FACULTE DE MEDECINE DE TOURS Année 2014 N° Thèse pour le DOCTORAT EN MEDECINE

Académie d’Orléans –Tours Université François-Rabelais

FACULTE DE MEDECINE DE TOURS

Année 2014 N°

Thèse pour le

DOCTORAT EN MEDECINE Diplôme d’Etat

Par

Elodie MIQUELESTORENA épouse STANDLEY Née le 04 août 1984 à Bordeaux (33)

Présentée et soutenue publiquement le 11 décembre 2014

Jury

Président de Jury : Monsieur le Professeur Serge GUYÉTANT Membres du jury : Monsieur le Professeur Jean-Christophe PAGÈS

Monsieur le Professeur Ephrem SALAMÉ Madame le Docteur Anne DE MURET Monsieur le Docteur Éric PIVER

PROFIL D’EXPRESSION DU MIR-152 ET DU MIR-122 DANS LES CARCINOMES HÉPATOCELLULAIRES

ASSOCIÉS AU VIRUS DE L’HÉPATITE C

1 5 mai 2014

UNIVERSITE FRANCOIS RABELAIS

FACULTE DE MEDECINE DE TOURS

DOYEN

Professeur Patrice DIOT

VICE-DOYEN Professeur Henri MARRET

ASSESSEURS

Professeur Denis ANGOULVANT, Pédagogie Professeur Mathias BUCHLER, Relations internationales Professeur Hubert LARDY, Moyens – relations avec l’Université Professeur Anne-Marie LEHR-DRYLEWICZ, Médecine générale Professeur François MAILLOT, Formation Médicale Continue

Professeur Philippe ROINGEARD, Recherche

SECRETAIRE GENERALE Madame Fanny BOBLETER

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DOYENS HONORAIRES Professeur Emile ARON (†) – 1962-1966 Directeur de l’Ecole de Médecine - 1947-1962 Professeur Georges DESBUQUOIS (†)- 1966-1972

Professeur André GOUAZÉ - 1972-1994 Professeur Jean-Claude ROLLAND – 1994-2004

Professeur Dominique PERROTIN – 2004-2014

PROFESSEURS EMERITES Professeur Alain AUTRET Professeur Jean-Claude BESNARD

Professeur Patrick CHOUTET Professeur Guy GINIES Professeur Olivier LE FLOCH Professeur Etienne LEMARIE Professeur Chantal MAURAGE Professeur Léandre POURCELOT

Professeur Michel ROBERT Professeur Jean-Claude ROLLAND

PROFESSEURS HONORAIRES

MM. Ph. ANTHONIOZ - A. AUDURIER - Ph. BAGROS - G. BALLON - P.BARDOS - J. BARSOTTI - A. BENATRE - Ch. BERGER - J. BRIZON - Mme M. BROCHIER - Ph. BURDIN - L. CASTELLANI -

J.P. FAUCHIER - B. GRENIER - A. GOUAZE - M. JAN - P. JOBARD - J.-P. LAMAGNERE - F. LAMISSE - J. LANSAC - J. LAUGIER - G. LELORD - G. LEROY - Y. LHUINTRE - M. MAILLET -

Mlle C. MERCIER - E/H. METMAN - J. MOLINE - Cl. MORAINE - H. MOURAY - J.P. MUH - J. MURAT - Mme T. PLANIOL - Ph. RAYNAUD - JC. ROLLAND - Ch. ROSSAZZA - Ph. ROULEAU -

A. SAINDELLE - J.J. SANTINI - D. SAUVAGE - M.J. THARANNE - J. THOUVENOT - B. TOUMIEUX - J. WEILL

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SERMENT D’HIPPOCRATE

E n présence des Maîtres de cette Faculté, de mes chers condisciples

et selon la tradition d’Hippocrate,

je promets et je jure d’être fidèle aux lois de l’honneur et de la probité dans l’exercice de la Médecine.

Je donnerai mes soins gratuits à l’indigent,

et n’exigerai jamais un salaire au-dessus de mon travail.

Admis dans l’intérieur des maisons, mes yeux ne verront pas ce qui s’y passe, ma langue taira

les secrets qui me seront confiés et mon état ne servira pas à corrompre les mœurs ni à favoriser le crime.

Respectueux et reconnaissant envers mes Maîtres, je rendrai à leurs enfants

l’instruction que j’ai reçue de leurs pères.

Que les hommes m’accordent leur estime si je suis fidèle à mes promesses.

Que je sois couvert d’opprobre et méprisé de mes confrères

si j’y manque.

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Re R em me er rc ci ie em m en e n ts t s

A Monsieur le Professeur Jean-Christophe Pagès, je vous remercie de m’avoir confié ce travail, de m’avoir accueillie dans votre laboratoire et de m’avoir guidée dans l’apprentissage du raisonnement scientifique.

A Monsieur le Professeur Serge Guyétant, merci de me faire l’honneur de présider mon jury de thèse. Je vous remercie pour votre patience et votre disponibilité à toute épreuve face à toutes mes demandes pour ce travail, les précédents et ceux à venir. Merci pour vos conseils avisés et vos qualités pédagogiques, j’ai beaucoup appris à vos côtés.

A Monsieur le Professeur Ephrem Salamé, je vous remercie de m’avoir fait l’honneur de faire partie de mon jury de thèse.

A Madame le Docteur Anne De Muret, je suis heureuse de te compter parmi les membres de mon jury de thèse. Je te remercie pour tous les bons conseils et l’aide que tu m’as apportés durant mon internat. C’est un vrai plaisir de travailler avec toi.

A Monsieur le Docteur Eric Piver, merci pour ton aide durant tout ce travail et d’avoir pris le temps de m’apprendre à travailler avec les cultures cellulaires.

7 A Madame le Docteur Christine Collin, je te remercie pour ta grande disponibilité, ta gentillesse et toute l’aide que tu m’as apportée pour ce travail. Merci pour la formation pratique que tu m’as apportée en biologie moléculaire. J’aimerais t’exprimer ici toute ma reconnaissance.

Aux médecins anatomopathologistes de Trousseau, Bretonneau, Orléans et Chartres, merci d’avoir su partager avec moi votre savoir et votre amour de la discipline. Apprendre à vos côtés a été une vraie chance.

Aux techniciens et techniciennes d’anatomopathologie et de biochimie/biologie moléculaire, merci pour votre aide et votre soutien dans ce travail de thèse mais aussi dans le travail du quotidien.

A Monsieur le Professeur Philippe Roingeard et l’équipe INSERM U966, je vous remercie de votre accueil. Travailler au sein d’une équipe aussi dynamique et agréable est un vrai plaisir.

Un remerciement tout particulier à Madame le Docteur Catherine Gaudy-Graffin pour son implication dans la collection des sérums.

A Monsieur le Docteur Pascal Bourlier, merci pour votre aide précieuse dans le recueil de consentements de patients.

Aux patients qui ont accepté, le plus souvent avec plaisir et enthousiasme, de participer à cette étude.

A tous les supers co-internes que j’ai eus au fil de mes stages et avec qui j’ai passé d’excellents moments : Benjamin Chaigne futur grand professeur interniste, Hélène Longuet, Hélène Vegas, Alisson Millon, Flore Delalande, Caroline Vasseur, Charlotte Gardair, Charlotte Mauroy, Clémence Guillaume, Bérengère Ponroy, Claire Frank-Martel.

A mes « vieilles » copines, Cali, Tatèch, Jos, Nathou, Fanny et Mathilde. On ne se voit pas beaucoup mais rien n’a changé, à chaque fois qu’on se voit c’est que du bonheur ! Je vous adore les filles !!

A Charline et Laurence, mes copines de fac. Je suis heureuse de vous compter parmi mes amies de longue date et vous remercie pour votre soutien tout au long de ces années. Je vous souhaite d’être heureuses et comblées dans vos vies personnelles et professionnelles.

A mes amis Carina, Pierre, leur bébé à venir, Lauranne, Adrien et leur petite Louise. Merci pour les soirées et bons moments passés ensemble. Je suis heureuse que nos chemins se soient croisés et j’espère que ce n’est que le début d’une grande amitié.

A Bénédicte, merci d’avoir été là dans les petits et grands moments de ma vie. Te compter parmi mes proches amis est une vraie chance. Je suis heureuse que tu aies trouvé « ton Thierry », je vous souhaite beaucoup de bonheur à toi et ton Alex !!!

A mon danseur Guillaume, merci pour toutes ces discussions et les super soirées de fête. Je te souhaite de vivre heureux et amoureux !

8 Un grand merci à mon papa et à ma belle-maman Paulette pour leur présence à mes côtés.

Je vous remercie pour les valeurs que vous m’avez enseignées et de m’avoir appris à mériter ce que je voulais. Malgré les obstacles, je suis très heureuse des moments que nous partageons désormais ensemble.

Papa, je tiens de toi toute la rigueur et l’application que je mets dans mon travail. Je suis heureuse que nous nous soyons retrouvés.

Paulette, merci d’être là aujourd’hui, malgré tout.

Je vous aime.

A ma belle-famille, merci de m’avoir intégrée si facilement et si naturellement à votre petit cercle.

A mes grands-parents, Patti et Françoise, un grand merci à vous aussi pour votre présence.

Merci pour tous les bons moments passés ensemble. A tous nos rêves d’ailleurs partagés.

A ma tante Isabelle et mon oncle Guy, merci pour votre votre présence dans les moments importants. C’est toujours un immense plaisir de vous retrouver.

A ma sœur Aurélie, je te souhaite de trouver le bonheur et d’être heureuse.

A ma sœur Emilie, Babe, je crois pouvoir dire que la vie ne nous a pas toujours gâtées, mais nous avons su faire face, grandir ensemble et rester soudées. A deux nous avons été plus fortes et je réalise la chance que j’ai de t’avoir eu à mes côtés dans les moments douloureux mais aussi dans les moments heureux. Tu es quelqu’un d’extraordinaire, je suis très fière d’être ta sœur ! Toi aussi tu iras loin et tu auras la vie que tu mérites... tu es une mickette, tu ne peux pas échapper à ton destin !!!

Je t’aime.

A Thierry, mon mari, tu es le plus beau cadeau que la vie m’ait réservé. Ton amour sans faille me donne confiance et m’aide à avancer dans chacun de mes/nos projets. Merci de me soutenir dans tout ce que j’entreprends. L’amour qui nous lie est indescriptible, tu me complètes, tu es mon âme-sœur et chaque jour je réalise la chance que j’ai de t’avoir dans ma vie. A notre passion commune pour la photographie et les voyages et à tous nos projets futurs. Je t’aime « to the moon and back ».

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Ta T ab b le l e de d es s m m at a t iè i èr re es s

LiLissttee ddees s aabbrrévéviaiattiioonnss ...1111 RRésésuumméé ...1122 AbAbssttrraacctt ...1133 I

Innttrroodduuccttiioonn ...1144 I.I. CCaarcrciinnoommee hhééppaattoocceellllululaairiree eett vivirruuss ddee ll’’hhééppaattiittee CC ... 1515

A. Généralités ... 15

B. Physiopathologie ... 18

C. Anatomopathologie ... 19

1. Infection par le virus de l’hépatite C ... 20

2. Carcinome hépatocellulaire ... 21

IIII.. MMiiccrrooAARNRN ... 2525 A. Biogénèse et rôles ... 25

B. miR et cancers ... 26

C. miR-152 ... 27

D. miR-122 ... 28

IIIIII.. MMaattéérriieells s eett mméétthhooddeess ... 2929 A. Collecte des prélèvements ... 29

B. Extraction et dosage des ARN totaux ... 29

C. Transcription inverse et PCR quantitative... 31 IVIV.. OObbjjeeccttiiffss ddee ll’’ééttuuddee ... 3434 ArArttiiccllee ...3355 CoConncclluussiioonn ...5522 BBibiblliiooggrraapphhiiee...5566 AnAnnneexxeess...6611

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T T ab a b le l e d d es e s il i ll lu u st s tr ra at ti io o ns n s

F

FIIGGUURREESS

Figure 1 : Génome et polyprotéine du VHC ... 16

Figure 2 : Algorithme biologique de dépistage de l’hépatite C ... 16

Figure 3 : Histoire naturelle de l’infection par le VHC ... 18

Figure 4 : Mécanismes proposés d’hépatocarcinogénèse induite par le VHC ... 19

Figure 5 : Lésions hépatiques observées au cours d’une infection chronique par le VHC ... 21

Figure 6 : Aspects macroscopiques d’un carcinome hépatocellulaire ... 22

Figure 7 : Aspects microscopiques d’un carcinome hépatocellulaire ... 23

Figure 8 : Immunohistochimie d’un carcinome hépatocellulaire ... 24

Figure 9 : Maturation des microARN ... 26

Figure 10 : MicroARN de la famille miR-148/152 ... 28

Figure 11 : Analyse de l’intégrité des ARN ... 30

Figure 12 : Etapes d’un cycle de PCR quantitative par SYBR Green ... 31

Figure 13 : Courbes de fluorescence obtenues lors d’une PCR ... 32

Figure 14 : PCR quantitative des miR en deux étapes ... 33

TATABBLELEAAUUXX Tableau 1 : Score Metavir ... 20

Tableau 2 : Amorces de PCR ... 33

ANANNENEXEXESS Annexe 1 : Fibromètre® ... 62

Annexe 2 : Information sur la conservation et l’utilisation d’éléments et produits du corps humain ... 63

Annexe 3 : Transcription inverse et PCR quantitative des microARN ... 64

Annexe 4 : Transcription inverse et PCR quantitative du génome du VHC ... 65

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Li L is st te e de d es s ab a br ré év vi ia at t io i on n s s

ADN : acide désoxyribonucléique ADNc : ADN complémentaire ARN : acide ribonucléique

CHC : carcinome hépatocellulaire Ct : cycle threshold

HPS : hémalun-phloxine-safran IL : interleukine

IFN : interféron

IRM : imagerie par résonance magnétique kb : kilobase

NASH : stéatohépatite non alcoolique NK : cellules Natural Killer

nt : nucléotides

OMS : Organisation Mondiale de la Santé pb : paires de bases

PBH : ponction-biopsie hépatique

PCR : réaction de polymérisation en chaîne RIN : RNA integrity number

RT : reverse transcription TDM : tomodensitométrie Th : lymphocyte T helper TNF : tumor necrosis factor UTR : untranslated region VHB : virus de l’hépatite B VHC : virus de l’hépatite C

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Profil d’expression du miR-152 et du miR-122 dans les carcinomes hépatocellulaires associés au virus de l’hépatite C

Introduction : Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la troisième cause de mortalité par cancer dans le monde. L’infection par le virus de l’hépatite C (VHC) en est une des principales étiologies. Les mécanismes moléculaires qui sous-tendent l’hépatocarcinogénèse ne sont pas encore totalement identifiés mais des études ont démontré une implication de certains microARN (miR). Ces études rapportent des résultats parfois discordants, notamment con- cernant la contribution des miR-152 et miR-122. Ceci nous a conduits à évaluer l’expression de ces deux microARN dans le foie sain, des CHC et leur foie adjacent non tumoral respectif, pour des patients infectés et non infectés par le VHC.

Matériels et méthodes : Notre étude rétrospective a porté sur l’expression des miR-152 et - 122. Nous avons réalisé une transcription inverse puis une PCR quantitative sur des échantil- lons de foie normal (n=11), de CHC et de foie non tumoral adjacent de patients infectés (n=11) ou non (n=12) par le VHC. Cette étude a été complétée par la détection du génome du VHC dans les prélèvements des patients VHC+.

Résultats : Nous avons observé une surexpression des miR-152 et miR-122 dans les CHC et leur foie non tumoral adjacent comparé au foie sain. Au sein du groupe de prélèvements carcinomateux, le miR-152 était plus exprimé dans les échantillons VHC+ que dans les VHC-.

Il n’a pas été observé d’influence de l’étiologie du CHC sur l’expression du miR-122. Nous avons pu détecter la présence du génome viral C dans tous les prélèvements tumoraux et non tumoraux des patients ayant une charge virale sérique détectable au moment du dia- gnostic de CHC.

Discussion : Notre étude confirme que les miR-152 et -122 ont une expression modifiée dans le tissu hépatique au cours de la transformation carcinomateuse. Nous avons noté que le génome du VHC était toujours détectable dans les prélèvements hépatiques et que du fait de l’augmentation particulière de l’expression du miR-152 chez les patients VHC+, il serait intéressant de connaître l’origine de cette apparente corrélation. La dérégulation de l’expression du miR-122 semble, quant à elle, indépendante de l’étiologie du CHC.

L’identification d’une fonction des deux microARN dans les processus pathologiques nécessi- tera des études supplémentaires.

Mots clés :

Carcinome hépatocellulaire, CHC, miR-152, miR-122, virus de l’hépatite C, VHC

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Expression profile in hepatocellular carcinoma of miR-152 and miR- 122 in relation to HCV infection

Purpose: Hepatocellular carcinoma (HCC) is the third-leading cause of cancer-related death.

HCC is common in the course of chronic Hepatitis C virus (HCV) infection constituting the main burden for this disease. The molecular mechanisms underlying HCC are not yet clearly identified, and might involve certain microRNA (miR). However, since discordant results were reported concerning the expression of miR-152 and miR-122 in HCC, we aimed at mea- suring the levels of the two miRs in the normal liver, in HCC and adjacent tissues, for a series of HCV-infected and non-infected patients.

Methods: The present study is a retrospective analysis of miR-152 and miR-122 expression.

It was performed by RT-qPCR using, normal liver (n=11), fibrotic and carcinomatous frozen samples of HCV-infected (n=11) and non-infected (n=12) patients. The study was completed by a RT-qPCR to detect HCV genome in the liver samples of patients HCV+.

Results: As compared to normal liver, miR-152 and miR-122 appeared more expressed in HCC and adjacent liver. For HCC, miR-152 was more expressed in HCV+ versus HCV- samples.

Conversely the etiology of the HCC had no detectable influence on miR-122 expression. For patients with circulating HCV genomic RNA, we were able to detect HCV-replication signa- ture in all HCC and non-tumor samples.

Conclusions: Our study confirms that abnormal expression of miR-152 and miR-122 is ob- served in livers with altered function and harboring hepatocarcinoma transformation. Inte- restingly, we noticed that HCV genome was still detectable in liver samples and appeared associated to miR-152 but not miR-122 expression. Further studies are awaited to precise the role of the two molecules in the pathological process.

Key words

Hepatocellular carcinoma, HCC, miR-152, miR-122, hepatitis C virus, HCV

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I I n n t t r r o o d d u u c c t t i i o o n n

15

I I. . C Ca ar r ci c in no om me e hé h ép pa at to oc ce el ll lu ul la ai ir re e e et t v vi ir ru us s d de e l l’ ’ hé h é pa p at ti it te e C C

A.A. GGéénnéérralaliittésés

Le cancer du foie est la 5^ème cause de cancer et la 3^ème cause de mortalité par cancer dans le monde. En 2008, 748 300 nouveaux cas ont été diagnostiqués et 695 900 décès ont été attribués au cancer du foie ^1,2. Parmi les cancers primitifs du foie, le carcinome hépato- cellulaire (CHC) est le type histologique le plus fréquent, représentant 70 à 90% ³.

La majorité des CHC survient dans un contexte d’hépatopathie chronique, la plupart se développant sur un foie cirrhotique. Les infections par les virus des hépatites B (VHB) et C (VHC) représentent la principale cause de CHC dans le monde, suivies par l’intoxication éthy- lique chronique et, en Afrique et Asie de l’Est l’ingestion d’aflatoxine. L’augmentation de l’incidence de l’obésité et des désordres métaboliques contribue au développement de stéa- tohépatites non alcooliques (NASH) qui ont également été identifiées comme associées aux CHC ^3–5.

A l’heure actuelle, l’incidence des CHC va dans le sens d’une augmentation aux Etats- Unis et en Europe centrale, ceci pouvant notamment être expliqué par l’augmentation du nombre de personnes obèses dans ces pays mais également par l’histoire naturelle des in- fections par le VHC contractées dans les années 70-80. Inversement, certaines zones identi- fiées comme étant à haut risque de CHC voient leur incidence diminuer, en raison de la mise en place de politiques actives d’une vaccination préventive contre le VHB ^3,4.

Le virus de l’hépatite C, responsable d’environ 130 à 170 millions d’infections dans le monde et de 350 000 morts par an, est un hepacivirus de la famille des Flaviviridae ^3,6. Il s’agit d’un virus hépatotrope dont le génome de 9,6 kb est constitué d’un ARN simple brin de polarité positive. Cet ARN comporte un cadre principal de lecture ouvert dont la traduc- tion aboutit à la formation d’une polyprotéine et un cadre secondaire décalé d’une base. La maturation traductionnelle et post-traductionnelle de la polyprotéine, grâce à des protéases cellulaires et virales, conduit à la production de dix protéines virales ⁶ (Figure 1).

A l’heure actuelle, 6 génotypes (1 à 6) ont été dénombrés, chacun comportant plu- sieurs sous-génotypes. Le génotype 1 est le plus répandu en Europe. Le fort taux de réplica- tion ainsi que l’absence d’activité correctrice de l’ARN polymérase sont à l’origine d’une grande diversité génomique virale.

Le virus est transmis, le plus souvent, par voie sanguine (transfusion de produits san- guins, usage de drogues par voie intraveineuse, hémodialyse chronique et plus rarement accident d’exposition au sang), rarement par transmission mère-enfant et exceptionnelle- ment par voie sexuelle. Dans 30% des cas, l’origine de l’infection reste inconnue ⁴.

Selon les recommandations de la Haute Autorité de Santé, le dépistage de l’infection par le VHC repose sur la réalisation d’un test immuno-enzymatique à la recherche d’anticorps anti-VHC qui, s’ils sont positifs, sont contrôlés par une nouvelle sérologie réalisée sur un 2ème prélèvement. La positivité de ce 2^ème test doit faire rechercher l’ARN viral par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) quantitative ou qualitative à laquelle est associé un bilan hépatique (Figure 2) ⁷.

16 Figure 2 : Algorithme biologique de dépistage de l’hépatite C proposé par

l’INPES en 2007.

Figure 1 : Génome et polyprotéine du VHC selon Scheel et al..

Les sites d’action des protéases cellulaires sont représentés par des triangles blanc et bleus, ceux des protéases virales par des triangles rouge et verts.

17 Actuellement, le traitement des patients infectés repose sur une bithérapie dont l’objectif est d’obtenir une réponse virologique soutenue, définie par un virus indétectable 24 semaines après la fin du traitement. Cette bithérapie associe la ribavirine et l’interféron- pégylé. Ceci permet 80% de réponse virologique soutenue pour les génotypes 2 et 3 contre seulement 50% pour les génotypes 1, 4 et 6. L’apparition récente d’antiviraux à action ciblée, tels que les inhibiteurs de protéase ou les inhibiteurs de polymérase, a permis d’obtenir une réponse virologique soutenue de 70 à 80% chez des patients infectés par un virus de géno- type 1 ⁸.

La surveillance des patients porteurs du VHC est indispensable pour permettre le dé- pistage le plus précoce possible des complications de l’infection chronique (cirrhose, insuffi- sance hépatocellulaire, CHC) et ainsi contribuer à diminuer le risque de décès lié au CHC. En effet, le risque d’évolution d’une fibrose vers la cirrhose doit être régulièrement évalué, la cirrhose étant le facteur de risque principal du CHC. De même, la détection précoce d’un CHC permettra la mise en place d’un traitement curatif adapté.

Cette surveillance repose, d’une part sur l’évaluation de l’atteinte hépatique par des méthodes non invasives (bilan hépatique, Fibromètre®, Fibrotest®, Fibroscan®) (Annexe 1 : Fibromètre®) ou invasives (ponction-biopsie hépatique), d’autre part sur le dépistage du carcinome hépatocellulaire. Celui-ci est effectué tous les 6 mois par un dosage sérique de l’α-fœtoprotéine couplé à un examen d’imagerie (échographie le plus souvent, ou encore scanner ou imagerie par résonance magnétique) ⁹. En cas de suspicion de CHC, le diagnostic est ensuite confirmé par la réalisation d’un examen d’imagerie, le scanner (TDM) ou l’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec injection de produit de contraste. En l’absence d’un ou des 2 critères diagnostiques du CHC sur ce premier examen (hypervascula- risation au temps artériel et lavage au temps portal), un second examen d’imagerie est in- dispensable, en l’absence de contre-indication. Enfin, si ces 2 critères diagnostiques ne sont pas obtenus avec le second examen d’imagerie, une ponction-biopsie hépatique dirigée par échographie est réalisée.

La réalisation régulière de ce dépistage permet, le plus souvent en France, de porter un diagnostic précoce, chez un patient asymptomatique. Le CHC peut cependant être dé- couvert plus tardivement devant l’apparition d’une altération de l’état général, un ictère ou une ascite chez un patient non suivi pour une hépatopathie chronique.

Le traitement de référence du CHC reste la transplantation hépatique. Celle-ci est proposée aux patients de moins de 65 ans répondant aux critères de Milan (1 nodule ≤ 5 cm ou 2 à 3 nodules ≤ 3 cm). Cependant, en raison de la pénurie de greffons et d’un temps d’attente parfois long, la chimioembolisation ou la radioembolisation artérielles, l’ablation percutanée par radiofréquence ou encore la résection chirurgicale restent des options thé- rapeutiques lors des réunions de concertation pluridisciplinaires ¹⁰.

18

BB. . PPhhyysisiooppatathhoollooggiiee

Chez l’Homme, la réponse immunitaire, à la fois innée et adaptative, qui s’installe en réponse à une infection par le VHC permet une élimination du virus dans 20 à 50 % des cas ⁴. Ainsi, dans 50 à 80% des cas, l’infection persiste, induisant une infection chronique (Figure 3).

Le VHC n’étant pas un virus cytolytique, les lésions hépatiques observées lors de l’infection virale chronique sont attribuables à des mécanismes immunitaires. En effet, la présence du virus dans l’organisme est à l’origine d’une réponse immunitaire à la fois innée avec l’activation des macrophages hépatiques (cellules de Kupffer) et des cellules Natural Killer (NK) mais également adaptative avec l’activation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques et la différenciation des lymphocytes T CD4+ en T helper 1 (Th1) sécrétant des cytokines telles que l’interferon γ (IFN γ) ou le Tumor Necrosis Factor α (TNF α).

Figure 3 : Histoire naturelle de l’infection par le virus de l’hépatite C.

Dans la forme chronique, cet environnement cytokinique pro-inflammatoire a pour conséquence une lyse des hépatocytes ainsi qu’une activation des cellules stellaires (ou cel- lules de Ito) responsables de la sécrétion de protéines de la matrice extracellulaire condui- sant au développement d’une fibrose. A terme, l’architecture du parenchyme hépatique est modifiée avec apparition de nodules de régénération hépatocytaire cernés par des bandes de fibrose cicatricielle, l’ensemble de ces lésions correspondant au stade de cirrhose ¹¹. Le CHC se développe typiquement sur un foie remodelé par la cirrhose, dans un délai de 20 à 30 ans.

La transformation carcinomateuse est un processus multifactoriel faisant intervenir à la fois des facteurs génétiques de la cellule infectée, en particulier des modifications géné- tiques et épigénétiques apparaissant dans les cellules des lésions nécrotico-inflammatoires, mais également des facteurs viraux.

19 La régénération continue et le stress oxydatif subis par les hépatocytes sont associés à une instabilité génomique, des mutations du gène de la protéine TP53 impliquée dans le cycle cellulaire ou de la β-caténine. Ces mutations sont retrouvées dans 11 à 35% et 20 à 40% des CHC, respectivement ^12,13.

Bien que la cirrhose soit un facteur de risque majeur de CHC, la survenue de CHC chez des patients infectés par le VHC en l’absence de cirrhose suggère un rôle carcinogène de certaines protéines virales. Contrairement à des observations faites pour le virus de l’hépatite B, le génome du VHC ne s’intègre pas à celui de la cellule hôte. Il a été démontré que certaines protéines virales avaient des propriétés oncogéniques. Parmi celles-ci, la pro- téine de structure Core est capable d’induire un stress oxydatif et de se lier aux protéines du cycle cellulaire TP53 et Rb, la protéine d’enveloppe (E2) peut promouvoir la survie et la proli- fération cellulaires, les protéines NS3 et NS5A quant à elles peuvent interagir avec certaines protéines du cycle cellulaire ² (Figure 4).

Figure 4 : Mécanismes proposés d’hépatocarcinogénèse induite par le VHC adapté d’après Fung et al..

C

C.. AAnnaattoommooppatathhoolologgiiee

Les indications de la ponction-biopsie hépatique (PBH) ont évolué devant l’apparition de tests non invasifs (Fibromètre®, Fibrotest®, Fibroscan®) et de l’amélioration des perfor- mances des examens d’imagerie. De plus, il s’agit d’un examen invasif non dénué de risques de complications et qui nécessite, pour chaque patient, une évaluation du rapport béné- fice/risque. La PBH reste cependant l’examen de référence, en l’absence de contre- indication, pour l’évaluation de la fibrose et des lésions nécrotico-inflammatoires chez les patients porteurs du VHC pour lesquels un traitement doit être mis en place et apparaît sou- vent comme un élément clé pour le diagnostic de CHC.

20

1.1. IInnffeeccttiioonn ppaarr llee VVHHCC

L’analyse des coupes tissulaires incluses en paraffine puis colorées (hémalun- phloxine-safran ou hémalun-éosine-safran, trichrome vert de Masson, Perls, rouge Sirius) permet de déterminer d’une part le score Metavir, d’autre part la présence ou non d’une autre hépatopathie associée conditionnant la prise en charge et/ou le pronostic.

Le score Metavir est un score histologique réalisé sur ponction biopsie hépatique ou sur des prélèvements chirurgicaux. Il est utilisé pour évaluer la gravité de l’atteinte hépa- tique lors des infections par les virus des hépatites B et C.

Il permet d’évaluer 2 paramètres : l’activité et la fibrose. Pour chacun de ces para- mètres, le pathologiste donne un score selon l’étendue et la gravité des lésions permettant d’orienter le clinicien dans la prise en charge du patient.

L’activité, symbolisée par la lettre « A », comporte 4 grades allant de A0 (pas d’activité) à A3 (activité marquée). La fibrose, symbolisée par la lettre « F », comporte 5 stades allant de F0 (pas de fibrose) à F4 (cirrhose) (Tableau 1).

Tableau 1 : Score Metavir.

L’activité est évaluée par l’importance de l’infiltrat inflammatoire mononucléé au sein des espaces portes et la présence ou non de lésions de nécrose parcellaire péri-portale (piece meal necrosis) et intra-lobulaire.

La fibrose correspond à des bandes collagènes cicatricielles, conséquence de l’inflammation prolongée. Elle se développe initialement en regard des espaces portes et dans la région péri-portale pour s’étendre et réaliser des ponts de fibrose entre les espaces portes (septa). Dans le stade avancé (F4), le parenchyme hépatique est remodelé par une fibrose extensive, annulaire, encerclant des nodules de régénération hépatocytaire et réali- sant des lésions de cirrhose.

Typiquement, l’infection hépatique par le VHC est responsable de lésions hétéro- gènes selon les zones étudiées, d’une activité faible à modérée et d’une stéatose macrova- cuolaire.

21 Figure 5 : Lésions hépatiques observées au cours d’une infection chronique par le VHC.

A : Coloration à l’hémalun-phloxine-safran (HPS), B : Coloration au trichrome vert de Masson.

On observe une inflammation portale et des lésions de nécrose parcellaire modérées associées à une fibrose portale sans septa. Score Metavir : A2F1.

2.2. CCaarrcicinnoomeme hhééppaattoocceelllluullaaiirree

Lorsque le diagnostic de CHC est réalisé, une résection chirurgicale (hépatectomie partielle ou totale) est discutée.

L’examen macroscopique de ces pièces opératoires, permet, d’une part, d’analyser le parenchyme hépatique non tumoral, notamment la présence ou non de cirrhose, et d’autre part, de décrire et évaluer la lésion tumorale, en particulier sa taille, son caractère uni- ou plurifocal, la présence ou non d’une capsule, d’emboles.

22 Il s’agit d’une lésion, le plus souvent nodulaire, bien limitée, parfois encapsulée et parfois remaniée par de la nécrose. Des emboles veineux (hépatiques ou portaux) sont par- fois identifiés.

Figure 6 : Aspects macroscopiques d’un carcinome hépatocellulaire.

A : Pièce d’hépatectomie totale. On observe une lésion sous-capsulaire, blanchâtre, non encapsulée, mal limitée, aux contours lobulés.

B : Pièce d’hépatectomie partielle. On observe une tumeur encapsulée, assez bien limitée, d’aspect hété- rogène blanchâtre et jaunâtre, comportant des remaniements hémorragiques. La lésion vient à proximité de la limite chirurgicale encrée en bleu. Le parenchyme adjacent est remanié par de la cirrhose.

Du point de vue microscopique, les CHC présentent des aspects architecturaux et cy- tologiques variés. Quelques critères sont communs à l’ensemble des CHC : il s’agit de tu- meurs présentant une disparition des espaces portes, une capillarisation des sinusoïdes et faites de cellules atypiques d’allure hépatocytaire. Les cellules tumorales comportent un cytoplasme plus ou moins abondant, éosinophile, un noyau arrondi avec un nucléole visible (Figure 7). Différentes variantes de CHC, à cellules pléomorphes, à cellules claires ou à cel- lules fusiformes ont été décrites.

Trois types d’architectures peuvent être observés. Le type trabéculaire est le plus fréquemment observé dans les CHC bien à moyennement différenciés. Il est composé de cellulaires tumorales organisées en travées plus ou moins épaisses, séparées par des espaces vasculaires capillarisés plus ou moins dilatés. Le type pseudo-glandulaire (ou acineux) est souvent observé dans les tumeurs moyennement différenciées. Il est fait de structures bi- liaires anormales agencées entre les cellules tumorales, l’ensemble ressemblant à des glandes ou à des acini. Dans le type compact, type fréquent dans les tumeurs peu différen- ciées, les espaces vasculaires sont peu ou pas visualisés, donnant un aspect solide à la tu- meur.

23 Figure 7 : Aspects microscopiques d’un carcinome hépatocellulaire.

A : La coloration HPS standard montre un CHC moyennement différencié, encapsulé, composé de travées plus ou moins épaisses de cellules atypiques. Le parenchyme non tumoral adjacent est fibrosé et inflammatoire.

B : La coloration argentique de Gordon Sweet montre une disparition de la trame réticulinique au sein des nodules de CHC alors que celle-ci est conservée dans le foie cirrhotique adjacent.

24 L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a mis en place une classification des CHC selon leur différenciation : bien, moyennement ou peu différencié.

Les tumeurs bien différenciées sont, le plus souvent d’architecture trabéculaire et/ou pseudo-glandulaire, et composées de cellules peu atypiques, avec un rapport nucléo- cytoplasmique augmenté. Les CHC moyennement différenciés sont d’architecture trabécu- laire ou pseudoglandulaires et comportent des cellules comportant un degré d’atypie plus important. Enfin, les CHC peu différenciés sont d’architecture compacte et faits de cellules au noyau augmenté de volume, parfois pléomorphes ¹⁴.

La coloration argentique de la trame réticulinique de Gordon Sweet montre une dé- sorganisation de la trame et un épaississement des travées cellulaires comparé au foie non tumoral.

L’étude immunohistochimique de ces lésions montre, dans la majorité des CHC, un marquage des hépatocytes tumoraux par les anticorps anti-glutamine synthétase, anti- antigène hépatocytaire, anti-α fœtoprotéine. Un marquage par les anticorps anti-glypican 3 et anti-β-caténine (marquage nucléaire) est parfois observé. L’anticorps anti-CD34 témoigne de la capillarisation sinusoïdale et de la néoangiogénèse tumorale (Figure 8).

Figure 8 : Immunohistochimie d’un carcinome hépatocellulaire.

A : Marquage par l’anticorps anti-glutamine synthétase. On observe un marquage plus fort dans le tissu tumoral (à droite) que dans le foie cirrhotique (à gauche).

B : Marquage des sinusoïdes par l’anticorps anti-CD34 témoignant d’une capillarisation de ceux-ci.

C : Marquage par l’anticorps anti-antigène hépatocytaire. L’antigène hépatocytaire est exprimé à la fois par les cellules carcinomateuses et les cellules du foie cirrhotique.

D : Marquage par l’anticorps anti-glypican 3. Le glypican 3 est fortement exprimé dans le nodule tumoral.

25

II I I. . M Mi ic cr r oA o A RN R N

A.A. BBiiooggéénnèèssee eett rrôôlleess

Les microARN (miR) matures sont de petits ARN d’une vingtaine de nucléotides (nt), simple brin, produits par le génome cellulaire (endogènes), non codants.

Ils sont générés dans le noyau à partir de séquences généralement introniques si le transcrit est codant ou bien de séquences introniques ou exoniques si le transcrit est non codant. Dans plus de la moitié des cas, les miR sont groupés (cluster), donnant lieu à un transcrit primaire polycistronique ¹⁵. Ces séquences sont transcrites par l’ARN polymérase II, capées en 5’ et polyadénylées en 3’. Le transcrit ainsi obtenu est appelé pri-miR. Par ingénie- rie, des miR ciblés peuvent être transcrits par l’ADN polymérase III.

Le précurseur subit un premier clivage par le complexe Drosha-DGCR8. La protéine DGCR8 comportant un domaine de liaison aux nucléotides détermine le site de clivage per- mettant le clivage des extrémités 5’ et 3’ par l’endoribonucléase III Drosha. Ce clivage abou- tit à la formation du pré-miR, ARN d’environ 70 nt, partiellement double brin, présentant une conformation en tige-boucle.

Après exportation dans le cytoplasme grâce à l’Exportin 5, le pré-miR subit une matu- ration. La boucle du pré-miR est clivée par une 2^ème endoribonucléase III, le complexe Dicer, conduisant à la formation d’un ARN double brin, de 22 nt, le miR.

Les 2 brins du duplex miR sont ensuite dissociés, un des 2 brins est dégradé et le brin restant est sélectionné et incorporé au complexe RNA Induced Silencing Complex (RISC), il s’agit du miR mature ^16,17 (Figure 9).

Les miR ont pour rôle la régulation de la traduction d’ARNm cibles par complémenta- rité de séquences miR-ARNm. Une fonction de régulation de la transcription a également été décrite pour les microARN. Cette complémentarité miR-ARNm, si elle est de 100%, induit le clivage de l’ARNm cible et donc sa dégradation ; en revanche, une complémentarité partielle conduit à une inhibition de la traduction protéique. Le plus souvent, les miR agissent par liaison à la région non traduite en 3’ (ou untranslated region (UTR) 3’) de l’ARNm cible ¹⁷.

26 Figure 9 : Maturation des microARN selon Winter et al..

BB.. mimiRR eett ccaanncceerrss

Les études menées sur les miR depuis leur découverte ont montré que ces petits ARN sont impliqués dans des processus physiologiques tels que la prolifération, la différenciation, la croissance ou le métabolisme. Ils sont ainsi capables d’interagir avec des oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeurs. La dérégulation d’expression des miR peut induire une modification de ces interactions et ainsi contribuer au développement de processus de car- cinogénèse ^17,18.

Plusieurs études ont démontré, d’une part, une expression tissu-spécifique de cer- tains miR, d’autre part, la présence d’une signature et d’un profil miR variable selon les tu- meurs. En effet, selon le type de cancer on observe une augmentation ou une diminution de l’expression dans le tissu tumoral par rapport au tissu sain. Ainsi, certains miR sont considé- rés comme des proto-oncogènes, d’autres comme des gènes suppresseurs de tumeurs ^15,19–21.

Par ailleurs, les miR matures exprimés par les cellules et les tissus tumoraux peuvent être sécrétés dans les liquides biologiques et le sang circulant où ils sont présents, de façon stable, sous deux formes²². La première population de miR circulants est protégée au sein d’exosomes, petites particules de 50 à 90 nm. La deuxième population est complexée à des

27 protéines telles qu’Ago2 ou à des lipoprotéines ^22–24. La présence de miR dans le sang circu- lant ainsi que l’existence de profils de miR variables selon les tumeurs permettent d’envisager leur utilisation comme marqueurs d’initiation ou de progression d’un cancer.

L’existence de profils de miR spécifiques selon les tumeurs et leur présence dans le sérum ou le plasma en ferait donc des outils intéressants en diagnostic car facilement acces- sibles et mesurables par un prélèvement peu invasif ^15,22,24.

Les mécanismes d’altération de l’expression des miR sont comparables à ceux régis- sant les gènes classiques codant des protéines : génétiques et épigénétiques. Ainsi il a été mis en évidence trois principaux mécanismes responsables d’anomalies d’expression des miR ²¹.

Le premier est lié à la localisation particulière des gènes codant les miR : plus de la moitié de ces gènes ont été identifiés au sein de régions génomiques associées aux cancers ou de sites fragiles. Ces régions comprenant des gènes suppresseurs de tumeurs ou des on- cogènes sont des sites privilégiés de translocation, délétion, amplification et d’insertion de virus oncogènes, l’ensemble de ces réarrangements pouvant avoir pour conséquence une modification de l’expression des miR ²⁵.

Deuxièmement, une inhibition épigénétique de l’expression des miR par déméthyla- tion des histones ou par hyperméthylation des îlots CpG des promoteurs qui contrôlent leur expression a été démontrée dans des cancers tels que les carcinomes mammaires, endomé- triaux ou hépatiques ^26–28.

Enfin, l’altération ou l’absence des protéines impliquées dans la maturation des miR constitue le troisième niveau de dérégulation de ces ARN. Dans un modèle murin, Sekine et al. ont montré que le gène Dicer1 codant l’endoribonucléase de type III indispensable à la maturation des miR, était un gène déterminant dans la survie hépatocytaire, le métabolisme et la régulation de gènes suppresseurs de tumeurs. Dans ce même modèle, la perte de Dicer était responsable, en présence d’un stimulus oncogénique, du développement de carcinome hépatocellulaire ^29,30.

En pathologie hépatique, la dérégulation d’un certain nombre de miR a été impliquée dans la physiologie et la pathologie. Différents profils d’expression correspondant aux stades de fibrose/cirrhose et de CHC ont été identifiés 24,28,31–33

.

C

C.. mmiiRR--151522

Le miR-152 est un microARN de 21 nt appartenant à la famille miR-148/152, codé par un gène localisé dans un intron du gène COPZ2 sur le chromosome 17 (position 17q21.32).

Cette famille est composée de trois membres, miR-148a, miR-148b et miR-152. Ces trois miR de 21 à 22 nt comportent une séquence d’ancrage (seed) commune de 8 nt (Figure 10).

La séquence de nucléation (seed) est cruciale dans la liaison aux régions UTR 3’ des ARNm cibles ³⁴. Parmi les ARNm cibles du miR-152 ont été identifiés celui de l’ADN méthyl- transférase 1 (DNMT1) anormalement exprimée dans de nombreuses tumeurs ^34,35.

28 Figure 10 : MicroARN de la famille miR-148/152 selon Chen et al..

La séquence seed commune aux 3 miR apparaît en rouge.

A l’instar des autres miR, les membres de la famille miR-148/152 participent à de nombreux phénomènes physiologiques et une dérégulation de leur expression a été démon- trée dans des pathologies variées, telles que les néphropathies à IgA, le diabète de type 1, l’athérosclérose ou encore dans des processus carcinologiques ³⁴. Des études ont ainsi dé- montré une sous-expression du miR-152 dans les carcinomes endométriaux, prostatiques, mammaires et hépatocellulaires ^27,36,37.

Par ailleurs, Huang et al. ont récemment démontré que, dans le cas particulier d’une infection par le VHC, la protéine virale Core était responsable, dans les cellules HepG2, d’une diminution de l’expression du miR-152, elle-même responsable d’une augmentation de la production de la protéine Wnt1 et de la prolifération de ces cellules ³⁸. Ces observations donnent à penser que miR-152 pourrait être impliqué dans la transformation carcinoma- teuse de certains tissus, en particulier le foie, et pourrait ainsi constituer une cible diagnos- tique ou thérapeutique intéressante chez des patients atteints de CHC.

A notre connaissance, miR-152 n’a cependant pas encore été étudié dans des prélè- vements de CHC issus de patients porteurs du virus de l’hépatite C.

D.D. mmiiRR--121222

miR-122 est un microARN de 22 nt, codé par un gène situé sur le chromosome 18 (18q21.31). Il s’agit du miR le plus abondant dans le foie sain, représentant environ 50 à 70%

des miR hépatiques, il joue un rôle physiologique dans le métabolisme du foie ^33,39. Il est éga- lement impliqué dans la stabilisation de l’ARN et la réplication du VHC et souvent décrit comme sous-exprimé dans les CHC ^31,33,40. Cependant, une étude récente de Spaniel et al.

tend à nuancer ce résultat selon l’étiologie du CHC. En effet, ces auteurs ont démontré que le taux de miR-122 était diminué dans les CHC induits par le VHB par rapport au foie non tumoral alors qu’il n’était pas modifié dans les CHC liés à l’HCV ⁴⁰. Ceci suggérant un rôle des stimuli externes sur la régulation du taux des miR, notamment le type d’infection virale comme observé dans cette étude ou encore les rayonnements ionisants dans l’étude de Wang et al. ^40,41. De même, Varnholt et al. ont, quant à eux, observé une surexpression de ce miR dans les CHC comparé au foie sain ⁴².

Le rôle de ce miR n’est actuellement pas totalement compris et son implication dans la transformation carcinomateuse reste controversée et nécessite des études supplémen- taires ³⁹.

29

II I II I. . M Ma at té ér r ie i el ls s et e t mé m ét t ho h od de es s

A.A. CoColllleeccttee ddees s pprrélélèèvveememenntsts

Les sérums et les prélèvements tissulaires ont été collectés entre novembre 2009 et avril 2014 et conservés à -20°C et -80°C respectivement au Centre Hospitalier Régional Uni- versitaire de Tours avant leur utilisation pour transcription inverse et PCR quantitative.

Des prélèvements tissulaires ont également été fixés en formol neutre et inclus en paraffine pour étude microscopique de la tumeur et tu tissu adjacent.

Pour 8 patients porteurs d’un CHC d’origine virale C, nous avons obtenu à la fois le sérum et les prélèvements tissulaires.

Les patients étaient considérés comme porteurs du VHC s’ils avaient eu une valeur positive d’ARN viral sérique.

Un recueil écrit du consentement des patients en vue de l’utilisation et de la conser- vation de ces prélèvements a été obtenu (Annexe 2 : Information sur la conservation et l'utilisation d'éléments et produits du corps humain).

B.B. ExExttrraaccttiioonn eett ddoossaaggee ddeses AARRN N ttoottaauuxx

Les prélèvements tissulaires congelés ont été soumis à une étape de lyse mécanique par le TissueLyser LT (Qiagen) permettant un broyage et une homogénéisation des tissus et des cellules. Les kits commerciaux utilisés pour l’extraction des ARN totaux (RNeasy© Mini Kit, Qiagen pour les prélèvements tissulaires congelés et les cellules et miRNeasy Serum/Plasma Kit, Qiagen pour les sérums) combinent une phase de lyse cellulaire au thiocyanate de gua- nidine et une phase d’extraction au phénol-chloroforme (ratio 5:1). Les ARN totaux présents dans la phase aqueuse sont ensuite retenus dans une colonne de silice puis élués à l’eau.

Ces ARN ont ensuite été soumis à une digestion enzymatique par la DNase afin d’éliminer l’ADN résiduel (RNase-Free DNase Set, Qiagen). La DNase a été éliminée par pas- sage des échantillons dans une colonne de silice et les ARN ont été élués à l’eau (RNeasy^® MinElute^® Cleanup Kit, Qiagen).

Pour les ARN extraits des sérums, le miR-39, un miR synthétique issu de C.Elegans (spike-in control) est ajouté avant l’extraction des ARN, ce qui permet, au moment de la PCR en temps réel, de contrôler les différentes étapes d’extraction, de transcription inverse et de PCR. Il sert également de référence pour la quantification du miR-152.

Le dosage des ARN totaux a été réalisé par méthode fluorimétrique grâce au kit Qu- bit^TM RNA Assay (Invitrogen).

L’intégrité des ARN a été déterminée à l’aide du 2100 Bioanalyzer, Agilent Technolo- gies correspondant à un système d’électrophorèse capillaire sur puce. Le gel, mélangé à un marqueur fluorescent, est préalablement diffusé à l’ensemble du réseau de la puce. Le mar- queur fluorescent (dye) a la capacité de s’intercaler dans les structures de l’ARN, permettant ensuite une détection par laser. Un marqueur de masse moléculaire (étalon) contenant des fragments d’ARN de tailles et de concentrations connues est déposé dans un des puits ; ce-

30 lui-ci permettra d’obtenir une courbe standard déterminant la masse moléculaire grâce à la vitesse de migration. Les échantillons à tester sont déposés dans les 12 autres puits, ainsi qu’un marqueur de faible masse moléculaire afin d’aligner les données des échantillons aux données de l’étalon.

L’ensemble des puits est soumis à un champ électrique, permettant une séparation des ARN selon leur masse moléculaire. Lors de leur passage dans le gel, les brins d’ARN sont marqués par le dye, ce qui permet leur détection par un laser en fin de migration. Ainsi, l’appareil mesure en temps réel, pour chaque échantillon, l’intensité de la fluorescence en fonction du temps de rétention au sein du microréseau. Ces données sont comparées à la courbe standard de l’étalon puis retranscrites sous la forme d’un électrophorégramme (pics) ou d’un gel (bandes).

L’analyse informatique de ces données permet d’obtenir une donnée chiffrée (de 0 à 10) : le RNA Integrity Number (RIN), qui prend en compte la totalité des ARN du profil, avec notamment mais pas seulement, le ratio des sous-unités 28S/18S des ARN ribosomaux. Plus le RIN est élevé (proche de 10), meilleure est la qualité de l’échantillon analysé.

Figure 11 : Analyse de l’intégrité des ARN (2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies).

A : Prélèvement contenant des ARN sans altération de qualité.

B : Prélèvement contenant des ARN dégradés.

Sur l’électrophorégramme d’un échantillon de bonne qualité (Figure 11-A), le pre- mier pic observé correspond au marqueur de bas poids moléculaire permettant d’aligner tous les échantillons avec l’étalon. Les 2 pics les plus grands correspondent, au pic de la sous-unité ribosomale 18S (pic le plus précoce) et à celui de la sous-unité 28S (pic plus tardif).

Ces résultats sont également représentés sous la forme d’un gel (à droite de l’électrophorégramme) : la bande verte correspond au marqueur de bas poids moléculaire et les 2 bandes les plus prononcées, aux sous-unités d’ARN ribosomal.

L’électrophorégramme d’un échantillon dont les ARN sont moins bien conservés (Fi- gure 11-B) montre, comme précédemment, un premier pic correspondant au marqueur de bas poids moléculaire. Le reste de l’électrophorégramme montre plusieurs pics avec une

31 faible intensité de fluorescence dont le RIN à 3,2 témoigne d’une altération de la qualité des ARN.

L’ensemble des étapes de lyse mécanique, d’extraction des ARN, de digestion enzy- matique par la DNase, de dosage des ARN et d’évaluation de leur intégrité a été réalisée se- lon les instructions fournies par les fabricants avec les kits.

C.C. TrTraannssccrripipttiioonn iinnvverersse e eett PPCCRR qquuaannttiittaattiivvee

La PCR quantitative en temps réel est basée sur le principe d’une amplification de la séquence génomique cible et d’une détection, à chaque cycle, des produits amplifiés à l’aide d’un fluorochrome, le SYBR Green. Chaque cycle de PCR comprend une étape de dénatura- tion des 2 brins d’ADN, une étape d’hybridation des amorces et une étape d’élongation par ajout de dNTP complémentaires au brin amplifié par une ADN polymérase. Le SYBR Green est un fluorochrome qui s’intercale au sein de l’ADN double brin, la fluorescence détectée est ainsi proportionnelle à la quantité d’amplicons présents (Figure 12).

Les résultats obtenus pour chaque échantillon analysé en duplicate montrent une courbe de fluorescence en fonction du nombre de cycles de PCR, courbe exponentielle arri- vant à un plateau en fin de réaction (Figure 13). Le cycle seuil (ou Cycle Threshold) corres- pond à la dérivée seconde du cycle auquel la fluorescence dépasse le seuil du bruit de fond de fluorescence.

Figure 12 : Etapes d’un cycle de PCR quantitative par SYBR Green.

La dénaturation des brins d’ADN à haute température ① est nécessaire pour l’hybridation des amorces

②. Durant la phase d’élongation ③ le SYBR Green est incorporé à l’ADN double brin. L’incorporation du SYBR Green induit une fluorescence détectée à chaque fin de cycle.

32 Figure 13 : Courbes de fluorescence obtenues lors d’une PCR.

On observe une première phase dite de bruit de fond, phase durant laquelle le nombre d’amplicons néo- formés reste inférieur au seuil de détection de fluorescence.

Lorsque ce seuil est dépassé (aux environs de 25 et 35 cycles respectivement pour chaque échantillon), débute la phase exponentielle de croissance.

La phase de plateau débute enfin lorsque les constituants du mix de PCR deviennent limitants.

Les courbes de duplicate pour chaque échantillon sont superposables, témoignant d’une bonne reproduc- tibilité de la manipulation avec un même échantillon.

Dans notre étude, deux PCR en temps réel ont été réalisées : une pour l’étude des miR (Annexe 3 : Transcription inverse et PCR quantitative des microARN) et une pour l’étude du génome du virus de l’hépatite C (Annexe 4 : Transcription inverse et PCR quanti- tative du génome du VHC. Dans les 2 cas, la PCR a été réalisée selon un processus en 2 étapes.

Concernant l’étude des miR, la première étape, réalisée en présence du tampon HiS- pec Buffer, comprend une polyadénylation des miR matures par une polymérase et une transcription inverse de ceux-ci, à l’aide d’une amorce oligo-dT comportant un tag universel (miScript II RT kit, Qiagen). Les ADN complémentaires (ADNc) obtenus sont soumis à une PCR en temps réel grâce à une amorce sens spécifique du miR-152 ou du miR-122, et à une amorce anti-sens universelle fournie dans le miScript SYBR Green PCR kit, Qiagen (Figure 14 et Tableau 2). Pour les sérums, l’ARN de référence utilisé était le miR-39 synthétique ; pour les prélèvements tissulaires congelés, il s’agissait de l’ARN cellulaire RNU6B.

Pour la quantification du génome du VHC, la transcription inverse a été réalisée en présence du tampon HiFlex Buffer, par ajout d’hexamères aléatoires (SuperScript^TM III First- Strand Synthesis System for RT-PCR, Invitrogen) aux composants du miScript II RT kit. La PCR quantitative a été réalisée grâce à l’utilisation d’amorces sens et anti-sens spécifique du VHC et au kit Light Cycler^® 480 SYBR Green I Master de Roche (Tableau 2). Le contrôle utilisé pour la normalisation de la PCR est l’Actine.