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Accumulation du cuivre par les bactéries isolées à partir des eaux de mer

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Academic year: 2021

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Texte intégral

(1)

و حبلا و يلاعلا نيلعتلا ةراس ث علا ل و ي

République Algérienne Démocratique et populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et la Recherche Scientifique تعهاج

ىيحي نب قيدصلا محمد

-لجيج

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

ة

ايحلاو تعيبطلا مىلع تيلك Département : Microbiologie Appliquée et و تيقيبطتلا ايجىلىيبوزكيولا:نسق Sciences Alimentaires تيذغتلا مىلع

Mémoire de Master

Filière : Sciences Biologiques Option : Microbiologie Appliquée

Membre de jury Présenté par : Présidente : Dr Moussaoui S. Fortas Nadia

Examinatrice : Dr Ouled Haddar H. Mouats Nour- El- Houda Encadreur : Mme Benhamada W. Zouyed Nassira

Année Universitaire 2018-2019

Numéro d’ordre (bibliothèque) :

Accumulation du cuivre par les bactéries isolées à

partir des eaux de mer

(2)

Remerciements

Nous tenons tout d’abord à remercier ALLAH Le tout Puissant et

Miséricordieux qui nous a donné la force et la patience d’accomplir ce travail.

Nous tenons à remercier chaleureusement Madame Benhamada Wahiba qui

nous a permis de bénéficier de son encadrement, des conseils qu’ellle nous a

prodigués.

La patience, la confiance qu’elle nous a témoignées ont été déterminantes dans la

réalisation de notre travail de recherche

.

Nous remercions le membre de jury :

Docteur Moussaoui Sagia, pour avoir accepté de présider ce jury et d’évaluer ce

travail et

Docteur Ouled Haddar Houria qui nous a fait l’honneur d’examiner ce

document.

Nous aimerons remercier également tous les ingénieurs du Laboratoire de

Microbiologie de l’université de Jijel de nous avoir aidé à chaque fois qu`on en

(3)

Dédicace

Je dédie ce travail

A mes chers parents mon père et ma mère pour

leur patience, leur amour, leur soutien et leurs encouragements.

A ma seour Sara et mon petite frère Mohammed Cherif

Puisse ALLAH vous donner santé, bonheur, courage et surtout

réussite.

A ma famille, mes grands-mères, et a ceux qui ont partagé

avec moi tous les moments d’émotion lors de la réalisation

de ce travail.

A mes amies surtout Sara, Marwa et Yassemine et à toutes mes

camarades qui m’ont toujours encouragé.

Sans oublier mon trinôme Nadia et Nassira pour leur soutien moral et leur

patience.

(4)

Dédicace

Je dédie ce mémoire

A la meilleur de toutes mes mères qui m’a soutenu durant toute

Ma vie, pour son amour infini.

A mon très cher père pour son soutien et ses encouragements.

Puisse ALLAH vous donner santé.

A mon chèr mari Ali qui n’a pas cessé de me conseiller, encourager et soutenir

tout au long de mes études. Que ALLAH le protège.

A mes sœurs et mes frères je vous souhaite une vie pleine de bonheur, de joie et

beaucoup de succès.

A mon neveu Chouaïb que ALLAH le garde pour nous.

A mes oncles, tantes et cousines surtout Moufida.

A mes meilleurs amies Fouzia, Chahra, Nour, Nassira, Amina, Chaima, Menel,

et Faiza, je vous aime mes cheres, pour votre sincère amitié.

J’ai passé avec vous des moments extraordinaires, qui resteront gravés dans mon

cœur.

A tous mes collègues et amis du master spécialité microbiologie appliquée.

(5)

Dédicace

Du profond de mon cœur je dédie ce travail

A ma chère mère, votre affection m’a toujours été d’un grand soutien. Trouvez

dans ce travail le fruit de vos indéfectibles efforts et qu’ils puissent récompenser

votre patience. Que le bon Dieu vous accorde santé et longévité.

A la mémoire de mon père qui me quitte trop tôt et qui a gardé une place dans

mon cœur que Dieu le bénisse dans son vaste paradis.

A ma sœur Zahira et mon frère Bilal à qui je souhaite une vie pleine de bonheur,

de santé et de réussite

A mon fiancé Oussama qui m’a aidé par son soutien, ses conseils et ses

Encouragements

A tous mes grands parents, mes oncles, mes tantes et mes cousines.

A mes chères amies surtout Nadia, Nour El Houda, Fouzia, Souad et Rima et

avec lesquels j’ai partagé des moments inoubliables

A toute mes camarades de la promotion microbiologie appliquée 2019 à qui je

souhaite une bonne continuation et d’atteindre leurs rêves.

Nassira

(6)
(7)
(8)

Liste des abréviations ... x

Introduction ... 1

Partie I : Synthèse bibliographique Chapitre I : Généralités sur le cuivre I.1. Les métaux lourds ... 2

I.1.1. Classification des métaux lourds ... ...2

I.1.2. Toxicité des métaux lourds ... 3

I.1.2.1.Toxicité des métaux lourds sur l’être humain ... 3

I.1.2.2. Toxicité des métaux lourds sur les plantes ... 3

I.2. Le cuivre ... 4

I.2.1. Présentation du cuivre ... 4

I.2.2. Origine du cuivre ... 4

I.2.3. Propriétés physicochimiques du cuivre ... 5

I.2.4.Propriétés biologiques du cuivre ... 5

I.2.5. Utilisation du cuivre ... 5

I.2.6. Toxicité du cuivre ... 6

I.2.6.1. Toxicité du cuivre sur les plantes... 6

I.2.6.2. Toxicité du cuivre sur les êtres humains ... 7

I.2.6.3. Toxicité du cuivre sur les microorganismes ... 7

Chapitre II : Bioremédiation du cuivre II.1. Les méthodes biologiques d’élimination du cuivre ... 9

II.1.1. Biosorption ... 9

II.1.1.1. Echange d'ions ... 10

II.1.1.2. Complexation ... 10

II.1.1.3. Adsorption physique ... 10

II.1.2 Bioaccumulation ... 11

II.2 Mécanisme de résistance ... 11

II.2.1. Systèmes d’efflux ... 12

II.2.2. Séquestration du cuivre……….….13

(9)

III.1.Matériel ... 14

III.1.1. Présentation des sites de prélèvement ... 14

III.1.2. Prélèvement d’échantillon d’eau ... 14

III.1.3. Milieux de culture ... 15

III.1.4.Produits chimique et réactif ... 15

III.1.5. Matériel et appareillage ... 16

III.2. Méthodes ... 17

III.2.1. Etude microbiologique de l’eau ... 17

III.2.1.1. Préparation des dilutions ... 17

III.2.1.2. Isolement des bactéries ... 17

III.2.1.2.a. Recherche de la flore aérobie mésophile totale (FTAM) ... 17

III.2.1.2.b. Recherche des Coliformes totaux ... 17

III.2.1.2.c. Recherche des Coliformes thermotolérants... 17

III.2.1.2.d. Recherche des streptocoques fécaux ... 18

III.2.1.2.e. Recherche des clostridium Sulfitoréducteur ... 19

III.2.1.2.f. Recherche des Staphylocoques ... 19

III.2.1.2.g. Recherche des Entérobactéries ... 19

III.2.1.2.h. Recherche de Pseudomonas ... 19

III.2.1.3. Identification des souches bactériennes par étude microscopique ... 19

III.2.2. Traitement des souches bactériennes isolées par le cuivre ... 20

III.2.2.1. Préparation des différentes concentrations du cuivre ... 20

III.2.2.2. Préparation des cultures bactériennes ... 20

III.2.2.3. Mesure de la croissance bactérienne ... 20

III.2.2.3.a. Croissance sur milieu liquide ... 20

III.2.2.3.b. Croissance sur milieu solide... 20

III.2.3. Dosage du cuivre ... 20

III.2.3.1. Digestion ... 20

III.2.3.2. Dosage du cuivre par Spectrométrie d’absorption atomique ... 21

Chapitre IV : Résultats et discussion IV.1. Evaluation de la qualité microbiologique de l’eau ... 22

IV.1.1. Flore totale aérobie mésophile (FTAM) ... 22

IV.1.2. Coliformes totaux, Coliformes thermotolérants, Streptocoques fécaux ... 22

(10)

IV.2. Résultats de l’identification microscopique ... 23

IV.3. Influence de la concentration du cuivre sur la croissance des bactéries ... 26

IV.3.1. Etude de la croissance des bactéries isolées en présence de différentes concentrations du cuivre sur milieu solide ... 26

IV.3.2. Etude de la croissance des bactéries isolées en présence de différentes concentrations du cuivre sur milieu liquide ... 26

IV.4. Test de bioaccumulation du cuivre ... 31

Conclusion ... 35

Références bibliographiques ... 36 Annexes ... I Résumé

(11)

I : Résultat de dénombrement des germes totaux dans l’eau de mer (D) ………...22 II : Résultat de dénombrement des germes totaux dans l’eau de mer (I)………. 22 III : Résultats de coloration de Gram………24

(12)

01 Protéines impliquées dans la résistance au cuivre chez les bactéries 12

02 Localisation du 1er site de prélèvement 14

03 Localisation du 2ème site de prélèvement 14

04 Photo du 1er site de prélèvement 15

05 Aspect du 1er échantillon 15

06 Photo du 2ème site de prélèvement 15

07 Aspect du 2ème échantillon 15

08 Photo du spectrophotomètre d’absorption atomique 21

09 Présentation des spores de Clostridium sulfitoréducteur 23

10 Résultat de test catalase 23

11 Croissance de la flore totale aérobie mésophile (D) dans le bouillon nutritif en présence de différentes concentrations du cuivre.

27

12 Croissance de la flore totale aérobie mésophile (I) dans le bouillon nutritif en présence de différentes concentrations du cuivre

27

13 Croissance des Coliformes fécaux (D) dans le bouillon nutritif en présence de différentes concentrations du cuivre

27

14 Croissance des Coliformes fécaux (I) dans le bouillon nutritif en présence de différentes concentrations du cuivre.

27

15 Croissance des Streptocoques fécaux (D) dans le bouillon nutritif en présence de différentes concentrations du cuivre

28

16 Croissance des Streptocoques fécaux (I) dans le bouillon nutritif en présence de différentes concentrations du cuivre

28

17 Croissance des Clostridium Sulfitoréducteur (D) dans le bouillon nutritif en présence de différentes concentrations du cuivre

28

18 Croissance des Clostridium Sulfitoréducteur (I) dans le bouillon nutritif en présence de différentes concentrations du cuivre

28

19 Croissance des Staphylocoques (D) dans le bouillon nutritif en présence de différentes concentrations du cuivre

29

20 Croissance des Staphylocoques (I) dans le bouillon nutritif en présence de différentes concentrations du cuivre

29

21 Croissance de S1 d’Entérobactérie (D) dans le bouillon nutritif en présence de différentes concentrations du cuivre

(13)

23 Croissance de S2 d’Entérobactérie (D) dans le bouillon nutritif en présence de différentes concentrations du cuivre

30

24 Croissance de S2 d’Entérobactérie (I) dans le bouillon nutritif en présence de différentes concentrations du cuivre

30

25 La quantité du cuivre accumulée par les FTAM (D) 31

26 La quantité du cuivre accumulée par les FTAM (I) 31 27 La quantité du cuivre accumulée par les Coliformes fécaux (D) 31

28 La quantité du cuivre accumulée par les Coliformes fécaux (I) 31 29 La quantité du cuivre accumulée par les Streptocoques fécaux (D) 32

30 La quantité du cuivre accumulée par les Streptocoques fécaux (I) 32 31 La quantité du cuivre accumulée par Clostridium sulfitoréducteur (D) 32

32 La quantité du cuivre accumulée par Clostridium sulfitoréducteur (I) 32

33 La quantité du cuivre accumulée par les Staphylocoques (D) 32

34 La quantité du cuivre accumulée par les Staphylocoques (I) 32

35 La quantité du cuivre accumulée par S1 d’Entérobactérie (D) 33

36 La quantité du cuivre accumulée par S1 d’Entérobactérie (I) 33

37 La quantité du cuivre accumulée par S2 d’Entérobactérie (D) 33

38 La quantité du cuivre accumulée par S2 d’Entérobactérie (I) 33

(14)

ATP: Adenosine Tri-Phosphate B: Bore

BCPL : Bouillon Lactosé au Pourpre de Bromocrésol Br : Brome

Cd : Cadmium Co : Cobalt Cr : Chrome Cu : Cuivre

Cu (I) : Cuivre monovalent Cu (II) : Cuivre divalent DO : Densité Optique H2O2 : eau oxygénée Hg : Mercure

HNO3 :acide nitrique Mn : Manganèse Mo : Molybdène mV : millivolt Ni : Nickel

OMS : Organisation Mondiale de Santé PCA: Plate Count Agar

Pb: Plombe

ppm : Partie par million

ROS: Reactive Oxygen Species S1: Souche 1 S2: Souche 2 Se: Selenium Sn: Etain SFB: Selenite F Broth V: Vanadium

VBL : Bouillon lactose au Vert brillant Zn: Zinc

(15)
(16)

monde. La mobilisation des métaux lourds à travers l'extraction des minerais et leur traitement ultérieur pour différentes applications ont conduit à la libération de ces éléments dans l'environnement. La pollution par les métaux lourds devient de plus en plus dangereuse avec l’industrialisation croissante et la perturbation des cycles biogéochimiques naturels. Contrairement aux substances organiques, les métaux lourds sont essentiellement non biodégradables et s'accumulent dans l'environnement (Ali et al., 2013).

La toxicité des métaux lourds dans le milieu marin est une préoccupation majeure car ils constituent un risque potentiel pour un certain nombre d'espèces de la flore et de la faune, y compris l'Homme, à travers les chaînes alimentaires. Les métaux lourds peuvent atteindre les cours d’eaux naturellement, par le biais de divers processus biochimiques ou par le rejet des eaux usées municipales, agricoles et industrielles (Boran et Altınok, 2010 ; Abd-Elnaby et

al., 2011).

Parmi les métaux lourds on trouve le cuivre qui est largement utilisé, il existe de nombreuses sources réelles ou potentielles de la pollution par le cuivre. C'est un oligo-élément essentiel pour le métabolisme humain, mais à concentration élevée il inhibe le métabolisme cellulaire. Il a été considéré comme l’un des métaux toxiques les plus courants (Nadaroglu et al., 2010 ; Ochoa-Herrera et al., 2011). Il est donc devenu extrêmement important de trouver une option écologique pour nettoyer l'environnement contaminé par les métaux et, par conséquent, préserver notre environnement. La bioremédiation est une technologie relativement jeune, peu coûteuse et socialement acceptable, elle implique l'utilisation des ressources renouvelables telles que les microorganismes et les plantes pour résoudre les problèmes liés aux métaux lourds (Oves et al., 2013).

Les microorganismes sont connus pour employer une grande variété des stratégies élaborées pour faire face aux ions métalliques toxiques. Ils peuvent survivre grâce à des propriétés intrinsèques telles que celles liés à la structure de leur paroi cellulaire et la production des exopolysaccharides (Llanos et al., 2000).

L’objectif de ce travail est d’étudier le processus de bioaccumulation du cuivre par les

bactéries isolées de deux sources marines différentes. Cette étude est divisée en deux parties : La première partie est un rappel sur les métaux et les différentes méthodes biologiques pour

l’élimination du cuivre.

La deuxième partie consiste à faire isoler les différentes bactéries de l’eau de mer, d’étudier la tolérance au cuivre de chaque souche en présence de différentes concentrations du cuivre et enfin d’évaluer le processus de bioaccumulation du cuivre par les souches isolées.

(17)

Partie I :

Synthèse

Bibliographique

(18)

Chapitre I :

Généralités sur

le cuivre

(19)

I.1. Les métaux lourds

Les métaux lourds sont des substances à haute conductivité électrique, malléables et lustres, qui perdent volontairement leurs électrons pour former des cations (Jaishankar et al., 2014). Le terme métaux lourds désigne tout élément métallique qui a une densité spécifique supérieure à 5 g/cm3 et nuisant à l'environnement et aux organismes vivants (Duruibe et al., 2007; Jaishankar et al., 2014). Ils sont impliqués dans le cycle biogéochimique (Cyraniak et Draszawka-Bołzan, 2014), et constituent un groupe très hétérogène d'éléments aux propriétés chimiques et aux fonctions biologiques très variées (Raikwar et al., 2008).

Les éléments en traces métalliques (ETM) sont les 80 éléments constituants de la croûte terrestre, dont la concentration est inférieure à 0,1%. Les éléments en traces peuvent être des métaux (Pb, Zn, Cu etc.), des métalloïdes (As, B, Se) ou des non métaux (N, F, Cl, Br) (Baize, 1997).

Les métaux lourds peuvent provenir de deux types de sources : naturelles et anthropiques :  Origine naturelle des métaux lourds associés à des éruptions volcaniques, altération

des roches, l’incendie des forêts créatifs ou évaporation des océans (Cyraniak et Draszawka- Bołzan, 2014).

 La source anthropique due aux activités anthropiques telles que les mines, les émissions industrielles, les effluents domestiques et l'agriculture (N'Guessan et al., 2009).

Les métaux lourds sont classés dans la catégorie des polluants environnementaux en raison de leurs effets toxiques sur les plantes, les humains et les animaux. Certains métaux lourds comme l’arsenic, le cadmium, le plomb et le mercure sont des poisons cumulatifs, ces métaux lourds sont persistants, s'accumulent, ne sont pas métabolisés en d'autres composés intermédiaires et ne se décomposent pas facilement dans l'environnement. Ils s'accumulent dans la chaîne alimentaire du fait de leur absorption par les producteurs primaires et de leur consommation par les consommateurs (Raikwar et al., 2008).

La contamination par les métaux lourds est l’un des problèmes environnementaux les plus graves, limitant la productivité des plantes et menaçant la santé humaine (Demirevska-Kepovaa et al., 2004).

I.1.1. Classification des métaux lourds

Certains métaux sont nécessaires aux processus biologiques, mais ils sont tous toxiques à des concentrations élevées, cela est dû à leur capacité oxydative à former des radicaux libres et à leur capacité à remplacer les métaux essentiels dans les enzymes, interrompant ainsi leur activité normale. D'autres métaux ne sont pas essentiels et s'accumulent dans différents

(20)

organismes. De ce fait, ils sont toxiques même à faible concentration. Le mercure, le chrome, le plomb, l'arsenic, le cuivre, le cadmium, le cobalt, le zinc, le nickel, le béryllium, le manganèse et l'étain sont les métaux lourds les plus toxiques selon l'Agence de protection de l'environnement des États-Unis (EPA) (Velásquez et Dussan, 2009). Les métaux lourds peuvent être classés en deux groupes principaux :

 Essentiel : Parmi ces éléments, les oligoéléments (Cu, Zn, Ni, Cr, Co, Fe, Mn, V, Mo, Sn) sont essentiels à l'activité biologique, dans des concentrations acceptables. Ces métaux sont toxiques s'ils dépassent les exigences.

 Non essentiel : comme le Pb, le Cd, l'As et l’Hg, ils ne présentent aucune fonction biologique et sont particulièrement toxiques et nocifs pour les organismes vivants (Raikwar et al., 2008 ; N'Guessan et al., 2009).

I.1.2. Toxicité des métaux lourds

I.1.2.1.Toxicité des métaux lourds sur l’être humain

Les métaux lourds présentent des risques pour la santé humaine car ils sont de nature persistante et ont tendance à s'accumuler dans les systèmes biologiques (Sharma et Agrawal, 2005). Ils pénètrent dans le corps humain principalement par trois voies : inhalation directe, ingestion et contact cutané (Rahman et al., 2019).

Les métaux lourds peuvent perturber les fonctions métaboliques du corps de plus, ils peuvent s'accumuler dans des organes vitaux tels que le foie, le cœur, les reins, le tissus adipeux et le cerveau, et affectent donc notre système nerveux central, ou ils peuvent être déposés dans nos systèmes circulatoires et perturbent le fonctionnement normal de nos organes internes et bloquent les activités vitales dans le corps. Ils peuvent agir aussi en tant que cofacteurs dans d'autres maladies et peuvent causer des dommages à l'ADN, donc des effets mutagènes, tératogènes et carcinogènes seront probablement induits (Rehmane et al., 2018 ; Rahmanet

al., 2019).

I.1.2.2. Toxicité des métaux lourds sur les plantes

La phytotoxicité des métaux lourds peut résulter d'altérations de nombreux processus physiologiques provoquées au niveau cellulaire / moléculaire par l'inactivation des enzymes, blocage des groupes fonctionnels des molécules métaboliquement importants, en remplaçant ou en substituant des éléments essentiels et perturber l'intégrité de la membrane. La production accrue d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) est une autre conséquence de l’intoxication par les métaux lourds due à une interférence avec les activités de transport d'électrons, notamment celle des membranes des chloroplastes (Rascio et Navari-Izzo, 2011). La toxicité des métaux lourds pour les plantes varie selon les espèces de plantes, les

(21)

métaux spécifiques, la concentration, la forme chimique, la composition du sol et le pH. Par exemple, le Cd modifie la composition lipidique de la membrane plasmique racinaire de Pisumsativum, autres métaux tels que Cd, Ni et Cu affectent les fonctions photosynthétiques des plantes supérieures, Cu et Zn ont modifié l'activité hydrolytique de chlorophyllase dans les feuilles de riz, alors que les métaux lourds toxiques tels que le Cd, le Ni, le Co, le Cr, le Zn et le Pb seraient à l'origine d'un déficit en Fe, soit en diminuant l'absorption, soit en provoquant une immobilisation dans les racines (Sharma et Agrawal, 2005).

I.2. Le cuivre

I.2.1. Présentation du cuivre

Le cuivre est un élément familier de la vie dans les pays développés. Le symbole chimique du cuivre Cu provient du mot latin cyprium, qui a ensuite été raccourci en cuprum, ce qui signifie l'île de Chypre. Le cuivre trouvé à l'état pur dans la nature, appelé cuivre natif, est connu depuis l'Antiquité (Johanson, 2006). Le cuivre est un métal naturel avec un numéro atomique de 29 et une masse de 63,546 appartenant à la troisième série de transition du tableau périodique, ainsi que d'autres métaux essentiels tels que le fer, le zinc, le molybdène, et le sélénium (OMS 1998). Le Cu n'existe que sous la forme de deux isotopes stables (63Cu et 65Cu) et de deux isotopes radioactifs (54Cu et 67Cu avec des demi-vies extrêmement courtes, 13 et 62 h, respectivement) (Stern, 2010). Le cuivre (Cu) est au 26ème rang en abondance dans la lithosphère, se produit dans quatre états d'oxydation (Cu0, Cu1+, Cu2+ et Cu3+), Cu2+ étant le plus commun dans l'environnement. L'ion Cu2+ a une grande affinité pour la liaison à la matière organique (Bini et Bech, 2014).

I.2.2. Origine du cuivre

Le Cu est un métal largement répandu dans la nature sa concentration moyenne dans la croûte terrestre serait comprise entre 45 et 70 mg/kg, elle est de l’ordre de 50 ppm. On peut le trouver dans la nature soit sous forme de cuprite (88,8%) soit sous forme d’oxyde de sulfure. Il est particulièrement abondant dans les roches mafiques et intermédiaires. Les teneurs les plus élevées (>80 mg/kg) seraient observées dans les roches magmatiques basiques riches en minéraux ferromagnésiens. Les roches granitiques contiennent en général beaucoup moins de Cu. Parmi les roches sédimentaires, les argiles et les schistes présentent des concentrations plus fortes que les roches détritiques (grés, sable). Il est au contraire très peu représenté dans les roches carbonatées (Kebir, 2012). Cependant, le développement des activités industrielles et minières a contribué à l'augmentation de la présence de Cu dans les écosystèmes. Le cuivre est également ajouté aux sols provenant de différentes activités humaines, notamment

(22)

l'extraction et la fusion des minerais contenant du cuivre. Les activités minières génèrent une grande quantité de résidus qui se déposent à la surface (Nagajyoti et al., 2010).

I.2.3. Propriétés physicochimiques du cuivre

Le cuivre est un métal de transition, rouge-brun, malléable et ductile, excellent conducteur électrique et thermique (Gaetke Chow, 2003 ; Vinot, 2004 ; Amiard, 2011), relativement résistant à la corrosion, il réagit à chaud avec les acides oxydants, le chlore, le soufre et le phosphore. Il est oxydé à froid par l'air humide contenant du gaz carbonique ce qui donne le vert-de-gris. Il fournit des composés toxiques sous l'action des acides faibles, en particulier de l'acide acétique (Vinot, 2004).

I.2.4. Propriétés biologiques du cuivre

Le cuivre est un oligo-élément essentiel trouvé en petite quantité dans une variété de cellules et de tissus et à l’état de trace dans la composition des protéines et pour les processus cellulaires tels que la voie hydrolytique, le transport du fer, la respiration et la défense contre le stress oxydatif (Pontel et Soncini, 2009). Le cuivre est aussi un cofacteur de plus de 30 enzymes connues chez des organismes supérieurs. Les exemples les plus connus sont la lysyl oxydase, impliquée dans la réticulation du collagène, la tyrosinase, essentielle à la synthèse de la mélanine, la dopamine β-hydroxylase de la voie des catécholamines, le cytochrome c oxydase en tant qu’accepteur d’électrons terminal de la chaîne respiratoire et le superoxyde dismutase, nécessaire à la défense contre les dommages oxydatifs. Les membres d'une autre classe de protéines de cuivre, telles que les plastocyanines et les azurines, agissent en tant que transporteurs d'électrons. En fonction du type de coordination du cuivre sur la protéine, le potentiel d'oxydo-réduction peut varier entre 200 et 800 mV (Solioz et al., 2010).

I.2.5. Utilisation du cuivre

Le cuivre est l’un des métaux les plus employés à cause de ses propriétés physiques et de sa conductibilité électrique et thermique. Il est utilisé par la civilisation humaine depuis plus de 10 000 ans, et devenu le centre de recherches scientifiques renouvelées (Gaetke et chow, 2003 ; Amiard, 2011). Le cuivre est le troisième métal le plus utilisé au monde, les plus importants étant les sulfures, les oxydes et les carbonates de cuivre (Bini et Bech, 2014). Le cuivre est principalement utilisé dans les applications électriques (65%) et comme armes de construction (25%), de transport et à des fins militaires et comme un composant important de l'or blanc et autre alliage utilisés pour les bijoux d'imitation. Le cuivre est largement utilisé dans la fabrication de textiles, de peintures antisalissure, et trés largement employé dans la fabrication de matériels électriques (dynamos, transformateurs), d'appareils de plomberie, de tuyaux, de pièces de monnaie, d'ustensiles de cuisine, de conteneurs et de munitions. Le Cu

(23)

est également utilisé dans les produits dentaires, dans les dispositifs intra-utérins, dans les cosmétiques, dans les équipements industriéls, et dans l’automobile…etc. Les composés du cuivre sont présents dans les produits de préservation du bois, les pesticides, les fongicides et les algicides. Le sulfate de cuivre peut être utilisé comme micronutriment dans les engrais agricoles et comme additif alimentaire (Gaetke et chow, 2003 ; Amiard, 2011; Bini et Bech, 2014).

L’effet antimicrobien du cuivre est reconnu depuis longtemps et a une application potentielle dans le secteur de la santé en tant que mécanisme permettant de réduire la contamination de l'environnement et de prévenir ainsi les infections associées aux soins de santé (O'gorman et Humphreys, 2012).

I.2.6. Toxicité du cuivre

Le cuivre sous sa forme ionique est un oligo-élément requis pour la plupart des organismes procaryotes et eucaryotes, y compris l'Homme. Il est nécessaire en petites quantités, le cuivre peut facilement devenir toxique en surplus. Cette toxicité est principalement due aux propriétés intrinsèques de cuivre, car les ions de cuivre libres subissent un cycle des réactions redox alternant Cu(I) et Cu(II). Cela résulte aussi dans le transfert d'électrons au peroxyde d'hydrogène et la génération concomitante des radicaux hydroxyles qui attaquent facilement et endommagent les biomolécules cellulaires (Santo et al., 2011).

I.2.6.1. Toxicité du cuivre sur les plantes

Le cuivre est considéré comme un micronutriment pour les plantes et les algues supérieures et a un impact direct sur la photosynthèse. C'est un constituant du donneur d'électrons primaire du photosystème I, la plastocyanine de la protéine Cu (Sharma et Agrawal, 2005). De nombreux auteurs ont également décrit le Cu comme constituant de photosystème II (PSII). Cependant, des concentrations élevées de Cu inhibent le transport d'électrons photosynthétique, en particulier dans les PSII. De plus, une déficience en Cu et une toxicité en Cu interfèrent avec la biosynthèse des pigments et des lipides et par conséquent, avec l'ultrastructure des chloroplastes, influençant ainsi négativement l'efficacité de la photosynthèse (Barón et al., 1995). Le cuivre joue un rôle important dans l'assimilation du CO2 et la synthèse de l'ATP. Un excès excessif du Cu inhibe la respiration, affecte négativement le métabolisme de l'azote et des protéines. Il affecte également les enzymes impliquées dans la réduction des nitrates, entraînant une diminution de l'azote total, provoque une réduction du contenu en chlorophylle et inhibe certaines fonctions photosynthétiques des feuilles par destruction des chloroplastes. Un excès de Cu inhibe la photophosphorylation et diminue l'intégrité de la membrane (Demirevska-Kepovaa et al., 2004).

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L'excès de Cu dans le sol joue un rôle cytotoxique, induit un stress et cause des dommages aux plantes. Cela entraîne un retard de croissance des plantes et une chlorose des feuilles. (Nagajyoti et al., 2010 ; Islam et al., 2016). Le stress oxydatif perturbe les voies métaboliques et endommage les lipides membranaires, les protéines, les pigments et les acides nucléiques, entraînant ainsi une réduction spectaculaire de la croissance et de la productivité, entraînant finalement la mort des plantes (Hegedϋs et al., 2001).

I.2.6.2. Toxicité du cuivre sur les êtres humains

Le cuivre est nécessaire au développement du tissu conjonctif, des membranes nerveuses et des os (Fraga, 2005). L'absorption de doses excessivement élevées de Cu entraîne une irritation et une corrosion graves des muqueuses, des lésions capillaires étendues, des lésions hépatiques et rénales et une irritation du système nerveux central suivie d'une dépression (Sharma et Agrawal, 2005). La toxicité peut provoquer la maladie de Wilson (Seth et al., 2005), cette maladie est caractérisée par une erreur innée du métabolisme dans laquelle le défaut héréditaire réside dans l'incorporation de Cu2+ dans l'apocerplasmine pour former la céruloplasmine et également une capacité réduite du foie à excréter du Cu dans la bile, ce qui entraîne une accumulation de Cu dans les tissus du foie, du cerveau, des reins et de la cornée, entraînant des lésions organiques (Sharma et Agrawal, 2005).

L'intoxication aiguë au Cu entraîne des effets gastro-intestinaux caractérisés par des douleurs abdominales, des crampes, des nausées, des diarrhées et des vomissements (Fraga, 2005). La toxicité chronique du Cu est rare chez l'Homme et affecte principalement le foie, car il s'agit du premier site de dépôt de Cu après son entrée dans le sang. La toxicité du Cu se manifeste généralement par le développement d'une cirrhose du foie avec des épisodes d'hémolyse et des lésions aux tubules rénaux, au cerveau et à d'autres organes (Gaetke et chow, 2003).

I.2.6.3. Toxicité du cuivre sur les microorganismes

Pour de nombreux organismes le cuivre est très toxique lorsqu’il est en excès ; parce que l'accumulation d'ions de cuivre ou la libération intracellulaire d'ions de cuivre libres à partir de protéines provoque des dommages cellulaires (Santo et al., 2011).

En effet, le cuivre catalyse facilement les réactions entraînant la production de radicaux hydroxyles et provoquant la peroxydation des lipides et l’oxydation des protéines. Les ions de cuivre libres sont capables d’oxyder des groupes sulfhydryle et d’inactiver les protéines en endommageant les amas Fe-S dans les hydratases cytoplasmiques. Chez E. coli et B. subtilis le Cu entraine une augmentation de l'acquisition de fer et de l’assimilation de soufre à la fois,

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cela est dû à la diminution de la stabilité des amas de fer et de soufre pendant leur biogenèse (Dupont et al., 2011; Santo et al., 2011).

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Chapitre II :

Bioremédiation du

cuivre

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Un certain nombre de méthodes sont actuellement appliquées pour éliminer les ions des métaux lourds. Le plus commun comprend: précipitation, échange d’ions, procédés membranaires, évaporation et filtration. L'application de ces méthodes est souvent associée à des difficultés technologiques telles que la gestion des déchets générés. L'application des méthodes biotechnologiques utilisant du matériel biologique tel que des micro-organismes et des plantes peut constituer une alternative aux méthodes chimiques et physiques actuellement appliquées (Zabochnicka-Świątek et Krzywonos, 2014). Les micro-organismes sont une solution envisageable car ils peuvent atteindre différents processus de transformation et d'immobilisation (Velásquez et Dussan, 2009).

La bioremédiation des métaux lourds à l'aide des micro-organismes a fait l'objet de beaucoup d'attention ces dernières années, non seulement en tant que nouveauté scientifique, mais également pour son application potentielle dans l'industrie.

La réponse des microorganismes aux métaux lourds toxiques est importante compte tenu de l’intérêt porté à la remise en état des sites pollués (Abd-Elnaby et al., 2011). Les matières biologiques peuvent se lier aux métaux par le biais de processus de biosorption et de bioaccumulation (Zabochnicka-Świątek et Krzywonos, 2014) ; c’est-à-dire les microorganismes absorbent les métaux de manière active (bioaccumulation) et / ou de manière passive (biosorption). De nombreux micro-organismes ont mis au point des mécanismes de détoxification à contrôle chromosomique ou extra-chromosomique afin de surmonter les effets néfastes des métaux lourds (Abd-Elnaby et al., 2011). Ces dernières années, les travaux de recherche ont porté principalement sur les méthodes biologiques de traitement des effluents, dont certaines sont en cours de commercialisation.

Les technologies biologiques présentent trois principaux avantages pour l’élimination des polluants; premièrement, les processus biologiques peuvent être transportés in situ sur le site contaminé, deuxièmement, les technologies de bioprocédés sont généralement sans danger pour l’environnement (pas de pollution secondaire) et troisièmement, elles sont rentables (Vijayaraghavan et Yun, 2008).

II.1. Les méthodes biologiques d’élimination du cuivre II.1.1. Biosorption

La biosorption est définie comme un processus dans lequel la biomasse microbienne est utilisée pour retenir, éliminer ou récupérer les métaux lourds (Baltazar et al., 2018). La biomasse la plus couramment utilisée à cette fin peut provenir d’algues, de levures, de champignons et de bactéries (Ahluwalia et Goyal, 2007; Baltazar et al., 2018). La biosorption est un processus métaboliquement passif qui utilise la biomasse morte et qui

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permet aux micro-organismes d’absorber les contaminants sur leur structures cellulaires (Velásquez et Dussan, 2009 ; Zabochnicka-Świątek et Krzywonos, 2014 ; Cornu et al., 2017). La biosorption implique divers mécanismes, notamment l'échange d'ions, la complexation de surface et l’adsorption physique (Cornu et al., 2017) :

II.1.1.1. Echange d'ions

Il s'agit d'une réaction chimique réversible consistant à échanger des ions mobiles contre d'autres ions de même charge se produisant sur des contenants solides des groupes fonctionnels pertinents (Zabochnicka-Świątek et Krzywonos, 2014). Il joue un rôle de premier plan dans la biosorption des métaux en raison des interactions électrostatiques qui se produisent entre la charge positive du métal ionique libre et la charge négative de la paroi cellulaire microbienne (Cornu et al., 2017).

II.1.1.2. Complexation

Les ions des métaux lourds sont liés aux groupes fonctionnels présents dans les membranes cellulaires (Zabochnicka-Świątek et Krzywonos, 2014).

II.1.1.3. Adsorption physique

L’dsorption physique est déclenchée par une interaction intermoléculaire - forces de van der Waals. Dans le cas de la physisorption, aucune liaison chimique ne se produit (Zabochnicka-Świątek et Krzywonos, 2014).

Les fonctions anioniques présentes dans les peptidoglycanes, les acides teichoïques et les acides teichuroniques sont les principaux responsables du caractère anionique et de la capacité de liaison des métaux avec la paroi cellulaire chez les bactéries à Gram positif et les peptidoglycanes, les phospholipides et les lipopolysaccharides chez les bactéries à Gram négatif (Ahalya et al., 2003 ; Vijayaraghavan et Yun, 2008). Il a été rapporté que le pH, la température et les concentrations initiales de métaux et de biosorbants ont un effet important sur l’efficacité du processus de biosorption (Andreazza et al., 2010).

Parmi les bactéries les plus utilisées pour la biosorption des métaux en raison de leur grande résistance et de leurs capacités d'adsorption Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas et Stenotrophomonas pourraient éliminer le cuivre efficacement (Pugazhendhi et al., 2018). L'élimination du métal par la biosorption porte plusieurs avantages principalement en raison de leur sélectivité élevée, des taux d'éliminations élevés, des coûts bas, minimisation des volumes des boues chimiques, possibilité de traiter des volumes importants et efficacité élevée pour les effluents à faible concentration (Baltazar et al., 2018).

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II.1.2 Bioaccumulation

La bioaccumulation est un processus qui permet de lier des métaux toxiques ou des substances organiques à l’intérieur d’une structure cellulaire. L'activité biologique de la biomasse est essentielle au processus de bioaccumulation. Les cellules adsorbent les contaminants par les fonctions métaboliques et donc ils doivent être en vie (Zabochnicka-Świątek et Krzywonos, 2014).

La bioaccumulation peut être divisée en deux étapes. Au premier stade, les ions des métaux sont liés à la surface de la cellule. Cette partie du processus est métaboliquement passive et est identique au mécanisme de biosorption. Ensuite, les ions des métaux sont transportés dans la cellule. La deuxième partie de ce processus est inclue dans le transport du substrat à l'intérieur des cellules par le plus souvent le transport de système actif, il n’est possible que lorsque les cellules sont métaboliquement actives (Chojnacka, 2010 ; Zabochnicka-Świąteket Krzywonos, 2014).

La bioaccumulation ou le transport intracellulaire dépendant du métabolisme peut s'accompagner de symptômes toxiques. Dans certains cas, le transport intracellulaire est dû à une augmentation de la perméabilité de la membrane résultant d'interactions toxiques. Avec plusieurs métaux, la majeure partie de l’accumulation dans la biomasse microbienne est basée en surface et ne nécessite que peu ou pas d’absorption intracellulaire, sauf par diffusion (Gadd, 1990). Une fois à l'intérieur des cellules, les ions métalliques peuvent être préférentiellement situés dans des organites spécifiques et / ou liés aux structures intracellulaires (protéines telles que la métallothionéine) (Chojnacka, 2010). Les bactéries les plus impliquées dans le processus d’accumulation du cuivre sont les suivantes :

Bacillus cereus, Bacillus subtilis (Costa et Duta, 2001), Bacillus sphaericus (Velásquez et Dussan, 2009), Enterococcus hirae, Mycobacterium scrophulaceum, Streptococcus lactis, Vibrio alginolyticus, Xanthomonas campestris (Saxena et al., 2002), Escherichia coli (Brown et al., 1995), Pseudomonas cepacia (Savvaidis et al., 2003).

II.2. Mécanisme de résistance

Le cuivre est un oligo-élément essentiel pour la plupart des organismes, mais il est toxique à des niveaux plus élevés. Pour maintenir la concentration appropriée en cuivre intracellulaire, les organismes procaryotes, en particulier les bactéries, ont mis au point diverses stratégies, notamment la séquestration passive intra et extracellulaire, la détoxification enzymatique et les systèmes de résistance active au cuivre (figure1). Ces mécanismes de résistance compliqués constituent sans aucun doute la base de l'utilisation des micro-organismes pour améliorer la bioremédiation des milieux contaminés par le cuivre (Huang et al., 2019). La

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résistance au cuivre a été démontrée chez plusieurs bactéries telles que E. coli, Pseudomonas, Enterococcus hirae et Xanthomonas campestris (Saxena et al., 2002).

Figure 1:Protéines impliquées dans la résistance au cuivre chez lesbactéries(Bondarczuk et Piotrowska-Seget, 2013).

Abréviations: CM cytoplasmic membrane, PS periplasmic space, OM outer membrane. Assignment of particular proteins: multicopper oxidase (CueO), RND (CusA), MFP (CusB), OMF (CusC), copper chaperone (CusF), ATPase (CopA).

II.2.1. Systèmes d’efflux

Chez les bactéries, la plupart des Cu+ ATPases confèrent une tolérance au Cu en provoquant un efflux cytoplasmique du métal, ceux-ci constituent le sous-groupe P1B-1 de la famille de transporteurs ATPases de type P. L'efflux de métaux se produit en présence d'ATP lorsque les chaperons cytoplasmiques du Cu+ livrent l'ion aux deux sites de transport de Cu+ transmembranaires (González‐Guerrero et al., 2010), censés interagir de manière électrostatique avec le domaine de liaison au cuivre cytoplasmique amino-terminal de leurs ATPases (Ladomersky et Petris, 2015).

Bien qu'un certain nombre de types différents de protéines d'exportation de cuivre aient été identifiés chez les bactéries, les plus répandus sont les ATPases de type P1B exportatrices de cuivre. Des exemples de ces protéines comprennent CopA d’E. coli, CtpV de Mycobacterium tuberculosis, CopAl et CopA2 de Pseudomonas aeruginosa et CopA et GolT de Salmonella typhimurium. La fonction principale de ces protéines est d'empêcher l'accumulation cytoplasmique de cuivre en exploitant l'énergie dérivée de l'hydrolyse de l'ATP pour pomper le Cu à travers la membrane cellulaire. Dans le cas des bactéries à Gram positif, le cuivre est

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exporté à travers la membrane plasmique, alors que chez les bactéries à Gram négatif, le cuivre est exporté à travers la membrane interne vers l'espace périplasmique. La distribution de cuivre à ces exportateurs est facilitée par les chaperones de cuivre (Ladomersky et Petris, 2015).

II.2.2. Séquestration du cuivre

D'autres mécanismes de détoxification du cuivre chez les bactéries comprennent la séquestration du cuivre via des protéines analogues à la métallothionéine riches en cystéine. Les métallothionéines sont relativement rares chez les bactéries. La mieux caractérisée de ces protéines est le MymT de la famille des Mycobacteriaceae, qui confère une tolérance au cuivre chez Mycobacterium tuberculosis et une protection contre les espèces réactives de l’oxygène. La protéine CusF périplasmique d’E. coli peut également fonctionner comme un tampon de cuivre en plus de son rôle dans l'apport de cuivre au complexe CusBC pour l'exportation à travers la membrane externe. CueP est une autre protéine récemment identifiée dans le périplasme de Salmonella typhimurium et dont la capacité de liaison au cuivre est censée protéger contre la toxicité du cuivre dans ce compartiment (Hodgkinson et Petris, 2012 ; Ladomersky et Petris, 2015).

II.2.3. La détoxification enzymatique

Le périplasme bactérien est le principal site d’utilisation du cuivre chez les bactéries, il contient plusieurs enzymes connues dépendantes du cuivre. Des exemples notables comprennent les superoxydes dismutases contenant du cuivre / zinc (protéines SodC), qui protègent certaines bactéries pathogènes contre les anions superoxyde générés par l'éclatement respiratoire des cellules phagocytaires (Hodgkinson et Petris, 2012).

Les bactéries ont développé aussi une oxydase multi-cuivre qui protège contre la toxicité du cuivre. Les membres de la famille des oxydases multi-cuivre contiennent généralement quatre atomes de cuivre, chacun participant à l'oxydation d'un électron. L'oxygène est réduit en eau pour compléter le cycle de réaction. Les oxydases multi-cuivre bactériennes qui sont connues pour conférer une tolérance au cuivre incluent CueO chez E. coli et S. typhimurium et MmcO chez M. tuberculosis (Grass et Rensing, 2001; Ladomersky et Petris, 2015).

Cependant le CueO d’Escherichia. Coli présente une fonction biologique qui pourrait être la détoxification périplasmique du cuivre ainsi qu’il protège la phosphatase alcaline contre les réactions toxiques induites par le Cu. Ces propriétés font de CueO un système modèle intéressant pour l’étude des oxydases multi-cuivre bactériennes (Grass et Rensing, 2001).

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Partie II :

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Chapitre III :

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Jijel, durant la période mai- juin de l’année 2019. L’objectif de ce travail était d’isoler et d’identifier les différentes bactéries de l’eau de mer, d’étudier la capacité de chaque souche d’accumuler le cuivre après traitement par différentes concentrations du cuivre.

III.1. Matériel

III.1.1. Présentation des sites de prélèvement

Les échantillons d’eaux utilisés au cours de notre étude expérimentale sont prélevés à partir de deux sites différents. Le premier site est au niveau de la plage d’Arabta et exactement dans la plage de Zaway qui reçoit les déchets industriels de l’usine de la tannerie de Jijel (figure 2). Le deuxième site est au niveau de la plage Kotama, c’est l’une des plages qui reçoit les déchets domestiques de la population jijéliènne (figure 3).

Figure 2 : Localisation du 1er site de prélèvement (la plage de Zaway).

Figure 3 : Localisation du 1er site de prélèvement (la plage Kotama).

III.1.2. Prélèvement d’échantillon d’eau :

Le prélèvement des échantillons a été effectué le 28/04/ 2019 au niveau des deux sites déjà cités et présentés dans les figures 4 et 6. Les échantillons d’eaux ont été recueillis dans des flacons en verre stériles de 250 ml et qui ont été rempli de 3 /4 de leurs volumes totaux (figure 5 et 7). Les prélèvements se font à une profondeur de 15 à 20 cm de la surface de l’eau, en évitant la pénétration de l’air, les échantillons sont ensuite transférés rapidement au laboratoire dans une glacière. Les analyses bactériologiques sont débutées dans un délai maximal de 24 heures après la prise des échantillons.

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Figure 4 : Photo du 1er site de prélèvement. Figure 5 : Aspect du 1er échantillon.

Figure 6 : Photo du 2ème site de prélèvement. Figure 7 : Aspect du 2ème échantillon.

III.1.3. Milieux de culture

 Bouillon nutritif : pour l’ensemencement des Pseudomonas, Escherichia coli, Salmonella.  Gélose nutritif : milieu d’isolement non sélectif.

 PCA : pour le dénombrement de la flore aérobie mésophile totale (FTAM).  Chapman : pour l’isolement des Staphylocoques.

 Eva Litsky : pour faire le test confirmatif des Streptocoques fécaux.  Rothe : pour la recherche des Streptocoques fécaux.

 Columbia : pour l’identification des Streptocoques.  Viande fois : pour la culture de Clostridium.  BCPL : recherche des Coliformes.

 VBL : pour faire le test confirmatif des Coliformes thermotolérants.  Urée indole : pour la recherche d’Escherichia coli.

 SFB : pour la recherche des Entérobactéries.

 Hektoen : pour l’isolement et la différentiation des Entérobactéries.  King A et B : pour la recherche de Pseudomonas.

III.1.4. Produits chimiques et réactifs  Alune de fer.

 Sulfite de sodium.  Sulfate de cuivre.

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 Acide nitrique.

 Les colorants de la coloration de Gram. III.1.5. Matériel et appareillage

 Autoclave (pbibrand).

 Bain marie (Gerhart et memmert).  Microscope (Motic).

 Vortex (VWR vv3).  Papiers filtres (Wattman).  Etuve (memmert).

 Balance analytique (KERN).  Spectrophotomètre (analytikjena).

 Spectrophotomètre d’adsorption atomique (SAA) (SHIMADZU).  Hautte (KIT LAB).

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III.2.1. Etude microbiologique de l’eau III.2.1.1. Préparation des dilutions

Les dilutions (10-1, 10-2, 10-3) de la solution mère ont été réalisées par la méthode classique en utilisant de l’eau physiologique stérile (NaCl 9%), en ajoutant 1 ml d’eau à analyser dans un tube contenant 9 ml d’eau physiologique, le tube est agité par des mouvements de rotation ou au moyen d’un Vortex (Jean).

III.2.1.2. Isolement des bactéries

III.2.1.2.a. Recherche et dénombrement de la flore aérobie mésophile totale (FTAM) La FTAM est une microflore complexe qui constitue un élément majeur de la population bactérienne. Il s’agit de microorganismes qui se développent sur milieu ordinaire ce qui exclut un nombre important de germes.

Pour le dénombrement de cette flore il s’agit de faire ensemencer en masse la gélose PCA avec 1 ml de la solution mère et de ses dilutions dans des boites de pétri. Les boites sont ensuite incubées à 37°C pendant 72 h.

III.2.1.2.b. Recherche des Coliformes totaux

Les Coliformes totaux sont des bâtonnets aéro-anaérobies facultatifs, capables de se multiplier en présence des sels biliaires ou d’autres agents de surface ayants des propriétés équivalentes (inhibitrices) et capables de fermenter le lactose avec production de gaz à 35-37°C (Chérif Ibrahima, 2006).

Cette recherche comporte deux tests successifs :  Test présomptif

Des tubes de bouillon lactose au BCPL double concentration avec cloche du durham sont ensemencés avec 10 ml de chaque dilution, ces tubes sont ensuite incubés 24 à 48 h/37°C. Les résultats positifs sont exprimés par un virage de couleur au jaune et production de gaz dans la cloche.

 Test confirmatif

A partir des tubes positifs, d’autre tubes de milieu VBL double concentration sont repiqués et incubés à 37°C pendant 24-48 h. La présence d’un trouble plus production du gaz dans la cloche confirme les résultats présomptifs positifs.

III.2.1.2.c. Recherche des Coliformes thermotolérants

Les Coliformes thermotolérants (ou fécaux) présentent les mêmes caractéristiques que les coliformes totaux mais après incubation à 44°C. Escherichia coli est de loin la plus fréquente

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Klebsiella, et Enterobacter (Chérif Ibrahima, 2006).

A partir des tubes BCPL présomptif positif, d’autres tubes de milieu VBL sont ensemencés et incubés à 44°C pendant 24 ± 2 h; si après 24 heures ou moins, il y a une formation de gaz, cela indique la présence de Coliformes thermotolérants (Brasilia, 2013).

Pour la mise en évidence d’Escherichia coli, des tubes contenant l’eau peptonée exempte d’indole sont ensemencés à partir des cultures positives sur milieu VBL et incubés à 44°C pendant 24 h. Après l’incubation, 3 gouttes de réactif Kovacs sont ajoutées. Un test positif se traduit par la formation d’un anneau rouge sur la surface du milieu.

La pureté des souches a été vérifiée sur la gélose nutritive par plusieurs repiquages en stries (2 à 3 fois).

III.2.1.2.d. Recherche des Streptocoques fécaux

Les Entérocoques intestinaux (ou Streptocoques fécaux) sont capables d’hydrolyser l’esculine en présence de bile qui caractérise la présence d’antigène D de LANCEFIELD (Chérif Ibrahima, 2006).

 Test présomptif

Ce test est effectué par ensemencement d’un milieu de ROTHE. Ce milieu contient de l’azide de sodium qui inhibe la plupart des microorganismes (inhibiteur des phénomènes respiratoires). Ce milieu est peu favorable à la croissance des Streptocoques fécaux et la plupart des autres bactéries n’y cultivent pas. Le milieu de ROTHE est cependant moins sélectif que le milieu de LITZKY, ce qui le fait utiliser d’abord, les germes “adaptés” à l’effet inhibiteur de l’azide étant ensuite à même de s’adapter à la présence d’éthyle violet (Jean). 10 ml de la solution mère et de ses dilutions sont ensemencés dans 10 ml de milieu puis incubés à 37°C pendant 24 à 48 h, un résultat positif se traduit par l’apparition d’un trouble bactérienne.

 Test confirmatif

L’addition d’éthyle violet au milieu de Rothe le rend sélectif des seuls streptocoques fécaux. Ce milieu est ensemencé à partir des tubes positifs du test présomptif avec une anse de platine. Après 24h d’incubation (ou 48 h) à 37°C, un résultat positif se traduit par l’apparition d’un trouble bactérienne et parfois la formation d’un culot violet ou blanc (Jean).

La pureté des souches a été vérifiée sur la gélose Columbia par plusieurs repiquages (2 à 3 fois) en stries sur les boites de pétri préalablement coulées et solidifiées.

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Ce groupe regroupe plusieurs espèces telles que Clostridium perfringens. Ils sont ainsi dénommés car ils sont capables de réduire les sulfites présents dans le milieu de culture en sulfures ; ceux-ci se combinent avec un sel de fer pour donner du sulfure de fer noir (Delarras, 2010). La recherche de Clostridium sulfitoréducteur passe par plusieurs étapes : -Chauffage de 5 ml de l’eau à analyser à 80 °C pendant 10 minutes, puis refroidissement brutal sous l’eau de robinet pour la destruction de la forme végétative ;

-Addition de 2.5 ml d’alun de fer et 6.25 ml de sulfite de sodium au milieu viande foie qui est déjà fondu ;

-Addition de 15 ml de la gélose VF aux échantillons de l’eau préalablement chauffés. Incubation à 37 °C pendant 48 h.

III.2.1.2.f. Recherche des Staphylocoques

Les Staphylocoques sont des germes qui peuvent vivre en saprophytes dans la nature ; en bactéries commensales sur la peau et les muqueuses de l’Homme et des animaux et en bactéries pathogènes dont S. aureus est l’espèce majeure, d’origine humaine, animale et environnementale ou non spécifiques (Delarras, 2010). A partir des cultures positives sur le bouillon nutritif, l’ensemencement du milieu Chapman par la méthode de strie a été réalisé. La pureté des souches a été vérifiée par plusieurs repiquages sur le milieu Chapman, un test de catalase est ensuite réalisé pour confirmer la présence de la catalase.

III.2.1.2.g. Recherche des Entérobactéries

A partir des cultures positives sur le milieu d’enrichissement SFB, le milieu Hektoen est ensemencé en faisant des stries à la surface de la gélose, puis incubation à 37°C pendant 24 h. La pureté des souches a été vérifiée par plusieurs repiquages sur le milieu Hektoen.

III.2.1.2.h. Recherche de Pseudomonas

Des espèces de Pseudomonas produisent des pigments dont les deux principaux sont la pyocyanine et la pyoverdine qui peuvent être mise en évidence sur les géloses King A et King B respectivement (Delarras, 2014). A partir des cultures positives sur bouillon nutritif, les milieux King A et King B sont ensemencés en faisant des stries à la surface de chaque milieu avec l’anse de platine. L'incubation est réalisée à 37°C pendant 24 h.

III.2.1.3. Identification microscopique des souches bactériennes

Des frottis bactériens à partir des cultures pures des souches isolées sont destinés vers un examen microscopique.

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III.2.2.1. Préparation des différentes concentrations de cuivre

Une série de dilution a été préparée à partir de la concentration mère de cuivre (1M), dont les concentrations suivantes : 10, 100, 300, 500 mM.

III.2.2.2. Préparation des cultures bactériennes

Des suspensions bactériennes dans l’eau physiologique sont préparées à partir des cultures jeunes des différentes souches bactériennes, la turbidité est ensuite ajustée à la DO entre 0.08 et 0.1 par le spectrophotomètre.

Pour chaque souche bactérienne, 5 tubes de bouillon nutritif sont ensemencés avec 100µl de la suspension bactérienne, dans chaque tube 50µl de chaque concentration de cuivre est additionnée (0, 10, 100, 300 et 500mM). Les tubes sont ensuite incubés à 37°C pendant 24 h. Après incubation, la croissance des souches bactériennes en présence des différentes concentrations de cuivre ainsi que le témoin a été vérifiée sur des boites de Pétri préalablement coulées avec la gélose nutritive.

III.2.2.3. Mesure de la croissance bactérienne III.2.2.3.a. Croissance sur milieu liquide

Après repiquage sur des boites de pétri contenant de la gélose nutritive à partir des bouillons nutritifs présentant un trouble, la croissance bactérienne a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre piloté par un ordinateur à la longueur d’onde 630 nm en utilisant le bouillon nutritif ainsi que les bouillons nutritifs avec les différents concentrations du cuivre comme des blancs.

III.2.2.3.b. Croissance sur milieu solide

La croissance des différentes souches bactériennes en présence de différentes concentrations du cuivre a été vérifiée sur les boites de Pétri contenant la gélose nutritive.

III.2.3. Dosage du cuivre III.2.3.1. Digestion

Des suspensions bactériennes dans l’eau physiologique sont préparées à partir des cultures positives sur la gélose nutritive, la turbidité est ajustée à la DO 0.2 en utilisant un spectrophotomètre à la longueur d’onde 630 nm. Les suspensions sont ensuite séchées à 90°C pendant 24 h. Après le séchage, 1 ml de H2O2 et 2 ml de HNO3 sont ajoutés aux tubes et placées sous l’abri de la lumière à la température ambiante pendant 48 h. Après, les suspensions ont été filtrées avec des filtres du Wattman à 0.22 nm et portés à un volume de 10 ml avec de l’eau physiologique. Les échantillons ainsi prêtes ont été destinées vers une analyse par un spectrophotomètre d'absorption atomique à la flamme (Warren, 1994).

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La spectrométrie d’absorption atomique (SAA) est une méthode d’analyse quantitative s’adressant essentiellement aux métaux lourds. Elle est basée sur la propriété des atomes, de l’élément à doser, qui peuvent absorber des radiations de longueurs d’ondes déterminées. La solution de l’élément à analyser est nébulisée dans une flamme, ce qui provoque successivement ; l’évaporation du solvant, la vaporisation de l’élément sous forme de combinaisons chimique et en fin la dissociation de ces combinaisons avec production d’atomes libres à l’état fondamental (Rodier, 2009).

Le dosage du cuivre accumulé par les différentes souches bactériennes a été effectué à l’aide d’une spectrophotométrie d’absorption atomique à flamme (SAA) de type SHIMADZU AA-6200 (figure 8) piloté par ordinateur au niveau du laboratoire de Biologie générale N°13 de l’université de Jijel.

Figure 8 : Photo du Spectrophotomètre d’absorption atomique

En spectrométrie d’absorption atomique avec flamme, la solution analysée est aspirée dans un nébuliseur qui la transforme en brouillard fin. Ce brouillard est ensuite aspiré vers le bruleur, où la flamme évapore l’eau et casse les molécules en atomes isolés.

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Chapitre IV :

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IV. 1. Evaluation de la qualité microbiologique de l’eau de mer

Les résultats de l’analyse microbiologique de l’eau de mer de la plage Kotama qui reçoit les rejets domestiques (D) et l’eau de la plage Zaway qui reçoit les rejets industriels (I) de l’usine de la tannerie de Jijel ont montré l’existence des FTAM, des Coliformes, des Streptocoques, des Clostridium sulfitoréducteurs, des Staphylocoques, des Entérobactéries, et l’absence d’Escherichia coli et de Pseudomonas.

IV.1.1. Germes aérobies mésophiles totales (FTAM)

Les résultats de dénombrement des FTAM dans les eaux de mer (D) et (I) sont présentés respectivement par les tableaux I et II.

Tableau I : Résultat de dénombrement des germes totaux dans l’eau de mer (D).

Dilutions Nombre des colonies/boite

Solution mère indénombrable

10-1 indénombrable

10-2 Indénombrable

10-3 72

Tableau II : Résultat de dénombrement des germes totaux dans l’eau de mer (I).

Dilutions Nombre des colonies/boite

Solution mère Indénombrable

10-1 Indénombrable

10-2 109

10-3 93

D’après ces résultats, le nombre des FTAM dans l’eau de mer (D) est égale à 72.103

UFC/ml et dans l’eau de mer (I), le nombre des FTAM est égal à 18 363,636 UFC/ml.

IV.1.2. Coliformes totaux, Coliformes thermotolérants et Streptocoques fécaux

Les résultats obtenus ont montré que les eaux analysées contiennent les Coliformes totaux, Coliformes thermotolérants et les Streptocoques fécaux.

(44)

IV.1.3. Clostridium sulfitoréducteur

Le test de la présence de ces bactéries dans les eaux analysées est positif, ce résultat se traduit par un noircissement du milieu de culture indiquant la réduction des sulfites et la production des sulfures de fer et la production de gaz (figure 09).

Figure 09: Présentation des spores de Clostridium sulfitoréducteur. IV.1.4. Staphylocoques

Le résultat de la recherche de ces germes est positif et se traduit par l’apparition des colonies et le virage de la couleur du milieu de rouge au jaune.

Les résultats de test de catalase sont positives (figure 10).

Figure 10 : Résultat de test catalase. IV.1.5. Entérobactéries

Les résultats obtenus montrent la présence des Entérobactéries dans les eaux de mer analysées, qui se traduit par l’apparition des colonies et le virage du milieu au saumon et au vert. Les Entérobactéries sont trouvées dans les eaux où ils participent à la dégradation des matières organiques.

IV.2. Résultats de l’identification microscopique

Les résultats de la coloration de Gram des souches bactériennes isolées à partir de l’eau de mer (D) et l’eau de mer (I) sont représentés dans le tableau III.

(45)

Tableau III : Résultats de coloration de Gram. Eau de mer (D)

Souche Forme Photo Type de Gram

Les Coliformes Bacille Négatif

Les Streptocoques Cocci Positif

Les Staphylocoques Cocci Positif

La S1 d’Entérobactérie Bacille Négatif La S2 d’Entérobactérie Bacille Négatif

(46)

Eau de mer (I)

Souche Forme Gram Type de Gram

Les Coliformes Bacille Négatif

Les Streptocoques Cocci Positif

Les Staphylocoques Cocci Positif

La S1 d’Entérobactérie Bacille Négatif La S2 d’Entérobactérie Bacille Négatif

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