Correction juin 2005
Pour répondre à ce sujet, il fallait connaître un peu de la biologie de Cryptococcus neoformans.
- Pour identifier l'homologue de wc-1, il suffit d'analyser la séquence génomique (maintenant disponible) de C. neoformans à l'aide d'un programme de comparaison de séquences (par exemple BLAST). Cette analyse montre qu'une seule séquence du génome de C. neoformans code pour une protéine avec un % de similitude fort avec le gène wc-1. Pour montrer que BWC1 est nécessaire pour la régulation de la reproduction sexuée par la lumière, il faut inactiver le gène. Chez Cryptococcus neoformans, deux stratégies sont possibles : soit le remplacement du gène par un évènement de double recombinaison, soit une inactivation par RNAi. La souche inactivée doit faire la reproduction sexuée en présence de lumière. (3 points)
- Pour faire la mutagenèse insertionnelle, il faut soit transformer C. neoformans avec un fragment d'ADN contenant un marqueur de sélection ne possédant pas de ressemblance avec le génome (un gène de résistance à un antibiotique par exemple) et dans ce cas l'intégration de l'ADN se fait au hasard, soit utiliser un transposon modifié. On génère ainsi une collection d'individus ayant un fragment d'ADN inséré dans leur génome à différents endroits. Ils ont ensuite évalué la reproduction sexuée parmi tous les individus obtenus après mutagenèse et sélectionné ceux qui font la reproduction sexuée en présence de lumière. Ensuite, on peut identifier le gène inactivé de plusieurs manières.
La plus simple et d'amplifier par PCR inverse les séquences de jonction ADN inséré/génome de C. neoformans et d'en faire la séquence. (3 points)
- Pour visualiser l'abolition de l'expression du gène mfa1, il suffit de faire un Northern Blot avec de l'ARN extrait d'une souche sauvage et des deux mutants et de le sonder avec une sonde recouvrant le gène mfa1. (1 point)
- Pour montrer de BWC1 et BWC2 interagissent, il faut soit faire une co- immunoprécipitation avec un anticorps pour un des partenaires et vérifier que l'autre
est dans le précipité, soit un test en double hybride utilisant un des partenaire comme appât et l'autre comme proie. (2 points)
- Pour montrer la diminution de virulence, il suffit d'injecter à une souris des cellules sauvages et des cellules mutantes et de comparer les taux de mortalité de souris.
L'injection de cellule sauvage devant causer une mortalité à une dose inférieure. (1 point)
Les conclusions que l'on peut tirer:
- Les mêmes protéines intervenant dans la régulation par la lumière chez un basidiomycète et un ascomycète, il est probable que cette régulation par la lumière était présente chez l'ancêtre commun de ces deux champignons. Celui-ci utilisait donc déjà la lumière pour sentir les conditions extérieures et possédait probablement une meilleure adaptation que ses compétiteurs aveugles (ce système a été conservé pendant 1 milliard d'année !). On peut noter cependant que l'évolution a conduit à des régulations diamétralement opposées dans leurs effets : activation de la reproduction sexuée chez Neurospora, inhibition chez Cryptococcus. Les raisons de cette différence ne sont pas claires mais sont probablement liées au mode de vie de ces deux organismes. (5 points)
- On peut espérer utiliser les connaissances acquises sur BWC1 et BWC2 pour essayer de contrer la virulence de C. neoformans. En effet, BWC1 fonctionnant avec un cofacteur flavine, on doit pouvoir trouver soit des produits inhibant la synthèse ou l'activité de ce cofacteur. Alternativement, l'utilisation des souches possédant une virulence atténuée pourrait conduire à la production d'un vaccin. (5 points)
