Correction des exercices du TD 2 Correction exercice 1
1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie échangeuse d'ions. Une résine polystyrénique substituée par des groupements sulfonate (-SO3-) est chargée négativement et est donc une résine échangeuse de cations.
Lorsque le pH est supérieur au pHi (pH > pHi), l'acide aminé est chargé négativement (forme anionique).
Lorsque le pH est inférieur au pHi (pH < pHi), l'acide aminé est chargé positivement (forme cationique).
Le tableau ci-dessous donne les charges des 3 acides aminés, à pH = 2 et à pH = 7.
acide aminé
Acide L-Glutamique (Glu) L-Leucine (Leu)
L-Lysine (Lys)
pHi 3,22 5,98 9,74
charge à pH = 2 +
+ +
charge à pH = 7 -
- +
Ainsi, à pH = 2, les trois acides aminés sont chargés positivement, et seront retenus lors du passage sur la colonne.
A pH = 7, seuls Glu et Leu, chargés négativement, seront élués. Lys reste fixé à la colonne.
Glu est élué en premier (pHi = 3,22) puis Leu l'est ensuite (pHi = 5,98).
Correction exercice 2
1 - Proportion des groupements carboxyméthyls (pKa = 4,76) chargés négativement aux pH : 1, 4,76, 7 et 9.
Le pH est donné par la relation suivante :
[On considère que [A] est la forme acide (-CH2-COOH), et [B] est la forme base (-CH2-COO-)]
À pH = 1 : = pH - pKa = 1 - 4,76 = -3,76 donc : = 1,74 10-4
Sachant que [A] + [B] = 100 % et que [B] = 1,74 10-4.[A], on en déduit que [A] + 1,74 10-4.[A] = 100 Donc : [A] = 100 /(1 + 1,74 10-4)
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : [A] = 99,98 % et [B] = 0,02 % De la même manière, on peut calculer le pourcentages des formes (A) et (B) aux autres pH : À pH = 4,76 : = pH - pKa = 4,76 - 4,76 = 0 donc : = 1
[A] + [B] = 100 % et [B] = [A] [A] + [A] = 100 Donc : [A] = 100 /(2) , [A] = 50 % et [B] = 50 %
À pH = 7 : = pH - pKa = 7 - 4,76 = 2,24 donc : = 173,78 [A] + [B] = 100 % et [B] = 173,78[A] [A] + 173,78[A] = 100
Donc : [A] = 100 /(174,78) ; [A] = 0,575 % et [B] = 99,425 %
À pH = 9 : = pH - pKa = 9 - 4,76 = 4,24 donc : = 13378 [A] + [B] = 100 % et [B] = 173,78[A] [A] + 13378[A] = 100
Donc : [A] = 100 /(13379) ; [A] = 5,73 10-3 % et [B] = 99,994 %
- Globalement, on peut donc constater qu'à un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements carboxyméthyls se présenteront majoritairement sous forme acide (-CH2-COOH).
À l'inverse, à un pH supérieur au pKa (pH basique), les groupements carboxyméthyls se présenteront majoritairement sous forme basique (-CH2-COO-)
2 - À pH = 7, on a pu calculer que la résine était à 99,425 % sous forme basique, chargée négativement (-CH2-COO-).
Protéine Ovalbumine Cytochrome c
Lysozyme
pHi 4,6 10,65
11
Charge à ph = 7 négative
positive positive
Ainsi, seule l'ovalbumine, qui à pH = 7 est chargée négativement, ne sera pas retenue sur la colone. Le cytochrome c et le lysosyme seront retenus.
Correction exercice 3
1 - Proportion des groupements diéthylaminoéthyls (DEAE : pKa = 9,4) chargés négativement aux pH : 2, 7, 9,4 et 12. (calculer les proportions de la même manière que dans l’exercice 2) ;
Le pH est donné par la relation suivante :
À pH = 2 : = pH - pKa = 2 - 9,4 = -7,4 donc : = 3,98 10-6
Sachant que [A] + [B] = 100 % et que [B] = 3,98 10-6.[A], on en déduit que [A] + 3,98 10-6.[A] = 100 Donc : [A] = 100 /(1 + 3,98 10-6)
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : [A] = environ 100 % et [B] = 0 % À pH = 7 : = pH - pKa = 7 - 9,4 = -2,4 donc : = 3,98 10-3
[A] + [B] = 100 % et [B] = 3,98 10-3.[A] [A] + 3,98 10-3.[A] = 100 Donc : [A] = 100 /(1 + 3,98 10-3) ; [A] = 99,996 % et [B] = 0,004 % À pH = 9,4 : = pH - pKa = 9,4 - 9,4 = 0 donc : = 1
[A] + [B] = 100 % et [B] = [A] [A] + [A] = 100
Donc : [A] = 100 /(2) ; [A] et [B] : [A] = 50 % et [B] = 50 %
À pH = 12 : = pH - pKa = 12 - 9,4 = 2,6 donc : = 398,1 [A] + [B] = 100 % et [B] = 398,1[A] [A] + 398,1[A] = 100
Donc : [A] = 100 /(1 + 398,1) ; [A] = 0,25 % et [B] = 99,75 %
- Globalement, on peut donc constater qu'à un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements diéthylaminoéthyls se présenteront majoritairement sous forme acide (-NH+).
À l'inverse, à un pH supérieur au pKa (pH basique), les groupements diéthylaminoéthyls se présenteront majoritairement sous forme basique (-N)
2 - À pH = 7, on a pu calculer que la résine était à 99,996 % sous forme acide (-NH+), chargée positivement.
Protéine Sérumalbumine
Uréase Chymotrypsinogène
pHi 4,9
5 9,5
Charge à ph = 7 négative négative positive
Ainsi, à pH = 7 la sérumalbumine et l'uréase sont chargées négativement, et seront donc retenues sur la colone. Le chymotrypsinogène ne sera pas retenus.
Correction exercice 4
Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations. L'élution est effectuée à l'aide d'un tampon à pH = 6.
Question : dans quel ordre peut-on prévoir la sortie de ces acides aminés ?
Si les trois acides aminés ont été retenus sur la colonne, c'est que la charge de la colonne a été réalisée à un pH inférieur au plus petit des pHi, soit un pH inférieur à 2,87, afin que les acides aminés se présentent sous une forme chargée positivement et qu'ils puissent être retenus sar la résine échangeuse de cations, chargée négativement.
Acide aminé : pHi Charge à pH < 2,87 Charge à pH 6
Asp 2,87 + -
Leu 6 + neutre (50%/50%)
Arg 10,76 + +
À un pH de 6, Asp est chargé négativement; il est donc élué de la colonne. La leucine est ensuite éluée.
L'Arginine, toujours chargée positivement à pH = 6 reste sur la colonne et n'est donc pas éluée.
