Interactions et assemblages de prolamines du blé

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Interactions et assemblages de prolamines du blé

Justine Pincemaille

To cite this version:

Justine Pincemaille. Interactions et assemblages de prolamines du blé. Ingénierie des aliments. Uni-versité Montpellier, 2018. Français. �NNT : 2018MONTG056�. �tel-02010574�

THÈSE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR

DE L’UNIVERSITÉ DE MONTPELLIER

En Biochimie et Physico-Chimie Alimentaire

École doctorale GAIA – Biodiversité, Agriculture, Alimentation, Environnement, Terre, Eau

Unité de recherche Ingénierie des Agropolymères et Technologies Emergentes, et Laboratoire Charles Coulomb, Université de Montpellier

Présentée par

Justine PINCEMAILLE

Le 22 novembre 2018

Sous la direction de Marie-Hélène MOREL,

et

Laurence RAMOS

Devant le jury composé de

Mr Antoine BOUCHOUX, Chargé de recherche, INRA Toulouse Mr Denis RENARD, Directeur de Recherches, INRA Nantes

Mr Christophe CHASSENIEUX, Professeur des Universités, Université du Mans Mme Marie-Hélène MOREL, Directeur de Recherches, INRA Montpellier

Mme Amélie BANC, Maître de Conférence, Université de Montpellier Mr Paul MENUT, Maître de Conférence, SupAgro Montpellier

Rapporteur Rapporteur Président du jury Directrice de thèse Co-encadrante Co-encadrant

Interactions et Assemblages de Prolamines du Blé

!

Interactions!et!Assemblages!de!

Prolamines!du!Blé!

Justine PINCEMAILLE

Thèse de Doctorat

Encadrée par : Marie-Hélène MOREL, Laurence RAMOS,

Amélie BANC et Paul MENUT

Table des matières

Introduction

Chapitre 1 – Etat de l’art ………..

1. Description des protéines du grain de blé ………. 7

1.1 Classification des protéines de blé ………. 8

1.2 Le gluten ………... 9

1.3 Les protéines de réserves du blé ………. 11

1.3.1 Les gliadines ………. 11

1.3.2 Les gluténines ……….. 12

1.4 Interactions des protéines du gluten ……… 13

1.5 Extraction des protéines du gluten ……….. 15

2. Comportement des protéines en bon solvant ………. 16

2.1 Quelques notions de physique ………. 16

2.1.1 Chaîne idéale et chaîne réelle ……….. 16

2.1.2 Polymère en solution ……… 18

2.1.2.1 Concentration critique de recouvrement ……… 18

2.1.2.2 Longueur de corrélation et longueur de persistance ………. 19

2.1.2.3 Rayon de giration et rayon hydrodynamique ……….. 20

2.2 Modèle gli+glu ……… 21

2.3 Modèle gli ………. 22

3. Transition de phases des protéines – diagrammes de phases ………. 23

3.1 Etablissement des diagrammes de phases ………. 24

3.2 Détermination de la température de points de trouble, Tcloud ………. 26

3.3 Mécanisme de séparation de phases ………. 28

Chapitre 2 – Matériels et méthodes ……….

1. Matériel ………. 39

2.1 Extraction des protéines du gluten ……….. 39

2.2 SE-HPLC ……….. 42

2.3 Electrophorèse SDS-PAGE ……….. 44

2.4 Développement d’un outil moyen débit de mesure des points de trouble 46 2.5 Techniques de diffusion aux petits angles ………. 46

2.5.1 Diffusion de neutrons aux petits angles (SANS) ……… 48

2.5.2 Diffusion de rayons X aux petits et grands angles (SAXS – WAXS) 49 2.5.3 Diffusion dynamique de la lumière (DLS) ………. 51

2.6 Calorimétrie à balayage différentielle modulée (MDSC) ……… 53

2.7 Microscopie ……….. 55

2.8 Rhéologie ……….. 55

2.9 Fractionnement par flux de forces asymétrique (AsFlFFF) ………. 58

Chapitre 3 - Mise en place d’un nouvel outil pour la

détermination des points de troubles ………..

1. Définition du besoin ……… 68

2. Conception et calibration du montage expérimental ……….. 73

2.1 Dispositif expérimental ……….. 73

2.2 Contrôle de la température ……….. 74

2.2.1 Plaque lumineuse ……….. 74

2.2.2 Enceinte ………. 76

2.3 Acquisition et traitement de l’image ……… 78

2.3.1 Caméra ……… 78

2.3.2 Traitement de l’information ………. 79

2.3.3 Homogénéité de la plaque lumineuse ……… 81

2.4 Mesures de transmittance de point de trouble ……… 82

2.4.1 Calibration du niveau de gris ……….. 82

2.4.2 Prévenir l’évaporation et la condensation du solvant ………. 84

3. Validation de l’outil pour la détermination des points de trouble .. 85

3.1 Détermination de la température de transition ……….. 85

3.2 Utilisation d’un système modèle le Tx-114 ……….. 87

Chapitre 4 – Caractérisations biochimiques des isolats de

protéines du blé ………..

1. Solubilité des protéines du gluten en solvant éthanol/eau ………….. 95

2. Fractionnement des protéines solubles en éthanol/eau ………. 98

2.1 Effet de la température de trempe sur la partition en masse entre les phases dense et légère ………. 99

2.2 Effet de la température de trempe sur la composition protéique des phases dense et légère ………. 100

2.3 Rendements du protocole de trempe ……… 109

2.4 Préparation des solutions diluées de protéines par filtration ……….. 110

Conclusion ………. 112

Chapitre 5 – Mise en évidence d’assemblages

_{š-gli+glu et}

impact sur les diagrammes de phases ………..

1. Propriétés dynamiques des échantillons modèles ………. 115

2. Propriétés dynamiques et structurales des échantillons modèles fractionnés en fonction du Rh par AsFlFFF ………. 120

3. Diagrammes de phases ……….. 133

Conclusion ………. 144

Chapitre 6 – Impact de la composition protéique sur la

rhéologie et la structure d’échantillons dilués et semi-dilués à

température ambiante ………..

1. Observations macroscopiques ……….. 149

2. Propriétés rhéologiques ………. 151

3. Propriétés des microstuctures ……… 152

3.1 En milieu dilué ……… 152

3.2 En milieu semi-dilué……….. 155

3.2.1 Diffusion de rayons X ……….. 155

3.2.2 Diffusion de neutrons ……….. 166

Chapitre 7 – Dynamique de séparation de phases

liquide-liquide ………..

1. Étude de la décomposition spinodale ………. 175

1.1 Microscopie optique ………. 175

1.2 Comportement rhéologique au cours de la séparation de phases ………….. 178

2. Observation de la séparation de phases par diffusion ………. 181

2.1 Dynamique de séparation de phases au cours d’une trempe en température ………. 181

2.2 Cinétique de croissance de la longueur caractéristique ……….. 183

2.2.1 Profil classique d’une décomposition spinodale ……….. 183

2.2.2 Cinétique de croissance de la longueur caractéristique ……… 185

2.2.3 Séparation de phases arrêtée ……… 188

2.2.4 Facteur de Porod ……….. 188

2.3 Mise à l’échelle dynamique ……….. 190

2.4 Échantillons enrichis en gluténines ……….. 192

Conclusion ………. 195

Conclusion générale et Perspectives ……….

Liste des techniques

AsFlFFF Fractionnement par flux de forces asymétrique DLS Diffusion dynamique de la lumière

LS Diffusion statique de la lumière

MDSC Calorimétrie à balayage différentielle modulée SANS Diffusion de neutrons à petits angles

SAXS Diffusion de rayons X aux petits angles

SDS – PAGE Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium

SE-HPLC Chromatographie phase liquide à haute performance par exclusion de taille UV Spectroscopie Ultra-Violet

VSANS Diffusion de neutrons à très petits angles WAXS Diffusion de rayons X aux grands angles

Liste des symboles

ƕ Taux de décroissance ţ Longueur d’onde

ɻs Viscosité ū Contrainte de cisaillement

Š Angle _ߩ Densité

Ŧ Taille de blob ť Exposant de Flory

ɂ Longueur de corrélation ů Paramètre de Flory-Huggins l0 Longueur de persistance ߛሶ Vitesse de cisaillement

Liste des abréviations

A Absorbance N Niveau de gris

A1, A2 Amplitude 1, amplitude 2 Na Nombre d’Avogadro C Concentration Pguinier Facteur de guinier

C* Concentration critique de recouvrement

P(q) Facteur de forme Cc Concentration critique q Vecteur d’onde

C1/C2 Culot 1, Culot 2 Q Débit

d Distance R Rapport

D Coefficient de diffusion Rh Rayon hydrodynamique df Dimension fractale Rg Rayon de giration F Coefficient de frottement S Surface

F1, F2, … Fraction 1, Fraction 2, … S1/S2 Surnageant 1, Surnageant 2 G’ Module élastique S(q) Facteur de structure

G’’ Module visqueux t Temps

Gli Gliadines T Température

Glu Gluténines Tc Température critique

HMW-SG Haut poids moléculaire Tcloud Température de points de trouble I Intensité diffusée Téchantillon Température de l’échantillon

k Constante Tenceinte Température de l’enceinte

K Indice de consistance TP1/TP2 Sonde thermique 1 et 2

KPorod Coefficient de Porod Tr Température transition rhéologie

kB Constante de Boltzmann Tt Température de trouble

l Longueur du trajet optique U Energie de contact LMW-SG Faible poids moléculaire V ou v Volume

m Masse V Volume exclu

ms Matière sèche Vc Flux linéaire

Mw Masse molaire Ve Volume d’exclusion n Indice de réfraction Vt Volume total

Introduction

1

Introduction

En 2013, 720 millions d’hectares de céréales ont été cultivés dans le monde (FAO). Parmi ces céréales, le blé, l’orge, le triticale, le seigle ou encore l’avoine contiennent naturellement du gluten. Ce dernier a été défini pour la première fois en 1745, par le professeur Giacomo Beccari en Italie, comme étant « une masse cohésive obtenue après lavage de la farine de blé avec de l'eau ». Ce n’est que plusieurs années plus tard que le gluten est défini comme un ensemble de protéines. Le gluten de blé, en particulier, est utilisé dans une large gamme de produits alimentaires aux textures contrastées (farines, pains, pâtes, biscuits, bières, semoules, …). Ses propriétés de transformations et sa capacité à répondre aux besoins nutritionnels de la population font de lui une des premières ressources utilisées sur le marché européen comme texturant et additif. Le gluten se présente donc comme un bon candidat en substitut potentiel aux produits animaux. En effet, depuis une dizaine d’années, la consommation de viande dans le monde (311,8 millions de tonnes en 2014) est en perpétuelle augmentation. Cette dernière nécessite un coût à la production supérieur aux légumineuses, et l’élevage des animaux représente la 2e _{source la plus importante d’émissions de CO2 dans le monde (FAO, 2014). Un}

régime alimentaire plus végétal, incluant le gluten, semblerait donc être une solution plus durable pour l’environnement.

Néanmoins, depuis les années 2000, l’industrie a dû s’adapter à l’accroissement des intolérances et allergies, en développant des produits sans gluten. En France, 78 millions € ont été dépensés pour le marché du sans gluten en 2015 qui continue son expansion depuis. Les produits sans gluten représentent un secteur en forte croissance qui amènent de nombreuses interrogations. En effet, seulement 1% de la population est réellement touchée par les allergies, et les

Introduction

2

intolérances restent à ce jour non décelables cliniquement. Cependant, depuis 2014 la Commission Européenne a adopté une nouvelle loi, obligeant un étiquetage particulier indiquant tout produit contenant du gluten, ce qui représente un véritable étau pour les industriels. De plus, la suppression totale du gluten de certains produits implique des modifications texturales et physico-chimiques non négligeables, qui demandent aux producteurs de s’adapter continuellement pour satisfaire les clients. Une meilleure connaissance du gluten représente donc un enjeu industriel incontestable : contrôler son comportement, et notamment les interactions entre les protéines, pourrait permettre le développement de nouveaux produits tout en respectant les contraintes actuelles.

Pour pallier cette difficulté, une problématique demeure : à ce jour, le gluten constitue une des familles de protéines les plus complexes du règne végétal et sa structure n’est toujours pas complétement connue. La difficulté à dissocier les différentes classes de protéines dont les gliadines et les gluténines rend la caractérisation et la détermination des protéines plus périlleuse. Cette difficulté sous-entend la présence de nombreux mécanismes au sein du système. Cela nous amène donc à la réalisation de cette thèse qui a pour but de déterminer la structure de ces protéines du gluten et de comprendre leurs mécanismes d’associations.

Ce projet de thèse s’inscrit dans la continuité des travaux établis précédemment par l’UMR IATE, et le laboratoire Charles Coulomb à Montpellier. Les travaux de thèse d’Adeline Boire avaient permis de mettre en évidence la séparation de phases liquide-liquide que subissent des solutions riches en gliadines à basse température. Suite à ces observations, des diagrammes de phases de gliadines ont pu être établis. Cependant, la dépendance de température similaire observée sur un continuum entre gliadines de haute masse moléculaire (ű-gliadines) et gluténines a suggéré des mécanismes d’interactions similaires, qui n’ont pas été explorés. D’autre part, Mohsen Dahesh par son travail de thèse axé sur les mécanismes de structuration du gluten, a pu établir une différence rhéologique entre les modèles gliadines et gliadines + gluténines. En effet, les systèmes modèles gliadines + gluténines présentaient des comportements rhéologiques beaucoup plus complexes que les modèles gliadines. Ces modèles binaires montraient également une gélification spontanée au cours du temps au-delà d’une certaine concentration. L’étude de structure des échantillons concentrés a présenté des caractéristiques typiques de gels de polymères en bon solvant. L’objectif de ce travail de thèse est donc d’acquérir une connaissance et une maîtrise des processus d’assemblages des protéines du gluten. Nous essayons de comprendre les mécanismes d’association des protéines du gluten

Introduction

3 et de caractériser les structures formées à différentes échelles. L’étude de la composition, des propriétés rhéologiques et des conformations est rationalisé grâce aux concepts de physique de la matière molle.

Pour atteindre cet objectif, nous avons développé une approche expérimentale découpée en 3 parties principales (Fig. 1). La première a pour but de pouvoir maîtriser certains paramètres tels que la composition en protéines. Pour cela, nous avons optimisé le protocole d’extraction des protéines du gluten afin d’obtenir des fractions protéiques avec un rapport massique gluténines / gliadines contrôlé. À partir des produits obtenus, la seconde partie tend à moduler les interactions entre les protéines notamment en jouant sur des paramètres physico-chimiques tels que la température ou la concentration. La détermination du point de trouble des solutions protéiques, en fonction de ces différents paramètres, permet d’établir des diagrammes de phases des différents extraits. De plus, l’étude structurale et rhéologique du matériel permet de caractériser les interactions entre les protéines. L’interprétation et la modélisation des résultats se font par des outils et des modèles de la matière molle pour des polymères ou encore des gels. Enfin, une troisième partie méthodologique, détaille la mise en place d’un montage expérimental destiné à la lecture des points de trouble des solutions protéiques.

Introduction

4

Déterminer l’impact des

différents extraits sur les

diagrammes de phases

Mise en place d’une

méthode de lecture des

points de trouble

Optimiser un protocole

d’extraction basé sur la

séparation de phases liquide

liquide pour obtenir des isolats

aux compositions contrastées

Chapitre 7

Etudier le phénomène de

séparation de phases

liquide-liquide

Déterminer l’impact du ratio

glu/gli sur la structure des

échantillons en régime dilué à

température ambiante

Chapitre 2

Définition de l’état de l’art

Chapitre 2

Matériels et Méthodes

Chapitre 6

Gluten

Chapitre 4

Chapitre 1

Chapitre 3

Chapitre 5

Introduction

5 Ce manuscrit de thèse est ainsi composé de 7 chapitres :

Le Chapitre 1 est dédié à une étude bibliographique qui a pour but de rappeler les caractéristiques et les propriétés des protéines du gluten ainsi que leurs caractéristiques physico-chimiques. Il introduit les connaissances actuelles sur le comportement des gliadines et gluténines en solution et rappelle les concepts fondamentaux de la physique et de la matière molle appliqués par la suite à nos échantillons.

Le Chapitre 2 présente le matériel, techniques et méthodes expérimentales utilisés au cours de la thèse. Il présente notamment le protocole d’extraction des protéines du

gluten qui permet d’obtenir le matériel étudié. Il est complété par le descriptif des

méthodes, avec notamment un bref rappel du fonctionnement de chaque appareil ainsi que les conditions expérimentales adoptées pour nos expériences.

Par la suite, le Chapitre 3 met en avant le développement d’une nouvelle méthode

d’analyse destinée à établir des diagrammes de phases sur des mélanges complexes. Il décrit

notamment la mise en place de la méthode afin de l’appliquer aux isolats de protéines de blé. L’application de la méthode sur des modèles déjà connus dans la littérature permet de valider l’outil et de confirmer son intérêt.

Le Chapitre 4 est axé sur la caractérisation biochimique des isolats de protéines du

blé. Il tend à définir, dans un premier temps, la composition du gluten utilisé pour l’ensemble

des manipulations présenté dans le manuscrit. Dans un second temps, ce chapitre mettra en avant la caractérisation en protéines des mélanges obtenue suite au protocole d’extraction. Pour cela, les méthodes types telles que la chromatographie par exclusion de taille et l’électrophorèse, couramment utilisées sur les protéines de blé, seront exploitées.

Le Chapitre 5 est axé sur la caractérisation structurale des isolats de protéines du

blé en milieu dilué et semi-dilué et l’impact sur les diagrammes de phases. L’objectif

de ce chapitre est de déterminer s’il existe des interactions ou assemblages entre les gliadines et les gluténines. Pour cela, nous utiliserons l’association de la technique du fractionnement par flux de force asymétrique avec celle de chromatographie par exclusion de taille.

Le Chapitre 6 présente la rhéologie et la structure des échantillons en solutions à

Introduction

6

la diffusion de neutrons et de rayons X aux petits angles seront utilisées pour définir les tailles caractéristiques des protéines et montrer s’il existe un impact de la composition protéique sur ces dernières.

Le Chapitre 7 étudie la dynamique de séparation de phases liquide-liquide. L’objectif de ce chapitre est de caractériser les phénomènes qui ont lieu au cours de cette séparation à différentes échelles. Dans un premier temps, le comportement rhéologique des produits sera étudié à l’échelle macroscopique en fonction de la température puis la décomposition spinodale sera examinée à l’échelle microscopique via la diffusion de neutrons et de rayons X aux petits angles.

Chapitre 1 –Etat de l’art

7

Chapitre 1 – Etat de l’art

En 2018, la production mondiale de blé est de 744 millions de tonnes (FAO). Pour cause, grâce à leur capacité à former une masse cohésive après hydratation, les protéines de réserve que contient le grain de blé permettent d’obtenir le gluten. Ce dernier présente des propriétés viscoélastiques largement exploitées par les industriels. Le blé est actuellement l’une des seules céréales dont on extrait directement le gluten pour le réincorporer comme additif ou adjuvent dans d’autres produits alimentaires ou dans les farines. Également destiné à l’alimentation animale et à l’amidonnerie, le blé est la 1ère _{céréale produite en France. Très présent dans notre}

société, il fait l’objet de nombreuses études notamment pour comprendre les mécanismes texturaux du gluten et définir ses propriétés physico-chimiques. L’objectif de ces études est de développer de nouveaux produits issus de la culture végétale et d’améliorer ceux existants. Ce chapitre bibliographique présente les caractéristiques biochimiques des protéines de réserve du blé ainsi que les études récentes faites sur le comportement de ces protéines en solution. Il se termine par la présentation des mécanismes de transitions de phases applicables aux protéines du gluten.

1. Description des protéines du grain de blé

De nombreuses études ont tenté de décrire les protéines du grain de blé car un nombre considérable d’informations sur ces dernières manquent encore à l’appel. Basé sur différents paramètres, il existe aujourd’hui plusieurs moyens de les classer.

Cette partie tend à décrire les moyens utilisés pour extraire les protéines du grain, leur classification et leurs structures.

Chapitre 1 –Etat de l’art

8

1.1 Classification des protéines du blé

En 1907, Osborne établit une description des protéines de blé selon leur fonction dans le grain puis en fonction de leur solubilité. Il classe ainsi les protéines en 2 grandes familles.

D’une part, les protéines du métabolisme, qui sont les protéines fonctionnelles du grain de blé, sont composées des albumines (solubles dans l’eau), et des globulines (solubles dans des solutions salines). Cette classe de protéines représente environ 20% des protéines totales du grain de blé déterminée sur une base de matière sèche (ms) et plus précisément de 15% d’albumines et 5% de globulines.

D’autre part, les protéines de réserve sont composées des gliadines, (solubles en milieu alcoolique) et des gluténines, (soluble en milieu acide ou alcalin). Ces protéines plus connues sous le nom de prolamines représentent environ 80% des protéines du blé. Cette nomenclature a ensuite été complétée en 1986, par les travaux de Shewry, qui proposent de les classer selon la teneur en acides aminés soufrés des protéines insolubles. Plus précisément, ces protéines ont été classées en sous-catégories : les gliadines, qui sont des protéines monomériques, sont composées d’ű-gliadines qui sont pauvres en soufre, des ř et Ś-gliadines ainsi que des ś-gliadines riches en soufre. Les gluténines forment les prolamines polymériques composées de protéines de plus hauts poids moléculaires (HMW-SG) et de protéines plus riches en soufre (LMW-SG). L’ensemble de ces classifications est regroupé dans la Figure 1.1. Les protéines de réserve sont présentées plus en détails dans la suite du chapitre.

Chapitre 1 –Etat de l’art

9

Figure 1.1 : Classification des protéines de blé par Osborne (1907) et Shewry (1986)

De façon générale, les protéines ne sont pas réparties uniformément dans le grain. Cependant, pour les plantes de blé, environ 70 à 80% des protéines totales sont retrouvées au niveau de l’albumen amylacé. Ces teneurs en protéines restent une estimation et varient selon les conditions climatiques ainsi que les facteurs génétiques (Campbell, 1979). La teneur en gliadines est plus importante que celle en gluténines lors d’une augmentation du taux de protéines dans le grain. De plus, l’apport d’azote au grain accroît les teneurs en ű-gliadines et en gluténines de hauts poids moléculaires, mais diminue les teneurs en ś–gliadines et en gluténines de bas poids moléculaire (Charmet et al., 2017).

1.2 Le gluten

Selon la classification précédente, les protéines de réserve correspondent aux prolamines. Les prolamines du blé, incluant les gliadines et les gluténines forment un réseau majoritairement constitué du gluten. Le gluten tient son origine du latin glutinum et signifie « lien », ou « colle ». Il est essentiellement composé de constituants protéiques (75-85% ms) liés entre eux

Chapitre 1 –Etat de l’art

10

par les ponts disulfures et liaisons hydrogènes (Fig.1.4) ainsi que de quelques granules d’amidon (10-15% ms) et de lipides (5-8% ms). Le gluten est le produit du lavage d’une pâte de blé sous un filet d’eau. Cette étape est plus couramment appelée lixiviation. Le complexe protéique insoluble qui se forme à la suite de cette dernière possède alors des propriétés viscoélastiques très diverses.

D’abord extrait de la farine de blé par voie humide puis séché pour une meilleure conservation, les industries utilisent ce produit pour diverses applications. Son premier usage est celui de la

panification où il est ajouté à la farine comme agent correcteur. En effet, la viscoélasticité du

gluten joue un rôle important sur la texture des produits tels que la pâte à pain et a fait l’objet de nombreuses études. Les résultats ont mis en évidence que les propriétés mécaniques du gluten dépendent essentiellement des gluténines. Les gliadines une fois hydratées possèdent une

viscosité beaucoup plus faible que celles des gluténines et l’élasticité des gliadines est

beaucoup moins importante que celles des gluténines (Cornec et al., 1994). La ténacité de la pâte est amplifiée par l’augmentation de la quantité de gluténines par rapport à celle de gliadines alors que la quantité de gliadines favorise l’extensibilité et le gonflement de la pâte (Wrigley et al., 2006). Précédemment, des études plus poussées sur les propriétés mécaniques du gluten ont démontré que la viscosité dépend essentiellement du degré de polymérisation des gluténines (MacRitchie, 1992, Gupta et al., 1993).

De plus, de par sa capacité à se dissoudre en milieu acide ou basique, le gluten a fait aussi l’objet de nombreuses recherches sur sa transformation en matériaux biodégradables (Pallos, et al., 2006) ou encore en biofilms (Feillet, 2000). La conservation des propriétés mécaniques et la barrière à la vapeur d’eau que présentent les films de gluten (Gontard, et al., 1993) font de ces derniers un matériau intéressant pour la conservation des produits alimentaires. Enfin, lorsque le gluten est chauffé de façon trop importante lors de l’étape de séchage (T > 80°C), les protéines et plus particulièrement les gluténines se dénaturent. Le gluten perd alors de sa fonctionnalité et devient un produit d’alimentation animale. Ainsi, le gluten possède des propriétés mécaniques et physiques qui font de lui un matériau utilisé pour de nombreuses applications mais dont la structure reste à ce jour assez mal définie.

Chapitre 1 –Etat de l’art

11 1.3 Les protéines de réserve du gluten

Les protéines de réserve représentent environ 80% des protéines totales et constituent une réserve d’azote sous forme d’acides aminés utiles au grain lors de la germination (Wrigley et al., 2006). D’autres céréales sont également composées majoritairement de prolamines mais portent un nom différent tel que avénines chez l’avoine, hordéines chez l’orge, sécaline chez le seigle ou encore zéines chez le maïs. La suite de cette partie s’intéresse à la description des prolamines du blé qui composent le gluten : les gliadines et les gluténines.

1.3.1 Les gliadines

Les gliadines sont des protéines monomériques de faible poids moléculaire compris entre 30 et 80 kDa. Elles sont divisées en plusieurs classes selon leur mobilité électrophorétique à bas pH (Woychik et al., 1961) : les ř-, Ś-, ű-, et ś-gliadines. Les ř- et Ś- gliadines sont généralement regroupées en une seule classe (ř/Ś-gliadines) et représentent par rapport aux gliadines totales 44 à 60%, les ű–gliadines 30 à 46% et les ś-gliadines 6 à 20% (Wieser et al., 1994).

La structure primaire des différentes gliadines est très proche et peut être divisée en deux domaines distincts : un domaine N-terminal, répétitif, riche en résidus prolines et en glutamines et un domaine C-terminal, non répétitif. Les cystéines, présentes en nombre pair au niveau de la séquence répétée, sont impliquées dans des liaisons intramoléculaires (Fig.1.4) (Tatham & Shewry, 1985). Selon Shewry & Tatham, en 1990, les ř/Ś-gliadines contiennent 6 résidus cystéines contre 8 pour les ś-gliadines. Plus tard, une nomenclature selon laquelle les ponts disulfures intramoléculaires s’établissent entre les cystéines 1 et 4, 5 et 7 ainsi qu’entre les cystéines 6 et 8 a été proposée par Müller & Wieser, 1995, (Fig.1.2).

Dès 1980, Bietz et al., identifient les ű-gliadines comme des protéines différentes du reste des gliadines avec un poids moléculaire spécifique plus important de l’ordre de 60 à 80 kDa (contre 28 à 35 kDa pour les ř/Ś-gliadines et 31 à 38 kDa pour les ś-gliadines). Elles se distinguent des ř/Ś- et ś-gliadines par leur absence de cystéines et de méthionines mais contiennent un nombre plus important de glutamines, prolines et phénylalanines (Feuillet, 2000). Par leur composition, les ű-gliadines sont donc incapables de former des liaisons covalentes via des ponts disulfures intra-chaînes et forment la classe de protéines la plus hydrophobe. Par ailleurs, il existe deux variantes principales d’ű-gliadines basées sur la composition en acides aminés : les ű1,2 et les

Chapitre 1 –Etat de l’art

12

ű5 (Kasarda et al., 1983). Les gliadines de type ű5 ont un poids moyen de 44 à 55 kDa et les gliadines de type ű1,2 de l’ordre de 34 à 44 kDa (Wieser et al., 2000).

Figure 1.2 : Représentation schématique de la structure primaire des différents types de gliadines selon Shewry & Tatham, 1997. Les bandes grises correspondent aux séquences en acides aminés répétées et les chiffres aux cystéines établissant des ponts disulfures intramoléculaires.

Outre une structure primaire légèrement différente, la composition en acides aminés des gliadines influence également la structure secondaire des protéines (Shewry & Tatham, 1990). Les hélices ř, nombreuses dans les domaines répétés, et les coudes Ś très présents dans les domaines non répétés contribuent directement à la conformation de la protéine. En effet, les hélices řsont attribuées à une structure compacte et les coudes Ś à une structure en spirale. Via des mesures de dichroïsme circulaire, Tatham & Shewry, en 1985, estiment que les ř/Ś- et ś-gliadines contiennent 30-35% d’hélices ř et 10-20% de coudes Ś. Les ű-gliadines possèdent également quelques coudes Ś mais principalement des tours Ś qui ne contiennent pas d’hélices ř ni de feuillets Ś. Plus spécifiquement, l’ensemble des coudes Ś est localisé au niveau des domaines N-terminale et les hélices ř au niveau des domaines C-terminal.

1.3.2 Les gluténines

Les gluténines représentent 40 à 50% des protéines de réserve de blé. Contrairement aux gliadines, les gluténines sont des protéines polymériques de haut poids moléculaire compris entre 500 à 10 000 kDa, qui résultent de la polymérisation de sous-unités. Les gluténines sont divisées en 2 groupes de sous-unités polypeptidiques : celles de hauts poids moléculaires (HMW-SG) et celles de faibles poids moléculaires (LMW-(HMW-SG).

- les LMW-SG sont les sous-unités majoritaires parmi les gluténines et représentent 60 à 80% des gluténines. Ces dernières peuvent être divisées en trois groupes selon leur poids moléculaire : B, C et D. Les LMW-SG de type B ont un poids moléculaire de 40 à 50 kDa, celles de types C

Chapitre 1 –Etat de l’art

13 de 30 à 40 kDa et celles de types D de 50 à 70 kDa. De même que pour les gliadines, les LMW-SG sont composées d’un domaine N-terminal constitué de séquences répétitives et d’un domaine C-terminal constitué de 8 cystéines capables de faire des liaisons disulfures intramoléculaires (Fig.1.3), (Wieser, 2007).

- Les HMW-SG représentent la plus faible proportion des protéines du gluten (у10%) mais également les plus complexes. Leur séquence en acides aminés est composée de 80 à 100 résidus au niveau de la partie N-terminal, et contient 3 à 5 résidus cystéines. L’autre partie de la séquence non répétitive, au niveau C-terminal, est composée de 42 résidus dont 1 cystéine. La séquence répétée intermédiaire peut être composée de 490 à 700 résidus (MacRitchie, 1992).

Figure 1.3 : Représentation schématique de la structure primaire des différents types de gluténines de faibles poids moléculaires et de hauts poids moléculaires selon Shewry & Tatham, 1997. Les bandes grises correspondent aux séquences en acides aminés répétées et les chiffres aux cystéines établissant des ponts disulfures intramoléculaires.

Comparativement aux gliadines, Field et al., 1987 ont démontré que pour les HMW-SG, les hélices ř se trouvent essentiellement dans les séquences non répétées et les coudes Ś dans les séquences répétées.

1.4 Interactions des protéines du gluten

Quelle que soit la protéine, la localisation des cystéines sur les chaînes polypeptidiques permet d’expliquer la formation des ponts intra- et intermoléculaires (Keck et al., 1995), (D’Ovidio & Masci, 2004), (Fig.1.4).

Chapitre 1 –Etat de l’art

14

Figure 1.4 : Représentation des associations des protéines via des liaisons disulfures intra- et intermoléculaires (Feuillet, 2000).

Outre les liaisons disulfures covalentes, il existe également d’autres types de liaisons telles que les liaisons hydrogènes non covalentes et les liaisons hydrophobes qui contribuent à la stabilité des structures (Tatham & Shewry, en 1985).

Bien que le gluten se présente comme un réseau stable, les contraintes mécaniques et physiques appliquées au gluten peuvent modifier le réseau. Un chauffage de l’ordre de 80°C avec la présence de 20% d’eau minimum modifie la conformation des gluténines. Ce dernier altère les liaisons cystéines libres, engendrant de nouvelles liaisons avec les gliadines jusqu’à la formation de polymères, (Pallos et al., 2006). Plus particulièrement, une étude réalisée sur les protéines en solvant eau/éthanol 70% (v/v) a démontré que le chauffage affecte la structure secondaire des protéines (Tatham & Shewry, 1985). Il résulte une perte partielle des hélices ř des gliadines qui restent néanmoins très stables grâce à la présence des liaisons hydrogènes. Ces liaisons

hydrogènes seraient également fortement présentes entre les résidus de glutamines des ű -gliadines afin de stabiliser la conformation en spirale des protéines. Des interactions

hydrophobes entre les résidus aromatiques renforcent également les tours Ś des ű-gliadines. Une étude UV plus poussée des ű-gliadines a montré que la conformation en tours Ś est aussi renforcée par la présence de liaisons non-covalentes.

D’après ces différentes observations, les liaisons disulfures joueraient un rôle important : les ponts que forment les cystéines permettent d’expliquer le comportement rhéologique des produits alimentaires tels que celui de la pâte à pain. La rupture et la reformation de ces liaisons engendrent une modification du réseau protéiques qui rend la ténacité et l’élasticité de la pâte plus ou moins importante. Lors de la formation de la pâte humide, les liaisons

non-Liaisons disulfures intermoléculaires Æ élasticité

Liaisons covalentes intramoléculaires Æ viscosité

Chapitre 1 –Etat de l’art

15 covalentes et disulfures permettent de modifier le réseau de gluténines en un réseau de gluten plus étendu (Bietz & Huebner, 1980). Ainsi, bien que les liaisons disulfures soient à l’origine d’une grande stabilité des protéines, il n’en demeure pas moins que les liaisons hydrogènes, hydrophobes et non-covalentes impactent également la conformation qu’adoptent les protéines du gluten, et contribuent aux propriétés élastiques et cohésives du gluten.

1.5 Extraction des protéines du gluten

Les gliadines sont principalement solubles en milieu alcoolique alors que les gluténines le sont dans des milieux acides ou alcalins. De nombreuses méthodes ont été mises au point pour séparer les différentes protéines du gluten mais la plupart sont basées sur un protocole similaire à celui établi par Osborne en 1907. L’ensemble des protocoles repose sur la mise en solution des protéines dans différents solvants puis d’une succession de centrifugations. Le nombre d’extraction, la force de centrifugation ou encore la température sont autant de paramètres qui permettent d’obtenir des fractions plus ou moins enrichis en gliadines et gluténines. Il est donc possible d’adapter la méthode d’extraction en fonction de la composition en protéines désirée. Cependant, la plupart des études ont principalement étudié l’impact du solvant utilisé. La Table 1.1 résume une partie non exhaustive des solvants testés dans la littérature.

Table 1.1 : Récapitulatif de différents types de solvants utilisés pour extraire les protéines du gluten (liste non exhaustive)

Protéines solubilisées Extractant Références

Albumines / globulines puis Gliadines

Chlorure de sodium 0,5M puis Ethanol 70%

Bietz, et al., 1975

Gliadines issues de la farine Ethanol 55% Charbonnier, 1973 Toutes les protéines du

gluten

Tampon Tris 0,1M- HCl pH 8,4, 2% de SDS

Bottomley et al., 1982

Toutes les protéines du gluten

Tampon Tris 0,1M- HCl pH 7, 2% de SDS

Danno, 1981

Gluténines Isopropanol 50% (v/v) contenant 0,08M Tris-HCl tampon, pH 6,8

Mélas et al., 1994

HMW-gluténines Propanol 60% (v/v) Marchylo et al., 1989 Prolamines Acide chlorhydrique dilué MacRitchie, 1987

Chapitre 1 –Etat de l’art

16

L’analyse des différentes fractions obtenues se fait généralement par chromatographie et

électrophorèse. Divers types d’électrophorèses ont été proposés afin d’optimiser la résolution

des pics mais l’électrophorèse en gel de polyacrylamide (que nous utiliserons par la suite) est actuellement la plus répandue (Lookhart et al., 1982). Qu’elles soient d’exclusion (Dachkevitch & Autran, 1989), échangeuses d’ions (Ewart, 1975) ou encore en phase inverse, les méthodes chromatographiques nécessitent toutes d’ajouter des agents dénaturants afin de solubiliser les prolamines, comme vu précédemment. Une alternative utilisant un traitement ultrasonore contrôlé a été proposé pour permettre une optimisation de l’extraction tout en réduisant la dégradation des gluténines (Morel et al., 2000).

2. Comportement des protéines en bon solvant

Les protéines du blé et plus particulièrement les gluténines sont des macromolécules dont l’organisation dépend de la conformation qu’elles peuvent adopter dans différents solvants. Les interactions qu’elles ont avec les gliadines pourraient être à l’origine des diverses propriétés physico-chimiques qui dépeignent le gluten.

Par leur comportement, il est possible d’appliquer aux protéines du gluten les notions de la

matière molle. Inventée par Madeleine Veyssi dans les années 70, la matière molle désigne

tous systèmes colloïdes, surfactants, tensio-actifs et polymères pour lesquels sont mis en jeu des énergies d’interactions faibles entre objets (Cousin et al., 2010). Rationaliser le fonctionnement des gliadines et gluténines par les concepts de la matière molle permettra donc d’expliquer les interactions entre ces dernières via différents modèles physiques.

2.1 Quelques notions de physiques

2.1.1 Chaîne idéale et chaîne réelle

Le modèle le plus simple pour décrire un polymère est une chaîne dite « idéale ». Les chaînes

idéales sont composées de N monomères de même longueur b qui ne sont pas en interactions entre eux. Les différents liens entre monomères se font par des rotations libres qui sont une suite d’événements indépendants. La distance moyenne entre les deux extrémités d’une chaine de monomères mis bout à bout, <R²> répond à l’égalité <R2> = Nb2.

Dans le cas d’une chaîne idéale, R² est reliée au rayon de giration Rg, d’une particule. Rg qui résulte de la distance quadratique moyenne des masses constitutives d’un polymère et de son

Chapitre 1 –Etat de l’art

17 centre de masse (Gregory Dewey, 1998) s’exprime comme le rayon de la sphère contenant une chaîne de polymères et vaut alors <Rg²> = ழோ²வ

଺ .

Dans le cas d’une chaîne idéale où il existe des interactions, on parle alors de chaîne réelle ou de chaîne à volume exclu. Ces interactions, qui peuvent être soit répulsives soit attractives, impactent directement la conformation de la chaîne de polymères. Il existe 2 types d’interactions : les interactions solvant et les interactions

monomère-monomère. Le volume exclu, V, rend compte de la distance des monomères les uns par rapport aux autres lorsque ces derniers sont dans un solvant. En fonction du type de solvant, la chaîne de polymères aura alors une conformation différente (Fig.1.5).

En diminuant la qualité du solvant, le volume exclu devient nul et les segments de la chaîne s’attirent. Dans ce cas, la chaîne idéale possède des interactions nettes monomères/monomères qui deviennent quasi nulles. Les polymères sont alors en solvant _{Ő : on ne différencie plus} interactions monomères-solvants ou monomères-monomères.

Si le volume exclu est supérieur à 0 les interactions nettes monomères/monomères sont répulsives et ce sont les interactions monomères-solvants qui sont favorisées. Les polymères sont alors en bon solvant.

Selon la théorie de Flory, la distance bout à bout R répond à l’équation R ř

bN

l’exposant de Flory qui mesure l’interaction effective nette entre 2 monomères. Le facteur de )ORU\ťSHXW prendre différentes valeurs selon la qualité du solvant avec ť HQmauvais VROYDQWť HQVROYDQWŠť HQERQVROYDQW

Figure 1.5 : Exemple de conformation tridimensionnelle d’une chaîne idéale de polymère dans différents solvants

Chapitre 1 –Etat de l’art

18

D’autre part, un polymère est un objet fractal aléatoire qui peut prendre différentes dimensions. 'H *HQQHV D PRQWU¢ OʑDQDORJLH HQWUH OʑH[SRVDQW GH )ORU\ ť HW OD dimension fractale, df, selon laquelle df = ଵ

ఔ. De façon générale, la chaîne idéale est un objet fractal aléatoire de

dimension fractale 2.

2.1.2 Polymère en solution

2.1.2.1 Concentration critique de recouvrement

Il existe 2 types de polymères en solutions : les fondus de polymères lorsque qu’il n’y a plus de solvant ou les solutions de polymères. Nous nous intéressons ici uniquement aux solutions de polymères qui peuvent être soit en régime dilué soit en régime semi-dilué.

En régime dilué, les chaînes de polymères sont éloignées les unes des autres et ne présentent pas d’interactions entre elles. Du fait de leur isolement elles ont un comportement similaire à ceux des polymères en chaînes idéales. Néanmoins, lors de l’augmentation de la concentration, les interactions de type volume exclu vont devenir plus importantes et les pelotes de polymères vont alors se rapprocher. Pour une concentration donnée, propre à chaque polymère, les pelotes de polymères vont entrer en contact et se superposer. Cette concentration correspond à la

concentration critique de recouvrement, C*, qui marque le passage du régime dilué au régime semi-dilué. Lorsque les interactions sont devenues trop importantes au point que les pelotes de polymères s’enchevêtrent, la solution passe dans un régime concentré (Fig.1.6). La concentration critique de recouvrement, C*, est définie par l’équation suivante :

C* = ଷெ௪

ସ௽ோ௚᥷ ே௔

Chapitre 1 –Etat de l’art

19

Figure 1.6 : Représentation de la conformation des pelotes de polymères à différentes concentrations (inspirée de Rubinstein & Colby, 2003).

2.1.2.2 Longueur de corrélation et longueur de persistance

En régime semi-dilué en bon solvant, les monomères appartenant à une chaîne de polymère peuvent se rapprocher des monomères d’une autre chaîne de polymère. La distance qui sépare alors les deux monomères voisins correspond à une sphère de rayon Ň où Ň est la longueur

de corrélation, (Fig.1.7). Ce paramètre est utilisé pour décrire les polymères (De Gennes,

1976), ou les gels de polymères (Seiffert, 2017).

Figure 1.7 : Représentation de la longueur de corrélation, ɂ, en solution semi-diluée (a) et de la longueur

de persistance, l0, d’une chaîne de polymère (b).

Chapitre 1 –Etat de l’art

20

La longueur de persistance, l0, est également un paramètre utilisé pour décrire les

macromolécules ou polymères et traduit la rigidité intrinsèque de la chaîne (Fig.1.7). lo est

d’autant plus petit que la chaîne est flexible et peut être relié au rayon de giration, Rg, à partir des équations établis par Benoit et Doty en 1953 selon lesquelles :

Rg

_l

Selon ce modèle Rg 2_{= lc} 2_{/12 pour des polymères en forme de bâtons (l0>>lc) et Rg} 2 _=lc*lo/3

pour des pelotes statiques (lc>>l0).

2.1.2.3 Rayon de giration et rayon hydrodynamique

Les dimensions des macromolécules sont très souvent décrites en fonction de leur rayon de giration et hydrodynamique. En règle générale, Rg est une taille associée au moment d’inertie des objets et devient un paramètre indispensable dans la détermination du facteur de forme, P(q), dans le régime de Guinier. En effet, en absence d’interactions, l’intensité au vecteur d’onde, q, pour lequel q = 0 est proportionnelle au nombre total en masse ou volume d’éléments diffusés. L’approximation de Guinier permet alors de déduire le facteur de forme selon lequel :

Pguinier(q) = 1 - ௤²ோ௚²

ଷ

Le rayon hydrodynamique, Rh, ou rayon de Stockes est une grandeur hypothétique selon laquelle la particule diffuse à la même vitesse qu’une sphère dure. Déterminé généralement par diffusion dynamique de la lumière, il tient compte de l’hydratation de la molécule et dépend de la viscosité du solvant dans lequel se déplace la particule. Il peut être calculé à partir de la relation de Stokes selon laquelle F= 6Ũşs.Rh où F représente le coefficient de frottement subit

par la particule de rayon hydrodynamique Rh, dans un solvant de viscosité şs. Le rayon

hydrodynamique d’une protéine telle que le lysozyme est de l’ordre de 2 nm lorsque la protéine est repliée (Wilkins et al., 1999) et son rayon de giration de l’ordre de 1,5 nm (Chen et al., 1996).

Chapitre 1 –Etat de l’art

21 Dans la plupart des cas, Rg et Rh sont utilisés pour calculer le paramètre ũ qui résulte du rapport de Rg/Rh et qui informe sur la géométrie des polymères. Chaque valeur de ce rapport est relative à une conformation particulière (Fig.1.8). Selon la théorie de Kirkwood-Riseman, ũ = 0,77 est une valeur de référence qui correspond à une sphère homogène dense et ũ = 1,504 est la valeur pour laquelle le polymère se présente sous forme d’une longue chaîne linaire dans un solvant avec des interactions hydrodynamiques.

Figure 1.8 : Architecture des polymères en fonction du rapport ũ

Pour des systèmes composés de gliadines et gluténines en régime dilué, Dahesh et al., 2014 rapportent des rayons de giration de l’ordre de 150 nm et des rayons hydrodynamiques de l’ordre de 128 nm soit ũ = 1,15. Ainsi, les polymères se trouvent sous forme de polymères réticulés et/ou ramifiés et se rapprochent de bobines de polymères en bon solvant.

Outre des tailles caractéristiques telles que Rg et Rh ces systèmes ont fait l’objet d’études approfondies et sont détaillés dans les paragraphes suivants.

2.2 Modèle gli+glu

L’étude de la solubilité des systèmes composés de gluténines et gliadines (modèle gli+glu) a montré que ces derniers sont solubles dans des solvants eau/éthanol 40/60 à 60/40 v/v. Dans le travail de thèse proposé par M.Dahesh, ces modèles gli+glu sont composés de 43% de monomères et de 49% de polymères de gluténines en solvant eau/éthanol 50/50 (v/v). La série d’échantillons de 10 à 600 mg/ml présentée dans la Figure 1.9 montre qu’au-delà d’une certaine

Chapitre 1 –Etat de l’art

22

concentration, dans un mélange eau/éthanol 50/50 (v/v), les échantillons semblent changer de couleur et deviennent moins turbides ce qui suppose une évolution du produit avec la concentration. Pour C > C* (avec C* = 180 g/l) les échantillons présentent une gélification spontanée qui dépend de la concentration et du temps. Cette gélification est due à la formation lente de liaisons hydrogènes au sein du système.

Figure 1.9 : Photo d'échantillons de gluten à différentes concentrations en protéines, C, de 10 à 600 mg/ml, dans un mélange eau/éthanol 50/50 (v/v) (Dahesh et al., 2014).

D’autre part, la structure de ces échantillons concentrés présente des caractéristiques de gels de polymères flexibles en bon solvant. Des mesures SANS ont permis de définir différentes longueurs caractéristiques telles que les rayons de giration (Rgу 116 nm) ou encore la longueur de persistance (l0 у 0,7 nm). De plus, les complexes observés montrent une conformation de

chaîne de polymères ramifiée et non linéaire avec une dynamique interne à grands q observée par diffusion dynamique de la lumière. Les différentes observations ont démontré la présence d’agrégats dans le milieu sans toutefois détailler la nature de ces derniers.

2.3 Modèle gli

Contrairement aux modèles glu+gli, les modèles composés en majeure partie de gliadines (modèle gli), (>82%) présentent des propriétés rhéologiques moins complexes. En effet, d’après les travaux de Mohsen Dahesh ce système a la particularité rhéologique de se comporter comme un fluide newtonien jusqu’à des concentrations très élevée de l’ordre de 560 mg/ml. D’autre part, il ne présente aucune transition d’une solution vers un gel. Ces observations amènent donc à conclure que la gélification des solutions de glu+gli est amenée par les gluténines ou par leur association avec les gliadines.

Chapitre 1 –Etat de l’art

23 Les travaux de thèse d’Adeline Boire, 2014, ont permis de mettre en avant la séparation de phases liquide-liquide que subissent les gliadines en solution dans un solvant eau/éthanol lors d’une diminution de la température. Ces résultats expérimentaux ont amené à l’établissement de diagrammes de phases (Fig.1.10) et à la mise en évidence de la dépendance en température du potentiel d’interaction des gliadines.

Figure 1.10 : Représentation de la température de transition d’isolat de protéines de blé dans une solution éthanol-eau à 55% v/v, de force ionique 0,5 mM déterminée par des mesures de turbidité (I : système monophasique, II : système biphasique) (Boire et al., 2013).

Ces systèmes ne présentent pas de séparation de phases arrêtée et le caractère liquide de la dispersion de gliadine de blé à 20°C à une fraction volumique élevée suggère de faibles interactions entre protéines et / ou une forte interaction entre protéine et solvant.

3. Transition de phases des protéines – diagramme de phases

Les diagrammes de phases sont utilisés en thermodynamique pour prédire la composition de chaque phase à l’équilibre en fonction de paramètres physico-chimiques précis. L’établissement des diagrammes de phases permet de délimiter le comportement physique d’un système et plus particulièrement la zone de stabilité de la solution en fonction de sa concentration. En règle générale, les diagrammes de phases aident à la compréhension des systèmes ainsi qu’à comprendre les interactions entre les différents constituants d’une solution. Cette partie vise à présenter les différents moyens de détermination de ces diagrammes ainsi que les mécanismes mis en jeu au cours de la séparation de phases.

Chapitre 1 –Etat de l’art

24

3.1 Établissement des diagrammes de phases

D’après la théorie de Flory-Huggins, il existe des contributions énergétiques de types entropiques et enthalpiques spécifiques à chaque type de polymères. Pour un mélange binaire composé d’une espèce A et d’une espèce B, l’énergie d’interaction, UA, (ou énergie de paire)

est l’énergie d’interaction d’un monomère de l’espèce A de fraction volumique ŎA avec pour

voisins des monomères de l’espèces B de fraction volumique, ŎB = 1 - ŎA. Cette énergie

d’interaction est définie pour un monomère A comme UA = uAAŎA + uABŎB et comme UB =

uBBŎB + uABŎA pour un monomère B. uAA est l’énergie d’interaction entre deux molécules A,

uBB entre deux molécules B et uAB entre une molécule A et une molécule B. Chaque site du

réseau possède z voisins et un nombre total, n, de sites du système combiné, ce qui amène à une énergie totale d’interaction du mélange :

U = ௭௡

ଶ [UAŎA+UBŎB] (1.4)

Soit U = ௭௡

ଶ [uAAŎ2 +2uABŎ(1-Ŏ)+uBB (1-Ŏ)2] (1.5)

Le modèle de Flory-Huggins, qui intervient dans l’expression de l’enthalpie, permet de relier le paramètre de Flory, ů aux différences des énergies d’interactions. ů est alors défini comme un paramètre d’interactions pour un mélange composé de 2 espèces A et B, selon lequel :

ů = ௭ ଶ ଶ௎ಲಳି ௎ಲಲି௎ಳಳ ௞் = E + ி ் (1.6)

Avec E représentant la dépendance à la température.

Il a été démontré que dans la plupart des cas, ů est inversement proportionnel à la température et dépend de la composition en polymères.

Si F > 0, le polymère est parfaitement soluble au-dessus de la température de séparation de phases. Le polymère a alors un comportement type UCST (Upper Critical Solution

Temperature).

Si F < 0, le polymère est soluble en-dessous de la température de séparation de phases. Le polymère a alors un comportement type LCST (Low Critical Solution Temperature) (Fig.1.11).

Chapitre 1 –Etat de l’art

25

Figure 1.11 : Représentation de diagrammes de phases de type UCST (a) et LCST (b) inspirée de Teraoka, 2002.

Dans le cas des diagrammes de phases de type UCST, à faible température (et inversement pour les diagrammes de phases de type LCST), le système se sépare en deux phases : une phase pauvre en protéines et une phase riche en protéines qui se trouvent dans un équilibre

thermodynamique et dont les compositions sont déterminées par la courbe binodale

(Fig.1.12). En dessous de cette courbe, le système est biphasique et la courbe binodale représente donc la limite entre un système monophasique et un système biphasique. Cette séparation de phases peut se faire dans différentes conditions : en fonction de la température, de la pression osmotique, de la concentration, du pH ou encore de la force ionique. Dans le cadre de cette thèse, nous étudierons des diagrammes de phases en température en fonction de la concentration.

Chaque diagramme de phases est caractérisé par une température critique, Tc, qui est la limite supérieure de la courbe binodale. À cette température critique correspond une

concentration critique, Cc, qui se lit sur l’axe des abscisses. D’autre part, lorsque le système

a passé la courbe binodale et se retrouve en 2 phases, la phase diluée a une concentration C’ correspondante à une température T’ et la phase concentrée a une concentration C’’ qui correspond à une température T’’. Il est important de noter que T’ est alors égale à T’’.

Chapitre 1 –Etat de l’art

26

Figure 1.12 : Représentation d’un diagramme de phases en température d’un système en solutions tel que les polymères

La détermination des diagrammes de phases exige l’étude d’un grand nombre de conditions en termes de concentrations, de température, de pH ou de force ionique. Pour mesurer l'effet d'un paramètre, il faut systématiquement faire varier sa valeur et caractériser l’évolution du système une fois l’équilibre atteint, ce qui peut être long et fastidieux.

3.2 Détermination de la température de points de trouble, Tcloud

L’établissement de la courbe binodale est la méthode absolue pour établir des diagrammes de phases et peut se faire par différentes techniques. La plus précise d’entre elles consiste à isoler les deux phases après la séparation, par exemple par centrifugation, et d'analyser leur composition. Les concentrations de phases dense et diluée sont généralement définies par spectroscopie d'absorption UV en mesurant de petites aliquots de chaque phase (Thomson et al., 1987). Cependant, par simplification la température de point de trouble est plus souvent déterminée.

La température de point de trouble (ou cloud point temperature, Tcloud), est définie

pour tout système comme étant la température à laquelle débute la séparation de phases à une concentration fixée. Déterminer Tcloud à différentes concentrations est une approche qui permet

Chapitre 1 –Etat de l’art

27 Différentes techniques ont été développées, basées sur l'évolution des propriétés optiques d'une solution protéique lorsqu'une séparation de phases se produit dans un système initialement homogène. Si les gouttelettes formées sont suffisamment grandes pour diffuser la lumière visible, la solution devient trouble. Il est donc possible de déterminer le début de la séparation de phases avec n'importe quel dispositif qui mesure soit une diffusion accrue d'un échantillon, soit une diminution de la lumière transmise. La mesure de diminution de l’intensité transmise par un laser est un moyen efficace de déterminer avec précision la température d'opacification de la solution, qui correspond donc à la température de point de trouble, Tcloud. De façon générale,

un seuil de lecture est fixé pour mesurer Tcloud, (cf Chapitre 3) mais la méthode des

tangentes est aussi utilisée (Corti et al., 1984 ; Kim et al., 2015) (Fig.1.13).

Figure 1.13 : Exemple d’une méthode des tangentes utilisées pour déterminer Tcloud par Corti et al.,

1984.

Quelle que soit la méthode de lecture utilisée, cette détermination de la transition de phase donne des résultats quantitativement similaires avec la détermination des compositions à l'équilibre. Cette technique très utilisée est décrite pour les premiers mélanges de lysozyme et d'eau salée par Ishimoto, et al., 1977 et Tanaka, et al., 1977 pour sa ressemblance avec certaines formes de cataractes. Taratura, et al., 1990, utilise la mesure par séparation et celle par opacité indépendamment l’une de l’autre. Ils confirment ainsi l'efficacité de chaque méthode pour prouver le phénomène de séparation de phases liquide-liquide dans des mélanges aqueux de lysozyme. Par ailleurs, la détermination de Tcloud est un paramètre largement utilisé pour

Chapitre 1 –Etat de l’art

28

Table 1.2 : Exemples de points de trouble Tcloud, déterminés sur différentes protéines

Protéines Solvant Tcloud (°C) pH Références

Caséine 20 mM tampon

imidazole 50<Tcloud <60 pH = 6,6 Kessler, et al., 2013 Lysozyme 0,1 M tampon acétate,

3% NaCl 4,3 pH = 4,8 Lu, et al., 2004 Albumin 0,15 M chloride de

sodium 63,1 Boyer, et al., 1946

Arachine chloride de sodium 19 pH = 6 Tombs, et al., 1974 BPTI* 350 mM thiocyanate de

potassium 17 pH = 4,9

Grouazel, et al., 2002

* Inhibiteur de la trypsine pancréatique bovine 3.3 Mécanisme de séparation de phases

Il existe 2 types de séparation de phases mettant en œuvres des mécanismes différents : la

décomposition spinodale et la nucléation-croissance. D’après les travaux de Cahn, en

1958, la décomposition spinodale se fait dans des systèmes thermodynamiquement instables et la nucléation-croissance dans des systèmes métastables. Ces différentes zones de stabilités sont délimitées par la courbe spinodale qui se trouve sous la courbe binodale dans le cas d’un diagramme UCST. La courbe binodale, qui représente la limite entre deux états bien séparés qui peuvent coexister, donne deux concentrations à l’équilibre, alors que la courbe spinodale délimite deux mécanismes de séparations de phases. Ces deux courbes possèdent le même extrémum via le point critique, Tc, qui coïncide (Fig.1.14).

La zone qui se situe entre la courbe binodale et la courbe spinodale est une zone métastable à l’intérieur de laquelle se fait la nucléation-croissance. Cette zone métastable a la particularité d’être stable vis-à-vis de fluctuations « faiblement localisées », mais instable vis-à-vis des fluctuations « fortement localisées » (Binder & Stauffer, 1976). Ces fluctuations fortement localisées donnent lieu à la formation de nucléi qui grossissent pour donner des gouttelettes. Binder & Stauffer, 1974, ont proposé une théorie selon laquelle les gouttelettes sont soumises au mouvement Brownien. Leur déplacement libre les amène ainsi à se rencontrer puis à se regrouper pour ne former qu’une seule grosse goutte. Le mécanisme se reproduit, permettant un grossissement progressif des gouttes jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une phase bien distincte d’une autre (Furukawa, 1985), (Fig.1.14). Par ailleurs, Tanaka en 2000, montre que la

Chapitre 1 –Etat de l’art

29 contrainte viscoélastique du milieu environnant peut influencer la nucléation-croissance qu’il est important de prendre en compte lors de l’étude des séparations de phases.

En dessous de la courbe spinodale réside une zone instable où il existe de nombreuses

fluctuations de concentrations. Le transfert de matière s’opère depuis les zones de faible

concentration vers les zones de fortes concentration, ce qui qui favorise la croissance des fluctuations de concentration. Ces fluctuations augmentent progressivement jusqu’à atteindre un équilibre thermodynamique (Fig.1.14). Ce phénomène est la décomposition spinodale qui est composée de 3 régimes distincts : le régime initial ou diffusif, (I), qui est le mode de croissance des gouttelettes le plus rapide, le régime intermédiaire, (II), et le régime final, (III).

D’après la théorie de Cahn-Hillard (Cahn, 1958 I et II; Cahn & Hillard, 1959), dans le premier stade de croissance diffusive (I), la taille du domaine suit une loi selon laquelle la longueur caractéristique, Ŧ, augmente avec le temps selon Ŧ ~ tn_{. Plus particulièrement, une évolution}

de la longueur caractéristique qui évolue selon une loi de puissance telle que Ŧ ~ t1/3 _témoigne

d’une croissance diffusive des gouttelettes (Siggia, 1979). Cette évolution révèle un grossissement contrôlé par diffusion par coalescence ou mûrissement d'Ostwald. En effet, les mécanismes de grossissement correspondants peuvent être associés :

- soit d’un mécanisme de diffusion des petites gouttes vers les plus grosses gouttes sur des domaines plus vastes d’une part,

- ou d’un mécanisme de coalescence des domaines d’autre part (Binder & Stauffer, 1974). Cependant, cette pente en t1/3 _{ne permet pas de distinguer lequel des deux mécanismes est mis}

en jeu. Dhont en 1996, souligne que l’exposant, n, varie toujours sur une gamme de 0,2 à 1,1 en fonction de l’importance des interactions hydrodynamiques.

Chapitre 1 –Etat de l’art

30

Quel que soit le mécanisme, la décomposition spinodale montre une évolution au cours du temps de fluctuations de concentrations qui s’amplifient ; contrairement à la nucléation-croissance où les objets sphériques, les nucléï, ayant une concentration à l’équilibre sous la binodale, vont grossir. Cependant, lorsque le phénomène de séparation de phases se produit près de la limite entre l’état métastable et l’état instable, il est difficile de distinguer nettement le mécanisme à l’origine de la séparation.

Figure 1.14 : Schéma du mécanisme de décomposition spinodale et de nucléation-croissance inspiré des travaux de Dhont, 1996.