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Figure 1: Représentation schématique du cycle de développement du Xenopus laevis.

Les stades de développement du Xenopus laevis sont définis par les tables de Nieuwkoop et Faber. Le développement embryonnaire du xénope est subdivisé en différentes phases définies notamment sur base de critères morphologiques: la fécondation, la segmentation, la gastrulation, la neurulation et l’organogenèse. Après la période d’organogenèse, un à deux mois s’écoulent avant que le têtard n’entame sa métamorphose pour former un xénope adulte. Ce dernier est mature sexuellement à l’âge d’un an (Wolpert, 2002).

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Figure 2: Modèle moléculaire de la spécification des feuillets embryonnaires et de l’induction neurale chez le xénope. Au stade blastula, la combinaison de VegT et β-caténine induit la formation du centre de Nieuwkoop au niveau du pôle végétatif dorsal. Les cellules du centre de Nieuwkoop vont générer un gradient dorso-ventral de Xnrs qui va induire les cellules adjacentes à former du mésoderme.

Différents facteurs maternels vont limiter l’activité des Xnfs dans le pôle animal et spécifier l’ectoderme.

β-caténine va induire la formation du centre BCNE dans l’ectoderme dorsal tandis que la combinaison des Xnrs et de β-caténine induisent le centre de Spemann, au niveau de la région équatoriale dorsale de l’embryon. Ces deux centres vont générer un gradient dorso-ventral de BMPs, en sécrétant des inhibiteurs extracellulaires des BMPs, induisant ainsi les cellules de l’ectoderme à former du côté dorsal du tissu neural et du côté ventral de l’épiderme. CNS, système nerveux central; BCNE, Blastula Chordin Noggin Expression center; β-cat, β-caténine.

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Figure 3: Le réseau de régulation neurale.

Les cellules ectodermiques sont poussées vers le destin neural aux stades blastula tardive et pendant la gastrulation. L’induction neurale requiert simultanément l’inhibition de la voie BMP par les antagonistes Chordin, Noggin et Follistatine, et l’activation de la voie FGF. Ainsi, les cellules expriment les gènes pan-neuraux Sox2 et SoxD au début de la gastrulation. A la fin de la gastrulation, la couche interne de l’épithélium neural exprime le marqueur des précurseurs neuronaux XNgnr1, qui permet par la suite l’expression de marqueurs de différenciation neuronale tel que N-tubuline. (Heasman, 2006).

1210

an epidermal differentiation pathway that is dictated by BMP signaling (Fig. 4). When all BMPs and the dorsally expressed BMP-like molecule anti-dorsalizing morphogenetic protein (ADMP) are depleted, the entire outer layer of the embryo expresses neural markers (Reversade and DeRobertis, 2005). What then causes neural specification?

An old idea was that no specific signal activates neural fates; that it is the ‘default state’, as disaggregated animal cells express neural markers (Godsave and Durston, 1997). However, it has recently been shown that cell dissociation actually activates FGF signaling and inhibits Smad1 by MAP kinase phosphorylation of its linker region (Kuroda et al., 2005). This raises the question, ‘is FGF the activator of neural specification, or does it act solely as a BMP signaling antagonist?’. Definitive evidence that FGF has proneural roles would be obtained by identifying specific FGF transcriptional targets required for neurogenesis. Recent in vivo studies suggest that this is the case; the proneural genes Sox2 and neural cell-adhesion molecule (Ncam) expression depend on low levels of FGF signaling at the blastula stage, independently of BMP antagonism (Delaune et al., 2005).

The epidermal regulatory network downstream of BMP signaling includes the transcriptional activators Xvent2(Onichtchouk et al., 1996) and Msx1 (Suzuki et al., 1997), which activate the epidermal pathway and also suppress pro-neural genes when ectopically overexpressed. These genes in turn activate more restricted pro- epidermal genes, which can directly regulate epidermal structural genes, but do not have neural repressive roles (Tao et al., 2005a), (Fig. 4). Thus, epidermal fate is determined by BMP signaling, while neural specification may require FGF signaling and BMP antagonism (Fig. 5).

The classical animal cap assay illustrates how easily mid-blastula animal cells can be diverted to mesodermal or endodermal fates by added growth factors. Moreover, several Xnr proteins have been shown to have long signaling ranges (White et al., 2002; Williams et al., 2004). But even after suppression of BMP signaling, or after suppressing both BMP signals and their antagonists, animal cells express neural, rather than mesodermal, markers (Reversade and De Robertis, 2005). So what prevents animal cells from undergoing mesoderm induction?

Recently, several intrinsic mesoderm antagonism mechanisms have been identified. One essential maternal regulator is the RING-type ubiquitin ligase, ectodermin, which regulates Smad4 degradation (Dupont et al., 2005). As Smad4 heterodimerizes with both Smad1 and Smad2, its degradation reduces both BMP and nodal-type TGF! signaling. The field of influence of ectodermin is dictated by its localized pattern of expression in the animal half of the oocyte and blastula, and its depletion causes the ectopic expression of the mesodermal gene eomesoderminand the expanded expression of the endodermal gene Mixer into the animal hemisphere. The neural marker Xsox2 is also downregulated by ectodermin depletion. Thus, the animal localization of ectodermin dictates the lower margin of the ectoderm precursor region and favors neural specification.

ectoderminexpression becomes asymmetrically enriched in the embryonic dorsal animal quadrant at the gastrula stage, where the abrogation of Xnr and BMP signaling is required for neural specification (Dupont et al., 2005).

Animally localized maternal and zygotic transcription factors also regulate the boundary between pro-ectodermal and mesodermal areas. The depletion of the maternal, animally localized, Zic2

REVIEW Development 133 (7)

Epidermal structural genes e.g. Xk81a1

Pro-neural genes BMP2, BMP4 and BMP7

Smad1 P

Msx1, Xvent2

Xgrhl Xap2

Dlx3/Dlx5

Fig. 4. The epidermal regulatory network. BMP signaling activates target genes directly, including Xvent2 and Msx1 (which activate the epidermal pathway and suppress neural fates when ectopically overexpressed). Xvent2 and Msx1 regulate the more-restricted pro- epidermal genes Xap2, Dlx3and Xgrhl1, which can directly regulate epidermal structural genes such as the cytokeratin gene Xk81.1a, but which do not have neural-inhibiting functions.

Proliferating neural precursors (Sox2, SoxD)

BMP Pro-epidermal genes

Specific neural precursors (Brg1, Xngnr1)

Neural terminal differentiation (N tubulin)

FGF + chordin, noggin follistatin

Fig. 5. The neural regulatory network. Animal cells are directed towards a neural fate beginning at the late blastula stage and continuing through gastrulation. Neural induction requires both suppression of the BMP-Smad1-Msx pathway by the BMP antagonists chordin, noggin and follistatin, and the activation of FGF signaling.

Cells begin to express proneural genes (Sox2, SoxD) at the gastrula stage. By the end of gastrulation, the deeper layer of the pro-neural ectoderm activates specific neuronal precursor markers, including Xngnr1, which in turn regulates primary neuronal differentiation via XneuroD and N-tubulin. Primary neurogenesis requires the function of the maternal chromatin remodeling protein Brg1.

Figure 4: Représentation schématique du modèle de l’induction neurale chez le xénope.

Au stade blastula les tissus présomptifs de l’épiderme (en bleu), du neuroectoderme (en vert) et du mésoderme (en rouge) sont positionnés par l’activité de signaux maternels. Le facteur de transcription Veg-T (points violets) présent dans le pôle végétatif induit la formation de l’endoderme et du mésoderme. Le facteur β-caténine (points orange) est présent dans la partie dorsale de l’embryon et induit la dorsalisation l’embryon du mésoderme et de l’ectoderme. L’action conjuguée de ces facteurs induit la formation de l’organisateur de Spemann. A la transition midblastula, l’activité transcriptionelle du zygote permet l’expression des facteurs nodal-related (Xnrs). Ces facteurs induisent la transformation des tissus en endoderme et jouent un rôle dans l’induction du mésoderme en même temps que FGF qui est le principal inducteur mésodermique. Les BMPs dans l’ectoderme induisent la formation de l’épiderme. Les données actuelles permettent de dire que le neuroectoderme apparaît grâce à l’action des antagonistes des BMPs (Noggin, Chordin) provenant de l’organisateur de Spemann et dont l’expression est induite par l’activité de la β-caténine (dont on sait que son activité est régulée par la voie Wnt). Intervient aussi l’action du FGF qui bloque, en association avec les antagonistes des BMPs mais aussi directement, la voie de signalisation des BMPs (Delaune et al, 2004).

Figure 5: Formation et différenciation de la crête neurale.

A: La CN est induite à la bordure de la plaque neurale. Au début de la gastrulation, la CN est positionnée à la jonction de la plaque neurale et de l’ectoderme non-neural. Durant la neurulation, la CN se retrouve au niveau dorsal du tube neural. Suite à la fermeture de la plaque neurale, les cellules se délaminent et migrent. B: La CN se différencie en de nombreux types cellulaires. La présentation schématique d’un embryon de xénope au stade bourgeon caudal permet de mettre en évidence les subdivisions majeurs de l’axe antéro-postérieur, ainsi que les types de dérivés de la CN provenant des différentes subdivisions y sont indiqués.

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Figure 6: Voies de signalisation impliquées dans l’induction de la CN.

a: Un gradient médio-latéral de BMPs est établi dans l’ectoderme et spécifie la bordure de la plaque neurale à une concentration intermédiaire. b: Un gradient antéro-postérieur croissant de Wnts et FGFs transforme la partie postérieure et latérale de la bordure de la plaque neurale en future CN. Le niveau des signaux Wnts est maintenu bas dans la partie antérieure de la plaque neurale par des inhibiteurs extracellulaires comme Dickkopf. A, antérieur ; P, postérieur ; M, médial ; L, latéral.

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Figure 7: Représentation schématique du rôle de Xmxi1 au cours de la neurogenèse primaire chez le xénope. L’induction neurale induite par les inhibiteurs des BMPs permet d’activer l’expression de plusieurs gènes pan-neuraux, parmi lesquels Sox3 et SoxD. En retour les facteurs Sox3 et SoxD activent l’expression de Xmxi1, qui induit l’expression de NCAM, Nrp-1 et XNgnr1. Xmxi1 est capable d’inhiber de manière transitoire l’expression des facteurs impliqués dans la différentiation neurones en aval des gènes proneuraux précoces. A des stades plus tardifs au cours de la neurogenèse, cette inhibition transitoire s’arrête, le facteur Xmxi1 peut alors induire la différenciation neuronale. Une boucle de rétrocontrôle positive permet alors aux facteurs proneuraux XNgnr1 et NeuroD de réguler l’expression du gène Xmxi1. En absence du facteur Xmxi1, XNgnr1 est incapable d’induire une neuralisation complète de l’ectoderme, la différenciation neurale est alors inhibée (Klisch et al, 2006).

cell death during primary neurogenesis was therefore evaluated by TUNEL staining. As shown inFig. 8D, injection of mRNA encoding for MT-Xmxi1 increased the amount of cells undergoing apoptosis. The increased number of apoptotic cells is most likely not sufficient to account for the loss of N- tubulin expression. To address if Xmxi1-induced apoptosis contributes to the activity of Xmxi1 during neurogenesis, MT- Xmxi1 was coinjected with the apoptosis inhibitor Bcl2. Bcl2 alone slightly increased neuronal differentiation, as reported previously (Yeo and Gautier, 2003) (data not shown). However, coinjection of human Bcl2 (500 pg) with MT-Xmxi1 did not alter the ability of MT-Xmxi1 to inhibit N-tubulin expression but was sufficient to block MT-Xmxi1-induced apoptosis (−Bcl2, ectopic Sox3, 76%,n = 34, inhibition N-tubulin 82%, n= 25; +Bcl2, ectopic Sox3, 73%,n= 32, inhibition N-tubulin 84%,n= 25) (Fig. 8D). These results demonstrate that, while both cell proliferation and apoptosis are induced by Xmxi1, both activities appear not to be necessary for the activation of Sox3 and inhibition of neuronal differentiation, suggesting that Xmxi1 may have a direct influence on cell fate.

Discussion

In this study, we report on the identification of a novel Xenopus Mad family member and its role in the context of neurogenesis. Xmxi1 is expressed broadly throughout the domains of primary neurogenesis during early embryogenesis, and, at later developmental stages, the expression is maintained

throughout the CNS. Consistent with the early expression of Xmxi1 transcripts during Xenopus primary neurogenesis, we have found that Xmxi1 plays an essential role in the formation of a mature neural fate, which can be acted upon by factors that induce neuronal differentiation.

A summary of the obtained results and the relationship of Xmxi1 with known components of the neurogenesis network are shown inFig. 9. Consistent with an early role in the context of neurogenesis, Xmxi1 was positively regulated by the pan- neurally expressed HMG-box transcription factors Sox3 and SoxD. Through loss-of-function experiments, Xmxi1 was shown to be required for the endogenous expression of X- ngnr-1 and consequently neuronal differentiation, as well as for SoxD-induced activation of Nrp-1, NCAM, and X-ngnr-1.

While Xmxi1 is required for neurogenesis, overexpression of Xmxi1 at high concentration inhibits neuronal differentiation, which may be the result of Sox3 induction and maintenance of an early neural cell fate. X-ngnr-1 and its early proneural target genes, such as X-MyT1 and Ebf2, are not inhibited by overexpression of Xmxi1, but the expression of late acting differentiation genes such as Ebf3 and those required for cell cycle withdrawal of the progenitors including XPak3 and p27 (Xic1) are inhibited. Suppression of neuronal differentiation is only transient, and, at later developmental stages, the expanded precursor population, perhaps due to a decline in concentration of Xmxi1 or Sox3, can undergo neuronal differentiation. In addition, Xmxi1 is also positively regulated by X-ngnr-1 and NeuroD. While Xmxi1 may have an additional role downstream

Fig. 9. Scheme representing the role of Xmxi1 during primary neurogenesis inXenopus. Neural induction by BMP inhibitors leads to the activation of several pan- neural expressed genes including Sox3 and SoxD. In turn, SoxD can activate Xmxi1, which is required for SoxD-induced activation of NCAM, Nrp-1, X-ngnr-1, and neuronal differentiation. Xmxi1 transiently inhibits neuronal differentiation downstream of the proneural genes (red dashed arrow), which may be the result of Sox3 activation. At later stages, Xmxi1 can induce neuronal differentiation (black dashed arrow). Xmxi1 is also activated by proneural genes such as X-ngnr-1 and NeuroD.

In the absence of Xmxi1, X-ngnr-1 does not completely neuralize the ectoderm, and neuronal differentiation is inhibited.

482 T.J. Klisch et al. / Developmental Biology 292 (2006) 470–485

Figure 8: Représentation schématique de la neurogenèse primaire dans la plaque neurale chez le xénope. A: L’induction neurale définie le territoire où la neurogenèse a lieu. Au sein de la plaque neurale, l’action des gènes proneuraux définit les régions cellulaires où vont naître les futurs neurones primaires, les domaines proneuraux. Les gènes neurogéniques vont permettre la sélection spécifique des cellules destinées à se différencier en neurones primaires et empêcher les autres cellules de devenir des neurones. B: Au cours de la neurulation, la plaque neurale converge en son axe médian pour former après fermeture, un tube neural. Une section du tube neural permet de distinguer trois couches cellulaires, une zone ventriculaire où les cellules progénitrices non différenciées sont présentes, une zone subventriculaire où les cellules entrent en différentiation, et une zone marginale où les neurones sont en fin de différenciation. C: Au niveau de la plaque neurale et la zone marginale du tube neural, les neurones primaires s’organisent en 3 paires de bandes, les neurones moteurs (rouge), les interneurones (vert) et les neurones sensoriels (bleu).

A

B

C

Repliement de la plaque neurale

Formation du tube neural Plaque neurale

Neurones moteurs Neurones intermédiaires Neurones sensoriels

N-tubulin

Neurones intermédiaires

Neurones sensoriels

Neurones moteurs

XNKL

XMYT1 Xash3

XATH3 Xebf2/XCoe2

Xebf3 XNeuroD

XNgnr1

XDelta

XNotch ICD Activation de la

cascade proneurale

Activation de la voie de signalisation Notch/ICD

(inhibition latérale)

XNgnr1

NEURONES CELLULES GLIALES

E(spl)R

Figure 5 : La neurogenèse primaire. (A)Représentation schématique de la formation du tube neural. Au sein de la plaque neurale ouverte se définissent trois domaines proneuraux où naissent les trois types de neurones primaires : les neurones moteurs (en rouge), les neurones intermédiaires (en vert) et les neurones sensoriels (en bleu). Au cours de la neurulation, la plaque neurale converge en son axe médian pour former, après fermeture, le tube neural. (B) Hybridationin situavec le marqueur des neurones primaires N-tubuline.

Figure 6 : Représentation schématique de la cascade d’activation des gènes proneuraux sous le contrôle de l’inhibition latérale. Le gène XNgnr-1 est le premier gène exprimé dans les cellules progénitrices neurales qui sont destinées à devenir des neurones. Il induit l’expression en cascade de gènes codant pour des protéines de types bHLH ou non bHLH, et qui permettront la différentiation neuronale. Dans d’autres cellules, cette cascade d’activation est inhibée par la voie de signalisation Notch (inhibition latérale).

A B

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Figure 9: Représentation schématique de la cascade d’activation des gènes proneuraux sous le contrôle de l’inhibition latérale. Le gène XNgnr1 est le premier gène exprimé dans les cellules progénitrices neurales qui sont destinées à devenir des neurones. Il induit l’expression en cascade de gènes codant pour des protéines de types bHLH ou non bHLH, et qui permettront la différentiation neuronale. Dans d’autres cellules, cette cascade d’activation est inhibée par la voie de signalisation Notch (inhibition latérale).

!

A

B

Figure 10: Représentation schématique de la voie de signalisation Notch et du mécanisme d’inhibition latérale. A: La liaison du ligand XDelta au récepteur XNotch-1 entraîne le clivage enzymatique de la partie intra-cytoplasmique Notch/ICD. En absence de Notch/ICD, le facteur de transcription XSu(H) est associé à un complexe répresseur (Co-rep.) qui bloque l’expression des gènes E (spl)R ; en présence de Notch/ICD, le complexe répresseur est déplacé et remplacé par un complexe activateur (Co-act.), ce qui induit l’expression des gènes E(spl)R bloquant ainsi l’expression du premier gène important de la cascade proneurale, XNgnr1. B: Au sein d’un groupe de précurseurs neuronaux non différenciés, une cellule entre dans le processus de différenciation neuronale. L’expression des gènes proneuraux est activée et le mécanisme d’inhibition latérale médié par la voie de signalisation Notch est déclenché. L’inhibition latérale permet d’établir autour d’un neurone différencié un ensemble de cellules maintenues à l’état indifférencié.

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Figure 11: Mécanismes moléculaires régulant la spécification de la crête neurale.

Une dose intermédiaire de BMPs en combinaison avec des signaux Wnts et FGFs induit l’expression des gènes de la bordure de la plaque neurale à la jonction de la plaque neurale et de l’ectoderme non- neural. Ces gènes répartis en deux sous-groupes selon leur domaine d’expression, vont spécifier la bordure de la plaque neurale. Le premier est exprimé dans la plaque neurale et en bordure de la plaque neurale (Pax3, Zic1) et le second dans l’ectoderme non-neural et la bordure de la plaque neurale (Msx1, AP2α). La combinaison de ces facteurs de transcription induit à son tour l’expression des gènes spécifiques de la CN tels que Slug, FoxD3 et les gènes SoxE qui vont déterminer la CN.

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B

Figure 12: A: Arbre phylogénétique des facteurs ZHX. B: Alignement de séquences des homéodomaines de Homez avec ceux des membres de la famille ZHX, ZHX1, ZHX2 et ZHX3. Les résidus identiques dans les séquences des 4 facteurs sont indiqués en vert, les acides aminés similaires en violet et les acides aminés communs entre Homez et les ZHX sont en rose. (Bayarsaihan et al, 2003).

HD1 HD2 HD3

Homez Z p s Z ac

Figure 13: Représentation schématique de l’organisation de la protéine Homez et l’alignement des séquences protéiques de Homez humaine, de souris et de rat.

La protéine Homez possède une organisation particulière comprenant 3 homéodomaines, 2 motifs leucine zipper et une région C-terminale acidique. Les homéodomaines sont indiqués en jaune, les motifs leucine-zipper en vert, les séquences riches en proline en violet, les séquences riches en sérine en bleu foncé et les régions acidiques en bleu clair.

Figure 14: Analyse du profil d’expression du gène Homez au cours du développement chez la souris. Les embryons de souris ont été fixés aux stades indiqués et l’expression de Homez a été analysée par hybridation in situ à l’aide d’une sonde antisens spécifique.

L’expression du gène Homez est ubiquitaire dans un premier temps, puis se régionalise pour se restreindre au niveau du système nerveux embryonnaire en développement. Les embryons de souris sont testés aux stades embryonnaires: A, E8,5 ; B, E9 ; C, E9,5 ; D, E10,5 ; E, E11,5 ; F, E12,5. (Bayarsaihan et al, 2003).

A B C

D E F

Figure 15: Structure et séquence de la protéine Homez.

A: Représentation schématique de la protéine Homez. B: Alignement de la séquence protéique prédite d’Homez chez le Xenopus laevis avec celles connues chez la souris et l’humain. Encadrés en rouge les 3 homéodomainessont encadrés en bleu et les motifs Leucine zipper et la région acidique C terminale en vert clair. Xl, Xenopus laevis ; Mm, Mus musculus ; Hs, Homo sapiens. Les lignes discontinues représentent les acides aminés similaires à ceux de la séquence d’Homez chez le Xenopus laevis.

HD1 HD2 HD3

Homez

A

B

Homez

VegT

Xbra

Xema

Hist. H4

B

-RT

Hist. H4 Hist. H4 XHomez A

Figure 16: Profil d’expression spatio-temporel de Homez chez le Xenopus laevis.

A: Etude de l’expression temporelle du gène Homez par RT-PCR à partir d’ARN d’embryons de xénope à différents stades du développement, de l’oeuf jusqu’au stade 36. Histone H4 et -RT servent de contrôles respectivement quantitatif et de la non contamination par de l’ADN génomique. B: Profil d’expression spatial réalisé en RT-PCR à partir d'ARNm extrait de dissections d’embryons de xénope au stade 10,5 afin de séparer les trois futurs feuillets germinaux. AP (Animal Pôle), MZ (Marginale Zone), VP (Végétatif Pôle), CE (Contrôle Embryons). L’histone H4 sert de contrôle quantitatif, VegT est exprimé au niveau du pôle végétatif, Xbra est un marqueur de la zone marginale et Xema un marqueur du pôle animal. C Hybridations in situ réalisées sur des embryons à différents stades du développement, avec les sondes antisens indiquées en bas à gauche de chaque profil d’expression. Ca: Expression du gène Homez au stade gastrula 10,5 (vue latérale, avec le blastopore situé à gauche; Cb, Cc, Cd, Ce: Profils d’expression au stade neurula précoce 12,5 respectivement des gènes Ngnr1, Myt1, Homez, N-tubuline (vue dorsale) ; Cf:

Expression de Homez au niveau de la plaque neural au stade 14 (vue dorsale). Cg: Profil d’expression de Homez au stade 28 (vue latérale) ; Ch, Ci, Cj, Ck: Coupes transversales au niveau du tube neural au stade 32. Cg: ganglions crâniens ; ba: arcs branchiaux.

C

Ngnr1 12.5 Myt1 12.5

b c

Homez 12.5 d

Ntub 125

e

14

Homez 28

Homez

ba cg

Ngnr1 32 Ntub

i k

a f

g h

Homez 10,5

j

32 32

Homez

Myt1 32

i

A

mRNA Noggin

      CC

Homez

- RT

Ep.K Sox3 Hist. H4 Hist. H4

100p g 40p g 10p g

Noggin

      C E

Homez

Sox3

IS

IS

tBr Nrgn1

Homez IS

b

ICD

Homez IS

B

IS IS

Ntub ESR1

a’ b’

c

c’

Homez IS

d

Figure 17: Régulation de l’expression du gène Homez chez le xénope.

A: Expression de Homez dans des calottes animales dérivées d'embryons surexprimant noggin à différentes doses: 100pg, 40pg, 10pg. L’expression du marqueur de l’épiderme Epi.K ainsi que celle de Sox3 marqueur pan-neural a été testée et utilisé comme contrôles. CC: Contrôle Calottes animales naïves ; CE: Contrôle embryon. LʼHistone H4 sert de contrôle de la quantité d'ARNm utilisée pour la RT-PCR. –RT, moins reverse transcriptase . B: Mise en évidence de la régulation de lʼexpression du gène Homez par hybridation in-situ sur des embryons au stade neurula surexprimant: a: le dominant négatif du récepteur aux BMP tBr (500pg, activation 100% n=8) ; b: Nrgn1( 50pg, activation 100% n=18) ; c: la forme intracellulaire du récepteur Notch ICD (500pg, inhibition 75% n=16) ; d: le dominent négatif du facteur intracellulaire de la voie Notch SUHDBM (500pg, activation 76%). a’, b’, c’: Sox3, N-tubuline et ESR1 servent respectivement de contrôles positifs pour les surexpressions de tBr, Ngnr1 et Notch ICD. IS, côté microinjecté («injected side»).

SuhDBM

a

MO Homez

CRMP4 N-tub

IS IS

IS

N-tub

Sox3 Ngnr1 Myt1

IS

IS IS

Su(H)DBM

Su(H)DBM + MO Homez Ntub

IS

Ngnr1

IS

Ntub Ngnr1

IS

Figure 18: La Perte de fonction Homez affecte l’expression des marqueurs neuronaux en aval du facteur Ngnr1. A: Test de spécificité du MO Homez. En haut la Séquence en 5ʻ de l’allèle homez présent chez le Xenopus laevis. La position du MO est soulignée en rouge. L’ATG de la région codante est encadré en vert. Les microinjections d’ARNm Homez-GFP (synthétisé in vitro à partir de la séquence en 5ʼ UTR de Homez fusionnée à la séquence de la GFP) a et a’: expression de l’ARNm Homez-GFP seule ; b et b’: expression de l’ARNm Homez-GFP en présence du MO Homez ; c et c’: expression de l’ARNm DMRT5 en présence du MO Homez. Les injections d’ARNm ont été effectuées à une concentration de 500pg par cellule et de 10pg pour le MO Homez par cellule. B: Hybridation in-situ réalisée sur des embryons au stade neurula microinjectés avec MO Homez à 10pg + 500pg dʼARNm LacZ. Les sondes utilisées sont : a: (SOX3 pas dʼeffet 91% n=23) ; b: (Nrgn1 faible inhibition 18% n=27) ; c: (Myt1 pas dʼeffet 100% n=14) ; d: (CRMP4 inhibition 52% n=25) ; e: (Ntub inhibition 72% n=22) ; f: coupe au niveau du tube neural au stade neurula d’un embryon ou Mo Homez bloque l’expression de N-tubuline du coté injecté. IS: coté injecté («injected side»). C: RT-PCR sur des calottes animales au stade neurula (St15) microinjectées au stade 4C avec les différentes constructions: CC: Calottes Contrôles ; Nrgn1: CA surexprimants Nrgn1 (50pg) ; Nrgn1+Moc (50pg+10pg): CA surexprimants l’ARNm Nrgn1 en presence du morpholino contrôle sans effet ; Nrgn1+MOHZ: CA surexprimants Ngnr1 (50pg) avec 2,5pg, 5pg, et 10pg de Mo Homez ; H2O : eau. Les RT sont réalisées avec 750ng d’ARNtotaux, les PCR avec 2ul d’ADNc, les PCR ont été réalisées avec les amorces suivantes: CRMP4, Ntubuline, BTBD6, Myt1, Sox3 et l’Histone H4. Un western blot anti-myc et et GAPDH sont réalisés pour déterminer la quantité de protéine Myc-Ngnr1 surexprimée dans chaque condition testée par rapport à l’expression de GAPDH endogène. La protéine endogène GAPDH sert de contrôle. D: Hybridation in situ au St15, Les embryons surexpriment SuH DBM (500pg) seule ou en présence du Mo Homez (10pg), l’effet de cette surexpression sur les marqueurs N tubuline et Ngnr ont été contabilisés: a: Ntubuline (SuHDBM: surexpression 79% n=28 ) ; a’: Ntubuline (SuHDBM+MoHz: inhibtion 63%, surexpression 16% n=32) ; b: Nrgn1 (SuHDBM: surexpression 89% n=28) ; b’ Ngnr1 (SuHDBM+MoHz: surexpression 73% n=11), IS: coté injecté («injected side»).

A B

C D

MO Homez Homez-eGFP

MO Homez

Homez-eGFP DMRT5-eGFP

GAPDH

-RT

MOHz

N-tub CRMP4 BTBD6

Sox3 Hist. H4 Myt1

CC

Ngnr1

Moc

Myc-Ngnr1

IS

a b c

a b c

d e f

a b

a’ b’

a’ b’ c’

NI

ARNm Flag-Homez

A B

Sox3

Hist. H4 M. Actin CRMP4

Sox2 N-tub Flag-Homez

67 kDa Anti-Flag

EpiK IS Sox3

ElrC IS Myt1 IS Ntub IS CRMP4 IS

IA1 IS

Nrgn1

Homez

IS IS

C

a b c d

e f g h

Epi.K

Figure 19: Etude des conséquences de surexpression du gène Homez sur la neurogenèse.

A: Surexpression de lʼARNm Flag-Homez dans des les 4 cellules du pôle animal au stade 8 cellules à une concentration de 500pg/cellule. Au stade blastula, les calottes animales sont disséquées et cultivées jusqu'au stade neurula.(st. 15). En haut à droite, lʼexpression de la construction Flag-Homez a été vérifiée en western blot avec un anticorps anti-Flag. NI, calottes animales non-injectées. En bas à droite, immunomarquage anti-flag montrant que Homez est détecté principalement dans les noyaux des cellules de la gastrula. B: Les ARN des calottes animales ont été utilisés en RT-PCR réalisée à partir de CE: contrôle embryon(embryons non injectés) ; CC: contrôle calottes (calottes animales naïves) ; Homez: calottes animales surexprimant Flag-Homez. Le niveau dʼexpression des gènes suivants a été testé: Epidermal kératine; CRMP4, N-tubuline, Sox2, Sox3, Actine et Histone H4. C: Hybridation in-situ en embryons surexprimants lʼARNm Homez. Les sondes utilisées sont: a: Epi.K: Epidermal Kératine (500pg: inhibition 66% n=24) ; b: Sox3 (500pg pas dʼinhibition 85% ; induction 15 %n=35) ; c: Nrgn1 (faible diminution 20% n=15) ; d: IA1 (pas dʼinhibition n=17) ; e: ElrC (500pg:

faible diminution 20% n=16) ; f: Myt1 (500pg faible diminution 25% n=30) ; g: Ntub (500pg diminution 57%

n=26) ; h: CRMP4 (500pg diminution 66% n=12). IS: coté injecté («injected side»).

Figure 21: Structure protéique du facteur CBFβ et organisation.

A: Structure stéréotypique de la protéine CBFβ. B: Reconstitution de la structure protéique de CBFβ composée de 5 hélices α, 6 feuillets β et dʼune grande boucle (long loop). (Wokf-wats et al, 2001).

A

B

Figure 22: Mise en évidence de l’interaction du facteur CBFβ avec le domaine Runt des facteurs CBFα. Les résidus Asn-104 et Gly-61 interagissent avec les deux extrémités de l’interface du domaine Runt. Les atomes de carbone sont représentés en bleu cyan pour le domaine Runt et en magenta pour le facteur CBFβ, Les atomes d’oxygène en rouge et les atomes de nitrogène sont indiqués en bleu foncé. En haut, l’interaction entre CBFβ et le domaine Runt a lieu entre les deux feuillets β parallèles, au niveau des résidus 102 et 104 du feuillet β4 de CBFβ et des résidus 159 et 161 du feuillet βG du domaine Runt. Les liaisons hydrogènes sont montrées en jaune discontinu. En bas, la deuxième interaction forte a lieu entre le carbone Cα du résidu Gly-161 de CBFβ et l’oxygène du résidu N-109 du feuillet βC du domaine Runt. Cette interaction est représentée en orange (Tang et al, 2000).

A

B

Figure 23: Séquence et analyse par RT-PCR de l’expression de CBFβ au cours de l’embryogenèse. A: Alignement de la séquence protéique prédite de CBFβ chez le Xenopus laevis avec celles connues de souris et de l’humain. Xl, Xenopus laevis ; Mm, Mus musculus ; Hs, Homo sapiens.

Les lignes discontinues représentent les acides aminés similaires à ceux de la séquence de CBFβ chez le xénope. B: Expression temporelle par RT-PCR de CBFβ (35 cycles) durant les stades indiqués du développement du Xenopus laevis. L’Histone H4 sert de contrôle. +/- RT correspondent à la présence ou pas de la reverse transcriptase lors de la synthèse des ADNc. C: Profil d’expression spatial de CBFβ déterminé par RT-PCR à partir d’ARNm extrait de différents explants d’embryons au 10,5. Ani Cap:

calotte animale ; Marg Zon: zone marginale ; Vegt Pol: pôle végétatif ; Cont.E: embryon contrôle. Les amorces utilisées: CBFβ ; VegT: marqueur du pôle végétatif ; Xbra: marqueur de la zone marginale ; Xema: marqueur du pôle animal. L’histone H4: sert de contrôle.

C

+RT -RT

CBF β H4 H4 -RT

+RT

VegT Xbra Xema Hist. H4

Figure 24: Profil d’expression de CBFβ chez le Xénope.

A: Hybridation in situ réalisée avec la sonde CBFβ au stade 10,5. B, C, D, E, F: Hybridation in situ au stade 14 mettant en évidence l’expression des gènes CBFβ, Msx1, Pax3 et Slug et Runx1. G et M: Coupes transversales au stade neurula et têtard respectivement au niveau de la plaque neurale et du tube neural. I,J et K: Vues antérieures. L,N et O: Vues latérales. A,B,C,D,E,F et H: Vues dorsales d’embryons, avec le coté postérieur à gauche. Abréviations: bpn: bordures de la plaque neurale ; pt: placodes trigéminales ; ph:

précurseurs hématopoïétiques ; po: placodes olfactives ; ccn: cellules de la crête neurale ; n: notochorde ; m:

mésoderme ; tn: tube neural ; nc: nerfs crâniens; r: rétine ; ab: arcs branchiaux ; mh: mésoderme hématopoïétique.

F St 14

Runx1

Figure 25: L’expression de CBFβ est contrôlée par les signaux BMP, Wnt, FGF, Notch et les facteurs proneuraux . dans la régulation de CBFβ.A: a: CBFβ est activé lors de la diminution de BMP (tBr à 50pg: activation 64% n=33) ; c: l’expression de CBFβ est inhibée lors de l’activation de la voie BMP (Ca-Alk3à 50pg: inhibition 77% n=53) ; b et d:Hairy2est utilisé comme contrôle, B,C: L’activation de la voie Wnt canonique ou FGF induit une surexpression de CBFβet leur inhibition réprime son expression. Ba: (dn GSK3β à250pg: activation 67% n=30) ; Bc: (GSK3βà 250pg: inhibition 67% n=21) ; Ca: (FGF8a à 10 pg: activation 70% n= 40) ; Cc: (∆FGFR4 à 250 pg: inhibition 56% n=27);Slug sert de contrôle. D: L’expression de CBFβest inhibée par l’activation de la voie Notch; a: (Su(H)ank à 500pg: inhibition 61% n=18) ; c l’inhibition de la voie Notch active l’expression de CBFβ: (Su(H)dbm (500pg): activation 50% n=16);b et d: N-tubuline sert de contrôle. E: Les facteurs proneuraux XNrgn1 et NeuroD induisent une activation deCBFβ: a: (XNrgn1à 50pg: activation 88% n=24) ; d: (NeuroDà 500pg: activation 82% n=16). XNrgn1 inhibe l’expression de Runx1: c:(XNrgn 1 à 50pg: inhibition 84% n=19);b et e: N-tubuline est utilisé comme contrôle. Toutes les microinjections ont été effectuées en addition de l’ARNm LacZ pour déterminer le coté injecté (Inj). La régulation deCBFβ a été établie au stade neurula.

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a b c d

a

a a

a b c c

c b b b

d d d e

a b c d

NI Flag-CBFβ

Anti-Flag

19 Kda

A

IS IS

Ntub Slug

B

Figure 26: La surexpression du facteur CBFβ n’affecte pas le développent de la CN et la neurogenèse.

A: Western blot anti-Flag réalisé à partir des protéines extraites d’embryons de xénope surexprimants ou pas la construction Flag-CBFβ. Les embryons qui surexpriment la construction ont été injectés avec 500pg d’ARNm dans les 4 blastomères au stade 4C. NI: puit contenant les protéines d’embryons non injectées; Flag-CBFβ: puit contenant les protéines d’embryons injectées avec la construction Flag-CBFβ. B: Hybridation in situ réalisée à partir d’embryons surexprimants Flag-CBFβ. Les sondes utilisées correspondent aux marqueurs a: N-tubuline et b: Slug. IS: coté injecté («injected side»).

a b

MO1+2 CBF β

IS Msx1

IS

IS IS

IS

HOX11L2

Twist Twist

Sox10 Sox10 HNK1 IS HNK1

NIE

NIS NIS

NIS IS

IS

Slug Ntub

B A

a

a’

b c

b’ c’

a b c c’ d e

f h h’ i i’

MO3

Sox3

g

Figure 27: La perte de fonction CBFβ affecte le développement de la CN et la neurogenèse.

A: Test de spécificité des MOs CBFβ. En haut la séquence en 5ʼ des deux pseudo-allèles CBFβ présents chez Xenopus laevis. La position des trois MOs utilisés est indiquée en bleu et rouge et noir. L’ATG de la région codante est encadré en vert. En bas, la miroinjection de l’ARNm CBFβ-GFP à 500pg (synthétisé in vitro à partir de la séquence 5’

des deux pseudo-allèles CBFβ fusionnées à la séquence de la GFP) et de l’ARNm DMRT5-GFP 500pg, en présence ou en absence des MO1 et MO2 ou des Mm1+Mm2 à 10pg chacun. B: Le phénotype des embryons microinjectés au stade 4 cellules au niveau d’un blastomère avec les MOs CBFβ (2,5pg chacun). L’hybridation in situ réalisée avec les sondes N-tub, Slug, Twist, Sox10, Hox11L2, Msx1 et Sox3 montre une diminution des marqueurs des CN et des neurones primaires. a: Slug (diminution de 89% n= 46) ; b: N-tub (diminution de 82% n=39) ; c et c’ (deux profils d’un même embryon microinjecté Mo CBFβ unilatéralement) Twist (diminution de 81% n=26) ; d Hox11L2 (diminution de 73% n= 19) ; e: Hox11L2 ( NIE: embryon non injecté) ; f: Msx1 (pas d’effet 90% n= 19) ; g: Sox3 (100% pas d’effet n=

15) ; h et h’: (les deux cotés d’un même embryon microinjecté Mo CBFβ unilatéralement) Sox10 (diminution de 84%

n=27). i et i’: (les deux côtés d’un même embryon microinjecté Mo CBFβ unilatéralement) correspondent à l’immunomarquage anti-HNK1 met en évidence une inhibition de l’expression de HNK1 (inhibition de 78% n=13). C:

Embryons microinjectés avec les Mo mutés Mis1et 2 (2,5pg chacun). Les Mos mutés n’inhibent pas le marquage des neurones primaires et de la CN a: Slug; b: N-tubuline ; c et c’: (les deux côtés d’un même embryon microinjecté Mis CBFβ unilatéralement) Twist. D: Immunomarquage anti pH3 sur des embryons morphats CBFβ. Les embryons testés ont été microinjectés avec: a et a’: la rhodamine seule (pas d’effet n=23); b et b’: les MO1+MO2 CBFβ+ la rhodamine (inhibition de la prolifération 96% n=30) ; c et c’: Mis1+Mis2 CBFβ+rhodamine (pas d’effet n=27). pH3:

Immunomarquage pHistonne H3 ; Rho: Fluorescence de la Rhodamine ; IS: coté microinjecté («injected side»).

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IS Twist Twist

C

NIS

c c’

Rhodamine

Mo 1+2 CBFβ

Rhodamine MM 1+2 CBFβ Rhodamine

pH3 IS pH3 IS pH3 IS

IS IS IS

Rho Rho Rho

D

a b c

a’ b’ c’

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a b

IS IS

Slug Ntub

CBFβ DAPI Merge

C B F β -G F P Runx1 C B F β -G F P Noggin C B F β -G F P N o g g in W n t8 C B F β -G F P

a a’ a’’

b b’ b’’

c c’ c’’

d’’

e’’

d’

e’

d

e

Figure 28: Localisation subcellulaire de CBFβ. Microscopie fluorescente chez le Xenopus laevis de calottes Animales microinjectées avec: a, a’ et a’’: l’ARNm CBFβ-GFP (500pg/cellule) seul ; b, b’ et b’’:

surexpression de CBFβ-GFP (500pg/cellule) + Runx1 (500pg/cellule) ; c, c’ et c’’: surexpression de l’ARNm CBFβ-GFP (500pg/cellule) + Noggin (50pg /cellule) ; d, d’, d’’ et e, e’ et e’’: surexpression de l’ARNm CBFβ- GFP (500pg/cellule) + Noggin+Wnt8 (50pg+50pg /cellule) ; f, f’ et f’’: surexpression de l’ARNm CBFβ-GFP (500pg/cellule) + Wnt8 (50pg/cellule) ; g, g’ et g’’: surexpression de l’ARNm CBFβ-GFP (500pg/cellule) + GSK3β (500pg/cellule) ; h, h’ et h’’: surexpression de l’ARNm CBFβ-GFP (500pg/cellule) + dnGSK3β (500pg/cellule) ; i, i’ et i’’: surexpression de l’ARNm CBFβ-GFP (500pg/cellule) + Pax3 (500pg/cellule). Les microinjections ont été réalisées au stade 4 cellules dans les 4 blastomères chez des embryons pigmentés.

Les dissections des calottes animales sont réalisées au stade 10,5. Les fluorescences verte et bleue correspondent respectivement à CBFβ-GFP et au Dapi (Marquage nucléaire).

f f’ f’’

g

h

i

g’ g’’

h’ h’’

i’ i’’

C B F β -G F P W n t8 C B F β -G F P G SK 3 β C B F β -G F P d n G SK 3 β C B F β -G F P Pa x3

CBFβ DAPI Merge

f

g

h

i i’ i’’

h’ h’’

g’ g’’

f’ f’’