Astrocytome pilocytique Grade I* Astrocytome Grade II Astrocytome anaplasique Grade III Glioblastome Grade IV

(1)

*Excepté les astrocytome pilomyxoïde de grade II

Tableau 1 | Principaux sous-groupes histologiques de tumeurs gliales d’origine astrocytaire et oligodendrogliale et leur classification en grade par l’OMS (Louis et coll. 2007a).

Figure 1 | Représentation schématique du pattern de croissance d’un glioblastome (Claes et coll., 2007).

Dans le parenchyme cérébral (a), nous observons en (b) l’accumulation péri-vasculaire de cellules tumorales, avec une satellitose péri-neuronale et une accumulation subpiale (les vaisseaux sanguins sont représentés en rouge, les cellules tumorales en bleu, les neurones en vert et les cellules tumorales prolifératives en noir) ; (c) illustration d’une migration cellulaire intrafasciculaire dans le corps calleux ; (d) présence de nécrose, typique d’un glioblastome, entourée d’une pseudopalissade de cellules tumorales et une prolifération microvasculaire glomérulaire.

Tumeurs Astrocytaires

Astrocytome pilocytique Grade I*

Astrocytome Grade II

Astrocytome anaplasique

Grade III Glioblastome Grade IV

Tumeurs Oligodendrogliales

Oligodendrogliome Grade II Oligodendrogliome

anaplasique

Grade III

Gliomes Mixtes

Oligoastrocytome Grade II Oligoastrocytome

anaplasique

Grade III

(2)

VEGF(or bFGF)

MMPs

Receptor protein Cancer cell

Endothelial cell

Matrix

Angiogenesis inhibitors

MMPs (matrix metalloproteinases), VEGF (vascular endothelial growth factor), bFGF(basic fibroblast growth factor)

Figure 2 | Illustration des voies thérapeutiques anti-angiogéniques (adapté de Da Silva, 2005).

Les inhibiteurs de l’angiogenèse peuvent interférer à différents niveaux de la cascade pro-angiogénique :

- en interférant dans l’interaction entre facteurs pro-angiogéniques et récepteurs cellulaires. Ainsi l’activation de l’angiogenèse par le facteur de croissance vasculaire d’origine endothéliale (VEGF) secrété par la tumeur peut être bloquée, par exemple, par des anticorps ;

- en inhibant la prolifération des cellules endothéliales. Cette prolifération peut être inhibée par des agents agissant sur le cycle cellulaire ou par des agents empêchant la maturation des cellules endothéliales ;

- en inhibant la migration des cellules endothéliales dans la matrice extracellulaire. La dégradation de la matrice extracellulaire par les cellules endothéliales activées par les facteurs de croissances peut également être prévenue.

(3)

WB = Western blot

Tableau 2 | Principales caractéristiques de l’apoptose et de l’autophagie (d’après Okada et Mak, 2004)

.

Type de mort

cellulaire

Changements morphologiques Biochimie Méthodes de détection

Noyau Membrane

cellulaire

Cytoplasme Apoptose Condensation de la

chromatine, fragmentation

nucléaire, fragmentation internucléosomique

de l’ADN

Protubérance membranaire

Fragmentation (formation de

corps apoptotiques)

Caspases- dépendante

Microscopie électronique, marquage TUNEL, marquage annexine V, essai de fragmentation de

l’ADN, essai d’activité des caspases, détection de

changement dans le potentiel des membranes

mitochondriales.

Par WB clivage de PARP Autophagie Condensation

partielle de la chromatine, pas de

fragmentation internucléosomique

de l’ADN

Protubérance membranaire

Augmentation du nombre de

vésicules autophagiques

Activité lysosomiale accrue, caspases-

indépendante

Microscopie électronique, essai de dégradation

protéique, essai de translocation protéique

dans les membranes autophagiques, marquage

monodensylcadavérine.

Par WB, expression de Beclin1, LC3 I/II

(4)

Figure 3 | Les voies de signalisation du processus d’apoptose (Duikera et coll., 2006 ; Fulda et Debatin, 2006).

La voie extrinsèque : TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) sous forme d’homotrimère se lie aux récepteurs membranaires de mort DR4/DR5 provoquant leur trimérisation puis leur assemblage au complexe DISC (death-inducing signalling complex). Une fois le message perçu, la transmission du message s’effectue par l’intermédiaire de la protéine adaptatrice FADD (Fas-associated death domain) qui interagit avec la caspase-8.

L’activation subséquente des caspases-3, 6 et 7, par un clivage protéolytique de la caspase-8, induit l’autodestruction cellulaire en clivant les composantes essentielles au maintien de la vie cellulaire.

La voie intrinsèque : fait intervenir des protéines régulatrices de la famille Bcl-2 connues pour leur activité pro- apoptotique (Bax et Bak) ou anti-apoptotique (Bcl-2 et Bcl-XL). L’action de Bax/Bak provoque la perméabilisation de la membrane mitochondriale entraînant les relâchements consécutifs du cytochrome c dans le cytosol et d’autres facteurs induisant l’apoptose (AIF (Apoptosis Inducing Factor), l’endonucléase G, Smac (second mitochondria-derived activator of caspases)/DIABLO et Omi/HtrA2). Le cytochrome c peut intervenir sur la cascade des caspases en se liant avec la protéine Apaf-1 (apoptosis protease-activiting factor-1) pour former l’apoptosome en présence d’ATP. L’apoptosome se lie à la procaspase-9 afin d’activer la caspase-9.

L’activation de cette caspase initiatrice mène à l’activation des caspases effectrices, telles les caspases-3, 6 et 7.

Toutes ces activités conduisent à l’autodestruction cellulaire. Le clivage de la protéine pro-apoptotique Bid par la caspase-8 activée permet aussi la libération de cytochrome c, créant ainsi un lien entre ces deux voies d’induction de l’apoptose.

(5)

Figure 6 | La régulation moléculaire de l’autophagie (Kondo, 2005).

La voie de signalisation comprenant la PI3K de type I (phosphatidylinositol 3- kinase-classe I), les kinases Akt/PKB et mTOR (mammalian target of rapamycin) est impliquée dans la survie des cellules cancéreuses par résistance à l’apoptose et inhibe également le mécanisme d’autophagie. Par contre, la voie de signalisation activée par le complexe PI3K de type III/beclin1 permet son induction. D’autres protéines régulatrices peuvent intervenir, pour induire l’autophagie, comme les suppresseurs de tumeur PTEN (phosphatase and tensin homologue) et p53, ou l’inhiber tel l’oncogène RAS (quand il active la PI3K de type I). La sous-expression de BCL2 ou, au contraire, la sur-expression de BNIP3 (BCL2–adenovirus E1B 19-kD-interacting protein 3) et HSPIN1 (a human homologue of the Drosophila melanogaster spin gene-product) au niveau mitochondrial déclenche aussi le mécanisme d’autophagie. L’oncogène RAS, dont le rôle peut être dual sur l’autophagie, peut aussi stimuler l’autophagie en activant sélectivement la cascade Raf1/MEK/ERK (mitogen-activated protein kinase kinase /extracellular signal- regulated kinase). D’autres facteurs, telles les protéines DAPK (cell death-associated protein kinase) et DRP1 (death-associated related protein kinase 1), sont nécessaires au processus d’autophagie.

(6)

Figure 7 | Représentation schématique des 5 étapes de la migration des cellules cancéreuses isolées en interaction avec la MEC (Friedl et Wolf, 2003)

Etape 1 : Polarisation cellulaire avec formation de protrusions membranaires à partir de la polymérisation localisée de filaments d’actine aux bords extrêmes de la cellule. Au front de migration de la cellule, les petites Rho-GTPases, Cdc42 et Rac1, induisent la polymérisation de l’actine résultant en la formation de filopodes et lamellipodes qui vont permettre à la cellule d’avancer. Etape 2 : Interaction des parties extracellulaires des intégrines avec les composants de la MEC et formation de contacts focaux et de complexes d’adhésion. Etape 3 : Protéolyse focalisée de la MEC au point de contact cellule/MEC par recrutement de protéases à la surface membranaire. Etape 4 : Contraction des filaments d’actomyosine poussant la cellule vers l’avant (l’activation de la myosine II provoque sa liaison avec les filaments d’actine, ce qui génère une contraction cellulaire). Etape 5 : Désassemblage des contacts focaux : raccourcissement des filaments d’actine, clivage des composants des contacts focaux par une protéase cytoplasmique (calpaïne) et désassemblage par les FAK.

(7)

Figure 8 | Voies de signalisation moléculaire responsables de la résistance à la chimiothérapie de type pro- apoptotique (Guo et Giancotti, 2004).

La liaison d’un ligand aux récepteurs à tyrosine kinases (RTKs) provoque sa dimérisation activant sa fonction tyrosine kinase. Le récepteur ainsi autophosphorylé initie une cascade de transduction de signal impliquée dans la prolifération et la survie cellulaire. Les voies de signalisation RAS (rat sarcoma protein)/Raf//MAPK (mitogen- activated protein kinase) et PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) / Akt (serin/threonin kinase B protein) / NFB (nuclear factor-B) sont impliquées dans la résistance au processus apoptotique. Les voies de signalisation activées par les intégrines via les kinases de la famille des Src (SFKs) sont suffisantes pour induire la migration cellulaire et conférer une certaine protection à l’apoptose. La plupart des intégrines recrutent la kinase d’adhésion focale (FAK) au niveau de leur sous unité  pour activer les différentes voies de signalisations PI3K/AKT, ERK (human mesangial cell extracellular signal-regulated kinase)/MAPK ou encore CAS (Crk-associated substrate )/Crk(c-CrkII). Mais elles peuvent aussi recruter directement certaines SFKs via leur sous unité pour initier, via la phosphorylation de la protéine adaptatrice SHC, les cascades de transduction du signal activées par les RTKs.

(8)

Tableau 3| Ligands endogènes potentiels du R-sigma1 (Megalizzi et coll., 2010 ; Cf. annexe 4)

Tableau 4| Liste non-exhaustive de ligands exogènes des Rs-sigma et leurs activités biologiques connues dans les cellules cancéreuses (Megalizzi et coll., 2010) (Cf. annexe 4)

40b

(9)

Figure 9 | Représentation schématique du R-sigma1 (Palmer et coll., 2007)

A: L’analyse transmembranaire du R-sigma1, déterminée par son graphique hydropathique, révèle la présence potentielle d’une nouvelle région d’hélice transmembranaire (résidu d’acide aminé 176-203).

B: La séquence d’acides aminés du R-sigma1 contient plusieurs motifs CBD (cholesterol-binding domain) de structure L/V-X1-5-Y-X1-5-K/R dans sa partie terminale COOH. Les séquences VEYGR (1 motif CBD) et LFYTLRSYAR (2 motifs CBD) sont représentées schématiquement dans le modèle du R-sigma1. Cette séquence montre aussi les résidus amino-acides connus dont la présence est obligatoire pour permettre la liaison des ligands auR-sigma

.

(10)

Figure 10 | Structure chimique de quelques ligands du R-sigma1 (Guitart et coll., 2004)

Figure 11| Pharmacophore du R-sigma1 selon le modèle de Glennon (Glennon, 2005)

(11)

Tableau 5| Ligands du R-sigma1 impliqués dans des essais cliniques liés aux thérapies anticancéreuses (Megalizzi et coll., 2010 : Cf. annexe 4)

(12)

Figure 12 | Voie métabolique de la céramide (Gouazé et Cabot, 2006)

(13)

Lignée cellulaire Code ATCC Origine

U373-MG HTB-17 Glioblastome astrocytaire humain

U-87 MG HTB-14 Gliome astrocytaire de haut grade ; femme caucasienne 44 ans Hs683 HTB-138 Oligodendrogliome grade III ; homme caucasien 76 ans T98G CRL-1690 Glioblastome multiforme ; homme caucasien 61 ans

SW 1088 HTB-12 Astrocytome ; homme caucasien 72 ans

SW 1783 HTB-13 Astrocytome grade III ; homme caucasien 68 ans

A-172 CRL-1620 Glioblastome ; homme 53 ans

U-118 MG HTB-15 Glioblastome astrocytaire ; homme caucasien 50 ans U-138 MG HTB-16 Glioblastome ; homme caucasien 47 ans

H4 HTB-148 Glioblastome ; homme caucasien 37 ans

Tableau 6 | Informations sur les lignées cellulaires utilisées dans notre travail (ATCC = American Type Culture Collection).

(14)

Gene cible (humain)

Amorce Sens Anti-Sens Localisation Positions Taille du

produit PCR Rsigma1 P1 5’-gccttctctcgtctgatc-3’ 5’-cgtgtactaccgtctcc-3’ Inter-exons 243-537 (v1)

243-444 (v2) 295 202

Rsigma1 P2 5’-ggagacggtagtacacg-3’ 5’-agcataggagcgaagagt-3’ Intra-exon 521-678 175

-actine 5’-ggagacggtagtacacg-3’ 5’-agcataggagcgaagagt-3’ Inter-exons 661-1185 525

Tableau 7 | Description des amorces PCR utilisées dans notre travail pour cibler le R-sigma1, ses différents variants d’épissage et la -actine.

(15)

s1 = sigma1 ; s2 = sigma2 ; WB = Western blot

Tableau 8 | Ensemble des tests réalisés in vitro précisant les ligands du R-sigma1 et les concentrations utilisées.

Figure

13 | Contrôle de solubilisation des solutions stocks de ligands R-sigma1

Illustré pour le 4-IBP : A) solution à 10mM dans du DMSO (solution mère) après 30min de sonication, B) Cette même solution diluée 10X dans du DMSO (solution stock=1 mM) après 15 min de sonication.

Activité étudiée Ligand Concentration(s) utilisée(s) Type

Viabilité cellulaire et détermination des IC (MTT)

SK&F 10047 1nM à 10µM Agonist

PRE-084 1nM à 10µM Agonist sélectif s1

IPAG 1nM à 10µM Antagonist

Haloperidol 1nM à 10µM Antagonist

Fluvoxamine 1nM à 10µM Agonist

Eliprodil 1nM à 10µM Agonist

BMY 14802 1nM à 10µM Antagonist

BD1008 1nM à 10µM Antagonist sélectif s1 et s2

BD1047 1nM à 10µM Antagonist

4-IBP 1nM à 10µM Agonist sélectif s1 et s2

BD1063 1nM à 10µM Antagonist sélectif s1

4-IPAB 1nM à 10µM sélectif s1

Croissance, division, colonisation (vidéomicroscopie)

4-IBP 10µM Agonist sélectif s1 et s2

Haloperidol 5µM Antagonist

BD1008 10µM Antagonist sélectif s1 et s2

Eliprodil 5µM Agonist

Donepezil 2.5µM Agonist

IPAG 2.5µM Antagonist

Motilité (vidéomicroscopie) 4-IBP 1 et 10 nM

Agonist sélectif s1 et s2

Cytosquelette d’actine 4-IBP 1 et 10 nM

Ca2+ intracellulaire 4-IBP 10nM, 100nM et 10µM

Chimiorésistance des cellules

migrantes et chimiosensibilisation ^4-IBP ^10nM

Processus de mort cellulaire

par cytométrie de flux ^4-IBP 10nM, 100nM et 10µM

par WB 4-IBP 10nM à 10µM

Cibles moléculaires

par immunofluorescence 4-IBP 1 et 10nM

par WB 4-IBP 1nM à 10µM

(16)

Figure 14 | Description du test MTT. Illustration d’une plaque 96 puits dans laquelle le test colorimétrique MTT est réalisé. A J0, les cellules sont ensemencées, les puits bordant sont remplis d’eau afin de limiter l’évaporation. A J1, les cellules sont mises en présence ou non (colonne de droite représentant le contrôle) de concentrations croissantes (réalisés en sextuplicat de gauche à droite) de la molécule d’intérêt pour une durée de 72h. Celui-ci est ensuite remplacé par le produit MTT qui est transformé en cristaux de formazan par les mitochondries encore fonctionnelles des cellules. Ces cristaux dissous dans du DMSO donnent une coloration violette plus ou moins intense selon le nombre de cellules vivantes. La plaque est ensuite placée dans un lecteur de plaque spectrophotomètre UV/visible pour mesurer la densité optique et ainsi évaluer le nombre de cellules survivantes dans chaque puit.

Figure 15 | Système de vidéomicroscopie assistée par ordinateur

(A) Des microscopes inversés à contraste de phase sont placés dans une enceinte régulée en température à 37°C.

Les microscopes sont équipés d’une caméra commandée par ordinateur grâce à un programme d’acquisition d’images qui permet d’enregistrer une photo du champ observé toutes les x minutes, durant une période de temps t.

(B-C) Un logiciel d’analyse d’images permet alors de reconstituer les trajectoires cellulaires individuelles et d’en extraire la variable MRDO (maximal relative distance to the origin, cf. texte pour détails).

A

MRDO

C B formazan

MTT

mitochondrie

C° (M)

10^-9 0,510^{- 8} 10^-8 0,510^-7 10^-7 0,510^-6 10^-6 0,510^-5 10^-5 0 (CT)

(17)

Figure 16 | Système de microscopie à épifluorescence utilisé pour l'évaluation de la concentration du calcium intracellulaire (mis à notre disposition par le Pr. Gailly de l’UCL).

Lampe à arc au xénon

Microscope à épifluorescence

Pompe péristaltique

Chambre de microscope

(18)

Figure 17 | Illustration morphologique du profil d’invasion de cellules humaines Hs683(A) et U373 (C) greffées de manière orthotopique dans le cerveau de souris athymiques (objectif 40X).

Les gliomes obtenus par ce type de greffe montrent pour Hs683 (B) une forte activité mitotique ainsi qu’une forte densité vasculaire, et pour U373 (D) des caractéristiques morphologiques de GBM, tels l’atypie cellulaire, le fort indice mitotique, la forte densité vasculaire et une nécrose entourée par une pseudopalissade cellulaire (objectif 100X) (Branle et coll., 2002).

Figure 18 | Photographie de l’implantation dans le cerveau d’une souris d’une micropompe (flèche blanche simple) connectée à un cathéter (flèche double) délivrant la solution souhaitée. Le système de micropompe est implanté en sous-cutané (flèche en pointillé) (Lefranc et coll., 2003).

(19)

Figure 19 | Illustration microscopique (A) et macroscopique (B) du processus d’invasion de cellules A549 humaines greffées de manière orthotopique dans le poumon de souris athymiques. Ce modèle de xénogreffe développe des métastases cérébrales (C) pour approximativement 2/3 des souris greffées (Mathieu et coll. 2004)

(20)

Figure 20 | Expression en termes d’ARNm des variants d’épissage du R-sigma1 (V1 & V2) (d’après Megalizzi et coll., 2007 et 2009).

(A) Représentation schématique du gène du R-sigma1 précisant les sites ciblés (amorces : flèches rouges et noires) pour les 2 produits PCR P1 et P2 (lignes rouge et noire). Le RCD correspond à la région codante du V1 épissé de l’ARNm et l’exon 3 est absent du V2. Les résultats de l’analyse RT-PCR sont illustrés pour (B,E) 10 lignées de gliomes humains, (C) 6 échantillons de glioblastomes humains et (D) 4 primocultures

La première ligne: 1-kb plus DNA ladder; Ct-: H2O utilisé comme contrôle négatif, (?): fragment d’amplification non spécifique. Dans (C et D) la lignée U373-MG est utilisée comme contrôle positif.

(21)

Figure 21 | Expression protéique du R-sigma1.

A) Les résultats de l’analyse WB sont illustrés pour les lignées de gliomes U373, HS683 et T98G (CT- = albumine bovine, CT+ = lignée CHO) B) Expression de la protéine R-sigma1 (révélée par la fluorescence rouge) dans les cellules U373 non traitées (CT) ou traitées durant 72h à 10 µM de 4-IBP (objectif 40x). C) Vues agrandies de cellules U373 non traitées observées respectivement en fluorescence, champ clair et après superposition des deux canaux, où les flèches blanches semblent montrer une localisation périnucléaire du R- sigma1. D) Expression de la protéine R-sigma1 dans des GBM révélée par immunohistochimie réalisée sur une lame de « tissue microarray » (TMA).

B A

Tubuline R-sigma1 V1 dR-sigma1 V1 dR-sigma1 V1&V2

(22)

Tableau 9 | Evaluation par test MTT des effets de différents ligands du R-sigma1 sur la viabilité de cellules de gliomes humains de haut grade :

Les données représentes le % moyen (± SEM) de viabilité cellulaire par rapport à la condition contrôle (Ct=100%) mesuré après 72h de traitement avec une concentration de ligand de 10µM (n=6)

10µM Type de

ligand H4 Hs683 SW1088 U373 U87 T98G

(+)-SK&F-10047

hydrochloride Agonist

100±2 82±2 80±1 77±7 93±3 96±6

PRE-084 hydrochloride

Agonist

Selectif s1

85±3 111±7 91±1 93±3 123±11 101±3

IPAG Antagonist

35±2 62±2 56±2 66±6 90±5 72±2

Haloperidol

hydrochloride Antagonist

95±3 96±3 106±4 71±2 72±3 50±2

Fluvoxamine

maleate Agonist

90±3 73±1 87±1 85±1 80±2 83±1

Eliprodil Agonist

57±1 77±1 90±1 56±2 68±2 111±1

BMY-14802

hydrochloride Antagonist

77±2 94±6 98±2 68±4 90±2 148±5

BD1008 dihydrobromide

Antagonist

Selectif s1 et s2

81±2 68±2 82±1 70±2 74±1 70±2

Antagonist

Selectif s1

70±2 77±2 93±1 91±3 98±2 76±2

4-IBP Agonist

Selectif s1 > s2

59±1 58±2 61±2 64±2 67±3 73±1

Antagonist

Selectif s1

69±3 94±2 107±2 88±3 92±2 82±1

4-IPAB Selectif s1

76±4 92±3 102±1 57±2 55±3 96±1

(23)

Figure 22 | Taux de croissance cellulaire évalués par deux techniques différentes (d’après Debeir et coll., 2008 cf. Annexe 3).

A) Résultats du test MTT : Nous observons une inhibition de la croissance, durant 6 jours, de deux lignées de GBM traitées à 10 µM de 4–IBP, par rapport à la condition contrôle. Le même nombre de cellules a été ensemencé à J0. B) Résultats du test par vidéomicroscopie : Les images extraites des séquences enregistrées illustrent l’évolution des cellules U373 sous traitement (10 µM de 4-IBP) ou non (CT). Le temps J0 montre à la 1^ère image prise immédiatement après la mise en contact des cellules avec le traitement. C) Résultats de la quantification des pourcentages de cellules vivantes : Croissance au cours du temps des 2 lignées, traitées ou non au 4-IBP à 10µM.

0 100 200 300 400

J1 J2 J3 J6

0 100 200 300 400

J1 J2 J3 J6

Percentage of cell growth inhibition (CT_J1 = 100%)

J0 J1 J2 J3

CT4-IBP

U373 C ell Lin e

B

T98G

A _U373

CT

4-IBP 4-IBP

C

(24)

Figure 23 | Analyse quantitative et spécifique du processus de division cellulaire (d’après Megalizzi et coll., 2009).

A-B : Séquences illustratives d’un événement complet de division cellulaire dans des cellules U373 traitées au 4- IBP ou non traitées (CT). Les carrés verts indiquent la portion de séquence identifiant l’événement de division.

C: Taux de division mesurés durant 72h pour les conditions CT et traitée au 4-IBP (10µM) dans la lignée U373 de gliome. CDNR (Cell Division Number Ratio) est le rapport des taux de division de la condition traitée par celui du contrôle. D: Durées des divisions cellulaires mesurées durant 72h pour les conditions CT (n = 195) et traitée au 4-IBP à 10µM (n = 45) dans la lignée U373. Le DTR (Division Time Ratio) est le rapport des durées médianes entre les conditions traitée et contrôle. (*** : p < 0.001)

(25)

Figure 24| Effets du 4-IBP sur le processus de recolonisation cellulaire (test de la cicatrice).

Illustration du processus de recolonisation évalué durant 48h, des cellules U373 traité au 4-IBP (10µM) ou non traité (CT). La colonisation cellulaire est quantifiée (cf. Figure 25) par le pourcentage de surface progressivement recouverte par les cellules au cours du temps.

Figure 25 | Analyse quantitative du processus de recolonisation cellulaire (test de la cicatrice) (Megalizzi et coll., 2009).

A-B : La recolonisation cellulaire est évalué quantitativement par le pourcentage de surface de la cicatrice qui est progressivement recouvert par les cellules U373 traitées au 4-IBP (10 µM) ou non traitées (CT) avec un milieu de culture supplémenté à 2.5% ou 5% respectivement. C : Résultats similairement obtenus avec les cellules T98G en présence de 5% de sérum. Afin d’être comparables, tous ces résultats ont été normalisés par l’aire de la plus petite cicatrice initiale opérée dans le tapis cellulaire dans les différentes expériences comparées (= 100%). Chaque expérience est réalisée en triplicat. Les valeurs sont exprimées en termes de moyennes et des intervalles des valeurs minimales et maximales (barres). Le SWAR représente le ratio des moyennes des pourcentages d’aire recolonisée entre conditions CT et traitée.

CT

U373-MG

A

t0

CT

t48h

U373-MG

A

t0 t48h

4-IBP 10µM

t0 t48h

B 4-IBP 10µM

t0 t48h

B

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Time(h)

0 20 40 60 80 100

Mean (min-max)

U373-MG

2.5% SERUM C

SWAR/48H= 0.46

55%

25%

CT

4-IBP

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Time(h)

0 20 40 60 80 100

Mean (min-max)

U373-MG

2.5% SERUM C

SWAR/48H= 0.46

55%

25%

CT

4-IBP

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Time(h)

0 20 40 60 80 100

Mean (min-max)

5% SERUM

SWAR/48H= 0.44 106%

46%

D

CT

4-IBP

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Time(h)

0 20 40 60 80 100

Mean (min-max)

5% SERUM

SWAR/48H= 0.44 106%

46%

D

CT

4-IBP

(26)

TBD = Totaly Blocked Division. GGR (Global Growth Ratio) est le rapport entre les deux taux de croissance obtenus dans les conditions traitée et contrôle. CDNR (Cell Division Number Ratio) est le rapport des taux de divisions cellulaires entre les conditions traitée et contrôle. DTR (Division Time Ratio) est le rapport des durées médianes de division cellulaire obtenues dans les conditions traitée et contrôle (* : p < 0.05, ** : p < 0.01, ***: p < 0.001) .

Tableau 11| Effets in vitro des ligands au R-sigma1 sur la division cellulaire dans des lignées de GBM (Megalizzi et coll., 2009).

Formula and Compound Name

Cell Line

GGR CDNR DTR

(72 h)

48 h 72 h 48 h 72 h

4-IBP

U373

0.70 0.46 0.39 0.24 2.00***

T98G

0.58 0.42 0.41 0.33 1.55***

Haloperidol

U373

5µM

0.73 0.80 0.55 0.75 1.47***

T98G

5µM

0.86 0.80 0.79 0. 76 1.42***

BD 1008

U373

0.84 0.73 0.86 0.68 1.44***

T98G

0.67 0.51 0.60 0.50 1.75***

Eliprodil

U373

5µM TBD

T98G

5µM

0.99 0.57 0.62 0.36 1.67***

Donepezil

U373

2.5µM TBD

T98G

2.5µM

0.82 0.40 0.56 0.27 2.71***

IPAG

U373

2.5µM TBD

T98G

2.5µM

0.30 0.21 0.20 0.20 1.36***

I

O

N

F

O

Cl

N

O

Cl

N

Cl

N

F

Cl

N O

O O

I

N

N N

(27)

Figure 26 | Effets du 4-IBP sur la motilité cellulaire (d’après Megalizzi et coll., 2007). Distribution des valeurs de MRDO obtenues pour les lignées de GBM (U373) traitées avec des concentrations croissantes de 4-IBP (0 = contrôle). Les données ont été extraites sur différentes périodes de temps (cf. axe X). Seuls les niveaux de probabilité significatifs par rapport au contrôle sont indiqués (barre horizontale = médiane).

Figure 27 | Effets du 4-IBP sur l’organisation du cytosquelette d’actine (Megalizzi et coll., 2007).

A : L’actine fibrillaire et l’actine globulaire apparaissent respectivement en fluorescence verte et rouge dans les cellules U373 traitées durant 72h à 10^-9M de 4-IBP (A2) ou non traité (A1). B : Effet de 2 concentrations de 4- IBP sur la distribution des rapports « actine fibrillaire / actine globulaire » quantifiés par cellules au cours de différentes périodes de temps. (Seuls les niveaux de probabilité significatifs sont indiqués, barre horizontale = médiane).

B U373 Glioblastoma Cells

4-IBP Concentration (M) Over time

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

3h 7h 12h

Fib rilar a c tin /Glo b ul ar a c tin

U373 Glioblas tom a Ce lls

4-IBP Concentration (M) Ov er time period

0 4 8 12 16 20 24

C

Ma ximum Rela ti v e Di sta nc e t o th e Orig in (MRD O µ m/ hr )

P<0.001

P<.001 P<0.05

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

3h à 9h 12h à 24h

B U373 Glioblastoma Cells

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

3h 7h 12h

Fib rilar a c tin /Glo b ul ar a c tin

B U373 Glioblastoma Cells

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

3h 7h 12h

Fib rilar a c tin /Glo b ul ar a c tin

U373 Glioblas tom a Ce lls

0 4 8 12 16 20 24

C

Ma ximum Rela ti v e Di sta nc e t o th e Orig in (MRD O µ m/ hr )

P<0.001

P<.001 P<0.05

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

3h à 9h 12h à 24h U373 Glioblas tom a Ce lls

0 4 8 12 16 20 24

C

Ma ximum Rela ti v e Di sta nc e t o th e Orig in (MRD O µ m/ hr )

P<0.001

P<.001 P<0.05

P<0.001

P<.001 P<0.05

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

3h à 9h 12h à 24h

U373 Glioblas tom a Ce lls

0 4 8 12 16 20 24

C

Maximum Relative Distance to the Origin(MRDO µm/hr) P<0.001

P<.001 P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-9 10^-8

3h à 9h 12h à 24h

A

B

U373 Glioblastoma Cells

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 3h 7h 12h

Fibrilaractin/Globularactin

1

2

0 4 8 12 16 20 24

C

P<.001 P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-9 10^-8

3h à 9h 12h à 24h

A

B

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 3h 7h 12h

0 4 8 12 16 20 24

C

P<.001 P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-9 10^-8

3h à 9h 12h à 24h U373 Glioblas tom a Ce lls

0 4 8 12 16 20 24

C

P<.001 P<0.05

P<0.001

P<.001 P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-9 10^-8

3h à 9h 12h à 24h

A

B

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 3h 7h 12h

B

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 3h 7h 12h

1 2 1

2

0 4 8 12 16 20 24

C

P<.001 P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-9 10^-8

3h à 9h 12h à 24h

A

B

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 3h 7h 12h

1

2

0 4 8 12 16 20 24

C

P<.001 P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-9 10^-8

3h à 9h 12h à 24h

A

B

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 3h 7h 12h

0 4 8 12 16 20 24

C

P<.001 P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-9 10^-8

0 4 8 12 16 20 24

C

P<.001 P<0.05

P<0.001

P<.001 P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-9 10^-8

3h à 9h 12h à 24h

A

B

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 3h 7h 12h

B

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 3h 7h 12h

1 2 1

2

0 4 8 12 16 20 24

C

P<.001 P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-9 10^-8

3h à 9h 12h à 24h

A

B U373 Glioblastoma Cells

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 0 10^-910^-8

3h 7h 12h

1

2

0 4 8 12 16 20 24

C

P<.001 P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-9 10^-8

3h à 9h 12h à 24h

A

B U373 Glioblastoma Cells

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 0 10^-910^-8

3h 7h 12h

0 4 8 12 16 20 24

C

P<.001 P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-9 10^-8

0 4 8 12 16 20 24

C

P<.001 P<0.05

P<0.001

P<.001 P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-9 10^-8

3h à 9h 12h à 24h

A

B U373 Glioblastoma Cells

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 0 10^-910^-8

3h 7h 12h

B U373 Glioblastoma Cells

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10^-910^-8 0 10^-910^-8 0 10^-910^-8

3h 7h 12h

1 2 1

2 B U373 Glioblastoma Cells

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

3h 7h 12h

U373 Glioblas tom a Ce lls

0 4 8 12 16 20 24

C

P<.001 P<0.05

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

3h à 9h 12h à 24h

B U373 Glioblastoma Cells

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

3h 7h 12h

B U373 Glioblastoma Cells

0 40 80 120 160 200 240

P<0.05

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

3h 7h 12h

U373 Glioblas tom a Ce lls

0 4 8 12 16 20 24

C

P<.001 P<0.05

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

3h à 9h 12h à 24h U373 Glioblas tom a Ce lls

0 4 8 12 16 20 24

C

P<.001 P<0.05

P<0.001

P<.001 P<0.05

0 10

^-9

10

^-8

0 10

^-9

10

^-8

3h à 9h 12h à 24h

(28)

Figure 28 | Absence d’effet du 4-IBP sur la concentration intracellulaire de Ca²⁺

.

Différentes concentration de 4-IBP ont été testées (A : 10nM, B : 100nM et C : 10µM) sur la lignée cellulaire U373. En fin de chaque expérience, le traitement à l’ionomycine est utilisé pour contrôler le bon fonctionnement du dispositif. Les temps correspondant à l’addition des composés 4-IBP et

ionomycine sont précisés (flèches).

(29)

Figure 29 | Evaluation des effets de sensibilisation au TMZ opérés par le 4IBP sur la lignée de GBM U373 lors d’un test de la cicatrice (d’après Megalizzi et coll., 2007).

Taux de recolonisation de la cicatrice par les cellules U373 mesurés après 16h (moyenne + SEM calculées sur 18 réplicas). A : Cellules prétraitées avec du 4-IBP seul à 10 nM durant des temps variables, allant de 0h (condition contrôle) à 24h. B : Cellules prétraitées avec du 4-IBP (à 10 nM) durant des temps variables, allant de 0h (pas de prétraitement au 4-IBP) à 24h, avant l’ajout de TMZ à 1µM (gris clair) ou 10µM (gris foncé).

(*: p < 0.05 ; **: p < 0.01 ; ***: p < 0.001)

Figure 30 | Absence d’effet in vitro du 4-IBP à 10nM sur la voie PI3K/Akt et l’apoptose des cellules U373 (Megalizzi et coll., 2007).

C) Evaluation par test Elisa du niveau d’expression de p85-PI3K total (barres noires) ou phosphorylé (barres ouvertes) et D) d’Akt dans les cellules U373 non traitées (CT) ou traitées à 10nM de 4-IBP pour la période indiquée sur l’axe X. Les valeurs sont exprimées par les moyennes ± SEM (calculées sur 6 réplicas). Les essais sont validés par un contrôle positif de phosphorylation qui consiste en des cellules U373 cultivées sans sérum et traitées avec de l’EGF à 200 ng/ml durant 10 minutes. (E) Analyses par Western blotting du clivage de PARP dans les cellules U373 non traitées (0) ou traitées à 10nM de 4-IBP durant 48, 72 et 96 heures.

(30)

Figure 31 | Effets in vivo du 4-IBP (Megalizzi et coll., 2007).

A : Courbes de survie de souris greffées orthotopiquement avec la lignée humaine de GBM U373, après un traitement au 4-IBP seul (ligne rouge) ou combiné au traitement par TMZ (ligne rose), comparées au TMZ seul (ligne verte) et à l’absence de tout traitement (ligne bleue). B : Courbes de survie de souris greffées orthotopiquement avec la lignée humaine pulmonaire A549 NSCLC, après un traitement au 4-IBP seul (ligne rouge) ou combiné au traitement par l’irinotécan (IRI) (ligne rose), comparé à l’IRI seule (ligne verte) et au contrôle (ligne bleue).

(31)

Figure 32 | Effets in vitro et in vivo du donepezil sur le modèle de gliome de haut-grade Hs683 (Megalizzi et coll., 2009).

A-B : Evaluation du processus de recolonisation des cellules Hs683, traitées par le donepezil (DNZ) à 2.5 µM ou non traité (CT) lors d’un test de la cicatrice (comme détaillé dans les Figures 24 et 25). C : Processus de recolonisation (test de la cicatrice) des cellules Hs683 suivi durant 40h pour des cellules traitées au temozolomide seul (TMZ 10 µM), traitées ou non au TMZ après un prétraitement de 40h au donepezil (Donepezil 40 h), et comparées au cellules n’ayant subit aucun traitement (CT). D: Pourcentage de divisions cellulaires détectées par tranche de 8h durant 48h de suivi, dans les mêmes conditions que celles testées en D. E : Courbes de survie de 4 groupes de souris immunodéprimées et greffées de manière orthotopique avec la lignée de gliome Hs683. Les souris sont soit non traitées (contrôle, ronds noirs), soit traitées au TMZ (carrés ouverts), au donepezil (ronds ouverts) ou par une combinaison des deux (étoiles).

(32)

Figure 33 | Effet pro-apoptotique du 4-IBP à 10µM

A) Expérience type de détection et quantification de l’apoptose par cytométrie de flux après double marquage à l’annexine V-FITC et à l’IP (iodure de propidium), dans des cellules U373 CT (72h) ou traitées durant 36h ou 72h avec une concentration de 4-IBP de 10µM. Les cellules marquées à l’annexine V-FITC fluorescent en vert (axe X) alors que les cellules marquées à l’IP fluorescent en rouge (axe Y). Un marquage annexin V- / IP- (en noir) correspond aux cellules vivantes, annexin V+ / IP- (en vert) aux cellules en stade précoce d’apoptose, annexin V+

/ IP+ (en violet) aux cellules en stade avancé d’apoptose, annexin V- / IP+ (en rouge) aux cellules mortes. B) Taux totaux de cellule en cours d’apoptose dans les différentes conditions.

A

(33)

Figure 34| Effet pro-autophagique du 4-IBP

A : Illustration par vidéomicroscopie de la formation de vacuoles (flèches blanches) dans les cellules U373 traitées durant 72h à des concentrations croissantes de 4-IBP. B : Détection et quantification des organelles vésiculaires acides par marquage à l’acridine orange et analyse par cytométrie de flux, dans des cellules U373 traitées durant 72h avec des concentrations croissantes de 4-IBP. Dans les cellules marquées à l’acridine orange, le cytoplasme et le noyau fluorescent en vert (axe Y) alors que les compartiments acides fluorescent en rouge (axe X). La fluorescence rouge est proportionnelle au degré et au volume des organelles vésiculaires acides, dont font parties les vacuoles autophagiques. Le taux (moyenne de 3 expériences ± déviation standard) de cellules ayant une proportion d’organelles vésiculaires acides est superposé pour chaque condition sur une expérience type. C-D : Analyse par Western blotting des expressions de Beclin-1 (C) et de la protéine LC3-associée aux microtubules, de type I (LC3-I) et de type II (LC3-II) (D), dans les cellules U373 traitées avec des concentrations croissantes de 4-IBP durant 72 heures

.

C D

B

A

(34)

Figure 35 | Effets du 4-IBP sur l’expression de protéines reliées au stress cellulaire (Megalizzi et coll., 2007).

Expression de la protéine Hsp70 reliée au stress cellulaire (A) et de la protéine GRP78/BiP reliée au stress du RE (B) dans les cellules U373 traitées durant 72h à des concentrations croissantes de 4-IBP (0 = CT). RQ = Relative Quantification.

Figure 36 | Effets du 4-IBP sur l’expression des protéines Rho-GDI (A-C) et GCS (D-F) dans les cellules U373 non traitées (A et D) ou traitées durant 72h à 1 nM (B et E) et 10nM de 4-IBP (C et F). Les niveaux d’expression de Rho-GDI et GCS sont révélés par la fluorescence rouge (b), l’image en champ clair (a) servant de contrôle morphologique (Megalizzi et coll., 2007).

(35)

Figure 37 | Phases du cycle cellulaire mises en évidence par la localisation d’un marqueur fluorescent spécifique (CCPM) (Padfiel et coll., 2009).

Ce schéma d’identification des différentes phases du cycle cellulaire est basé sur une comparaison de l’intensité du marquage fluorescent entre le noyau (de forme ovoïde) et le cytoplasme (hors du noyau). N correspond à l’intensité lumineuse dans le noyau et C correspond à l’intensité lumineuse dans le cytoplasme. Chacune des images illustre l’aspect typique du marquage lors des différentes phases du cycle cellulaire G1, S, G2, M, aboutissant à la division effective d’une cellule en ses deux filles.

Figure 38 | Représentation schématique des événements survenant au cours d’un blocage prolongé en mitose (Bekier et coll., 2009).

Au cours de la phase précoce du blocage en mitose et tant que la durée de ce blocage est inférieure à 15h, les cellules peuvent être protégées du déclenchement d’un processus de mort cellulaire. Par contre, si le blocage perdure au delà de 15h, un mécanisme de mort cellulaire et alors inexorablement enclenché : soit les cellules sortent de leur phase tardive de blocage en mitose entre 15 à 20h et, dans ce cas, elles meurent dans la partie interphase du cycle cellulaire ; soit le blocage perdure au-delà de 20h et la mort intervient suite à un processus dépendant des caspases.

(36)

Figure 39 | Proposition de schéma hypothétique concernant la signalisation intracellulaire induite par les ligands du R-sigma1 dans les cellules cancéreuses (Megalizzi et coll., 2010). Détaillé dans le texte.

(37)

Figure 40 | Effets des ligands exogènes du R-sigma1 et leur potentialisation des effets du TMZ.

Les flèches rouges représentes des inhibitions, les noires des activations, les pointillées des activités potentielles qui restent à confirmer. Les étoiles correspondent aux effets démontrés dans la littérature.

Astrocytome pilocytique Grade I* Astrocytome Grade II Astrocytome anaplasique Grade III Glioblastome Grade IV

Tumeurs Astrocytaires

Astrocytome pilocytique Grade I*

Astrocytome Grade II

Astrocytome anaplasique

Grade III Glioblastome Grade IV

Tumeurs Oligodendrogliales

Oligodendrogliome Grade II Oligodendrogliome

anaplasique

Grade III

Gliomes Mixtes

Oligoastrocytome Grade II Oligoastrocytome

anaplasique

Grade III

Matrix

.

.

Figure 10 | Structure chimique de quelques ligands du R-sigma1 (Guitart et coll., 2004)

Figure

Illustré pour le 4-IBP : A) solution à 10mM dans du DMSO (solution mère) après 30min de sonication, B) Cette même solution diluée 10X dans du DMSO (solution stock=1 mM) après 15 min de sonication.

Activité étudiée Ligand Concentration(s) utilisée(s) Type

A

C B formazan

MTT

mitochondrie

Lampe à arc au xénon

Microscope à épifluorescence

Pompe péristaltique

Chambre de microscope

B A

10µM Type de

ligand H4 Hs683 SW1088 U373 U87 T98G

100±2 82±2 80±1 77±7 93±3 96±6

85±3 111±7 91±1 93±3 123±11 101±3

35±2 62±2 56±2 66±6 90±5 72±2

95±3 96±3 106±4 71±2 72±3 50±2

90±3 73±1 87±1 85±1 80±2 83±1

57±1 77±1 90±1 56±2 68±2 111±1

77±2 94±6 98±2 68±4 90±2 148±5

81±2 68±2 82±1 70±2 74±1 70±2

70±2 77±2 93±1 91±3 98±2 76±2

59±1 58±2 61±2 64±2 67±3 73±1

69±3 94±2 107±2 88±3 92±2 82±1

76±4 92±3 102±1 57±2 55±3 96±1

U373 C ell Lin e

B

T98G

A U373

C

CT

A

CT

A

4-IBP 10µM

B 4-IBP 10µM

B

2.5% SERUM C

2.5% SERUM C

5% SERUM

D

5% SERUM

D

Formula and Compound Name

Cell Line

GGR CDNR DTR

(72 h)

48 h 72 h 48 h 72 h

U373

T98G

U373

5µM

T98G

5µM

U373

T98G

U373

5µM TBD

T98G

5µM

U373

A _U373