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optique : compaction de l’ADN, activité protéique et opérations microfluidiques

Anna Venancio Marques Serra

To cite this version:

Anna Venancio Marques Serra. Matière molle programmable par voie chimique ou optique : com- paction de l’ADN, activité protéique et opérations microfluidiques. Chimie organique. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2014. Français. �NNT : 2014PA066595�. �tel-01142069�

Mati` ere molle programmable par voie chimique ou optique :

compaction de l’ADN, activit´ e

prot´ eique et op´ erations microfluidiques

TH` ESE

pr´esent´ee et soutenue publiquement le 15 juillet 2014 pour l’obtention du

Doctorat de l’Universit´ e Pierre et Marie Curie

(mention chimie physique et chimie analytique) par

Anna Venancio-Marques

Composition du jury

Rapporteurs : ReikoOda VincentStuder Examinateurs : Roy Bar-Ziv

Jean-Fran¸coisJoanny Christof Niemeyer Directeur de th`ese : DamienBaigl

Table des mati` eres

Introduction g´en´erale 1

Partie I Stimulation de la compaction de l’ADN 5

Chapitre 1 Strat´egies de compaction et d´ecompaction de l’ADN : ´Etat de

l’art 7

1.1 Propri´et´es physico-chimiques d’un biopolym`ere particulier : l’ADN . . . 10

1.2 Une structure `a grande ´echelle stimulable : la compaction de l’ADN . . . 23

1.3 Strat´egies de compaction-d´ecompaction . . . 38

1.4 Bilan des strat´egies de simulation des syst`emes ADN-agents de compaction . 51 Chapitre 2 Compaction photostimulable de l’ADN par les polyamines pho- tosensibles 53 2.1 Choix des polyamines photosensibles. . . 56

2.2 Caract´eristiques des polyamines photosensibles . . . 65

2.3 Les polyamines photosensibles comme agents de compaction . . . 75

2.4 Une compaction-d´ecompaction photostimulable avecAzoTren . . . 84

2.5 Bilan des performances des polyamines photosensibles . . . 90

Partie II Stimulation de l’activit´e des prot´eines in vitro 93 Chapitre 1 Fonctions prot´eiques modul´ees par la lumi`ere : ´Etat de l’art et r´ealisations 95 1.1 Etat de l’art du contrˆole de fonctions prot´eiques par la lumi`ere´ . . . 98

1.2 Contrˆole de fonctions prot´eiques par le contrˆole de la compaction d’ADN . . 116

Chapitre 2 Photostimulation programm´ee sans modification chimique 131

2.1 Strat´egie de contrˆole d’une enzyme sans modification chimique . . . 134

2.2 Production photocontrˆol´ee de la β-lactamase . . . 140

2.3 Application au photocontrˆole d’une activit´e enzymatique . . . 148

2.4 Bilan : programmation d’une activit´e enzymatique par un photocontrˆole de l’´etat de compaction de l’ADN . . . 158

Partie III Microfluidique stimul´ee par la lumi`ere 161 Chapitre 1 Optofluidique et Microfluidique pilot´ee par la lumi`ere : ´Etat de l’art 163 1.1 La stimulation d’´el´ements fluides par la lumi`ere . . . 166

1.2 Optofluidique digitale : manipulation de gouttes individuelles . . . 179

1.3 Microfluidique pilot´ee par la lumi`ere . . . 188

1.4 Tensioactifs photosensibles pour le photocontrˆole isotherme des tensions su- perficielles . . . 195

Chapitre 2 Optofluidique digitale pour la chimie organique 203 2.1 Contrˆole de r´eaction chimique en gouttes . . . 206

2.2 Manipulation d’une goutte par la lumi`ere . . . 214

2.3 Fusion de gouttes pour d´eclencher des r´eactions organiques . . . 222

2.4 Fusion multi-gouttes en parall`ele et s´equentielle . . . 227

2.5 Bilan de la manipulation de gouttes par la lumi`ere . . . 233

Chapitre 3 Photocontrˆole dynamique du m´elange en canal microfluidique 237 3.1 M´elanger, une op´eration strat´egique en canaux microfluidiques.. . . 240

3.2 Elaboration d’un microm´elangeur photostimulable.´ . . . 253

3.3 Etude d’un m´elange d´eclench´e par la lumi`ere.´ . . . 261

3.4 Caract´eristiques du m´elange sous contrˆole de la lumi`ere . . . 269

3.5 Bilan : un microm´elangeur photostimulable . . . 274

Conclusion g´en´erale 277

Annexes 281

Annexe A → Protocoles :

Synth`ese de l’AzoTAB en laboratoire et `a plus grande ´echelle 281

Synth`ese des polyamines photosensibles et caract´erisation 285 Annexe C → R´esultats pr´eliminaires :

Polyamines photosensibles comme r´egulateurs de canaux ioniques 289 Annexe D → R´esultats publi´es :

Synth`ese d’une prot´eine membranaire fonctionnelle 295 Annexe E → Protocoles :

Obtention de dispositifs microfluidiques par photolithographie 301 Annexe F → R´esultats pr´eliminaires :

Vers une valve microfluidique contrˆol´ee par la lumi`ere 303 Annexe G → R´esultats pr´eliminaires :

Vers une surface solide photosensible 307

Bibliographie 309

R´ecapitulatif des articles publi´es 333

Abr´eviations 335

Introduction g´ en´ erale

Mati`ere molle synth´etique et mati`ere molle biologique : une synergie `a explorer ? La«mati`ere molle» est un vaste domaine qui regroupe mati`eres plastiques, gels, bulles, cris- taux liquides, cr`emes cosm´etiques, etc, c’est-`a-dire un ´etat de la mati`ere particulier qui englobe un grand nombre de syst`emes qui nous sont familiers. Le terme en lui-mˆeme a ´et´e popularis´e en 1991, lorsque le physicien Pierre-Gilles de Gennes intitule son discours de r´eception du prix NobelSoft Matter. Ce dernier souligne en particulier une des propri´et´es sp´ecifiques de la mati`ere molle en prenant comme exemple le latex, s´ecr´et´e par l’h´ev´ea et r´ecolt´e par les Indiens du bassin amazonien. Ce liquide se transforme, apr`es une simple p´eriode de s´echage, en un mat´eriel plus structur´e et r´esistant, le caoutchouc. Il apparaˆıt ainsi qu’une action chimique de petite envergure, r´esulte en un changement important des propri´et´es du syst`eme. Cette particularit´e de la mati`ere molle va guider ma d´emarche au cours de ce manuscrit. Je vais chercher `a utiliser ces propri´et´es pour d´evelopper des mat´eriaux programmables, capables de modifier leurs caract´eristiques sous l’effet d’un stimulus externe, le plus souvent la lumi`ere.

Les ´energies d’interaction mises en jeu dans les syst`emes de la mati`ere molle sont comparables

`

a l’´energie thermique kT `a temp´erature ambiante, avec des interactions bas´ees sur les liaisons hydrog`ene ou les forces de van de Waal. Ces ´echelles ´energ´etiques expliquent qu’une faible variation d’un param`etre exp´erimental externe, (la temp´erature, la concentration, le pH ou la pression), ou une stimulation de faible amplitude (une contrainte m´ecanique, un signal ´electrique ou magn´etique) peut provoquer une r´eorganisation importante du syst`eme physico-chimique

´etudi´e.

A l’interface `a la fois de la chimie, la biologie et la physique, la mati`ere molle englobe des syst`emes physico-chimiques vari´es allant des polym`eres, aux tensioactifs sans oublier les collo¨ıdes et les cristaux liquides. Si l’apport de la physique conduit souvent au d´eveloppement de mod`eles pour rendre compte des propri´et´es de cet ´etat de la mati`ere et qu’une approche chimique permet la cr´eation de nouveaux syst`emes stimulables, les syst`emes biologiques apportent une r´eelle source d’inspiration. Il s’agit en effet de mati`ere molle active, capable de s’adapter `a son environnement. On pense aux constituants tels que l’ADN, un biopolym`ere semi-flexible, aux prot´eines globulaires qui agissent comme des collo¨ıdes fonctionnels ou encore aux lipides, constituants de base des membranes proches des tensioactifs et qui joue un rˆole essentiel dans la compartimentation du microenvironnement biologique. Ces syst`emes, qui mettent en jeu de nombreux ph´enom`enes avec des ´energies de l’ordre de l’´energie thermique, sont tr`es dynamiques, avec, par exemple, les assemblages actifs de microtubules, qui offrent une rigidit´e modulable aux compartiments biologiques, la formation dynamique de pores dans une membrane qui permet de r´eguler les flux entre les environnements intra- ou extracellulaire, ou encore la pr´esence d’un brin d’ARNm au sein d’un ribosome qui synth´etise une s´equence d’acides amin´es. Au-del`a de nombreux points communs comportementaux avec la mati`ere molle synth´etique, la mati`ere molle biologique se distingue par une gamme de fonctions bien plus ´etendues ainsi que des propri´et´es uniques, comme le stockage et la transmission de l’information g´en´etique ou la capacit´e `a se

reproduire et `a ´evoluer.

Les objectifs de la th`ese

Un premier objectif de cette th`ese est de mettre `a profit la capacit´e des chimistes `a formuler la mati`ere molle synth´etique pour aller vers la grande gamme de fonctions accessibles `a la mati`ere molle biologique. Ainsi, dans un premier temps, nous nous attacherons `a voir comment exploiter des propri´et´es stimulables bien connues de la mati`ere molle synth´etique pour les appliquer `a la r´egulation de deux syst`emes biologiques particuliers : l’ADN et les prot´eines. On verra ainsi comment nous avons r´eussi `a combiner des propri´et´es d’assemblages, des interactions ´electro- statiques et des transitions conformationnelles propres aux poly´electrolytes semi-flexibles pour aboutir `a un photocontrˆole de la compaction de l’ADN pr´esentant des performances in´edites.

Ensuite, nous exploiterons les capacit´es de l’ADN `a stocker de l’information g´en´etique pour convertir, de mani`ere tr`es originale, le contrˆole conformationnel ainsi obtenu en une fonction prot´eique modulable par la lumi`ere.

Le deuxi`eme objectif de cette th`ese est d’exploiter la connaissance acquise en photo-actuation de la mati`ere molle pour l’appliquer de mani`ere innovante `a un domaine technologique en pleine expansion : la microfluidique. Avant cette th`ese, le d´efi du contrˆole des syst`emes microfluidiques par la lumi`ere a ´et´e majoritairement relev´e par des physiciens qui ont cherch´e `a convertir un signal lumineux en mouvement de liquide par utilisation directe des forces optiques (souvent trop faibles pour obtenir des effets importants) ou par dissipation en ´energie thermique (ce qui se traduit par des approches invasives aux effets tr`es locaux). Au contraire, nous montrerons ici comment des mol´ecules analogues `a celles utilis´ees dans le cadre des applications biologiques d´emontr´ees au d´ebut de cette th`ese, `a savoir des tensioactifs photosensibles, nous ont permis, pour la premi`ere fois, de mettre sous contrˆole de la lumi`ere une vaste gamme d’op´erations microfluidiques, aussi bien pour la manipulation, le transport et la combinaison de gouttes individuelles (optofluidique digitale) que pour le contrˆole au sein de dispositifs microfluidiques (photocontrˆole r´eversible du m´elange, par exemple).

Architecture du manuscrit

Ce manuscrit est divis´e en trois parties principales. Chaque partie d´ebute par un chapitre offrant un ´etat de l’art du domaine suivi par un ou plusieurs chapitres d´ecrivant les r´esultats que j’ai obtenus.

La premi`ere partie porte ainsi sur le contrˆole physico-chimique de la compaction de l’ADN, un ph´enom`ene au cours duquel la structure `a grande ´echelle est tr`es fortement modifi´ee. Nous montrerons comment les polyamines photosensibles, une nouvelle famille de mol´ecules que j’ai int´egralement synth´etis´ees et caract´eris´ees, constituent un outil novateur pour le photocontrˆole efficace et r´eversible de la compaction de l’ADN.

La deuxi`eme partie porte sur la r´egulation de l’activit´e des prot´eines au moyen de stimula- tions externes, et plus particuli`erement par voie optique. Nous d´ecrirons ainsi deux strat´egies permettant d’exploiter le contrˆole de la compaction de l’ADN pour le convertir en une fonction prot´eique stimulable. La premi`ere strat´egie repose sur une action directe sur une prot´eine-cible incluse dans un complexe ADN-prot´eine. La deuxi`eme voie que j’ai explor´ee est l’utilisation du photocontrˆole de la compaction d’un ADN codant pour une prot´eine d’int´erˆet. Nous montrerons comment, au sein d’un syst`eme d’expression reconstitu´e, cette approche m’a permis pour la premi`ere fois de r´eguler l’activit´e d’une enzyme, ici la β-lactamase, sans avoir recours `a aucune modification chimique, ni de l’ADN mis en jeu, ni de la prot´eine.

lumes de liquide sous contrˆole de la lumi`ere et montrerons comment l’emploi de tensioactifs photosensibles m’a permis de d´evelopper une v´eritable«boˆıte `a outils optique »permettant des performances in´egal´ees pour le photocontrˆole d’op´erations microfluidiques vari´ees, combinant flexibilit´e, robustesse, portabilit´e et simplicit´e de mise en œuvre.

Ces trois parties sont suivies par des annexes d´ecrivant des protocoles exp´erimentaux sp´eci- fiques ou bien des ´etudes connexes auxquelles j’ai particip´e durant ma th`ese. La bibliographie, les abr´eviations et la liste des articles publi´es dans le cadre de ce travail sont donn´es `a la fin du document.

Stimulation de la compaction de

l’ADN

Strat´ egies de compaction et

d´ ecompaction de l’ADN : ´ Etat de l’art

L’acide d´esoxyribonucl´eique (ADN) est un poly´electrolyte aux propri´et´es physico-chimiques tr`es particuli`eres. Dans ce chapitre bibliographique, le comportement de ce polym`ere semi-flexible tr`es fortement charg´e est caract´eris´e, en regardant notamment l’interaction ´electrostatique avec les esp`eces en solution dans le cadre de la th´eorie de condensation de Manning Oosawa. On souligne l’apparition d’un ph´enom`ene ´etonnant, la r´eduction possible et drastique des mol´ecules d’ADN au cours d’un ph´enom`ene appel´e compaction.

Ce chapitre passe alors en revue les diff´erentes m´ethodes physico-chimiques permettant de r´ealiser une compaction de l’ADN in vitro dans des conditions dilu´ees. Deux strat´egies sont fr´equemment utilis´ees : i) un effet d’encombrement mol´eculaire et ii) la facilitation du rappro- chement des segments d’ADN. Un accent particulier est alors mis sur les agents de compaction cationiques, que ce soit des cations inorganiques et organiques de valence ´elev´ee (Z = 3,4...), des polycations (lin´eaires ou branch´es), des nano-objets (nanoparticules, liposomes...) et enfin des tensioactifs cationiques.

Enfin c’est la d´ecompaction de l’ADN, c’est-`a-dire le passage d’une phase dense vers une chaˆıne d´epli´ee, qui est ´etudi´ee. Si la m´ethode de d´ecompaction d´epend ´enorm´ement de la m´ethode de compaction retenue, plusieurs approches sont n´eanmoins possibles. Les grandes strat´egies de d´ecompaction reposent i) sur l’ajout d’esp`eces qui ont une tr`es forte affinit´e soit pour l’ADN ou pour l’agent de compaction, ii) sur l’ajout d’esp`eces qui modifient les agents de compaction afin de diminuer leur efficacit´e de compaction (une charge qui diminue, des interactions hydrophobes amoindries) et iii) sur la modification de param`etres physico-chimiques du milieu environnant (permittivit´e relativeǫ_r, la temp´erature...)

Sommaire

1.1 Propri´et´es physico-chimiques d’un biopolym`ere particulier : l’ADN 10

1.1.1 Structure chimique de la double h´elice d’ADN . . . . 10

1.1.2 Un biopolym`ere charg´e . . . . 13

1.1.3 Un biopolym`ere semi-flexible . . . . 19

1.1.4 Points clefs des propri´et´es physico-chimiques de l’ADN . . . . 22

1.2 Une structure `a grande ´echelle stimulable : la compaction de l’ADN . . . . 23

1.2.1 Modification de la conformation de l’ADN . . . . 23

1.2.2 Agents de compaction cationiques . . . . 27

1.2.3 Points clefs de la compaction. . . . 37

1.3 Strat´egies de compaction-d´ecompaction . . . . 38

1.3.1 Ajout successifs d’agents antagonistes . . . . 38

1.3.2 Modificationin situ des param`etres physico-chimiques . . . . 44

1.3.3 Modificationin situ des agents de compaction . . . . 45

1.4 Bilan des strat´egies de simulation des syst`emes ADN-agents de compaction . . . . 51

L’ADN, l’acide d´esoxyribonucl´eique, est une macromol´ecule poss´edant un rˆole fondamental dans les syst`emes biologiques. Elle est notamment garante de l’information g´en´etique n´ecessaire `a la survie de l’organisme. Un fort int´erˆet est ainsi port´e `a la compr´ehension des propri´et´es physico- chimiques de la mol´ecule d’ADN, tout particuli`erement pour expliquer un ph´enom`ene drastique de changement de structure `a grande ´echelle de l’ADN, appel´e compaction. Les enjeux de la compaction en milieu biologiques sont forts, car l’´etat compact ou d´ecompact de l’ADN module sa fonction biologique. En plus de l’am´elioration des connaissances `a un niveau fondamental, des motivations plus pratiques en bio- et nanotechnologies sont ´egalement identifiables.

La compaction de l’ADN est en effet essentielle pour permettre la transfection, c’est-`a-dire l’introduction d’ADN dans des cellules, une ´etape clef des th´erapies g´eniques. L’´etat dense adopt´e par l’ADN lui permet de passer les membranes sans subir de dommage, tandis que le r´etablissement de l’´etat allong´e met la s´equence d’ADN `a la disposition de la cellule trans- fect´ee. [Demeneix et al., 2004] Le contrˆole de la compaction de l’ADN permet ´egalement de nombreuses applications en biochimie, comme la r´egulation de l’expression g´en´etique in vitro, [Tsumoto et al., 2003, Prasad et al., 2003, Ryan et al., 2004] ou encore la protection contre le cisaillement.[Millili et al., 2010]

L’ADN est devenue une mol´ecule-clef en nanotechnologie permettant la fabrication de na- nostructures de morphologie tr`es contrˆol´ee en utilisant par exemple des technologies d’ADN origami,[Sacc`a and Niemeyer, 2012], l’assemblage dirig´e de nanoparticules ou encore l’organi- sation de prot´eines. Par cons´equent, le contrˆole du comportement de la macromol´ecule, et en particulier la modulation de son ´etat de compaction, est ´egalement tr`es int´eressant lorsqu’un brin d’ADN est vu non plus pour ses propri´et´es biologiques, mais comme un compos´e participant

`

a un nano-´edifice.

Ce chapitre est ainsi consacr´e `a l’´etude de l’ADN, avec un accent sur les ph´enom`enes de compaction et d´ecompaction stimulables par des m´ethodes physico-chimiques en milieu dilu´e.

Un aper¸cu de la composition chimique et des caract´eristiques physiques uniques de l’ADN est donn´e dans une premi`ere partie. Ces propri´et´es influencent fortement le comportement `a grande

´echelle des mol´ecules d’ADN, en particulier la possibilit´e pour l’ADN de passer d’une forme d´epli´ee `a une forme tr`es compacte, ce qui fait l’objet d’une deuxi`eme partie. Le passage d’un

´etat d´epli´e `a un ´etat dense, appel´e la compaction, est alors ´etudi´e plus en d´etail. Finalement, une troisi`eme partie s’attache `a d´ecrire les strat´egies existantes de d´ecompaction, permettant d’obtenir des chaˆınes d´epli´ees d’ADN `a partir de mol´ecules dans l’´etat compact.

1.1 Propri´ et´ es physico-chimiques d’un biopolym` ere particulier : l’ADN

1.1.1 Structure chimique de la double h´elice d’ADN

La structure de l’ADN permet `a ce biopolym`ere de jouer son rˆole clef dans la synth`ese prot´eique et dans la transmission de l’information g´en´etique. Nous allons voir dans cette partie sa composition et ses propri´et´es, en partant des unit´es constitutives des monom`eres (voir la section 1.1.1.1), aux chaˆınes lin´eaires constituant l’ADN simple brin (voir la section 1.1.1.2) jusqu’`a la structure de l’ADN double brin (voir la section1.1.1.3).

1.1.1.1 Les bases azot´ees

Les bases azot´ees, identifi´ees en 1896 par Albercht Kossel, sont des blocs de construction essentiels de l’ADN. Elles sont classifi´ees en deux cat´egories, d’une part les purines qui sont des compos´es h´et´erocycliques comportant un cycle `a six atomes fusionn´e `a un cycle `a cinq atomes et d’autre part les pyrimidines, compos´es h´et´erocycliques `a six atomes. L’ad´enine (not´ee A) et la guanine (not´ee G) sont des purines (formules `a laFigure1.1,`a gauche) tandis que la thymine (not´ee T) et la cytosine (not´ee C) sont des pyrimidines (formules `a la Figure 1.1, `a droite).

Au sein de l’ADN les bases s’associent entre elles pour former des paires canoniques, dites de Watson-Crick, par ´etablissement de liaison hydrog`ene (en bleu dans laFigure1.1). Seules deux combinaisons sont possibles, `a savoir A-T et G-C. L’obtention de la paire A-T (ou T-A) passe par l’´etablissement de deux liaisons hydrog`ene tandis que celle de la paire C-G (ou G-C) passe par l’´etablissement de trois ponts hydrog`ene. Remarquons que les paires de base canoniques ont toutes deux la mˆeme taille, alors que l’assemblage de deux purines ne tiendrait pas au sein de l’h´elice (2,0 nm) et que deux pyrimidines formeraient un ensemble trop petit.

Figure 1.1 – Formules chimiques des quatre bases azot´ees, avec `a gauche les pyrimidines (cy- tosine not´ee C et thymine not´ee T) et `a droite les purines (ad´enine not´ee A et guanine not´ee G) avec les liaisons hydrog`ene (en bleu) entre les paires canoniques A-T et G-C.

1.1.1.2 Un polym`ere de nucl´eotides

Les nucl´eotides Le motif de base de l’ADN est constitu´e par l’assemblage covalent d’un groupe phosphate, d’un ose et d’une base azot´ee. La structure de ce monom`ere appel´ee nucl´eotide est donn´ee enade laFigure1.2dans le cas de la cytosine. L’ose, un cycle `a 5 atomes, ´etablit une liaison ester avec le groupement phosphate au niveau de la fonction alcool en 5’ , et une liaison N-osidique entre l’atome de carbone 1’ et la base azot´ee. Il reste une fonction alcool secondaire disponible sur le pentose en 3’. L’absence de fonction alcool en 2’ donne `a l’ose de l’ADN son nom de d´esoxyribose, ce qui n’est pas le cas pour l’ARN. On utilise habituellement les mˆemes abr´eviations pour les nucl´eotides que pour la base azot´ee (A, T, G et C) qu’ils contiennent.

Enchaˆınement de nucl´eotides Chaque brin d’ADN est un polym`ere lin´eaire compos´e d’un enchaˆınement de nucl´eotides, ce qui explique le terme d’Acide D´esoxyriboNucl´eique. En effet une liaison phosphodiester s’´etablit entre la fonction alcool en 3’ du pentose et le groupe phos- phate du nucl´eotide suivant (enb de la Figure1.2). Un simple brin d’ADN est ainsi compos´e d’un squelette alternant un groupe phosphate et un pentose portant une base azot´ee. La liaison phosphodiester octroie d’ailleurs une forte stabilit´e `a la chaˆıne vis-`a-vis de l’hydrolyse. Conven- tionnellement, on lit un enchaˆınement de nucl´eotides de l’extr´emit´e 3’ vers l’extr´emit´e 5’. La succession des nucl´eotides au sein d’un brin d’ADN, appel´ee s´equence, permet le codage de l’information g´en´etique n´ecessaire `a la survie d’un organisme.

Figure1.2 – a) Un monom`ere d’une chaˆıne simple brin d’ADN, avec l’assemblage d’un groupe phosphate, d’un d´esoxyribose et d’une base azot´ee, ici la cytosine. b) Une liaison phosphodiester entre deux nucl´eotides.

1.1.1.3 Une double h´elice

Une mol´ecule d’ADN double brin est compos´ee de deux brins d’ADN qui s’apparient pour former une structure tridimensionnelle. La forme la plus fr´equente en solution aqueuse est une double h´elice droite dite«forme B», dont nous allons voir les caract´eristiques.

Appariement des brins L’appariement de deux polym`eres de nucl´eotides est possible grˆace

`

a l’´etablissement de liaisons hydrog`ene entre paires de bases azot´ees compl´ementaires. Les bases azot´ees d’un brin sont projet´ees vers l’axe de la double h´elice, tandis que les groupements phos- phates sont orient´es vers l’ext´erieur de l’h´elice et sont diam´etralement oppos´es les uns aux autres (Figure1.3). Une base azot´ee port´ee par un brin va ´etablir des liaisons H avec une base azot´ee sur le second brin, en respectant strictement l’assemblage canonique A-T et G-C. L’assemblage de deux bases forme un plan, dont on a vu qu’il avait les mˆemes dimensions pour les deux paires de base canoniques. Les plans s’empilent au sein de la double h´elice, dans un arrangement spatial

´energ´etiquement favorable donnant lieu `a la formation d’un petit et d’un grand sillon de mˆeme profondeur et octroyant par la mˆeme occasion une certaine rigidit´e `a l’´edifice. Cette rigidit´e est caract´eris´ee plus en d´etail `a la section1.1.3. Les plans sont quasiment perpendiculaires `a l’axe, qui les intersectent en leur milieu et sont distants les uns des autres de a= 0,34 nm.

Figure 1.3 – Structure en double h´elice d’une mol´ecule d’ADN, et un aper¸cu de la structure chimique avec le squelette sucre-phosphate (en violet), les bases azot´ees (en vert) et les liaisons hydrog`ene qui s’´etablissent entre bases compl´ementaires (en bleu)

Distances caract´eristiques La double h´elice a un pas p qui correspond `a un enchaˆınement de dix nucl´eotides, ce qui donne p = 10a = 3,4 nm. Son diam`etre d vaut 2 nm. Le long du squelette ose-phosphate, chacun des brins d’ADN porte une charge n´egative due au groupe phosphate. La distance entre deux charges n´egatives,b, peut alors ˆetre calcul´ee :b=a/2 = 0,17 nm. Il s’agit de l’une des plus faibles distances rencontr´ees dans la nature, c’est-`a-dire que l’ADN est un biopolym`ere poss´edant l’une des charges lin´eiques n´egatives les plus ´elev´ees dans la nature. Les cons´equences de cette caract´eristique sont explor´ees `a la section1.1.2. Les grandeurs caract´eristiques d’une double h´elice d’ADN dans sa forme B sont rassembl´ees dans leTableau 1.1.

Taille de mol´ecules d’ADN Les mol´ecules d’ADN sont caract´eris´ees par leur s´equence, c’est-

`a-dire par l’enchaˆınement des nucl´eotides. La taille d’une mol´ecule d’ADN est ainsi fr´equemment caract´eris´ee par son nombre N de paires de base, ce qui a donn´e naissance `a l’unit´e «paire de

notation valeur taille d’un monom`ere : a 0,34 nm pas de la double h´elice : p 10a= 3,4 nm diam`etre de la double h´elice : d 2 nm

distance entre deux charges : b a/2 = 0,17 nm

Tableau 1.1 – Grandeurs caract´eristiques de la double h´elice d’ADN sous forme B, la plus fr´equente en solution aqueuse.

bases» (pb), ou pour les ADN g´eants, au multiple kilo paires de bases (kpb) pour pr´eciser la taille d’un ADN. La longueur de contourL_cdu biopolym`ere, d´efinie comme la longueur maximale entre les extr´emit´es du polym`ere, est une seconde grandeur couramment employ´ee pour d´ecrire la taille d’un polym`ere. On peut relier les deux simplement par la relationL_c =a N avecala taille d’une paire de base. Les ADN g´enomiques peuvent avoir une taille allant de mille paires de base

`

a une centaine de milliards de paires de base.¹ Deux ADN g´enomiques fr´equemment employ´es en laboratoire, `a savoir les ADN T4 et λprovenant de virus bact´eriophages, ont respectivement une taille de 166 kpb et 48 kpb, ce qui correspond `a des longueurs de contours de 52µm et 16,4 µm. Plus d’exemples sont disponibles dans le Tableau1.3.

1.1.2 Un biopolym`ere charg´e

Comme pr´ecis´e pr´ec´edemment, l’ADN est une macromol´ecule poss´edant l’une des charges lin´eaires n´egatives les plus importantes dans la nature. Une fois introduit en solution l’ADN pro- duit un polyanion et des petits cations appel´es contre-ions. Il s’agit le plus souvent des cations Na⁺et Mg²⁺ dans le cas de l’ADN commercial. Le polyanion, du fait de sa forte charge, cr´ee un fort champ ´electrique, et est donc amen´e `a interagir de fa¸con ´electrostatique avec les contre-ions.

Une analyse simplifi´ee mais pertinente de cette interaction dans le cas g´en´eral d’un poly´elec- trolyte est d´evelopp´ee dans la premi`ere section, puis pr´ecis´ee pour l’ADN dans la suivante. La nature charg´ee du biopolym`ere se traduit ´egalement par une sensibilit´e `a toutes les esp`eces char- g´ees introduites en solution, c’est-`a-dire non seulement `a la pr´esence des contre-ions, mais aussi

`

a l’ajout de divers sels en solution. L’impact de telles esp`eces sur le champ ´electrostatique cr´e´e par l’ADN, avec notamment un fort ´ecrantage, est caract´eris´e dans la derni`ere section.

1.1.2.1 Un poly´electrolyte et ses contre-ions en solution

Consid´erons dans un premier temps un poly´electrolyte, et en particulier un polyanion, en solution avec ses contre-ions dans l’eau pure.

Interactions ´electrostatique et agitation thermique D’un point de vue tr`es qualita- tif, deux ph´enom`enes entrent en concurrence lors de l’interaction entre un polyanion et ses contre-ions, `a savoir d’une part l’interaction ´electrostatique qui va avoir tendance `a localiser les

1. Un papillon, le Fritillaria assyriaca, poss`ede par exemple un g´enome de 140.10⁹ paires de bases [Emberton et al., 2005] tandis qu’une fleur japonaise, Paris japonica a l’un des plus grands g´enomes mesur´es,

`

a pr`es de 150.10⁹ paires de bases.[Pellicer et al., 2010]

contre-ions `a proximit´e du polyanion, et d’autre part l’agitation thermique qui s’oppose `a cette localisation.

– L’agitation thermique d´epend de la temp´erature et est caract´eris´ee par l’´energie thermique E_th de formule :

E_th =k_BT

avec k_B la constante de Boltzmann et T la temp´erature en Kelvin.

– Le potentiel coulombien `a grande distanceV_i,j(r) donne une id´ee de l’interaction de nature

´electrostatique entre deux particules ponctuelles de valenceZi etZj : Vi,j(r) =ZiZj e²

4πǫ₀ǫ_r 1 r

avec e la charge ´el´ementaire, ǫ₀ la permittivit´e di´electrique du vide et ǫ_r la permittivit´e di´electrique relative du milieu.

Longueur de Bjerrum Pour deux charges ponctuelles, la comp´etition entre les deux ph´eno- m`enes est comprise dans le rapport

V_i,j(r)

k_BT =Z_iZ_j e² 4πǫ₀ǫ_r×k_BT

1 r

En introduisant la longueur caract´eristique dite «de Bjerrum», not´ee ℓB et d´efinie par la relation suivante :

ℓ_B= e²

4πǫ0ǫrkBT (1.1)

le rapport des deux ´energies peut se mettre sous la forme Vi,j(r)

k_BT =ZiZj ℓB

r (1.2)

La longueur de Bjerrumℓ_Best la distance caract´eristique dans un solvant et une temp´erature donn´es `a partir de laquelle les interactions ´electrostatiques deviennent comparables `a l’agitation thermique. Dans l’eau `a 25 ^◦C, ℓ_B vaut 0,71 nm. L’Equation 1.2 montre que si r > ℓ_B alors l’agitation thermique est pr´epond´erante, tandis que si r < ℓ_B les interactions ´electrostatiques dominent.

Interaction polyanion - contre-ions Une ´etude plus pr´ecise doit ˆetre men´ee pour d´ecrire l’interaction entre un polyanion et ses contre-ions. La pr´esence d’un polyanion en solution se traduit par la cr´eation d’un potentiel ´electrostatique Φ qui attire les contre-ions avec une ´energie

´electrostatique de E_p = Z eΦ, avec Z e la charge positive des contre-ions. Une caract´erisation de l’attraction des contre-ions pour le polyanion a ´et´e ´elabor´ee par Manning et Oosawa en consid´erant un polyanion unique `a dilution infinie comme un fil infiniment long de densit´e lin´eique de charges n´egative uniforme λ. [Manning, 1969, Manning, 1978] Une application du th´eor`eme de Gauss donne alors l’expression de Φ :

Φ(r) =− λ 2πǫ_rǫ₀ lnr

Si on notebla distance entre les charges n´egatives du polyanion, on aλ=−e/bet une nouvelle expression du potentiel fait apparaˆıtre la longueur de Bjerrumℓ_B :

Φ(r) = 2ℓ_B b

k_BT e lnr

On ´etablit ensuite l’expression de la densit´e de probabilit´e de pr´esenceρdes contre-ions dans un rayon r < R autour du polyanion, en consid´erant une distribution de Maxwell-Boltzmann des contre-ions :

ρ(r≤R)∝ Z R

0 r e⁻

Ep kBT dr Soit, pour des contre-ions de valenceZ,

ρ(r≤R)∝ Z _R

0

r e^−ZeΦkBT dr En injectant l’expression de Φ, on obtient

ρ(r≤R) ∝ Z _R

0 r e^{−2ZℓbBlnr}dr

∝ Z R

0 r^{−(2ZℓbB−1)}dr

Un cas de figure int´eressant d’un point de vue physique est la divergence de l’int´egrale constat´ee si

(2Z ℓ_B

b −1)>1 soit pour ℓ_B b > 1

Z

Le rapportℓ_B/bjoue ainsi un rˆole pivot, ce qui nous am`ene `a introduire le param`etre de Manning ζ, une grandeur adimensionn´ee d´efinie par

ζ= ℓ_B

b (1.3)

La densit´e de probabilit´e de pr´esence des contre-ions autour du polyanion diverge donc si le param`etre de Manning, qui peut ˆetre vu comme un param`etre de charge caract´eristique d’un polyanion (`a travers b) dans un solvant donn´e (grˆace `aℓB), exc`ede une valeur critiqueξc qui est quant `a elle fonction de la charge des contre-ions :

ζc = 1 Z

L’interpr´etation physique de l’int´egrale divergente propos´ee par Manning est la condensation d’une fraction des contre-ions le long du polyanion.² La densit´e de charge effective, caract´eris´ee par exemple par la distanced_eff entre deux charges n´egatives du polyanion, voit alors sa valeur diminuer. Cette modification a des r´epercussions sur le potentiel ´electrostatique produit par le polyanion, et conduit `a d´efinir un nouveau param`etre de Manning apr`es condensation :

ζ_eff = ℓ_B

d_eff (1.4)

La non-divergence de l’int´egrale dans la d´efinition de la densit´e de probabilit´e des contre-ions est assur´ee pour une condensation d’ions telle que le param`etre de Manning atteigne sa valeur critiqueξ<sub>c</sub>. Dans ce cas de figure, la distance effective entre les charges n´egatives du polyanion, d<sub>eff</sub>, est alors ´egale `aZ ℓ_B. Un r´esum´e de cette situation est donn´e `a laFigure 1.4

2. Remarquons que pour un poly´electrolyte dont les caract´eristiques conduisent `a une int´egrale d´efinie, il n’y a pas de condensation observ´ee.A contrario, il y a toujours condensation pour la macromol´ecule qui nous int´eresse dans ce chapitre, `a savoir l’ADN.

Figure 1.4 – Un poly´electrolyte (en orange sur la figure) est d´efini par une taille a de ses monom`eres et par une distancebentre ses charges n´egatives. Pla¸cons nous dans une situation o`u b < Zℓ_B, c’est-`a-dire o`u ζ > ζ_c : l’interaction avec des contre-ions, pris ici monovalents, conduit alors `a une condensation le long du poly´electrolyte dans le solvant donn´e. La condensation des contre-ions modifie la densit´e de charge du poly´electrolyte, qui poss`ede alors une distance entre charge apparented_eff =Zℓ_B, soit pour une charge Z = 1 pour les contre-ions,d_eff =ℓ_B.

Application `a l’ADN et ses contre-ions L’ADN est un polyanion, on peut donc appliquer l’´etude pr´ec´edente pour caract´eriser son interaction avec ses contre-ions. On a vu que dans l’eau

`

a 25 ^◦C la longueur de Bjerrum ℓ_B vaut 0,71 nm tandis que pour l’ADN sous forme B la distance entre les charges n´egatives est de 0,17 nm. Le param`etre de Manning prend dans le cas de l’ADN une valeur de 4,2. Or quelque soit la chargeZ positive des contre-ions en solution, la valeur critique de ce param`etre est plus petite ou ´egale `a l’unit´e. On est donc dans une situation o`u il y a condensation des contre-ions (ζ > ζ_c), pour donner une mol´ecule d’ADN avec une distance apparente entre charges n´egatives de d_eff =Z×ℓ_B. Cette distance est, dans le mod`ele de Manning-Oosawa, uniquement fonction de la valence des contre-ions, de la temp´erature T utilis´ee et de la permittivit´e relativeǫ_r du solvant employ´e.

1.1.2.2 Cons´equences de la condensation des contre-ions sur l’ADN

La condensation des contre-ions le long de l’ADN produit une modification des propri´et´es de charge. Ainsi, la distance apparente entre charges n´egatives le long de l’ADN est fix´ee `a d<sub>eff</sub> = Z×ℓ<sub>B</sub> grˆace `a la neutralisation d’une certaine quantit´e de groupes phosphates.

Neutralisation de la charge La fraction des groupes phosphates de l’ADN neutralis´ee par condensation des contre-ions est not´ee θ, et est donn´ee par l’expression

θ= N_i^P −N_f^P

N_i^P = 1−N_f^P N_i^P

avecN_i^P le nombre de groupes phosphates initialement pr´esents sur le polym`ere etN<sub>f</sub><sup>P</sup> le nombre de groupes phosphates non neutralis´es apr`es condensation. Par d´efinition, on a donc en notant L la longueur totale de l’ADN :

( N_i^P = L/b N_f^P = L/d_eff

ce qui permet au final d’aboutir `a une expression du taux de neutralisation θ= 1− b

d_eff = 1− b

Z ℓ_B (1.5)

On constate `a nouveau que dans le cadre de la th´eorie de Manning Oosawa, le taux de neutralisation pour un poly´electrolyte donn´e ne peut ˆetre modifi´e qu’en changeant la valence Z des contre-ions ou en jouant sur les param`etres T et ǫ_r de travail. Une augmentation de la valence se traduit par une augmentation du taux de neutralisation. Une augmentation deT ou deǫr provoque une diminution du taux de neutralisation.

Neutralisation en pr´esence de contre-ions monovalents Utilisons la th´eorie de Manning- Oosawa afin de caract´eriser l’interaction entre une mol´ecule d’ADN en solution et ses contre-ions habituels, `a savoir les cations monovalents Na<sup>+</sup>. L’Equation´ 1.5permet de calculer le taux de neutralisation. Dans l’eau `a 25^◦C, la pr´esence de contre-ions monovalents comme Na⁺induit une neutralisation de 76% de la charge. Autrement dit, la charge effective de l’ADN n’est que 24 % de la charge due aux phosphates. Cette valeur est suffisamment faible pour expliquer l’existence de la double h´elice par minimisation de la trop forte r´epulsion ´electrostatique entre les groupes phosphates. Elle est suffisamment ´elev´ee pour rationaliser la structure en chaˆıne allong´ee, ´etudi´ee

`

a la section suivante (1.1.3), qu’adopte l’ADN en solution, par r´epulsion ´electrostatique le long du squelette de phosphates.

Le mod`ele tr`es simplifi´e de la condensation propos´e par Manning permet d’´etudier facilement l’interaction de l’ADN et de ses contres-ions, `a l’aide d’un unique param`etre ξ ais´ement d´eter- min´e. Ce mod`ele est d’autant plus utile que, de fa¸con surprenante, les conclusions de la th´eorie de Manning sur la condensation des contre-ions restent valables au-del`a des limites impos´ees par ses hypoth`eses.

Remarque :Sans remettre en cause l’utilit´e d’une vision globale du ph´enom`ene de condensation des contre-ions, soulignons toutefois la r´eelle complexit´e du ph´enom`ene. Le d´eveloppement de th´eories plus compl`etes et le recours aux simulations num´eriques de l’interaction entre l’ADN et ses contre-ions sont autant de pistes permettant de prendre en compte divers param`etres telles que la concentration en sel dans le milieu, la structure de l’ADN (taille finie de l’ADN, double h´elice) ou encore la r´epartition discr`ete des charges le long du biopolym`ere. Ainsi, de nombreuses organisations des cations condens´es sur l’ADN ont ´et´e d´ecrites, allant de la forma- tion de ponts inter- ou intramol´eculaires aux matrices bidimensionnelles quasi-cristallines dont structure rappelle celles des cristaux de Wigner. [Kornyshev, 2010]

1.1.2.3 Effet de la force ionique sur l’ADN

L’ajout d’un sel en solution, dans le but par exemple de tamponner le milieu, introduit des esp`eces charg´ees qui vont ˆetre amen´ees `a interagir d’un point de vue ´electrostatique avec l’ADN.

Deux ´equations sont utiles pour d´ecrire ce ph´enom`ene :

– l’´equation de Poisson, qui relie la densit´e de charge et le potentiel.

– la loi de distribution de Boltzmann, pour d´ecrire l’´equilibre.

Une ´equation diff´erentielle non lin´eaire du deuxi`eme ordre, dite de Poisson-Boltzmann, regroupe ces deux ph´enom`enes. Pour la r´esoudre, une approximation lin´eaire valable pour les potentiels

´electrostatiques faibles, est souvent r´ealis´ee, pour aboutir `a l’´equation de Poisson-Boltzmann lin´earis´ee dite de Debye-H¨uckel :

∆Φ = 1 λ_D² Φ

On voit apparaˆıtre une longueur caract´eristique, dite longueur de Debyeλ_D, qui est inversement proportionnelle `a la racine carr´ee de la concentration en sel :

λD= (4π ℓB

X

i

Zi2ρi)^−1/2

avec ρ_i la densit´e de particules de valence Z_i en mol´ecules par m`etres cubes. En solution dilu´ee, les concentrations molaires (c_i en mol.L⁻¹) sont bien plus fr´equemment employ´ees. Or

ρ_i= 10³Nac_i avec Na la constante d^′Avogadro

ce qui donne une nouvelle expression de la longueur de Debye λ_D faisant intervenir la force ionique I :

λ_D= (8π10³Naℓ_BI)^−1/2 avec I = 1 2

X

i

Z_i²c_i (1.6)

Pour mieux comprendre sa signification physique, observons le potentiel Φi obtenu par la r´esolution en coordonn´ees sph´eriques de l’´equation de Debye-H¨uckel :

Φi(r) =ZℓB

r e⁻

r λD

Ainsi, un cation proche de l’ADN (r < λ_D) ressent bien un potentiel ´electrostatique cou- lombien en 1/r, tandis que les cations plus ´eloign´es (r > λ_D) ressentent un potentiel fortement affaibli par la pr´esence des autres charges. La distance de Debye est donc une distance carac- t´eristique de la port´ee du potentiel ´electrostatique pour une solution comprenant des esp`eces charg´ees. Une solution d’eau pure«th´eorique», comprenant uniquement les ions HO<sup>−</sup>et H<sub>3</sub>O<sup>+</sup> issus de l’autoprotolyse de l’eau, induit une longueur de Debye d’environ 1µm. L’ajout d’esp`eces charg´ees provoque une diminution deλ_D. Une solution de sel monovalent `a 0,1 mM a ainsi une longueur de Debye bien plus faible qui vaut environ 3 nm.

La th´eorie de Manning d´ecrivait le passage entre deux ´etats, l’un dans lequel les ions sont localis´es et l’autre pour lequel les ions sont libres. Dans la description bas´ee sur l’´equation de Poisson Boltzmann, on ne prend pas en compte d’´etat localis´e en d´ecrivant une distribution continue des ions dans le milieu. Notons que la longueur de Debye est en g´en´eral nettement plus grande que la longueur de Bjerrum. Ainsi, il est possible de diff´erencier une r´egion proche de l’ADN telle que les interactions ´electrostatiques sont plus grandes quek_BT, au sein de laquelle les contre-ions vont s’associer `a l’ADN, et une r´egion plus ´eloign´ee de la chaˆıne o`u les ions sont libres car l’´energie thermique est plus forte que les interactions ´electrostatiques. La d´emarcation entre ces deux zones se trouve `a quelques fois la distancebautour de l’ADN.[Barrat and Joanny, 1997]

1.1.3 Un biopolym`ere semi-flexible

L’ADN est un polym`ere de nucl´eotides, dont la conformation peut ˆetre ´etudi´ee en observant tout d’abord celles adopt´ees par les chaˆınes de polym`eres non charg´es, puis en prenant en compte les effets de la charge, avec des r´epulsions ´electrostatiques entre monom`eres qui allongent un peu plus la chaˆıne

1.1.3.1 La longueur de persistance d’un polym`ere

D´efinition Pour un polym`ere neutre, la longueur de persistance not´ee ℓP correspond `a la longueur au-del`a de laquelle l’orientation du n-i`eme monom`ere ne d´epend plus de l’orientation du premier monom`ere, c’est-`a-dire au bout de laquelle les corr´elations d’orientation le long d’une chaˆıne sont perdues du fait des fluctuations thermiques. Il s’agit ainsi d’un param`etre traduisant la rigidit´e d’un polym`ere : plusℓ<sub>P</sub>est grande, plus le polym`ere est rigide

La comparaison entre la longueur de contour du polym`ere, not´ee L<sub>c</sub>, et sa longueur de persistance permet de caract´eriser une tr`es vaste gamme de rigidit´e mol´eculaire, du bˆatonnet `a la pelote flexible.

– si L_c < ℓ_P : les polym`eres agissent comme des bˆatonnets rigides.

– si Lc > ℓP : les polym`eres se comportent comme des pelotes flexibles

Longueur de persistance de l’ADN L’ADN double brin a une longueur de persistance de 50 nm, ce qui correspond `a 150 pb. La taille caract´eristique de l’ADN d´epend du nombre de paires de bases que le polym`ere contient. En particulier, les petits ADN d’une centaine de paires de bases (oligonucl´eotides appari´es), pour lesquels L < ℓ_P, sont des polyanions rigides tandis que les ADN plasmidiques ou g´enomiques, souvent de plusieurs milliers de paires de bases, n’ont pas de rigidit´e `a grande ´echelle. Par contre, on a toujours a < ℓ<sub>P</sub>. Un tel polym`ere est dit semi-flexible. Remarquons qu’en absence de la double h´elice, pour un simple brin d’ADN, la longueur de persistance devient bien plus faible, avec ℓ_P de l’ordre de grandeur du nanom`etre.

Cette valeur est proche de celles obtenues dans le cas des polym`eres organiques synth´etiques usuels. La structure en double h´elice, rendue possible par l’appariement des bases le long de l’axe, rigidifie donc consid´erablement l’ADN et joue ainsi un rˆole important dans les propri´et´es m´ecaniques de l’ADN.

Deux ´echelles de rigidit´e de l’ADN Comparons deux grandeurs caract´eristiques de l’ADN

`

a sa longueur de persistance. D’une part, consid´erons la longueur de contours d’une mol´ecule d’ADN de plusieurs milliers de paires de bases, qui est bien plus grande que la longueur de persistance. D’autre part consid´erons le pas d’une h´elice d’ADN,p= 3,4 nm, de longueur bien plus faible que la longueur de persistance de 50 nm. Cette vision sur deux ´echelles montre que l’ADN se comporte comme une chaˆıne semi-flexible fluctuante, rigide `a courte distance et flexible

`

a plus grande distance.

Effet de la charge Les charges le long du contours de l’ADN, s´epar´ees d’une longueur ℓ_B en pr´esence de contre-ions monovalents suite `a la condensation de Manning, sont amen´ees `a interagir entre elles (ℓ_B < λ_D).[Barrat and Joanny, 1997] Pour des polym`eres semi-flexibles fortement charg´es comme l’ADN, de longueur de persistance intrins`eque ℓ_P , Odijk, Skolnick et Fixman ont propos´e un mod`ele pour calculer la longueur de persistance en pr´esence de charge ℓ<sup>T</sup><sub>P</sub> en consid´erant la relation tr`es simple

ℓ^T_P=ℓ_P+ℓ_e

avec ℓ_e la longueur additionnelle due `a la charge, aussi appel´ee longueur de Odijk-Skolnick- Fixman.

Or, pour un polym`ere semi-flexible avec une distance entre les charges effective de ℓ_Bdu fait de la condensation des contres ions, on a

ℓ_e= 1 4

λ_D² ℓB

(1.7) On voit donc que la longueur de persistance augmente du fait de la charge le long du bio- polym`ere. Lorsque les charges ne sont pas ´ecrant´ees, l’ADN voit sa rigidit´e augmenter. Plus pr´ecis´ement, la d´ependance en λ_D² se traduit par une longueur ℓ_e inversement proportionnelle

`

a la concentration en sel. L’ajout de sel dans le milieu se traduit au final par une longueur de persistance totale qui d´ecroˆıt, car la contribution de la r´epulsion entre charges le long du poly- m`ere est amen´ee `a diminuer. Des simulations num´eriques ont pr´ecis´e les limites de ce mod`ele, en montrant que pour des forces ioniques tr`es ´elev´ees la d´ependance en λ_D plutˆot qu’en λ_D². Des

´etudes exp´erimentales ont d’ailleurs ´etabli, pour une concentration en ion sodium de 1 mM `a 10 mM, qu’une diminution de la concentration en Na⁺ se traduit par une forte augmentation de la longueur de persistance. Pour des concentrations plus ´elev´ees, la d´ependance est nettement moins marqu´ee.[Hagerman, 1988]

1.1.3.2 Longueurs caract´eristiques des polym`eres

Longueur bout `a bout dans un polym`ere id´eal Un polym`ere id´eal est d´ecrit par une chaˆıne constitu´ee de N segments rigides de longueur a accroch´es les uns aux autres, avec une libert´e totale d’orientation. Il n’y a ainsi pas d’interaction entre les segments. Sa longueur de contoursL_c est simplement d´efinie par la relationL_c=a N. La chaˆıne va toutefois ˆetre amen´ee

`

a adopter une conformation repli´ee pour minimiser le coˆut entropique. Une telle conformation est habituellement caract´eris´ee par sa longueur«bout `a bout» not´eeRd´efinit comme la racine carr´ee de l’´ecart quadratique moyen entre les extr´emit´es de la chaˆıne. Dans le cas d’un polym`ere id´eal, la chaˆıne a des conformations obtenues par marche al´eatoire. Toutes les conformations

´etant ´equiprobables, la longueur moyenne bout `a bout R<sub>0</sub> d’une conformation, dite pelote, est reli´ee `a la taillead’un monom`ere et au nombre N de monom`eres par la relation :

R₀ ∝a N^1/2 (1.8)

Effet du solvant La conformation adopt´ee par un polym`ere est fonction des interactions qui s’´etablissent entre les monom`eres et le solvant. Selon les interactions monom`ere-monom`ere et monom`ere-solvant, la distance bout `a bout R caract´eristique de la conformation voit sa d´ependance vis-`a-vis deN varier. Une expression g´en´erale de R est donn´ee par

R∝a N^ν (1.9)

avec ala taille d’un monom`ere, N le nombre de monom`eres et ν un exposant traduisant l’effet du solvant.

– un solvant id´eal, pour lequel les interactions monom`ere-monom`ere sont compl`etement ´equi- valentes aux interactions monom`ere-solvant, est caract´eris´e parν = 1/2. On retrouveR₀.

– un bon solvant, pour lequel les interactions monom`ere-solvant sont plus favorables que les interactions monom`ere-monom`ere, correspond `a ν = 3/5. La pelote subit alors un gonflement par rapport `a R₀.

– un mauvais solvant, pour lequel les interactions solvant -monom`ere sont d´efavorables, se traduit par ν = 1/3. La pelote est effondr´ee sur elle-mˆeme, permettant une occupation dense de l’espace par le polym`ere et donc un contact minimum avec les mol´ecules de solvant.

Remarquons que pour d´ecrire les diff´erents cat´egories de solvant, du bon au mauvais solvant, l’exposantν varie peu. L’effet est tout de mˆeme fort, de fait du grand nombreN de monom`eres au sein d’un polym`ere. Pour un polym`ere compos´e de 1000 monom`eres, on a un rapport R/R0

dans le cas d’un mauvais solvant de 0,05 ce qui correspond `a un r´eel effondrement de la chaˆıne.

Dans le cas d’un bon solvant, le rapportR/R₀ vaut 3, ce qui traduit un gonflement de la chaˆıne lorsque les mol´ecules de solvant essayent d’ˆetre tout autour de la chaˆıne.

Influence de la longueur de persistance Pour un polym`ere r´eel dans un solvant id´eal, la conformation adopt´ee par la chaˆıne n’est pas due `a une simple marche al´eatoire, car les interactions entre monom`eres se traduisent par des orientations ´energ´etiquement plus favorables.

On peut toutefois r´eutiliser le r´esultat ´etabli dans le cas id´eal en consid´erant un polym`ere

´equivalent constitu´e de segments de tailleℓ_P . En effet, les corr´elations entre les segments d’un polym`ere ne sont plus perceptibles au-del`a de la longueur de persistance, on peut donc consid´erer que les segments du polym`ere n’interagissent pas les uns avec autres :

R∝ℓ_PN_p^1/2

avecNp le nombre de segments de longueur ℓP compris dans la chaˆıne de longueur Lc

R∝ℓ_P Lc

ℓ_P 1/2

Or la chaˆıne de longueur L_c est compos´ee de N monom`eres de taille caract´eristique a, ce qui permet d’aboutir `a la relation

R∝a^1/2ℓ_P^1/2N^1/2

En particulier, siℓ_Paugmente, du fait par exemple de la charge d’un polym`ere comme l’ADN, la pelote statistique voit sa taille augmenter. Au contraire, si la force ionique augmente, alors la diminution deℓP se traduit par une pelote statistique de plus petite taille.

1.1.4 Points clefs des propri´et´es physico-chimiques de l’ADN

Les valeurs des grandeurs caract´eristiques ´etudi´ees dans les deux derni`eres sections sont regroup´ees dans leTableau 1.2.

Longueurs caract´eristiques du solvant

longueur de Bjerrum ℓ_B 0,71 nm (eau pure)

longueur de Debye λ_D 10, 3 et 1 nm

pour [NaCl] de 1, 10 et 100 mM Param`etres de l’ADN

longueur de persistance ℓ_P 50 nm

param`etre de Manning ζ 4,2

distance entre charge apr`es condensation d_eff Z ℓ_B

Tableau 1.2 – R´ecapitulatif des grandeurs clefs lors de la caract´erisation du comportement de l’ADN comme biopolym`ere semi-flexible poss´edant une forte densit´e lin´eique n´egative. Toutes les valeurs sont donn´ees pour une temp´erature de 25 ^◦C.

Les deux caract´eristiques de l’ADN mises en avant dans cette section, `a savoir la forte densit´e de charge n´egative de l’ADN et sa semi-flexibilit´e, impliquent

– une forte interaction de l’ADN avec les esp`eces charg´ees en solution, avec notamment une condensation des contre-ions `a proximit´e de l’ADN et un ´ecrantage ´electrosta- tique au-del`a de la longueur de Debye λ_D.

– une forte r´epulsion entre les segments d’ADN, avec des distancesd_effentre charges n´egatives d´ependant du solvant (ℓ_B) et des contre-ions (chargeZ).

– une forte rigidit´e `a petite ´echelle, de l’ordre de la longueur de persistanceℓ_P, sensible aux propri´et´es de la solution comme la force ionique.

1.2 Une structure ` a grande ´ echelle stimulable : la compaction de l’ADN

L’ADN peut subir de tr`es forts changements structurels `a grande ´echelle, lorsque la chaˆıne, initialement sous forme de pelote statistique, s’effondre sur elle-mˆeme pour former une structure tr`es compacte, occupant un volume fortement r´eduit par rapport `a celui de la pelote. Le passage d’une chaˆıne allong´ee vers une phase tr`es compacte est traditionnellement d´ecrit par le terme de condensation de l’ADN, ce qui peut prˆeter `a confusion notamment du fait de la condensation des contre-ions d´ecrite pr´ec´edemment. Nous lui pr´ef`ererons le terme de compaction de l’ADN, moins ambigu et d´ecrivant une r´ealit´e physique plus vaste. LaFigure1.5) r´esume de fa¸con sch´ematique la compaction d’une mol´ecule d’ADN (sch´ema a), et montre des images de mol´ecules d’ADN avant et apr`es compaction (images enb etc). Ce ph´enom`ene physique, pr´esentin vivo (section 1.2.1.1), peut ˆetre reproduitin vitro par introduction d’esp`eces favorisant la transition (section 1.2.1.2), notamment `a l’aide d’agents de compaction cationique d´ecrits `a la section (1.2.2).

Figure 1.5 – a) Sch´ema g´en´eral de la compaction, avec un effondrement de la chaˆıne sur elle- mˆeme b) Images de microscopie de fluorescence issues de [Yoshikawa et al., 2013] permettant de visualiser `a gauche (resp. `a droite) l’ADN T4 en l’absence (resp. en pr´esence) d’un agent de compaction, ici des polyamines t´etravalentes chirales. La barre d’´echelle vaut 5µm. c) Images par microscopie `a force atomique issues de [Venancio-Marques et al., 2014a] montrant sur la gauche (resp. sur la droite) un ADN de 4,5 kpb avant (resp. apr`es) compaction, avec une barre d’´echelle de 500 nm. L’agent de compaction est ici une polyamine photosensible (voir leChapitre2).

1.2.1 Modification de la conformation de l’ADN

Le changement de conformation que subit l’ADN, d’une chaˆıne d´epli´ee vers un ´etat compact se traduit par une modification drastique de la structure `a grande ´echelle de l’ADN. Bien que la r´eduction d’un facteur 10<sup>2</sup> `a 10⁵ des longueurs caract´eristiques au cours de la compaction s’accompagne naturellement d’un coˆut ´energ´etique, [Bloomfield, 1997],³ l’ADN compact peut

3. Le coˆut ´energ´etique est `a relier aux faibles rayons de courbure adopt´es par l’ADN pour atteindre une taille caract´eristique de l’ordre de sa longueur de persistance (1/300kBT par pb) ; `a la perte d’entropie lors de la d´emixtion entre l’ADN et le solvant (1/150kBT par pb) ; aux interactions ´electrostatiques entre les segments

ˆetre observ´e dans de nombreuses situations, aussi bienin vivo quein vitro.

1.2.1.1 Compaction in vivo

L’´etat tr`es dense de l’ADN est fr´equemment rencontr´e dans la nature, car la taille moyenne d’un g´enome est consid´erablement plus grande que le compartiment qui le contient. Des exemples mettant en avant ces diff´erences d’´echelle entre les mol´ecules d’ADN et leurs compartiments pour plusieurs types d’organismes sont donn´es dans le Tableau 1.3. La longueur de contour est retenue comme mesure de la taille de l’ADN tandis qu’une dimension caract´eristique du compartiment (capside de virus, noyau de cellule...) est fournie. Notons que bien souvent, les derniers ne contiennent pas uniquement l’ADN, mais ´egalement des prot´eines et d’autres mol´e- cules biologiques.

Taille du Facteur de Taille de l’ADN compartiment compaction Virus bact´eriophages

ADNλ 48,5 kpb 16 µm 190 nm 84

ADN T4 166 kpb 52 µm 130 nm 400

ADN T7 39,9 kpb 12 µm 78 nm 154

Bact´erie

Chromosome deE. Coli 4,7 10⁶ pb 1,7 mm 2µm 850

Eucaryotes

ADN de levure 13,5 kpb 4,6 mm 10 µm 460

ADN humain 3,4 10⁹ pb 2 m 5 `a 7µm 3 10⁵

Tableau 1.3 – La longueur de contour de l’ADN et les dimensions caract´eristiques du comparti- ment contenant cet ADN sont pr´ecis´ees pour diff´erents organismes. La derni`ere colonne donne le rapport entre ces grandeurs.

La Figure 1.6 permet de visualiser les diff´erences de taille notables entre une mol´ecule d’ADN T4 et la capside dans laquelle elle est contenue, `a l’aide ici d’observations par microscopie

´electronique. Remarquons que l’insertion de l’ADN T4 dans la capside du virus requiert l’action d’un moteur mol´eculaire.[Casjens, 2011,Jermy, 2011]

Une caract´eristique de la compaction in vivo qu’il convient de garder `a l’esprit, outre son fort coˆut ´energ´etique, est sa r´eversibilit´e. En effet, le ph´enom`ene de compaction doit rester dynamique, en ´etant coupl´e avec un ph´enom`ene de d´ecompaction finement r´egul´e, pour permettre une modulation dans le temps et dans l’espace des fonctions biologiques de l’ADN. Consid´erons par exemple la compaction de l’ADN humain (derni`ere ligne du Tableau 1.3) par des petites prot´eines, les histones, pour mettre en ´evidence la r´eversibilit´e de la compaction in vivo. Pour simplifier, admettons que l’interaction entre l’ADN et les histones soit essentiellement de nature

´electrostatique. Dans les conditions physiologiques, certains acides amin´es des histones (comme les lysines) poss`edent une charge positive : l’interaction entre l’ADN charg´e n´egativement et les histones est favorable, et l’ADN peut se compacter. La machinerie cellulaire n’a alors plus acc`es `a l’information port´ee par la mol´ecule d’ADN. L’´edifice ADN-histone est susceptible d’ˆetre d´efavoris´e par modification de la charge des histones. Une ac´etylation enzymatique des lysines

d’ADN (0,11 `a 0,14kBT par pb).

Figure 1.6 – Un ADN T4 issu d’un virus bact´eriophage poss`ede une longueur de contour de 52µm tandis que le virus mesure environ 200 nm par 90 nm. L’ADN doit donc subir une com- paction drastique pour tenir dans la particule virale. Les deux images obtenues par microscopie

´electronique (source : ICTV) sont `a la mˆeme ´echelle.

appartenant aux histones se solde en effet par une perte de charges positives, et se traduit par une d´ecompaction de l’ADN. La voie inverse, avec une d´eac´etalysation enzymatique, induit

`

a nouveau la compaction. La strat´egie utilis´ee in vivo donne ainsi lieu `a un m´ecanisme de compaction modulable et dynamique.

L’observation de la compaction in vivo met en avant le changement de structure `a grande

´echelle drastique qu’est capable de subir l’ADN, avec un fort contrˆole de l’environnement bio- logique sur le ph´enom`ene. L’efficacit´e et la r´eversibilit´e de la stimulation de l’ADN dans divers organismes a ainsi ´eveill´e l’int´erˆet des physico-chimistes, qui ont ´et´e `a leur tour amen´es `a proposer des pistes de compactionin vitro.

1.2.1.2 M´ethodes de compaction

Motivation pour ´etablir un contrˆole de compaction-d´ecompaction La compr´ehension du ph´enom`ene de compaction de l’ADN offre de nombreux d´efis physico-chimiques, relev´es par l’importance de cette mol´ecule dans de nombreux domaines. D’un point de vue fondamental, une meilleure compr´ehension de la compaction et de la d´ecompaction de l’ADN peut approfondir notre compr´ehension d’´ev`enements biologiques de premier ordre, que ce soit l’arrangement com- pact de l’ADN viral dans les capsides ou le repliement des chromosomes dans nos cellules. D’un point de vue plus pratique, ce changement de structure `a grande ´echelle de l’ADN poss`ede un fort potentiel au niveau des applications biotechnologiques et m´edicales, en particulier pour les th´e- rapies g´eniques. En effet, ces th´erapies reposent sur des techniques de transfection, c’est-`a-dire d’injection d’ADN dans une cellule. Un ADN compact est plus facilement capable de traver- ser les membranes biologiques et est moins susceptible d’ˆetre endommag´e par des contraintes physiques que son homologue d´epli´e. Une fois introduit dans la cible, l’ADN doit ˆetre relargu´e