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La biotechnologie
La biotechnologie moderne, fondée sur la manipulation de l’ADN, permet de modifier et/ou d’analyser des gènes de manière spécifique.
Elle permet aussi de les transférer entre des organismes aussi distincts que des bactéries, des plantes et des animaux.
Elle se base sur le génie génétique, qui regroupe les techniques permettant de manipuler l’ADN in vitro. On peut ainsi fabriquer de l’ADN recombinant, une molécule d’ADN contenant des séquences nucléotidiques provenant d’au moins deux sources différentes.
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Le clonage d’ADN
Pour pouvoir travailler avec un seul gène (qui ne représente qu’une très petite fraction du génome), les scientifiques ont mis au point la technique du clonage de gène. On peut alors obtenir un grand nombre de copies identiques du gène cloné.
Ce clonage se base sur l’utilisation de bactéries (E. coli) et de leurs plasmides (= molécules d’ADN circulaires assez petites, se répliquant de manière indépendante dans les bactéries). On commence par isoler un plasmide dans lequel on insère un ADN étranger : le plasmide devient une molécule d’ADN recombiné. Ce plasmide recombiné est replacé dans une bactérie. Lorsque celle-ci va se multiplier (elle va former un clone de cellules identiques), elle va également multiplier le plasmide qui porte le gène étranger : on dit que le gène est cloné. On obtient ainsi un grand nombre de copies de ce gène.
A partir de ce clone, on peut récupérer le gène en grande quantité mais aussi, si l’ADN cloné code pour une protéine, cette protéine que les bactéries auront synthétisée.
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Le clonage d’un gène
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Les enzymes de restriction
Les enzymes de restriction sont des enzymes qui coupent l’ADN à une séquence bien précise. Elles sont produites par les bactéries pour se protéger de l’ADN étranger provenant d’autres organismes (ex phages).
On connaît environ 40 enzymes de restriction qui reconnaissent chacune une séquence différente, appelée site de restriction. Ceux-ci sont souvent palindromiques.
Certaines enzymes coupent l’ADN au niveau de la même base sur les deux brins, on obtient alors de fragments à bout franc. Plus souvent, ces enzymes coupent les deux brins de façon décalée, on obtient alors des fragments avec une extrémité cohésive. Si on ajoute un autre fragment avec les mêmes extrémités cohésives, les bases vont s’apparier. On peut refaire des liaisons covalentes en utilisant une ADN ligase.
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Le clonage d’un gène dans un plasmide
Le plasmide = un vecteur de clonage, il porte un gène de résistance (qui indique si la bactérie a incorporé le plasmide) et un gène qui servira à voir si le plasmide est recombiné
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L’identification de clones contenant le gène recherché
Pour cribler toutes les colonies contenant un plasmide recombiné, on utilise l’hybridation moléculaire : on ajoute une sonde nucléique dont la séquence est complémentaire d’un fragment du gène recherché. Celle- ci peut aller s’hybrider (= reconnaître et se lier à sa séquence complémentaire) au gène d’intérêt après dénaturation de l’ADN des bactéries. La dénaturation est la séparation des deux brins de l’ADN, par exemple par la chaleur.
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Les banques d’ADN
La procédure de clonage à partir d’un mélange de fragments issus de l’ensemble du génome d’un organisme produit des milliers de plasmides recombinés différents insérés dans des bactéries différentes = une banque génomique. Des phages sont parfois utilisés comme vecteurs à la place des plasmides car ils peuvent contenir de plus grands fragments d’ADN étranger.
On peut aussi créer un autre type de banques d’ADN à partir des ARNm extraits de cellules. Une transcriptase inverse est utilisée pour fabriquer un ADN simple brin à partir de ces ARNm. Une ADN polymérase synthétise alors le deuxième brin d’ADN : on obtient de l’ADNc (ADN complémentaire) qu’on peut insérer dans des vecteurs de clonage. Il s’agit alors d’une banque d’ADNc, représentant tous les gènes exprimés par les cellules d’intérêt à un moment donné.
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L’amplification d’ADN in vitro par PCR
La PCR (polymerase chain reaction) permet de faire rapidement de
nombreuses copies (=
amplifier) d’une séquence d’ADN in vitro.
C’est la répétition cyclique de trois étapes qui produit une
amplification
exponentielle de cette séquence. Elle fait intervenir une ADN
polymérase résistante à la chaleur et une paire
d’amorces,
complémentaires des extrémités de la séquence à amplifier.
http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm http://bcs.whfreeman.com/mga2e/ch08/mga0801.swf
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L’analyse des fragments de restriction
L’analyse des fragments de restriction permet de détecter des différences dans la séquence nucléotidique des molécules d’ADN.
Après restriction, le mélange des fragments d’ADN est soumis à une électrophorèse sur gel, qui sépare les différents fragments en fonction de leur taille. Après ajout d’un colorant qui s’intercale dans la double hélice de l’ADN, on peut visualiser les différents fragments sous UV.
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L’analyse des fragments de restriction
Après restriction, le mélange des fragments d’ADN est soumis à une électrophorèse sur gel, qui sépare les différents fragments en fonction de leur taille. Après ajout d’un colorant qui s’intercale dans la double hélice de l’ADN, on peut visualiser les différents fragments sous UV.
matériel de départ = le gène purifié
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Le Southern blot
matériel de départ = le génome entier
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Le projet génome humain
La séquence complète d’un génome humain a été obtenue en 2003, par un consortium international.
Il a pu être finalisé en trois étapes : - la cartographie de liaison génétique - la cartographie physique
- le séquençage de l’ADN
D’autres génomes ont également été séquencés complètement :
la souris (Mus musculus) la levure de la bière
(Saccharomyces cerevisiae)
la drosophile (Drosophila melanogaster)
le nématode Coenorhabtidis elegans
plusieurs bactéries dont E. coli le riz (Oryza sativa)
…
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Le projet génome humain
C. Venter a proposé une autre approche, basée sur l’automatisation du séquençage de l’ADN à haut débit. C’est cette approche qui a permis le séquençage du génome de la bactérie Haemophilus influenzae et qui est maintenant utilisée pour le séquençage des autres génomes.
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La technique du séquençage par terminaison de PCR
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Les microdamiers à ADN (DNA arrays)
Les microdamiers à ADN
permettent de suivre l’expression de tous les gènes dans une cellule à un moment donné.
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Les applications de la biotechnologie en médecine
- L’identification de tous les gènes humains permet maintenant la détection des mutations qui causent les maladies génétiques.
- On peut aussi détecter, grâce à la PCR, la présence, même en quantité infime, d’organismes pathogènes, comme le virus du SIDA.
- On peut réaliser des empreintes génétiques, par exemple pour identifier un criminel ou pour réaliser des tests de paternité.
- Finalement, la thérapie génique permettra à l’avenir d’apporter au patient la version non mutée du gène qui lui fait défaut.
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Les applications en agriculture de la biotechnologie
Les plantes transgéniques contiennent un ou plusieurs gènes étrangers destinés à leur apporter une propriété qu’elles ne possédaient pas.
ex un gène de résistance à un herbicide, un gène de résistance à la sécheresse,…