Les acides gras ω 3 a longue chaîne réduisent la lipotoxicité induite par le palmitate en modifiant son métabolisme et son stockage dans la cellule musculaire c2c12

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Les acides gras ω 3 a longue chaîne réduisent la lipotoxicité induite par le palmitate en modifiant son métabolisme et son stockage dans la cellule musculaire

c2c12

Alexandre Pinel, Jean-Paul Rigaudière, Brigitte Laillet, Corinne Pouyet, Estelle Pujos-Guillot, Corinne Malpuech Brugere, V Lenoi, C Prip-Buus,

Béatrice Morio, Frédéric Capel

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Alexandre Pinel, Jean-Paul Rigaudière, Brigitte Laillet, Corinne Pouyet, Estelle Pujos-Guillot, et al.. Les acides gras ω 3 a longue chaîne réduisent la lipotoxicité induite par le palmitate en modifiant son métabolisme et son stockage dans la cellule musculaire c2c12. Journées scientifiques de l’ Insti-tut Multidisciplinaire de Biochimie des Lipides, InstiInsti-tut Multidisciplinaire de Biochimie des Lipides (IMBL). Villeurbanne, FRA., Jun 2014, Lyon, France. �hal-02743753�

A. Pinel1,2_{, J-P. Rigaudière}1,2_{, B. Laillet}1,2_{, C. Pouyet}1,3_{, E. Pujos}1,3_{, C. Malpuech-Brugère}1,2_{, V. Lenoir}4_{, C. Prip-Buus}4_{, B. Morio}1,2_{, F. Capel}1,2

1_{Institut National de la Recherche Agronomique, centre de Clermont-Ferrand Theix Lyon, Unité de Nutrition Humaine UMR1019.}

2_{Laboratoire de Nutrition Humaine, Equipe CHLEO (Contrôle de l’Homéostasie Lipido-énergétique et Obésité), 63009 Clermont Ferrand Cedex 1.} 3_{Plateforme d’Exploration du Métabolisme, 63122 St Genès Champanelle.}

4_{Institut Cochin, Unité INSERM 1016. Equipe Mitochondrie, Bioénergétique, Métabolisme et Signaling, 75014 Paris.}

LES ACIDES GRAS ω3 A LONGUE CHAÎNE REDUISENT LA LIPOTOXICITE INDUITE PAR LE PALMITATE EN MODIFIANT SON METABOLISME ET

SON STOCKAGE DANS LA CELLULE MUSCULAIRE C2C12.

Journées scientifiques de l’ Institut Multidisciplinaire de Biochimie des Lipides, 2014

Contexte

ObEpi-Roche, 2012

Prévalence de l’obésité en France

Les causes

Baisse activité Physique

Excès d’apport calorique par l’alimentation riche en sucres simples et en lipides [notamment acide gras saturés (AGS)]

Faible consommation d’AG polyinsaturés dont les oméga-3

L’obésité dans le monde

FOIE

MUSCLE SQUELETTIQUE TISSU ADIPEUX

Sang AG libres Relargage grâce aux lipases ATGL et LHS AGl, TG, glucose Lipolyse Gallagher et al. 2010 AG libres Captation via LPL et transporteurs d’acides gras (FABPs, FATPs) TG (VLDL)

Glucose

Production de glucose Samuel et al. 2004

(glycogénolyse / néoglucogenèse) Contenu en lipides (stéatose), DG, céramides Cahova et al. 2012

Obésité et insulino-résistance musculaire

Le muscle capte 80% du glucose en réponse à la sécrétion d’insuline après un repas.

En condition physiologique

En cas d’insulino-résistance

Diminution de la captation du glucose et de l’oxydation des lipides.

Zhang et al. 2010

Augmentation du contenu musculaire en triglycérides (TG),

diglycérides (DG) et céramides. lipotoxicité

Feng et al. 2012

L’excès de palmitate participe à l’accumulation de lipides (DG, céramides) et à l’insulino-résistance.

Obésité, palmitate et insulino-résistance musculaire

Schéma général de la voie de signalisation de l’insuline

DG : diglycerides, GLUT4 : glucose transporter 4, IRS-1: insulin receptor substrate-1,

PI3-K : phosphoinositide 3-kinase, PDK : phosphoinositide-dependent kinase,

Akt : protein kinase B, PKC : protein kinase C, PTEN : phosphatase and tensin homolog. Lozano et al. 1994 Chavez et al. 2003 PTEN Palmitate p38MAPK Insuline Akt/PKB SS ser473 thr308 PIP2 PIP3 PDK P P PI3-K P IRS-1 PKCϴ PKCζ céramides DG P P GLUT4 Captation de Glucose Palmitate tr a n sl o ca ti o n ?

Oméga-3 : précurseur et dérivés

Elongation et désaturation des acides gras oméga-3.

ALA : acide alpha-linolénique, DHA : acide docosahexaénoïque, EPA : acide éicosapentaénoïque.

ALA

Meyer et al.,

Les oméga-3 et leurs bénéfices dans l’insulino-résistance

FOIE

Sang

Lipogenèse (stéatose) Kim et al. 2008 Néoglucogenèse

AGl, TG, glucose

Oxydation des lipides via PPARα Pawar et Jump 2003

MUSCLE SQUELETTIQUE

Captation AG libres

Synthèse glycogène

Absorption glucose Aas et al. 2006 Captation des acides gras

TISSU ADIPEUX

Relargage AG libres

Oxydation des lipides Biogenèse mitochondriale Flachs et al. 2005 Adipogénèse Madsen et al. 2005 Relargage TG (VLDL) et Glucose Captation AG libres

Objectifs

Identifier les effets propres de chaque ω3 (ALA, EPA et DHA) à dose

équivalente et physiologique sur la réponse à l’insuline.

Suivre l’orientation intracellulaire du [1-14_{C]-palmitate en présence de}

chaque ω3 et définir les classes de lipides altérées.

Rechercher les voies de signalisation et mécanismes impliqués dans la

modulation de la réponse à l’insuline.

1

2

3

Matériels & Méthodes : modèle et protocole

Modèle in vitro

Cellules musculaires C2C12

Analyses

Western Blot : activations des kinases Akt, PKCs et MAPKs Anisotropie : fluidité membranaire

LC-MS : dosage des céramides

Flux intracellulaire de palmitate marqué ([1-14_{C]-palmitate)}

Protocole expérimentale

Différenciation Traitement Palmitate 500µM ±ω3 50µM

Jusqu’à 90% de confluence 16 heures

Mise en culture DMEM +10%SVF Collecte (cellules/Milieux) Prolifération 5 jours Traitement radioactif ou

palmitate TG Diglycérides Phospholipides Oxydation mitochondriale CO₂ CAS

Traitement radioactif des cellules

Dosage du CO2 libéré Comptage CAS (métabolites)

Récupération du milieu

Récupération des cellules

Extraction des Lipides

CCM

Comptage radioactivité Dosage des classes de lipides

Matériels &Méthodes : flux intracellulaire de palmitate marqué

TG AGNE DAG PL EC Cholestérol

Résultats : Sensibilité à l’insuline

L’EPA et le DHA améliorent l’activation d’Akt comparativement au

palmitate seul. Insulino-résistance induite par le palmitate 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 a a a b b a b b c c Insuline Akt/PKB SS ser473 thr308 PIP2 PIP3 PDK P P PI3-K P IRS-1 PKCϴ PKCζ céramides DG P P ALA EPA CTRL DHA PAL

Activation d’Akt (Thr308) Activation d’Akt (Ser473)

P h o sp h o -A k t (T h r3 0 8 ) / A k t to ta l (U .A .) P h o sp h o -A k t (S er 4 7 3 ) / A k t to ta l (U .A .)

L’EPA et le DHA favoriseraient la fluidité des membranes pouvant

jouer un rôle dans le bon fonctionnement de la cascade de signalisation de l’insuline.

Résultats : Fluidité membranaire

A n is o tr o p ie ( en % d u c o n tr ô le ) DPH (fluorescent) Détecteur Cellule Lumière

Plus la lumière est déviée plus la fluidité est importante

Principe de l’anisotropie 90 95 100 105 110 115 Fluidité membranaire Rigidité membranaire

Mesure de fluidité membranaire

a b *p<0,05 vs PAL ALA EPA CTRL DHA PAL ab a a

Oxydation totale Oxydation partielle Somme

L’EPA et le DHA restaurent l’oxydation du palmitate qu’elle soit

partielle ou totale. L’ALA n’a pas d’effet significatif sur ce

paramètre. 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 a b a ab ab a b a ab a

(En % du contrôle) (En % du contrôle) (En % du contrôle)

Résultats : Oxydation du palmitate marqué

Après 3 heures d’incubation avec du palmitate marqué :

ALA EPA CTRL

DHA PAL

0 20 40 60 80 100 120 140

Réduction de la quantité de DG et de céramides par les trois

supplémentations en oméga-3 vs palmitate. Effet plus marqué de l’EPA

sur la réduction des céramides.

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 a ac bc b c ab b ac ac ac

Résultats : Accumulation de composés lipotoxiques

C ér a m id es t o ta u x ( en n m o l / m g d e p ro t) D G ( en % d u c o n tr ô le ) Accumulation de palmitate marqué dans les diglycérides

ALA EPA CTRL DHA PAL Accumulation de céramides intracellulaires

Résultats : Inhibition de la voie de l’insuline par la PKC theta

L’EPA et le DHA inhibent l’activation de la PKCϴ par le palmitate. Pas

d’effet significatif de l’ALA vs palmitate.

Insuline Akt/PKB SS ser473 thr308 PIP2 PIP3 PDK P P PI3-K P IRS-1 PKCϴ DG P 0,00 100,00 200,00 300,00 400,00 500,00 600,00 700,00 800,00 900,00 1000,00 p h o sp h o -P K C ϴ / G A P D H (U .A .) a a a b b ALA EPA CTRL DHA PAL

Résultats : Exploration de la signalisation

L’EPA et le DHA inhibent l’activation de la p38MAPK par le palmitate.

Pas d’effet de l’ALA vs palmitate.

0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 300,00 350,00 p h o sp h o -p 3 8 / p 3 8 to ta le (U .A .) a a _a b _b 0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 p h o sp h o -E R K / E R K to ta le (U .A .) a b b b b ALA EPA CTRL DHA PAL

Activation des mitogen-activated protein kinase (MAPK)

p38MAPK ERK 1/2

Conclusion et perspectives (1)

Evaluation de la captation du glucose :

Modèle C2C12 pas idéal, mais développement en cours Rôle de la p38MAPK dans l’insulino-résistance ?

Evaluer la sensibilité à l’insuline en présence d’un inhibiteur de la p38MAPK

Captation glucose Sensibilité à l’insuline AGS (palmitate) DG céramides EPA/DHA vs palmitate Fluidité membrane ? Oxydation TG ? Captation glucose Sensibilité à l’insuline AGS (palmitate) DG céramides ALA vs palmitate Fluidité membrane ? Oxydation TG ?

PTEN Palmitate p38MAPK Insuline Akt/PKB SS ser473 thr308 PIP2 PIP3 PDK P P PI3-K P IRS-1 PKCϴ PKCζ céramides DG P P GLUT4 Captation de Glucose Palmitate tr an sl o ca ti o n ?

Conclusion et perspectives (2)

Le palmitate induit l’activation de la p38MAPK dans des hépatocytes murins.

Collins et al., Journal of Biological Chemistry 2006

La PKCδ induit l’activation de la p38MAPK dans des fibroblastes cardiaques.

Feng et al., British Journal of Pharmacology 2010

La p38MAPK active la kinase PTEN dans des cellules endothéliales humaines.

Shen et al., Journal of Biological Chemistry 2006

Remerciements

Collaborations :

- Institut Cochin, INSERM U1016 C.Esnous

V. Lenoir C.Prip-Buus

- Plateforme Métabolomique (INRA Theix) C. Pouyet

E. Pujos

Encadrants de thèse:

F. Capel B. Morio

Membres du comité de thèse:

J. Bellenger P. Guesnet

Financements et suivi scientifique :

- Sofiprotéol/Lesieur A.Dhaussy A. Huertas Equipe CHLEO: C. Jouve B. Laillet C. Malpuech-Brugère E. Pitois J-P. Rigaudière J-L. Sébédio