
Faculté de Médecine Paris 6
Tu m'as fait l'honneur de diriger cette thèse Je te remercie de tes précieux conseils, pour ton accueil chaleureux à chaque fois que j'ai sollicité ton aide ainsi que pour tes multiples encouragements Tu es mon maître à penser, celui à qui je dois tout ce que je suis devenu sur le plan professionnel Ta bienveillance à mon égard est pour moi une source perpétuelle de motivation J’espère avoir été digne de ta confiance et continuer à suivre ton exemple de rigueur
A CONSTANCE
Tu fais parti de ma vie depuis seulement 2 ans mais c’est comme si tu avais toujours été là. Ton soutient inconditionnel de tous les instants a été un élément essentiel à la réalisation de ce travail que je te dédis. La route est encore longue mais avec toi à mes côtés, je suis prêt à affronter toutes les épreuves.
A MA FAMILLE
Mes parents, ma sœur et mon grand-père, qui je l’espère, sont fiers de moi
Mes cousins, cousines, oncles et tantes qui ont chacun participé à ma culture
Tous ceux qui ne sont plus là pour voir ce que je suis devenu mais qui occupe une place particulière dans mon cœur
Bernadette et Jean-Marc qui ne font pas tout à fait partie de ma famille mais presque après tous ces étés passés en Corse
A MES AMIS
François et Jonathan avec qui on roule notre bosse depuis les bancs du lycée
Maxime, Laurent, Louis, Alexandre, Camille, et Claire pour ces fantastiques années d’externat et cette amitié qui nous unie depuis tout ce temps
Sébastien, Edouard et Loris que j’ai rencontré en première année de médecine et qui sont restés des amis fidèles
Nathalie, Sarah, Sophie, Antoine, Marie et Louis qui font également parti de mes amis très proches
Mathieu, et Maxime dont les aléas de la vie nous ont éloignés mais que j’ai toujours autant de plaisir à revoir même si c’est une fois par an
SOMMAIRE
I. GÉNÉRALITÉS ET OBJECTIF………p8
A. Epidémiologie des tumeurs urothéliales de la voie excrétrice urinaire supérieure………..p8 B. Carcinogénèse des tumeurs urothéliales de la voie excrétrice
urinaire supérieure………..p8 1. Oncogènes et gènes suppresseur de tumeur………p8 1.1. Principaux proto-oncogènes………p8 1.2. Gènes suppresseur de tumeur………..p10 1.3. Autres gènes candidats………...p12 1.3.1 Identifiés en immuno-histochimie……….p12 1.3.2 Identifiés par étude de méthylation………..p13 2. Hérédité génétique………..p13 2.1. Hérédité monogénique : syndrome HNPCC………p13 2.2. Hérédité multifactorielle………..p17
2.2.1 Généralités………p17 2.2.2 Principaux polymorphismes génétiques…………..p17 C. Bases moléculaires des risques évolutifs après néphrourétérectomie totale……….p18 1. Récidive intra-vésicale et développement clonal………p18 1.1. Monoclonalité : théorie de la dispersion intraluminale avec implantation cellulaire………..p19 1.2. Oligoclonalité : théorie de la cancérisation par plages de l’urothélium ………p19 1.3. Coexistence de la mono- et de l’oligoclonalité…………..p20 2. Récidive systémique………...p21 2.1. Envahissement locorégional………p21 2.2. Envahissement lymphatique………p22 2.3. Envahissement métastatique………...p23 D. Objectif………p23
II. RÉCIDIVE INTRA-VÉSICALE………p24
A. Epidémiologie et méta-analyse des facteurs prédictifs de récidive intra-vésicale après néphrouréterectomie totale………..p24
B. Recherche de la mutation FGFR3 sur l’ADN urinaire pour la prédiction du risque de récidive intra-vésicale………..p36 1. Introduction………..p36 2. Matériel et méthode………p37
2.1. Patients………p37 2.2. Prélèvements et préparation des échantillons…………..p38 2.3. Extraction de l’ADN urinaire………...p38 2.4. Quantification de l’ADN au NanoDrop®………..p39 2.5. Procédure de génotypage de FGFR3 selon la technique de taille de fragments……….p40 2.5.1. PCR Multiplex……….p41 2.5.2. Analyse des fragments d’ADN au séquenceur..p43 2.6. Analyse anatomopathologique de la pièce opératoire…p46 2.7. Suivi………..p47 2.8. Analyses statistiques………...p47 3. Résultats……….p48
3.1. Population………...p48 3.2. Analyse de la survie sans récidive intra-vésicale……….p50 3.3. Facteur prédictifs de récidive intra intra-vésicale………p50 4. Discussion………..p53 5. Conclusion.……….p54 III. RÉCIDIVE LOCOREGIONALE ET MÉTASTATIQUE………p56
A. Intérêt de la sous-stratification des tumeurs urothéliales pT3 de la voie excrétrice urinaire supérieure………...p56 B. Efficacité de la chimiothérapie adjuvante après néphrourétérectomie totale pour le traitement des tumeurs urothéliales de la voie excrétrice urinaire supérieure localement avancées………..p86 C. Caractérisation immunologique des tumeurs urothéliales de la voie excrétrice urinaire supérieure………..p101 1. Hétérogénéité des méthodologies évaluant l’expression de
2. Validation de la méthodologie permettant d’évaluer le statut PD1/PDL1des tumeurs de la voie excrétrice urinaire supérieure………...p107 2.1. Introduction………p107 2.1.1. Facteurs impliqués dans la variabilité des résultats
disponibles dans la littérature………p107 2.1.1.1. Le matériel tissulaire utilisé…………p107 2.1.1.2. Les anticorps utilisés………p108 2.1.2. Objectif de l’étude……….p110 2.2. Matériel et méthode………..p110 2.2.1. Sélection des échantillons……….p110 2.2.2. Construction des TMA………p111 2.2.3. Immunohistochimie……….p112 2.2.4. Interprétation des résultats………...p113 2.2.5. Analyses statistiques………..p113 2.3. Résultats……….p114 2.3.1. Caractéristiques de la population……….p114 2.3.2. Interprétation des marquages………p115 2.3.2.1. Interprétation et hétérogénéité du marquage anti PD-L1 (E1L3N et 28.8)...p116 2.3.2.2. Anticorps anti PD-1 (NAT105)…… …p119 2.3.3. Taux d'échantillons positifs pour les marquages de PD-L1 et PD-1……….p120 2.3.4. Analyse de la concordance des résultats des marquages PD-1 / PD-L1……….p121 2.3.4.1. En fonction du matériel utilisé………p121 2.3.4.2. En fonction des anticorps utilisés pour PD-L1……….p123 2.3.5. Association entre le statut PD-1 / PD-L1 et le stade
tumoral……….p124 2.4. Discussion………..p124 2.5. Conclusion...p129
IV. CONCLUSIONS………..p131
V. RÉFÉRENCES………p132
VI. TABLES DES ILLUSTRATIONS……….p144 VII. TABLES DES TABLEAUX………...p146 VIII. RÉSUMÉ………..p148
I. GÉNÉRALITÉS ET OBJECTIFS
A. Epidémiologie des tumeurs urothéliales de la voie excrétrice urinaire supérieure
Les carcinomes urothéliaux représentent la 4ème localisation tumorale chez l’homme en termes de fréquence, après le cancer de la prostate, le cancer du poumon et le
cancer colorectal [1]. La plupart d’entre eux sont des cancers de la vessie puisque
les tumeurs de la voie excrétrice urinaire supérieure (TVEUS) représentent seulement
5 à 10% des carcinomes urothéliaux [2]. Les TVEUS sont donc des tumeurs très rares,
avec une incidence annuelle estimée en France à 1 ou 2 nouveaux cas pour 100 000
habitants [3]. Il existe une prédominance masculine nette avec un rapport
homme/femme compris entre 3 et 4.
Ces tumeurs se développent à partir de l’urothélium des cavités pyélocalicielles ou de
l’uretère pour évoluer vers l’infiltration pariétale et la dissémination par voie
lymphatique ou hématogène. Il existe également un risque de dissémination dans
l’ensemble de la voie excrétrice urinaire, notamment responsable de localisations
vésicales synchrones ou asynchrones.
B. Carcinogénèse des tumeurs urothéliales de la voie excrétrice urinaire supérieure
1. Oncogènes et gènes suppresseur de tumeur 1.1. Principaux proto-oncogènes
Les proto-oncogènes codent pour des protéines qui régulent la prolifération cellulaire.
En cas de mutation activatrice, d’une translocation ou d’une amplification génique, ils
deviennent des oncogènes hyperactifs et sont responsables de la prolifération
cellulaire anarchique classiquement retrouvée au cours du développement d’un
cancer.
FGFR3 qui code pour le récepteur des facteurs de croissance fibroblastique. Ainsi,
une mutation de ce gène est retrouvée dans 40 à 50% des tumeurs de vessie et des
TVEUS [4]. À ce jour, huit mutations principales sur trois exons de ce gène (exons 7,
10 et 15) ont été identifiées et sont à l’origine d’une activation constitutionnelle du
récepteur FGFR3 indépendante de son ligand [5,6]. Un marquage positif pour FGFR3
en immunohistochimie a d’ailleurs été observé dans 61,5 % des TVEUS [7]. Comme
pour les tumeurs de la vessie, ces mutations sont plus fréquentes en cas de TVEUS
de bas grade (71 %) ou non invasive (53 %) [4]. De même, elles sont plus fréquentes
dans les tumeurs urétérales (50%) plutôt que pyélocalicielles (34 %) [4]. Enfin, un
risque de progression et, surtout, de mortalité spécifique réduite a été rapporté chez
les patients avec une TVEUS FGFR3 mutée en accord avec les données publiés dans
les tumeurs de la vessie [4,8,9]. La présence de ces mutations peut être recherchée
à partir de l’ADN extrait de l’urine des patients et constituerait donc un marqueur
intéressant pour confirmer le diagnostic initial ou détecter les récidives [10].
La famille des proto-oncogènes human epidermal growth factor receptor (HER) codant
pour des récepteurs transmembranaires à activité tyrosine kinase est également
impliquée dans la carcinogenèse des TVEUS. Ainsi, 50% des TVEUS seraient
positives pour EGFR (HER1) en immunohistochimie ; cette expression serait associée
non seulement aux stades et grades avancés, mais également, à la présence de
certains sous-types histologiques de mauvais pronostic comme l’inflexion épidermoïde
ou glandulaire. D’autre part, un marquage positif pour ERBB2 (HER2) a été observé
dans 39—53 % des TVEUS mais seuls 7—17 % d’entre elles présentaient une
surexpression de ce récepteur. Ceci également serait associé à des stades et grades
avancés, l’envahissement ganglionnaire et potentiellement aux récidives
Le dernier proto-oncogène impliqué dans le développement des TVEUS est le gène
PIK3CA qui code pour la sous-unité alpha de la phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate
3-kinase. Des mutations activatrices de ce proto-oncogène ont été mises en évidence
dans 13,6 % des tumeurs pyéliques. Ainsi une dérégulation de la voie de signalisation
PI3K/AKT (Figure 1) pourrait jouer un rôle dans la carcinogenèse des TVEUS [13].
Figure 1 : Fonctionnement du récepteur FGFR-3 par la voie PI3K/AKT
1.2. Principaux gènes suppresseur de tumeur
Un gène suppresseur de tumeur est un régulateur négatif de la prolifération cellulaire.
En cas de mutation ou de délétion de la région chromosomique contenant ce gène, la
perte ou l’altération de la fonction de sa protéine qui en résulte conduit à une levée
d’inhibition du cycle cellulaire, et donc, à une prolifération tumorale.
Le principal gène suppresseur de tumeur impliqué dans la carcinogenèse urothéliale
des altérations de l’ADN, l’induction de l’apoptose cellulaire et l’inhibition du cycle
cellulaire par l’inactivation du complexe enzymatique Cycline D/CDK4 chargé de
catalyser la phosphorylation de la protéine pRb responsable de la transition entre les
phases G1 et S (Figure 2). Certaines mutations de ce gène ont été identifiées dans
les TVEUS [14,15] dont notamment celles résultant de l’exposition à l’acide
aristolochique responsable d’un profil mutationnel très spécifique avec des
transversions de bases Adénine à Thymine [16]. La protéine p53 mutée est plus stable
que la protéine normale, ce qui pourrait donc expliquer la surexpression (plus de 10 à
20 % de cellules marquées) paradoxalement observée au cours des analyses en
immunohistochimie. Cette augmentation de l’expression de p53 serait corrélée à
l’apparition de TVEUS de stade ou de grade élevés tout comme dans la carcinogenèse
urothéliale vésicale [17], mais sa valeur pronostique reste encore discutée et n’a pu
être démontrée même au cours de plusieurs méta-analyses [18,19].
Le gène PTEN, situé en 10q23 et codant pour une phosphatase membranaire, est un
autre gène suppresseur important. En effet, une perte d’hétérozygotie et/ou une perte
d’expression de ce gène a été observée dans 25 à 37% des TVEUS, ce qui pourrait
conduire à une stimulation de la voie de signalisation PI3K/AKT (Figure 1) et donc à
Figure 2 : Voie de signalisation aboutissant à l’inactivation des protéines du rétinoblastome (pRB) responsable la phase gap 1 (G1) vers la phase synthesis (S) du cycle cellulaire
1.3. Autres gènes candidats
1.3.1. Identifiés en immuno-histochimie
L’expression de nombreuses protéines impliquées dans différentes voies de
signalisation ont permis d’identifier des biomarqueurs utilisables pour le pronostic des
TVEUS. Les protéines en question régulent le cycle cellulaire (p27, NFkB, Aurora A,
Stathmine, Caveoline-1, PTMA), le transport cellulaire (LAT1, GRP78), la signalisation
intracellulaire (AhR, COX2), l’angiogenèse (HIF), l’adhésion cellulaire (E-cadherine,
Parvivin , MMPs, UPIII) ou la transition épithélio-mésenchymateuse (Snail) [20]. À ce
jour, aucune mutation d’un des gènes correspondants n’a été rapportée dans les
régulation par d’autres gènes altérés au cours de la carcinogenèse. Une analyse
exhaustive de l’ensemble de ces biomarqueurs serait nécessaire afin de déterminer le
panel susceptible d’avoir une valeur pronostique indépendante.
1.3.2. Identifiés par étude de méthylation
L’épigénétique décrit l’ensemble des mécanismes moléculaires régulant l’expression
des gènes dont notamment la méthylation d’îlots dinucléotides Cytosine-Guanine
(CpG) situés dans les régions promotrices des gènes qui peut parfois être responsable
de leur inactivation. La méthylation des promoteurs des gènes hMLH1, RARB, p16,
p14, RASSF1A, MINT31 et E-cadhérine est décrite plus fréquemment dans les TVEUS
que dans les tumeurs de la vessie [21]. La méthylation du promoteur du gène DAPK
favorisait davantage la récidive des TVEUS alors que celle du gène MINT31 était
associée à la progression et à la mortalité des TVEUS.
Cependant, un taux élevé de méthylation du promoteur de trois autres gènes (GDF15,
TMEFF2 et VIM) a également été retrouvé dans les TVEUS comme ce qui avait été
précédemment observé dans les tumeurs de la vessie [22]. Un faible taux de
méthylation du gène VIM pourrait être responsable d’une diminution de la survie
spécifique des TVEUS.
2. Hérédité génétique
2.1. Hérédité monogénique : syndrome HNPCC
Le risque génétique de développer une TVEUS dans un contexte de prédisposition
héréditaire a été établi dans le syndrome hereditary non polyposis colorectal
carcinoma (HNPCC), autrement connu sous le nom de syndrome de Lynch). Les
TVEUS sont la 3e localisation tumorale par ordre de fréquence (5%) après les cancers
du côlon (63 %) et de l’endomètre (9 %) [23]. Dans une famille HNPCC, le risque relatif
pour un individu de développer une TVEUS varie de 14 à 22 [23,24].
un mode de transmission autosomique dominant. Le syndrome HNPCC est lié à une
mutation germinale de l’un des 6 gènes du système de réparation des
mésappariements de l’ADN (système MMR): hMSH2, hMSH3, hMSH6, hMLH1,
hPMS1, hPMS2 [23]. Ce type de mutation est responsable de l’apparition d’un
phénotype tumoral instable que l’on peut détecter à l’aide de l’expression d’instabilité
des microsatellites (MSI). En l’absence de système MMR fonctionnel les cellules
tumorales accumulent des erreurs de réplication notamment au niveau des séquences
nucléotidiques non codantes (microsatellites) dont la taille des répétitions varie d’une
cellule à l’autre. Le phénotype MSI traduit simplement l’existence de cet
épiphénomène génétique reflet indirect d’un dysfonctionnement du système MMR
[23]. En présence d’un statut MSI élevé, il faut évoquer une prédisposition héréditaire
au cancer. La confirmation diagnostique se fera par séquençage de l’ADN germinal à
la recherche d’une mutation des gènes hMSH2 (muté dans 60 %), hMLH1 (muté dans
30 %) et hMSH6 (muté dans 5 à 8%) [23]. Les mutations des autres gènes hMSH3,
hPMS1 et hPSM2 sont moins fréquente. La technique de séquençage longue et
coûteuse, peut être au préalable orientée par la recherche en immunohistochimie de
Figure 3 : Arbre décisionnel de la prise en charge d’une TVEUS dans un contexte de suspicion de syndrome de Lynch
Les critères de Bethesda révisés permettent d’identifier les patients susceptibles de
bénéficier d’un diagnostic génétique par séquençage de l’ADN [25] (Figure 5). Une
fiche de recueil spécifique au TVEUS dans ce cadre a été éditée par Audenet et al.
afin de sensibiliser la communauté urologique à la détection de ce syndrome [26]. Une
fois le diagnostic de syndrome HNPCC établi, le patient et sa famille doivent être
orientés vers une consultation d’onco-génétique pour le dépistage des autres tumeurs
du spectre HNPCC.
Figure 4 : Critères d’Amsterdam et de Bethesda pour le diagnostic du syndrome de Lynch
2.2. Hérédité multifactorielle 2.2.1. Généralités
Le développement d’un cancer est le fruit d’interactions complexes entre les facteurs
génétiques d’un individu et certains facteurs environnementaux ; on évoque ainsi
l’hérédité multifactorielle ou les polymorphismes génétiques (variations de séquences
nucléotidiques). Cette susceptibilité génétique expose davantage un individu ou un
groupe d’individus (variations ethno-géographiques) aux effets génotoxiques des
carcinogènes environnementaux. La plupart des produits chimiques impliqués dans le
développement des carcinomes urothéliaux comme ceux présents dans le tabac, sont
métabolisés dans le rein en catabolites génotoxiques interagissant avec l’ADN.
2.2.2. Principaux polymorphismes génétiques
Il existe des facteurs génétiques communs au risque de développer une TVEUS et
une tumeur de la vessie, mais également des polymorphismes propres aux TVEUS.
Ainsi, le génotype TT du polymorphisme rs9642880, situé en 8q24, qui avait
initialement été identifié comme associé à un risque élevé de tumeur de la vessie, a
été également associé à une augmentation de risque de TVEUS, en particulier, dans
sa forme agressive [27]. De même, une étude portant sur deux polymorphismes (−460
T/C et +936 C/T) du gène codant pour le vascular endothelial growth factor (VEGF)
impliqué dans l’angiogenèse, a établi dans la population taiwanaise que les individus
fumeurs, fortement exposés à l’arsenic et porteurs de l’un ou de ces deux génotypes
à avaient des risques respectifs de développer une tumeur de la vessie et une TVEUS
de 6,6% et de 9,9% [28].
Le premier polymorphisme génétique spécifique aux TVEUS concerne un gène codant
pour une sulfotransférase (enzyme cytosolique ubiquitaire impliquée dans la
détoxification des composés chimiques) [29]. Ce polymorphisme génétique de l’exon
acide aminé Arginine (allèle SULTA1*1) par une Histidine (allèle SULT1A1*2) au
codon 13 de la protéine correspondante (Arg213His). En présence de l’allèle
SULT1A1*2, la protéine SULT1A1 a une activité enzymatique plus faible et le risque
de développer une TVEUS est dès lors majoré [29,30].
De la même façon, le polymorphisme G870A de CCND1, gène codant pour une
protéine impliquée dans la régulation du cycle cellulaire, a un impact différent entre le
haut et le bas appareil urinaire. Le génotype GG est associé à un risque moins
important de tumeur de la vessie mais n’avait pas cet effet protecteur s’agissant des
TVEUS. Le génotype AG de ce marqueur était associé à un risque moins important de
tumeur de vessie infiltrant le muscle, alors que le génotype GG était associé à un
risque 5,88 fois plus important de développer une TVEUS invasive [31].
Enfin, une seule étude a rapporté l’association entre certains polymorphismes
génétiques et le pronostic des TVEUS. La présence de variants génétiques seuls
(polymorphisme Lys939Gln du gène XPD) ou en combinaison (au moins 3 variants)
de cinq gènes de réparations de l’ADN (gènes XPC, XPD, XPG, XRCC1 et XRCC3)
amélioraient la survie des patients [32,33].
C. Bases moléculaires des risques évolutifs après néphrourétérectomie totale
1. Récidive intra-vésicale et développement clonal
Le développement des TVEUS à partir de l’urothélium des cavités pyélocalicielles ou
de l’uretère peut être unifocal mais ces tumeurs sont plus souvent à même de proliférer
sur plusieurs sites de l’arbre urinaire de fa ̧con synchrone ou métachrone. Ceci
explique que de nombreuses TVEUS soient multifocales au moment du diagnostic
initial. Des hypothèses s’opposent afin d’expliquer ce phénomène (mono- et
localisation dans l’arbre urinaire [34].
1.1. Monoclonalité : théorie de la dispersion intraluminale avec implantation cellulaire
La théorie de la dispersion intraluminale avec implantation cellulaire, dite intraluminal
seeding and implantation est en faveur d’un développement monoclonal du cancer
[34]. Les localisations multiples et les récidives carcinologiques seraient liées à la
migration intraluminale puis à la greffe de cellules tumorales dans la paroi de l’arbre
urinaire, ou à l’expansion intra-épithéliale de cellules provenant d’une tumeur primitive.
Le caractère antégrade de la dissémination tumorale ainsi que la fréquence des
greffes tumorales au niveau des zones de stase plaident en faveur de cette hypothèse.
Le reflux vésico-urétéral primitif ou iatrogène expliquerait les localisations de la voie
excrétrice supérieure en cas de tumeur vésicale primitive [35]. Ainsi Mazeman et al.
ont rapporté un taux de récidive de 25 % dans le haut appareil après résection
trans-urétrale de vessie chez des patients porteurs d’un reflux contre seulement 4% en
l’absence de reflux [36].
1.2. Oligoclonalité : théorie de la cancérisation par plages de l’urothélium
La théorie de la cancérisation par plages, dite du field change or field defect est
expliquée par la présence d’agents mutagènes dans les urines au contact de
l’urothélium [37]. Les cellules seraient ainsi susceptibles de dégénérer sur plusieurs
sites, et donc d’initier le développement de plusieurs clones tumoraux. En effet,
chaque cellule urothéliale peut acquérir des altérations génétiques distinctes en
rapport avec le développement synchrone ou métachrone de différentes tumeurs
uniques sur le plan mutationnel. Ce phénomène est une caractéristique de
l’oligoclonalité tumorale. Les récidives tumorales dans les voies excrétrices
néphro-urétérectomie totale plaident en faveur de cette hypothèse. Par ailleurs, la description
de formes bilatérales de TVEUS en l’absence de tumeur vésicale renforce ce postulat.
1.3. Coexistence de la mono- et de l’oligoclonalité
La clonalité du carcinome urothélial a été décrite notamment grâce au profil
d’inactivation du chromosome X ou la perte d’hétérozygotie et l’hétérogénéité des
mutations du gène TP53. Certains auteurs ont démontré une implication prédominante
de la monoclonalité dans la carcinogenèse vésicale [38–41], alors que d’autres ont mis
en évidence des arguments en faveur de l’oligoclonalité [42,43]. La multifocalité des
TVEUS serait quant à elle principalement liée au phénomène de cancérisation par
plages de l’urothélium [44–47], mais des travaux récents n’excluaient pas la possibilité
d’une origine monoclonale et concluaient à une probable coexistence des deux
mécanismes [48] (Figure 5). L’hétérogénéité ou l’oligoclonalité serait ainsi expliquée
par la divergence clonale et la sélection de différentes sous-populations cellulaires
dérivées d’une cellule tumorale initiale commune. Peterson et al. ont rapporté,
l’existence d’une mutation de TP 53 identique entre une tumeur pyélique et urétérale
chez un patient et, d’autre part, l’existence d’une mutation de TP 53 différente entre
une tumeur pyélique et vésicale dans une seconde observation [49]. La différence de
topographie anatomique entre les cavités pyélocalicielles et la vessie préviendrait ainsi
Figure 5 : Les deux théories de la dissémination locale des tumeurs de la voie excrétrice supérieure : la dissémination intraluminale avec implantation et/ou la cancérisation de l’urothélium « par plage »
2. Récidive systémique
2.1. Envahissement locorégional
L’extension locorégionale des TVEUS est liée aux lésions de haut grade, mais elle
dépend également de la localisation tumorale. Au niveau urétéral, après le
franchissement des deux ou trois couches de la musculeuse et de l’adventice,
l’invasion tumorale s’effectue dans la graisse rétropéritonéale et des organes de
voisinage [50]. En cas de localisations pyéliques, l’extension se poursuit par-delà
l’adventice vers la graisse péripyélique puis hilaire, les structures lymphatique et
veineuse du hile ainsi que le parenchyme rénal. Enfin, l’extension des tumeurs
calicielles s’effectue directement vers le parenchyme rénal et débute initialement par
au-delà de 5 mm de profondeur [51]. Le parenchyme rénal a un rôle de barrière
anatomique protectrice contre la dissémination locale de ces tumeurs [52]. Toutefois
le débat vis-à-vis du pronostic des différentes localisations n’est pas clos [53–56].
2.2. Envahissement lymphatique
Le drainage lymphatique de la la voie excrétrice supérieure varie en fonction du côté
et de la localisation anatomique. Du côté gauche, les cavités pyélocalicielles et la
partie proximale de l’uretère se drainent dans le réseau lymphatique dont les ganglions
hilaires gauches puis latéro-aortique sont le relais. L’uretère distal se draine dans les
chaînes lymphatiques iliaques gauches. Du côté droit, les cavités pyélocalicielles et
l’uretère proximal sont drainés par le réseau lymphatique dont les ganglions hilaires
droit puis latéro- et rétro-cave sont le relais. L’uretère distal se draine dans les chaînes
lymphatiques iliaques droites [57,58]. Lorsque les cellules tumorales ont envahi les
premiers relais ganglionnaire, l’extension se poursuit le long des gros vaisseaux
prévertébraux vers le canal thoracique, le médiastin et les ganglions sus-claviculaires.
Outre le grade et le stade, l’envahissement ganglionnaire serait directement en rapport
avec la lymphoangiogenèse et la densité de tissu lymphatique péri-tumorale [59].
Certains auteurs ont également rapporté une origine monoclonale des métastases
ganglionnaires au cours de la carcinogenèse urothéliale. Ainsi, le potentiel
métastatique des TVEUS serait lié à la prolifération et à la dissémination d’une
population clonale unique à partir de la tumeur primitive [60]. L’envahissement
vasculaire tumoral précède l’apparition de métastases ganglionnaires [61]et constitue
un facteur pronostique postopératoire majeur des TVEUS localisées [62–64]. Une
augmentation du nombre de copie d’ADN sur différentes régions chromosomiques et
la surexpression de Pak1 modulé par l’activité de Rac1 sont des éléments
déterminants de l’envahissement vasculaire tumoral et du développement de
2.3. Envahissement métastatique
Rarement révélatrices de la maladie, les métastases extra-ganglionnaires des TVEUS
sont les localisations pulmonaires (52 %), hépatique (33 %) et osseuses (26 %)
[66,67]. Elles surviennent le plus souvent au cours de la surveillance après chirurgie
d’exérèse mais ne concerneraient que 16 à 26 % des patients. Comme pour
l’extension ganglionnaire, le grade, le stade tumoral et l’envahissement vasculaire
tumoral ont un rôle prépondérant dans l’apparition des métastases qui expriment une
certaine clonalité [68]. Par ailleurs, les métastases pulmonaires sont plus fréquemment
observées au cours de l’évolution des tumeurs des cavités pyélocalicielles [69].
D. Objectif
L’objectif de ce travail était de caractériser l’évolution des TVEUS aussi bien sur le
plan de la récidive intra-vésicale que sur celui de la récidive locale et métastatique,
avec la recherche de facteurs prédictifs cliniques, anatomopathologiques et
II. RÉCIDIVE INTRA-VÉSICALE
A. Epidémiologie et méta-analyse des facteurs prédictifs de récidive intra-vésicale après néphrourétérectomie totale
B. Recherche de la mutation FGFR3 sur l’ADN urinaire pour la prédiction du risque de récidive intra-vésicale
1. Introduction
Malgré l’existence de certaines différences, la carcinogénèse des TVEUS et des
tumeurs de vessie semblent présenter d’importantes bases communes [70]. Le
principal proto-oncogène impliqué dans la carcinogénèse urothéliale est le gène
FGFR3 qui code pour le récepteur des facteurs de croissance fibroblastique (Figure
2). Ce gène est situé sur le bras court (p) du chromosome 4 à la position 16.3 allant
de la paire de bases 1.793.298 à 1.808.871 (Figure 6).
Figure 6 : Localisation du gène FGFR3
Ainsi, selon les études, une mutation de ce gène est retrouvée dans 40 à 50 % des
tumeurs de vessie et des TVEUS [4]. A ce jour, huit principales mutations touchant
trois exons de ce gène (exons 7, 10 et 15) ont été identifiées et conduiraient à une
activation constitutionnelle du récepteur FGFR3 indépendante de son ligand [5,6].
Cependant, seule 4 d’entre elles situées sur les exons 7 (R248C, S249C) et 10 (G372C
et Y375C) représentent 95% des cas de mutations.
Par immunohistochimie, un marquage positif pour FGFR3 a été observé dans 61,5%
des TVEUS [7]. Comme pour le cancer de vessie, les mutations sont retrouvées avec
(53 %) [7]. De même, elles sont plus fréquentes dans les TVEUS localisées au niveau
de l’uretère (50%) que celles situées dans les cavités pyélocalicielles (34% ) [7]. Enfin,
plusieurs études ont rapporté un risque de progression et, surtout, de mortalité
spécifique moins important chez les patients présentant une TVEUS avec une
mutation de FGFR3 confirmant ainsi les résultats préalablement rapportés dans le
domaine du cancer de la vessie [7–9].
D’un point de vue clinique, la présence de ces mutations peut être recherchée à partir
de l’ADN extrait de l’urine des patients puisqu’il semble exister une excellente
corrélation entre la présence de cette mutation sur l’ADN urinaire et tumorale
[6,46,71,72]. La mutation de FGFR3 détectée à partir de l’ADN urinaire pourrait donc
constituer un marqueur intéressant pour confirmer le diagnostic initial de TVEUS [10]
mais également pour évaluer le risque de récidive de la maladie et notamment au
niveau vésical.
L’objectif de cette étude était donc d’analyser l’intérêt de rechercher la mutation de
FGFR3 sur l’ADN urinaire afin d’évaluer simplement le risque de récidive intra-vésicale
après néphrourétérectomie totale pour le traitement d’une TVEUS.
2. Matériel et méthode 2.1. Patients
Entre 2004 et 2006, 46 patients ont été traités par néphrourétérectomie totale à
l’hôpital Tenon pour une TVEUS localisée. La néphrourétérectomie totale était réalisée
par voie ouverte ou laparoscopique avec l’exérèse systématique d’une collerette
vésicale par voie extra-vesicale ou endoscopique. Aucun patient n’avait reçu de
chimiothérapie ou radiothérapie néo-adjuvante et les autres données cliniques péri
opératoires ou de suivi ont été recueillies dans une base de données anonymisée.
Tous les patients sélectionnés ont reçu une information claire, loyale et appropriée
2.2. Prélèvements et préparation des échantillons
Les urines de chaque patient sélectionné ont été prélevées en début d’intervention
après la pose de la sonde vésicale. Les échantillons urinaires de 50 cc ont été
conservés à température ambiante et acheminés vers le laboratoire de recherche
génétique afin d’être préparés. Après une centrifugation à 1600 rotations par minute
(RPM) pendant 5 minutes, le surnageant a été éliminé et le culot urinaire a été
transféré dans un microtube pour être à nouveau centrifugé à 5000 RPM pendant 2
minutes. Le surnageant a été une nouvelle fois éliminé avant d’ajouter un tampon de
PBS qui permet un lavage. Le culot urinaire a alors été conservé à -20°C.
2.3. Extraction de l’ADN urinaire
L’extraction de l’ADN urinaire a été réalisée selon le protocole du Kit « QIAamp DNA »
de Qiagen®. Après une centrifugation à 5000 rotations par minute, le surnageant a été
éliminé pour ajouter dans chaque tube, 200 µL de tampon ATL qui permet la lyse
cellulaire et 20 µL de protéinase K qui permet de digérer les protéines et d’enlever les
contaminants. Après une incubation pendant 2 heures à 56°C au bain-marie, 200 µL
du tampon AL et 20 µL de protéinase K ont été rajoutés une nouvelle fois afin de
finaliser la digestion enzymatique pendant 10 minutes à 64 ° C au bain-marie.
Après les 10 minutes d’incubation, 200 µL d’éthanol 100 % permettant de précipiter
l’ADN ont été rajoutés et le mélange a été transféré sur des colonnes de purification
(Figure 7). Le principe de ces colonnes est l’interaction spécifique entre des
phosphates négativement chargés de l’acide nucléique et les molécules de surface
positivement chargées du substrat. Ces colonnes retiennent donc les molécules
chargées négativement comme l’ADN et le tube collecteur doit être changé après
Figure 7 : Colonne de purification avec tube collecteur (A=membrane)
Une première centrifugation à 8000 RPM a été réalisée pendant 1 minute. Les étapes
de lavage ont ensuite été réalisées en ajoutant d’abord 500 µL de AW1 dans chaque
tube avant une nouvelle centrifugation à 8000 RPM pendant 1 minute, puis en ajoutant
500 µL de AW2 dans chaque tube avant une nouvelle centrifugation à 12000 RPM
pendant 3 minutes. Les colonnes de purification ont ensuite été transférées sur des
microtubes. Après avoir ajouté 70 µL du tampon de dilution AE afin de dépolariser la
membrane de chaque colonne de purification et décrocher l’ADN, les prélèvements
ont été laissés reposer pendant 5 minutes. Une nouvelle centrifugation à 8000 RPM a
été réalisée pendant 1 minute. Enfin les éluâts ont été prélevés dans les microtubes
pour être redéposés sur les colonnes de purification afin d’être centrifugés une
dernière fois à 8000 RPM pendant1 minute.
2.4. Quantification de l’ADN au NanoDrop®
Le spectrophotomètre NanoDrop® a été utilisé afin de quantifier l’ADN extrait de
chaque prélèvement (Figure 8). Plus de 40 ng d’ADN était disponible pour chaque
prélèvement, ce qui était amplement suffisant pour rechercher une mutation de
Figure 8: NanoDrop®
2.5. Procédure de génotypage de FGFR3 selon la technique de taille de fragments
Le génotypage des principales mutations de FGFR3 a été réalisé à l’aide de primers
spécifiques des mutations [73]. La PCR est une PCR multiplex où sont réunis les
primers pour amplifier chacune des mutations. Les mutations recherchées
appartiennent à 2 exons (Tableau 1) : l’exon 7 (codon 248 : R248C : CGC -> TGC ;
codon 249 : S249C : TCC -> TGC) et l’exon 10 (codon 372 : G372C : GGC -> TGC ;
codon 375 : Y375C : TAT -> TGT)
Tableau 1 : Séquence des exons 7 et 10 (Exon en rouge, Intron en noir, mutations surlignées en jaune) Exon Séquence 7 GTGAGGGCCCTGGGGCGGCGCGGGGGTGGGGGCGGCAGTGGCGGTGGTGGTGAGG GAGGGGGTGGCCCCTGAGCGTCATCTGCCCCCACAGAGCGCTCCCCGCACCGGCCC ATCCTGCAGGCGGGGCTGCCGGCCAACCAGACGGCGGTGCTGGGCAGCGACGTGGA GTTCCACTGCAAGGTGTACAGTGACGCACAGCCCCACATCCAGTGGCTCAAGCACGTG GAGGTGAATGGCAGCAAGGTGGGCCCGGACGGCACACCCTACGTTACCGTGCTCAAG GTGGGCCACCGTGTGCACGTGGGTGCCGCCGCTGGGGCTCCTGGGCTGGCCCCAAG GGTGCCCCTTGGCTGCGGGTTGCGTGAGGA 10 CTGAGGTTCTGAGCCCCCTTCCGCTCCCAGTGGTGCCTGCGGCTCTGGGCCAGGGGC ATCCATGGGAGCCCCGTGGGGGGGGGGGCCAGGCCAGGCCTCAACGCCCATGTCTT TGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCA TCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCT CTGCCGCCTGCGCAGCCCCCCCAAGAAAGGCCTGGGCTCCCCCACCGTGCACAAGAT CTCCCGCTTCCCGCTCAAGCGACAGGTAACAGAAAGTAGATACCAGGTTCTGAGCTGC CTGCCCGCCAGGCCTCCTGGAGCCCCACCTCGG
2.5.1. PCR Multiplex
L’ADN extrait des prélèvements a été dilué à une concentration de 4 ng/ µl dans un
volume minimal de 10 µl. Deux mélanges de PCR multiplex distinct ont été préparés
puisque les primers pour les codons 248 et 249 d’une part et 372 et 375 d’autre part,
présentent de grandes similitudes. Cependant, il est possible de mélanger les primers
pour les codons 248 et 372 d’une part et 249 et 375 d’autre part. Des primers de
globine ont été ajoutés au mélange afin d’utiliser ce gène comme témoin
d’amplification et valider ainsi la manipulation. Chaque primer était marqué avec un
fluorochrome différent (Tableau 2).
Tableau 2: Séquences des primers des codons 248, 249, 372, 375 et de la globine
Codon Primers 248-249 - FGFR3-F248-9 : 6-FAM-CAG-TGG-CGG-TGG-TGG-TGA-GG - FGFR3-R248 : ATG-GGC-CGG-TGC-GGG-GAC-CA - FGFR3-R249 : CAG-GAT-GGG-CCG-GTG-CGA-GC 372-375 - FGFR3-F372-375 : HEX-ATG-TCT-TTG-CAG-CCG-AGG-AGG-AG - FGFR3-R372 : AGC-TGA-GGA-TGC-CGG-CAT-ACA-CAC-TGC-A - FGFR3-R375 : ACC-CCG-TAG-CTG-AGG-ATG-CCT-TGA-C Globine - GLO-F : NED-CCT-TTG-GGG-ATC-TGT-CCA-CTC-CTG-A
- GLO-R : GTT-GTC-CAG-GTG-AGC-CAG-GCC-AT
En plus des primers spécifiques, chaque mélange contenait un tampon buffer, du
MgCl2 neutralisant les charges négatives des groupements phosphates au niveau de
l’ADN, du DMSO permettant d’améliorer les rendements et les spécificités de la PCR,
des dNTP (mélange des 4 désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP))
permettant d’allonger les brins d'ADN néosynthétisés, de l’eau et la polymérase
permettant la synthèse de nouveaux brins d'ADN complémentaire de la séquence cible
Tableau 3 : Mélange de la PCR afin de rechercher les mutations des codons 248 et 372
[INITIALE] [FINALE] Volume/puit (µl)
Tampon Buffer II 10 X 1 X 2 MgCl2 25 mM 2,5 mM 2 DMSO 100% 5% 1 dNTP 10 mM 0,2 mM 0,4 Primer 248 F 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer 248 R 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer 372 F 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer 372 R 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer GLO F 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer GLO R 20 µM 0,2 µM 0,2 Polymérase 5 UI/µl 2 UI 0,4 H20 qsp 15 µl 8
Tableau 4 : Mélange de la PCR afin de rechercher les mutations des codons 249 et 375
[INITIALE] [FINALE] Volume/puit (µl)
Tampon Buffer II 10 X 1 X 2 MgCl2 25 mM 2 mM 1,6 DMSO 100% 10% 2 dNTP 10 mM 0,2 mM 0,4 Primer 249 F 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer 249 R 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer 375 F 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer 375 R 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer GLO F 20 µM 0,2 µM 0,2 Primer GLO R 20 µM 0,2 µM 0,2 Polymérase 5 UI/µl 2 UI 0,4 H20 qsp 15 µl 7,4
Sur la plaque de PCR, 15µl d’un des 2 mélanges et 5µl d’ADN à 4 ng/ µl ont été placés
dans des puits séparés. Chaque échantillon a donc été amplifié avec les 2 mélanges.
Des échantillons témoins provenant de patients présentant chacune des 4 mutations
ont également été utilisés afin de valider les primers. Par ailleurs, un blanc d’extraction
et un échantillon contenant de l’eau ont permis de s’assurer de l’absence de
contamination lors de l’extraction ou au moment de la PCR, respectivement. Le
Tableau 5: Protocole de PCR multiplex
Température Durée d’1 cycle Nombre de cycles Durée totale
95°C 5 mn 1 cycle 1h15 95°C 15 sec 35 cycles 61°C 15 sec 72°C 15 sec 72°C 7mn 1 cycle 4°C ∞ 1cycle
2.5.2. Analyse des fragments d’ADN au séquenceur
Après amplification, les échantillons étaient trop concentrés pour être envoyés
directement en analyse au séquenceur. Les produits de PCR ont donc été dilués au
1/25ème. Un mélange de formaldéhyde et de marqueur de taille (Genescan 55) a ensuite été préparé afin d’être ajouté au produit de dilution de la PCR. Chaque puit de
la plaque du séquenceur contenait donc 15µl de mélange formaldéhyde et marqueur
de taille ainsi que 5µl d’ADN. Une plaque de séquenceur était donc composée de 16
puits à remplir puisque le séquenceur était composé de 16 capillaires de 50cm. Il
s’agissait d’un séquenceur utilisant un système d’électrophorèse capillaire avec une
grande rapidité de migration et une bonne automatisation. Après la migration des
fragments sur les capillaires, les données de fluorescence étaient récupérées au
niveau d’une cellule de détection et transmises vers une caméra CCD pour être
analysées par une plate-forme PC qui commandait également le remplissage des
capillaires et l’injection des échantillons (Figure 9).
L’analyse des résultats a été réalisée grâce au logiciel GeneMapper. Le fragment
correspondant à la globine était à environ 110 pb (fluorescence noire). Une mutation
du codon 248 donnait un fragment à 76 pb (fluorescence bleue, Figure 10).
Figure 10 : Mutation du codon 248 (R248C)
Une mutation du codon 249 donnait un fragment à 79 pb (fluorescence bleue, Figure
11).
Une mutation du codon 372 donnait un fragment à 72 pb (fluorescence verte, Figure
12).
Figure 12: Mutation du codon 372 (G372C)
Une mutation du codon 375 donnait un fragment à 76 pb (fluorescence verte, Figure
13).
Afin de vérifier l’absence de contamination lors des manipulations, les échantillons
correspondant au blanc d’extraction ou à l’eau ont été contrôlés (Figure 14)
Figure 14 : Absence de mutation décelée sur le blanc d’extraction ou l’eau
2.6. Analyse anatomopathologique de la pièce opératoire
L’analyse anatomopathologique des pièces de néphrourétérectomie totale a été
effectuée selon des procédures standardisées. La stadification tumorale était réalisée
selon la classification TNM publiée en 2002 par l’union internationale contre le cancer
[74] et le grade tumoral était définit selon la classification publiée en 1998 par la société
internationale d’uro-pathologie [75]. La localisation tumorale était définit comme
pyélocalicielle ou urétérale [53]. La multifocalité tumorale était définit comme la
présence synchrone de plus de 2 localisations tumorales (pyélocalicelle ou urétérale)
[76]. L’envahissement lymphovasculaire était définit comme la présence visible de
cellules cancéreuses dans les vaisseaux lymphatiques ou sanguins [77].
Une analyse immunohistochimique de la pièce opératoire a été systématiquement
inclus dans cette étude ne présentait de perte d’expression de hMSH2, hMLH1 et
hMSH6 [23].
2.7. Suivi
Les patients étaient suivis tous les trois à quatre mois pendant la première année après
la néphrourétérectomie totale, tous les 6 mois de la deuxième année à la cinquième
année, puis annuellement. Le suivi consistait en un examen clinique complet, un bilan
sanguin, une cytologie urinaire, un scanner thoraco-abdomino-pelvien régulier et une
évaluation cystoscopique régulière des parois de la vessie. La scintigraphie osseuse
et le scanner cérébral étaient réalisés uniquement sur signes d’appel.
La récidive intra-vésicale était définit comme la survenue d’une tumeur de vessie non
infiltrant ou infiltrant le muscle dans les suites d’une néphrourétérectomie totale pour
le traitement d’une TVEUS. Seules les récidives prouvées histologiquement étaient
considérées comme récidive intra-vésicale.
2.8. Analyses statistiques
Les analyses statistiques ont été réalisées grâce au logiciel R (version 3.1.0; R
Foundation for Statistical Computing, Vienne, Autriche). Les résultats étaient rapportés
sous forme de moyenne [IQR] pour les variables continues et sous forme de
pourcentage pour les variables catégorielles. Le test de Shapiro-Wilk a été utilisé pour
évaluer la distribution des variables. Les tests de Student et Mann-Whitney ont été
utilisés pour comparer les variables continues avec une distribution normale et
non-normale, respectivement. Le test du chi-squared a été utilisé pour comparer les
variables catégorielles. La significativité était définit par une valeur de p < 0,05.
La survie sans récidive intra-vésicale en fonction du statut mutationnel FGFR3 a été
analysée grâce à la méthode de Kaplan Meier. Le test du log-rank a permis de
comparer les courbes de survie sans récidive intra-vésicale des patients mutés et
Les facteurs de risque cliniques et anatomopathologiques de récidive intra-vésicale
après néphrourétérectomie totale pour le traitement d’une TVEUS ainsi que le statut
mutationnel FGFR3 ont été étudiés en analyse univariée. Seule les variables
significatives ont été inclues dans un modèle multivarié de Cox afin de déterminer les
facteurs prédictifs indépendants de récidive intra-vésicale.
3. Résultats
3.1. Population
Une mutation du gène FGFR3 était retrouvée sur l’ADN urinaire de 21 (46%) patients
parmi les 46 inclus dans cette étude. La répartition des différentes mutations du gène
FGFR3 sont présentées dans le Tableau 6.
Tableau 6 : Répartition des différentes mutations du gène FGFR3
Exon 7 10 7 10
Codon 249 375 248 372
Mutation S249C Y375C R248C G372C
n (%) 13 (61%) 4 (19%) 2 (10%) 2 (10%)
Les caractéristiques cliniques et anatomopathologiques de la population d’étude en
fonction du statut mutationnel FGFR3 sont rapportées dans le Tableau 7. Les
proportions d’hommes (81% vs 52% ; p=0,04) et de TVEUS localisées au niveau de
l’uretère (57% vs 40 ; p=0,04) étaient significativement plus importantes chez les
patients présentant une mutation du gène FGFR3 sur l’ADN urinaire. De même, sur le
plan anatomopathologique, les proportions de tumeurs superficielles (81% vs 36% ;
p<0,001), de bas grade (67% vs 8% ; p<0,001), sans CIS concomitant (10% vs 40% ;
p<0,001) et sans envahissement lymphovasculaire (5% vs 60% ; p<0,001) étaient plus
importantes chez les patients mutés. Il n’existait aucune autre différence significative
en termes de caractéristiques cliniques et anatomopathologiques entre les groupes de
Au total, 13 (28%) patients ont présenté une récidive intra-vésicale après un délai
médian de 19,9 [15-27] mois. Le taux de récidive intra-vésicale était significativement
plus élevé dans le groupe de patient présentant une mutation de FGFR3 (43% vs 16% ;
p=0,04) mais le délai de récidive était plus court dans le groupe de patients sauvages
bien qu’il s’agissait d’une différence non significative (21,7 mois vs 16 mois ; p=0,33).
Tableau 7 : Caractéristiques cliniques et anatomopathologiques de la population d’étude en fonction du statut mutationnel FGFR3
Caractéristiques Population totale FGRFR3 sauvage FGFR3 muté p
Nombre de patients (%) 46 (100) 25 (54) 21 (46) -
Age médian [IQR] 64 [53-77] 66 [55-79] 63 [52-74] 0,21 Sexe - Homme (%) - Femme (%) 30 (65) 16 (35) 13 (52) 12 (48) 17 (81) 4 (19) 0,04 Statut tabagique - Fumeur - Non-fumeur 18 (39) 28 (61) 11 (44) 14 (66) 7 (33) 14 (77) 0,38 Antécédent de tumeur de vessie 11 (24) 4 (16) 7 (33) 0,17 Cytologie urinaire préopératoire
- Positive - Négative 30 (65) 16 (35) 18 (72) 7 (38) 12 (57) 9 (43) 0,07 Localisation tumorale - Cavités pyélocalicielles (%) - Uretère (%) 24 (52) 22 (48) 15 (60) 10 (40) 9 (43) 12 (57) 0,04 Multifocalité tumorale 21 (46) 12 (48) 9 (43) 0,94 Néphroureterectomie - Ouverte (%) - Laparoscopique (%) 12 (26) 34 (74) 5 (20) 20 (80) 7 (33) 14 (77) 0,29 Exérèse de la collerette vésicale
- Extra vésical (%) - Endoscopique (%) 38 (83) 8 (17) 19 (76) 6 (24) 19 (90) 2 (10) 0,75 Stade T - Superficiel (%) - Infiltrant (%) 26 (57) 20 (43) 9 (36) 16 (64) 17 (81) 4 (19) <0,001 Stade N - pN+ (%) - pNx/N0 (%) 5 (11) 41 (89) 5 (20) 20 (80) 0 (0) 21 (100) 0,36 Grade - Haut (%) - Bas (%) 30 (65) 16 (35) 23 (92) 2 (8) 7 (33) 14 (67) <0,001 CIS concomittant (%) 12 (26) 10 (40) 2 (10) < 0,001 Envahissement lymphovasculaire (%) 16 (35) 15 (60) 1 (5) < 0,001
Récidive intra vésicale (%) 13 (28) 4 (16) 9 (43) 0,04
Délia médian avant récidive vésicale [IQR] 19,9 [15-27] 16 [15-17] 21,7 [18-27] 0,33 Suivi [IQR] 65,7 [13-118] 62,1 [12-105] 69,7 [19-124] 0,41
3.2. Analyse de la survie sans récidive intra-vésicale
Les courbes de survie sans récidive intra-vésicale en fonction du statut mutationnel
FGFR3 sont présentées sur la Figure 15. La probabilité de survie sans récidive
intra-vésicale à 2 ans après la néphrourétérectomie totale était de 74% et 82% dans le
groupe des patients mutés et sauvages, respectivement. La probabilité de survie sans
récidive intra-vésicale à 5 ans après la néphrourétérectomie totale était de 52% et 82%
dans le groupe des patients mutés et sauvages, respectivement. Cependant, cette
différence n’était pas significative (p=0,12).
Figure 15 : Courbes de survie de Kaplan Meier en fonction du statut mutationnel FGFR3
3.3. Facteur prédictifs de récidive intra-vésicale
Les résultats des analyses uni et multivariées des facteurs prédictifs de récidive
(HR2,93 ; IC 95%=[1,74-9,31] ; p=0,004), l’antécédent de tumeur de vessie (HR=2,35 ;
IC 95%=[1,87-4,78] ; p=0,001), la cytologie urinaire préopératoire positive (HR=2,61 ;
IC 95%=[1,19 ; IC 95%=[1,22-6,45] ; p=0,001), la localisation tumorale urétérale
(HR=1,74 ; IC 95%=[1,23-2,36] ; p=0,003), la multifocalité tumorale (HR=2,97 ; IC
95%=[1,51-4,96 ] ; p<0,001), l’exérèse extra vésicale de la collerette vésicale au cours
de la néphrourétérectomie totale (HR=1,19 ; IC 95%=[1,03-1,57] ; p=0,04), le stade
tumoral infiltrant (HR=1,91 ; IC 95%=[1,18-2,98] ; p=0,002), le haut grade tumoral
(HR=1,32 ; IC 95%=[1,02-1,99] ; p=0,03) et la présence d’une mutation FGFR3 sur
l’ADN urinaire (HR=2,72 ; IC 95%=[1,57-8,66] ; p=0,04) étaient des facteurs prédictifs
significatifs de récidive intra-vésicale.
En analyse multivariée, le tabagisme actif (HR=2,42 ; IC 95%=[1,67-5,80] ; p=0,006),
l’antécédent de tumeur de vessie (HR=2,14 ; IC 95%=1,66-4,34] ; p<0,001), la
cytologie urinaire préopératoire positive (HR= 2,25 ; IC 95%=[1,38-4,09] ; p<0,001), la
localisation tumorale urétérale (HR=1,55 ; IC 95%=[1,19-2,47] ; p=0,002) , la
multifocalité tumorale (HR=2,69 ; IC 95%=[1,31-4,72] ; p<0,001) et le stade tumoral
infiltrant (HR=1,78 ; IC 95%=[1,11-2,19] ; p=0,004) étaient des facteurs prédictifs
indépendants de récidive intra-vésicale. Cependant, la mutation du gène FGFR3
n’était plus significativement corrélée à la récidive intra-vésicale (HR=2,39 ; IC
Tableau 8 : Analyses uni et multivariée des facteurs prédictifs de récidive intra-vésicale après néphrourétérectomie totale
Variables Analyse univariée Analyse multivariée HR [IC 95%] p HR [IC 95%] p Age 1,07 [0,67-2,46] 0,75 - - e - Homme 1 1,08 [0,74-1,81] 0,19 - - Statut tabagique - Non-fumeur - Fumeur 1 2,93 [1,74-9,31] 0,004 1 2,42 [1,67-5,80] 0,006 Antécédent de tumeur de vessie - Absent - Présent 1 2,35 [1,87-4,78] 0,001 1 2,14 [1,66-4,34] <0,001 Cytologie urinaire préopératoire - Négative - Positive 1 2,61 [1,22-6,45] 0,001 1 2,25 [1,38-4,09] <0,001 Localisation tumorale - Cavités pyélocalicielles - Uretère 1 1,74 [1,23-2,36] 0,003 1 1,55 [1,19-2,47] 0,002 Multifocalité tumorale - Absente - Présente 1 2,97 [1,51-4,96] <0,001 1 2,69 [1,31-4,72] <0,001 Néphrouréterectomie - Ouverte - Laparoscopique 1 1,22 [0,91-2,79] 0,11 - - Exérèse de la collerette vésicale - Endoscopique - Extra vésicale 1 1,19 [1,03-1,57] 0,04 1 1,12 [0,83-1,46] 0,28 Stade T - Superficielle - Invasive 1 1,91 [1,18-2,98] 0,002 1 1,78 [1,11-2,19] 0,004 Stade N - pN+ - pNx/N0 1 1,09 [0,72-1,84] 0,32 - - Grade - Bas - Haut 1 1,32 [1,02-1,99] 0,03 1 1,05 [0,65-1,38] 0, 67 CIS concomitant - Présent - Absent 1 1,13 [0,78-1,86] 0,44 - - Envahissement lymphovasculaire - Présent - Absent 1 1,04 [0,64-1,35] 0,16 - - Mutation FGFR3 - Absente - Présente 1 2, 72 [1,57- 8,66] 0,04 1 2,39 [0,78-6,98] 0,09
4. Discussion
Le développement des TVEUS à partir de l’urothélium des cavités pyélocalicielles ou
de l’uretère est parfois unifocal mais ces tumeurs sont plus souvent capables de
proliférer de façon synchrone ou métachrone sur plusieurs sites de l’arbre urinaire
expliquant ainsi leur fréquente multifocalité au diagnostic initial ou l’existence de
récidive dans le haut comme le bas appareil urinaire. Comme dans le domaine du
cancer de la vessie, les hypothèses de la mono et oligo clonalité s’opposent afin
d’expliquer ce phénomène caractéristique du carcinome urothélial quelle que soit sa
localisation [34].
Les résultats de notre étude ont également mis en évidence des arguments cliniques
en faveur de l’implication des mécanismes de la mono et oligoclonalité dans la récidive
intra-vésicale après néphrourétérectomie totale pour le traitement des TVEUS.
L’implication de la multifocalité tumorale dans l’augmentation du risque de récidive
intra-vésicale illustrait d’ailleurs la coexistence de ces deux théories. Cependant, la
présence de cellules tumorales dans la voie excrétrice urinaire, détectée grâce à la
cytologie urinaire pré opératoire, ou la fragilité de l’adhésion intercellulaire des tumeurs
infiltrantes favorisant la dissémination intraluminale des cellules tumorales étaient
plutôt en faveur de la première hypothèse. L’augmentation du risque de récidive
intra-vésicale liée à la localisation urétérale des TVEUS postulait également en faveur de la
théorie de la monoclonalité compte tenu de la proximité anatomique entre l’uretère et
la vessie.
Il semblait également exister certains arguments cliniques en faveur du mécanisme de
cancérisation par plage. En effet, le contact répété des métabolites du tabac avec
l’urothélium pouvait alors expliquer selon cette hypothèse, le risque accru de récidive
intra-vésicale chez les patients présentant un tabagisme actif. De même, l’implication
confirmé que les localisations tumorales urothéliales métachrones se développant à
partir du bas comme du haut appareil urinaire pouvaient être secondaire à différentes
cellules tumorales ayant acquises des altérations génétiques distinctes.
Cette étude est la première à analyser le rôle de la mutation FGFR3 dans l’apparition
d’une récidive intra-vésicale après néphrourétérectomie totale pour le traitement d’une
TVEUS. Nous avons démontré que les patients porteurs d’une mutation FGFR3 sur
l’ADN urinaire présentaient une diminution importante de la survie sans récidive
intra-vésicale. Cependant, la différence avec les patients non mutés était non significative.
Par ailleurs, la présence d’une mutation FGFR3 était significativement corrélée à une
augmentation du risque de récidive intra-vésicale en analyse univariée mais elle n’était
pas un facteur de risque indépendant en analyse multivariée. La taille réduite de notre
population d’étude ainsi que le faible nombre de patients ayant récidivés pourraient
expliquer l’absence de différence significative entre les 2 groupes mais il semble
toutefois exister une forte tendance en faveur d’une augmentation du risque de récidive
intra-vésicale chez les patients mutés. Ces résultats postulent également en faveur de
la théorie de la dispersion intraluminale puisque la détection de cellules tumorales avec
certaines anomalies génétiques pourrait être responsable de l’augmentation du risque
de récidive intra-vésicale.
La détection d’une mutation de FGFR3 sur l’ADN urinaire avait déjà démontré un
intérêt dans la prédiction du risque de récidive intra-vésicale des tumeurs de vessie
non infiltrant le muscle [78]. En effet, la présence de cette mutation semble être
significativement corrélée au risque de développer une récidive intra-vésicale après la
résection endoscopique de tumeur de vessie.
5. Conclusion
Les facteurs de risque clinique de récidive intra-vésicale après néphrourétérectomie
mono et oligoclonalité. La détection de la mutation FGFR3 dans les urines pourrait
constituer un élément supplémentaire en faveur de la dissémination intraluminale d’un
clone tumoral unique. Cependant, il faudrait analyser les résultats d’une plus grande
cohorte de patients afin de pouvoir éventuellement mettre en évidence une différence
significative entre le risque de récidive intra-vésicale des patients mutés et non mutés.
En cas de résultats positifs, la détection de la mutation de FGFR3 sur l’ADN urinaire
pourrait servir de biomarqueur afin de dépister les patients les plus à risque de récidive
intra-vésicale et qui doivent donc se voir proposer des instillations intra vésicales post
III. RÉCIDIVE LOCOREGIONALE ET MÉTASTATIQUE
D. Intérêt de la sous-stratification des tumeurs urothéliales pT3 de la voie excrétrice urinaire supérieure