Importance de l'activation de l'immunité innée dans le mécanisme d'action anti-VIH-1 d'approches de thérapies géniques utilisant TRIM5a.

(1)

Caroline DUFOUR, Natacha MÉRINDOL et Lionel BERTHOUX

Laboratoire d’immunité antivirale – Université du Québec à Trois-Rivières

Introduction

Conclusion

Bibliographie

Généralité: L’un des obstacles majeurs au développement d’un traitement cura6f du SIDA réside dans la capacité du VIH-1 à infecter les cellules de manière latente. Des études portant sur l’approche « shock and kill »1_ont mis en évidence l’eﬀet ac6vateur de la voie de signalisa6on NF-κB sur les virus VIH-1 latents, puisque le promoteur du VIH-1 possède des sites pour NF-κB et AP-1. TRIM5α est une protéine cellulaire s6mulée par les interférons de type I (IFN-I) qui peut bloquer la réplica6on des rétrovirus

à un stade précoce de l’infec6on2_{. Plusieurs équipes, dont la nôtre, ont}

démontré que TRIM5α, en plus de causer la décapsida6on prématurée du virus, serait un détecteur pour l’ac6va6on des voies de signalisa6on de la défense an6virale de l’immunité innée, principalement les voies NF-κB, AP-1 et possiblement IRF3. Nous avons antérieurement produit un mutant de TRIM5α humain (huTRIM5α R332G-R335G) capable de

reconnaitre la capside et de restreindre l’infec6on du VIH-13_{, mais}

l’importance de son rôle d’ac6vateur de l’immunité innée dans la

protec6on contre le VIH-1 n’a pas encore été démontré.

Objectifs:

Déterminer et caractériser le rôle ac6vateur de l’immunité innée an6virale de huTRIM5α R332G-R335G dans la restric6on de l’infec6on au VIH-1, ainsi que l’eﬀet de cet état an6viral sur la réac6va6on des virus latents.

Procédure expérimentale

Production de vecteurs rétroviraux à partir de la nouvelle construction

Restriction de HIV-1-NL4.3-DsRed par huTRIM5

α

R332G-R335G

Méthodologie:

•  Produire des lignées cellulaires monocytaires (THP-1),

lymphocytaires (Sup-T1) et lymphocytaires avec un provirus VIH-1-GFP latent (J-Lat 6.3) surexprimant stablement huTRIM5α

R332G-R335G ou la version sauvage non restric6ve;

•  Confirmer l’efficacité et la spécificité de restric6on du VIH-1 par

huTRIM5α R332G-R335G dans les cellules transformées;

•  Évaluer l’eﬀet de réac6va6on des virus VIH-1 latents lors de la

restric6on du VIH-1 par huTRIM5α R332G-R335G;

•  Construc6on d’un vecteur rétroviral VIH-1-NL4.3 exprimant le gène

rapporteur DsRed à la place de GFP.

Réactivation des virus latents lorsqu’il y a restriction par TRIM5

α

Construction de pNL4.3-DsRed, pour effectuer des doubles infections

Remerciement

FRQS – Réseau SIDA et Maladies infec7euses 0.01 0.1 1 10 100 0.01 0.1 1 10 100 µl de VIH-NL4.3-GFP ajouté % de cellules exprimant GFP THP-1 0.01 0.1 1 10 100 0.01 0.1 1 10 100 µl de VIS-mac239-GFP ajouté % de cellules exprimant GFP 0.01 0.1 1 10 100 0.1 1 10 100 µl de VIH-NL4.3-GFP ajouté % de cellules exprimant GFP Sup-T1 0.01 0.1 1 10 100 0.1 1 10 100 µl de VIS-mac239-GFP ajouté % de cellules exprimant GFP pMIH pMIH huTRIM5α WT pMIH huTRIM5α GG pMI H huTR IM5α huTR IM5α GG 0 1 2 3 4 5 % de cellules exprimant GFP J-Lat 6.3 24 h post-infection pMIH huTR IM5α huTR IM5α GG 0 20 40 60 80

% de cellules exprimant DsRed

J-Lat 6.3 24 h post-infection pMI H huTR IM5α huTR IM5α GG 0 1 2 3 4 5 % de cellules exprimant GFP J-Lat 6.3 48 h post-infection pMI H huTR IM5α huTR IM5α GG 0 20 40 60 80

J-Lat 6.3 48 h post-infection pMI H huTR IM5α huTR IM5α GG 0 1 2 3 4 5 % de cellules exprimant GFP J-Lat 6.3 72 h post-infection 10 µl 30 µl 100 µl RPMI pMI H huTR IM5α huTR IM5α GG 0 20 40 60 80

J-Lat 6.3 72 h post-infection

10 µl 30 µl 100 µl RPMI

Restriction spécifique du VIH-1 par huTRIM5

α

R332G-R335G

0.01 0.1 1 10 100 0.001 0.01 0.1 1 10 100 µl de VIH-1-NL4.3-GFP ajouté % de cellules exprimant GFP THP-1 0.01 0.1 1 10 100 0.001 0.01 0.1 1 10 100 µl de VIH-1-NL4.3-DsRed ajouté

pMIH

pMIH huTRIM5α WT pMIH huTRIM5α GG

THP-1

Structure de TRIM5α R332G-R335G

Nos résultats préliminaires nous permeeent d’observer que la restric6on du VIH-1 par huTRIM5αR332G-R335G engendrait la réac6va6on des virus latents. Toutefois, le vecteur VIH-1 pCSRW, u6lisé pour sa fluorescence rouge, ne con6ent pas autant de gènes du VIH-1 que pNL4.3ΔenvΔnef-GFP, ce qui peut expliquer le faible taux de réac6va6on observé dans les cellules J-Lat 6.3 huTRIM5α R332G-R335G. Une construc6on pNL4.3ΔenvΔnef-DsRed a pu être créée, et nos résultats démontrent que ce nouveau virus est tout autant infec6eux que HIV-1-NL4.3-GFP. Nous avons également mis en évidence que huTRIM5α R332G-R335G restreint les deux construc6ons virales de façon similaire. Perspec7ves: •  Évaluer les propriétés d’ac6va6on de l’immunité innée an6virale de huTRIM5α R332G-R335G par Western Blot, microscopie à immunofluorescence et q-PCR; •  Évaluer l’effet protecteur de l’état an6viral, créé par la restric6on du VIH-1 par huTRIM5α R332G-R335G, lors d’une seconde infec6on;

•  Iden6ﬁer les voies d’ac6va6on de l’immunité innée impliquées et conﬁrmer leur importance à

l’aide de knockdowns et d’inhibiteurs pharmacologiques.

Rôle de TRIM5

α

dans la restriction du VIH-1 et

l’activation de l’immunité innée

1.Deeks, S. G. HIV: Shock and kill. Nature 487, 439-440, doi:10.1038/487439a (2012). 2. Merindol, N. & Berthoux, L. Restric6on Factors in HIV-1 Disease Progression. Curr HIV Res 13, 448-461 (2015). 3. Pham, Q. T., Bouchard, A., GrüPer, M. G. & Berthoux, L. Genera6on of human TRIM5alpha mutants with high HIV-1 restric6on ac6vity. Gene Therapy 17, 859-871, doi:10.1038/gt.2010.40 (2010). ARN du VIH et promoteur