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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Van Rymenant, M. (1954). Quelques aspects de la réaction du phénylisothiocyanate avec les amino-acides et peptides (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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Quelques aspects de la réaction

du Pnénylisotniocyanate

avec

les Amino - Acides et Peptid es

THÈSE PRÉSENTÉE A LA FACULTÉ DES

SCIENCES POUR L’OBTENTION Dl ’

DOCTORAT EN SCIENCES CHIMIQUES

2.

Tous nos remerciements vont à Mademoiselle de BROUCKERE poxir l'accueil plein de compréhension qu'elle nous réserva dès notre entrée dans son seivice, lors de notre mémoire de licence. C'est en grande partie à elle que nous devons d'avoir pris goût aux travaux de recher­ che et d'avoir persévéré dans la voie que nous nous étions tracée en passant momentanément de la Faculté de Médecine à la Facilité des Scien­ ces. L'intérêt qu'elle a constamment porté à notre travail, ses avis judicieux, les facilités matérielles qu'elle s'est toujours ingéniée à mettre à notre disposition, nous ont été particulièrement précieux.

A Monsieur J. LEORIS, chef de travaux, vont aussi nos remercie­ ments les plus chaleureux. Nous lui devons d'avoir réalisé la portée de l'évolution qui se produit actuellement dans la chimie des protéines. Nous lui devons aussi d'avoir participé à l’atmosphère d'enthousiasme intellectuel qui a accompagné la mise sur pied de son laboratoire.

Ses conseils amicaux, nos nombreuses et attachantes discussions, le soin qu'il prit à nous assurer, lors de notre travail de licence, une base expérimentale solide ont fortement contribué à notre formation scien­ tifique .

Nous sommes redevable aux professeurs BRACHET et CHANTRENNE de fructueux échanges d'idées, et d'avoir connu cet esprit de stimulation intellectuelle propre à leur laboratoire.

Les professeurs WIAME et GOLDFINGER ont droit à toute notre reconnaissance pour les facilités expérimentales qu'ils ont si aima­ blement mises à notre disposition et, au même titre que les autres membres du corps enseignant de la Faculté des Sciences, pour nous avoir fait participer à cette atmosphère scientifique particulière à la Faculté, si favorable à la coopération entre les diverses disci- plines.

Nous tenons, enfin, à rappeler à nos camarades de laboratoire, et tout spécialement à Raoul BUYLE et à Paul LEVAUX, tout le plaisir que nous avons éprouvé à travailler de concert les problèmes qui nous concernaient tous.

L’étude cinétique de la condensation des aminoacides et peptides avec le phénylisothiocyanate peut se faire grâ&e à une méthode continue de titration et d’enregistrement. Cette titration est effectuée à tem­ pérature, force ionique, concentration en réactif, et pH consta.5tits5 elle est réalisée d’une manière entièrement automatique, au moyen d’un "pïï- stat" dont les performances ont été améliorées. Les constantes ciné­ tiques expérimentales ont été déterminées grâce aux diagrammes loga­ rithmiques des concentrations résiduellesi les causes d’erreurs en sont discutées. Il est montré que, dans les conditions adoptées, la réaction est apparemment d’ordre un par rapport au groupe aminé. L’équation cinétique de la réaction a été établie| la discussion de cette équation cinétique, et l’étude de l’influence du pH sur la vitesse réactionnelle, permettent de vérifier que la réaction met en jeu les groupes aminés sous leur forme non chargée. L’analogie entre la réaction du phényliso­ thiocyanate et celle du sulfure de carbone est analysée et établie; il est possible de donner l’interprétation électronique de la réaction. Enfin, l’importance de ce genre d’études pour l’évaluation quantitative de la réactivité des acides aminés est discutée.

Un essai, visant à adapter aux protéines la microméthode au sul­ fure de carbone due à LEOmS, a été effectué sans succès; les raisons en sont analysées. Il est aussi montré que la réaction des dialkyl- xanthates, préconisée par KH0RA.HÔ., ne présente pas le caractère de sim­

elle requiert seulement 0.1 à 0.2 micromôle du produit initial. Toutes les étapes essentielles de la méthode ont été éprouvées et discutées : le choix du papier, les problèmes soulevés par l’élution, les difficultés rencontrées pour évaluer l’étape de condensation et, notamment, les

essais infructueux faits par voie spectrophotométrique et par chromato­ graphie sur papier. Il est montré que le rendement de la condensation ne peut s’obtenir qu’indirectement, après évaluation du rendement global des deux étapes. Les difficultés rencontrées au cours de la cyclisa­ tion dépendent principalement de la destruction des thiohydantolnes en milieu acide. L’origine de certaines taches parasites sur les chroma- togrammes est étudiée, et leur élimination rendue- possible. La tech­ nique opératoire mise au point a été appliquée à quelques acides aminés et peptides.

SOMMAIRE

-IITORODÜCTION

PREMIERE PARTIE : Cinétique de la réaction du phénylisothiocyanate.

I. Intr O duc t io n_.

II. Appareil automatique pour maintenir le pH constant, a - Principe.

b - Réalisation de l'appareillage,

c - Difficultés rencontrées dans la mise au point. III. Résultats expérimentaux.

a - Conditions opératoires,

b - Constantes cinétiques expérimentales. 17. Interprétation cinétique de la réaction,

a - Influence du pH sur la vitesse réactionnelle, b - Equation cinétique de la réaction,

c - Interprétation électronique de la réaction.

6 •

DEÜXITJW PARTIE s Etablissement d'une micro-méthode pour déterminer la séquence des acides aminés dans les peptides,

I, Introduction^

II, .Essai d'adaptation aux protéines_de_la_microméthode au sulfure de carbone,

III, Le xanthate préconisé par Khorana,

TV, Etablissement d'une microméthode au phénylisothiocyanate. a. Choix du papier.

b, Elution.

0, Etape de condensation,

1 - vérification par spectrophotométrie. 2 - chromatographie sur papier,

5 - excès de phénylisothiocyanate. Artefacts dûs à sa présence,

4 - conditions de condensation. d. Cyclisation des phénylthiouréidopeptides. e. Identification des thiohydantoînes.

f. Technique opératoire, g. Applications.

8

INTRODUCTION

En parcourant la littérature chimique internationale, on ne peut qu'être frappé par l'extension prise, ces quinze dernières années, par la chimie des protéines. Avant l'introduction de la chromatographie de partage par M&RTIN et SYNGE en 1941> on savait que les protéines sont composées d'acides aminés, mais on ne con­ naissait pas leur composition quantitative ni même qualitative exacte! on savait que ces acides aminés forment des chaînes au sein de la molécule, mais on ne connaissait pas la structure de ces chaînes, ni en ce qui concerne l'ordre des acides aminés, ni en ce qui concerne leiir disposition spatiale. La nature même de la liai­ son peptidique était encore sujet à controverse.

« enzymes, des anticorps, des toxines. La connaissance plus précise de toute une série de phénomènes vitaux dépend en dernier ressort de la détermination du mécanisme des interactions de ces substances. Il est certain que pour interpréter correctement ces interactions, il est nécessaire d’avoir à tout le moins une idée approchée de la for­ mule des protéines, c’est-à-dire, de la proximité variable des grou­ pes réactionnels et de leur facilité plus ou moins grande à entrer en réaction.

Le problème est très complexe. Le nombre et la variété des acides aminés qui entrent dans la molécule protéique rendent prati­ quement illimitées les combinaisons structtirales possibles. D'autre part, la purification des protéines, malgré les méthodes classiques qui permettent de vérifier leur pureté, reste une entreprise fréquem­ ment difficile et fastidieuse. Enfin, l'extrême sensibilité de cer­ taines protéines à ime modification de leur milieu extérieur, sen­ sibilité qui se traduit par leur "dénaturation", rend leiu: manipu­ lation parfois ardue et oblige à rechercher des conditions de réac­ tion particulièrement douces.

10.

Ce premier groupe d'étude entrepris et mené à bonne fin, restait à déterminer la structure fine de ces composés. Ici, aussi, les

progrès furent remarquables.

Ainsi, la composition de l'Oxytocine, une des hormones de la post-hypophyse, fut déterminée en 1950, par PIERCE et du VIGNEADI), après sa purification par l'appareil à contre-courant de CRAIG

(LIVERMORE et du VIGNEAUD, 1949). Du VIGREAUD et coll. (l955) et TUPPY (1953) déterminèrent indépendamment la séquence des acides ami­ nés dans le nonapeptide qui constitue la molécule. La synthèse totale de l'hormone fut faite par du VIGREADD et coll. (1955)* Ceci repré­ sente la première synthèse d'une hormone poly.peptidique d'un poids moléculaire de 1.000 environ. En confirmation remarquable de ces résxiltats, le dérivé synthétique montra des propriétés biologiques identiques à celles de l'hormone naturelle. Il provoque, notamment, la contraction in vitro de l'utérus du rat. In vivo, il induit l'accouchement chez la femme; 1 Y de produit synthétique par voie intraveineuse induit, en 20-30 minutes, l'expression du lait chez la femme qui allaite.

On mesure toute l'ampleur du problème et les progrès réalisés si l'on se rappelle qu'il fallut près de 25 ans pour arriver à éluci­ der la structure de cette substance et en effectuer la synthèse. C'est, en effet, en 1928, que TCAMM démontra sans ambiguité l'existence de deux principes actifs dans la post-hypophyse et les isola l'un de l'autre sous forme de poudre amorphe.

hypophyse, qui suivit un chemin parallèle à celui de 1’oxytocine, a

abouti à la détermination de sa structure (du VIGEEA.DD; ACHER et CHAUVET, 1955) ©"t à la synthèse d’un octapeptide qui possède les propriétés bio­ logiques attendues (.dû VIGÎIEAUD, LA77LER. et POPERHOE, 1955)

La baoitracine, antibiotique obtenu à partir du baoillus subtilis, fut également séparée en constitiiants polypeptidiques par la méthode du contre-courant (L.C. CRAIG et ooll. 1952). Ensuite, CRAIG étudia plus spécialement le constituant principal, la baoitracine A. Il sépara les peptides qui résultent de son hydrolyse partielle grâce à une variété de méthodes s distribution par contre-courant, électrophorèse sur papier, chromatographie sur papier; il détermina la séquence presque complète des acides aminés (CRAIG et coll., 1954 - HAÜSMAM, WEISIGER, CRAIG, 1955).

La Tyrocidine est un antibiotique isolé à partir de bacillus brevis; avec la Gramioidine, il constitue la Thyrothricine, qui est la base de certaines pastilles utilisées contre les inflammations de la gorge. La Tyrocidine fut également séparée en ses constituants polypeptidiques par l'efficiente méthode du contre-courant (PALADINI et CRAIG^ 1954)* CRAIG et ses collaborateurs établirent la séquence des acides aminés par un choix un peu différent de méthodes d'identification des peptides et des dérivés dinitrophénylés, consistant en une combinaison de distribution par contre-courant, de chromatographie sm: colonne et sur papier. Ils établirent ainsi que la Tyrocidine est un décapeptide cyclique dont \me partie du motif structural est identique à la séquence présente dans la gramicidine S.

cette hormone soit isolée à partir d'hypophyse de mouton et de porc (LI, EVANS, SIMPSON, 1943 - SAYERS, WHITE, LONG, 1943). Cette substan­ ce extrêmement intéressante stimxile la cortisone surrénale à secréter tin ou des agents très proches de la cortisone. Aussi cette hormone possède-t-elle la même propriété que la cortisone d'améliorer notamment l'arthrite rhumatoïde jusqu'ici réfractaire au traitement. (HENCH, KENDALL et coll., 1949).

De nombreuses études se sont succédées ces derniers temps sur la puri­ fication de cette hormone et de ses produits d'hydrolyse enzymatique, notamment par absorption sur de 1'oxycellulose, par distribution par contre-courant et chromatographie sur colonne.

Enfin, en 1953> WHITE obtint un produit pur'à partir de l'hormone non hydrolyséej il l'appela la corticotropine A.

■[Jn autre groupe obtint également un produit pur à partir d'extrait de glande traitée par do l'acide et de la pepsine s la corticotropine B

(BAZEMORE et coll., RICHTER et coll., KDEHL et coll., 1953). Ces deux produits sont actifs au point de vue hormonal, le second étant deux fois plus actif que le premier.

Les études des poids moléculaires de LI et PEDERSEN (1952), ont montré que des fragments obtenus par hydrolyse du produit initialement isolé et, donq d'un poids moléculaire nettement inférieur, étaient éga­ lement actifs chez l'animal et chez l'homme. D'autre part, ce fut LI qui montra, le premier, que 1* (X -sortictropine qu'il avait étudiée, avait une chaîne peptidique Tinique et ouverte composée de 39 acides aminés (LI et coll., 1954). Enfin, tout récemment, BELL et ses colla­ borateurs (1954) réussi à établir la structure totale de la

des fragments peptidiques par la méthode d*EDMA.II et la carhojsypeptidase. Quelques mois après, WHITE et LAEDMfi.M (l955) confirment cette structure en montrant que la corticotropine A , obtenue à partir du mime matériel mais par une méthode légèrement différente, présentait -une séquence

identique à quelques détails près. \

Ce groupe de recherches particulièrement brillantes a donc permis de déterminer la structure de plusieurs composés à action biologique importante.

Si l'on arrivait à synthétiser des composés de ce genre avec des rende­ ments intéressants et à partir de produits simples, on serait délivré de la tâche fastidieuse et coûteuse de les extraire de le\zrs sources natxxrelles. On peut aussi se rendre compte de l'intérêt que présente­ rait l'étude de légères modifications de structure sur les propriétés chimiques et biologiques du produit obtenu. Ceci permettra de mieux évaluer l'importance respective des groupes fonctionnels de la molécule. Peut-être aussi, dans la gamme des produits dont on sera amené à faire la synthèse, découvrira-t-on des substances aux propriétés nouvelles et utiles.

Les méthodes qui permirent, dans les cas précités, d'établir la séquence des acides aminés dans les protéines ou polypeptides se ramè­ nent à deux groupes.

Dans une première série de mtéhodes, on hydrolyse partiellement le polypeptide à étudier en une série de petits peptides que l'on identi­ fie ensuite par exemple par chromatographie sur papier. La comparaison de tous les fragments obtenus permet de déterminer une formule de poly­ peptide qui rende compte de tous les peptides obtenus.

14.

sait en fait d'un décapeptide cyclique et que la séquence trouvée doit être répétée dans le cycle.

SAITGER (1945) apporta à cette méthode la modification suivante : le

dinitrofluorohenzène réagit avec le groupe -KHg des polypeptides

ou acides aminés, et le composé dinitrophénylé résultant est soumis à l'hydrolise partielle. Il suffit, alors, d'identifier les différents dinitrophénylpeptides obtenus pour en déduire la séquence préexistante dans la protéine (DEP-A, DNP-AB, DEP-ABO --- ? séquence ABC).

La méthode de SAEGER a permis d'élucider la séquence des deux chaînes polypeptidiques qu'il avait préalablement isolées dans l'insuline, après oxydation (SAEGER et TUPPY, 1951 “ SAEGER et THOMPSOE, 1953).

Les résultats obtenus par cette méthode sont donc remarquables, d'autant plus qu'ils constituent la première détermination structurale d'une protéine de poids moléculaire relativement élevé. Cependant, la méthode est longue et peut-être fastidieuse car elle demande l'identification exhaustive de tous les peptides présents dans l'hydrolysat.

Le principe de la deuxième série de méthodes aiixquelles LEOEIS (1952) a donné le nom heureux de "Méthodes par récurrence", est le sui­ vant J on fixe sxxr le groupe -EHg libre des polypeptides un réactif qui dans un second temps s'élimine avec l'acide aminé terminal sous forme d'un composé hétérocyclique; le reste intact de la molécule peut subir une nouvelle série de réactions, l'acide aminé terminal étant enlevé

et identifié à chaque nouvelle étape.

Les trois réactifs particulièrement étudiés dans ce domaine ont été le sulfure de carbone, le xanthate, le phénylisothiocyanate*

dans des conditions semblables pour les différents amino-acides. Cependant, la facilité d’oxydation des composés intermédiaires et le rendement trop faible de l'étape de cyclisation, surtout dans le cas des protéines, en limitent fortement l'emploi. On trouvera dans notre mémoire de licence l'exemple de la [i-lactoglobuline, très signifi­ catif des difficultés rencontrées dans l'application aux protéines.

Aussi, les essais entrepris pour mettre au point une méthode d'étude des séquences polypeptidiques basée sur l'emploi du CS^ sont- ils abandonnés actuellement. Comme méthode d'étude de la constitu­ tion de peptides simples, ce réactif a cependant donné lieu à une mé­ thode très utile permettant d'utiliser des quantités minimes de subs­ tance au départ (-LEONIS, 1952). Les conclusiosn relatives à son em­ ploi sont exposées dans un article récent de LEONIS et LEVY (1954)*

Une autre méthode consiste à faire réagir les sels sodiques des peptides avec les alkyl-alkoxydithioformates (ou dialkylxanthates) (KHORAM, 1951 - KEmîER et KHORAM’, 1952). Par hydrolÿse alcaline puis acide du composé ÎT-thioncarbalkoxy obtenu, on récupère l'acide aminé terminal. Cependant, le produit cyclique intermédiaire n'a pu être obtenu et sa structure reste conjecturale, ce qui ne facilite pas l'em­ ploi de la méthode et la recherche des meilleures conditions. D'autre part, nous ne sommes pas parvenus à reproduire dans ce laboratoire les rendements élevés mentionnés par l'auteur. Un essai d'étude cinétique a confirmé que la réaction semblait être beaucoup plus complexe que ne le laissait supposer la publication initiale. Il est d'ailleurs à noter que ce réactif, dont à priori l'utilisation paraît séduisante, n'a plus fait l'objet dé publications ultérieures, ce qui tend à confir mer l'impression obtenue dans ce laboratoire.

16.

demande des conditions adaptées à chaque peptide mis en oeuvre, ce qui en rend l’application plus laborieuse. Néanmoins, les résultats obtenus à l’aide de ce réactif ont été très convaincants, et il fait actuellement l’objet de recherches nombreuses (cf., les revues d’ELLIOT et de DESNUELLE, 1954).

En fait, il semble bien qu’aujoiird’hui, les deux meille\ares méthodes d’étude des séquences polypeptidiques soient la méthode de SANGER, d’une part, celle d’EDMAN au phénylisothiocyanate, d’autre part. Il est à noter que ces méthodes sont en fait appliquées d'une manière relativement empi­ rique. Les conditions opératoires ont été fixées souvent de façon arbi­ traire, et les utilisateurs ne se sont pas toujours souciés du contrôle des diverses étapes de la réaction. On peut d'ailleiirs remarquer que la méthode de SANGER et celle d’EDMAN sont basées sur des principes en somme

opposés. Dans l’application des méthodes par hydrolyse partielle, on tire parti de ce que toutes les liaisons peptidiques sont suffisamment labiles pour être clivées, à l’exception des liaisons proches du radical dinitrophénylé. Dans les méthodes récurrentes, on suppose au contraire que l’hydrolyse libère 1’hétérocycle au cours de la seconde étape de la réaction, mais ne clive aucune autre liaison peptidique. On voit donc que

les limitations dans la première série de méthodes, à savoir la stabilité des liaisons peptidiques, constituent au contraire un facteur favorable aux méthodes par récurrence.

La recherche de ces conditions nous a amenés, dans la première partie du présent travail, à étudier la cinétique de la réaction du CgH^NCS avec les acides aminés et peptides.

D'autre part, les quantités de matière requise pour les études structurales sont en général assez abondantes, de l'ordre de plusieurs milligrammes. Or, il est certain que beaucoup de laboratoires ne peu­ vent se permettre d'acquérir des quantités importantes de produits

parfois coûteux, et que d'ailleurs les sovirces de produits naturels peuvent être assez limitées. Aussi y-a-t-il intérêt à se limiter

strictement à des quantités aussi petites que possible. C'est pourquoi nous nous sommes attachés à mettre sur pied une microméthode permet­ tant d'utiliser des quantités de peptide de l'ordre d'un à deux dixièmes do nicromôlo.

-oOo-PREMIERE PARTIE

CIHETIQÏÏE___ DE___ M____ ?_E_é_5_ï_L2_^____

?_5_5_LI_î!_î-§_2_Ll_î_2_2_ï_è_Lè_î_5

I. I1TTR0DUCTI0 17.

L'étude cinétique de la réaction des divers réactifs-du groupe aminé libre avec les acides aminés et protéines est intéressante à des points de vue très divers.

D'un point de vue général, comme toute étude cinétique, elle peut apporter des informations sur les meilleures conditions réactionnelles à utiliser. Elle peut aussi fournir des renseignements précieux sur le mécanisme de la réaction, ce qui permet de préciser les phénomènes à l'échelle moléculaire| ainsi, en se basant sur des considérations structu raies, l'on peut envisager l'utilisation de réactifs apparentés qui dif­ fèrent par l'-un ou l'autre radical, et, ce faisant, influencer favorable ment la vitesse réactionnelle.

20.

Dans le cas particulier des réactifs des groupes aminés litres des acides aminés et protéines, il existe bien des raisons qui semblent à priori justifier d'aborder une étude cinétique systématique.

En ce qui concerne les acides aminés ; il existe remarquablement peu d'études cinétiques des réactions de ces substances, malgré l'utilité des informations sur la réactivité des différents radicaux participant à la molécule. Ces études, par ailleurs, permettraient de mieux comprendre les réactions des chaînes polypeptidiques ou protéiques, et la perturbation qu'apporte dans une de ces molécules l'introduction d'un acide aminé pourvu d'un groupe réactionnel particulier. Compte tenu du nombre important des substances protéiques, ce champ d'investigation est pratiquement illimité.

En ce qui concerne les réactifs eux-mêmes ; leur usage dans l'étude des séquences d'acides aminés a fait avancer à grands pas l'étude de la structure fine des polypeptides. Il est certain que la connaissance plus précise de l'influence des groupes substituants favoriserait la mise en oeuvre de nouveaux réactifs à rendement plus élevé, ou peut-être à réaction plus sélective.

Dans le présent travail, nous avons étudié la cinétique de la réaction du phénylisothiocyanate avec une série d'acides aminés choisis pour leur caractère représentatif.

Nous avons réalisé la réaction au moyen d'un appareil automatique, permettant de maintenir le pH constant et d'enregistrer des courbes ciné­ tiques .

21.

II. APPAREIL AUTOMATIQUE POUR MAIUTSl'TIR LE PH CONSTANT.

Prinolpe : Le principe de cet appareil est le même que celui décrit dans la puLlication de JACOBSEN et LEONIS (1951 )l notre travail de licence en donne l’essentiel. Rappelons-le "brièvement ;

Réalisation de 1*appareillage.

La cellule de mesure est constituée par un récipient cylindrique, 5

de 2,5 cm de diamètre et de 10 cm environ de capacité, fermé par un "bouchon que traversent l’électrode de verre, l’électrode au calomel,

l’aigtiille de la seringue et l’agitateur de platine; elle est pourvue d'une amenée d’azote. La cellule est immergée dans un thermostat à huile réglé à 40° +_ 0,1.

L’appareillage comprend, outre la cellule, un système d'électrodes en relation avec un pHmàtre à lecture directe (RADIOÎüETER, type PHM 22). Ce pHmètre est relié à un galvanomètre dont le spot liimineux "balaie une cellule photo-électrique double, qui anime un relais électronique; ce dernier, dont le schéma est donné dans la figure 1, actionne le moteur de la seringue qui déverse dans la cellule de mesure une solution titrée de soude. Lorsque par diminution du pH, le spot lumineux éclaire la

22.

une augmentation de courantf celle-ci fait basculer le contact du relais dans une position telle qu’il ferme le circuit du moteiir de la seringuej et cette dernière déverse de la soude dans le milieu réactionnel. Ceci provoque une augmentation du pH dans la cellule de mesure et un déplace­ ment du spot dans la direction de la cellule photo-électrique II. Lorsque celle-ci est éclairée, le contact du circuit du motetir bascule dans la position inverse, arrêtant ainsi l'addition de soude. Cette dernière re­ prendra dès que le pH se sera rétabli à une valeur telle que la cellule I soit à nouveau éclairée. Il suffira donc d'ajuster convenablement le spot du galvanomètre au pH désiré, pour que toute augmentation du pH coupe le circuit du moteur, et que toute diminution de pH mette le moteur en route. L'ajustement du spot du galvanomètre se fait par comparaison avec une solution tampon.

La seringue utilisée était du type Agla micromètre (capacité totale:

5 X.

500 imr/j graduée en 0,2 mm )| les titrages ont été effectués au moyen de soude environ 0,1 N. L'enregistrement automatique de la cinétique réaction­ nelle a été assuré grâce au système préconisé par JACOBSEÏT et LEOKIS (1951 )•

(figure 2).

On trouvera le schéma de principe de tout l'appareillage à la figure 3 et une photo de l'installation complète à la figure 4*

Difficultés rencontrées dans la mise au point.

1) Le temps orageux et humide rendit à certains moments toute mesure impossible, probablement en raison de la formation de films conducteurs à la surface de l'armatvire externe de l’électrode en verre. On comprendra aisément la perturbation apportée, si l^on se rappelle que la résistance de la membrane de verre de l'électrode est fort élevée, de l'ordre de plusieurs centaines de mégohms.

2) L'agitateur de platine utilisé dans la cellule de mesure était primi­

tivement mû par un petit moteur dont le régime ne fut pas absolument constant. Or, toute variation de régime entraînait des fluctuations de l'aiguille du pH-mètre. De plus, le frottement de l'agitateur contre le tube de verre qui le guidait à travers le bouchon de la cellule de mesure produisait également des fluctuations de l'aiguille.

3) Les connexions reliant l'électrode de verre et l’électrode de réfé­

rence au pH-mètre doivent être fixées rigidement, tout déplacement de ces connexions entraînant un déplacement concomitant de l'aiguille du pH-mètre.

Il est à noter que ces trois causes perturbatrices se manifestèrent quoique toutes les parties de l'appareil fussent reliées à la terre.

Pour éliminer ces causes perturbatrices, nous avons dû apporter au montage les modifications suivantes ;

"b - Le thermostat lui-môme est placé sur une semelle métallique mise à la terre et munie de trois tiges de métal à ses angles. De plus, la cellule de mesure est entourée d*une cage de cuivre amovible, également reliée à la terre. De cette façon, la cellule de mesure se trouve complè­ tement isolée électriquement des perturbations extérieures ("effets de main").

c - La cellule de mesure elle-même a été sérieusement modifiée. Nous nous sommes aperçus, en effet, qu’un des facteurs perturbateurs les plus importants était le bouchon de liège qui fermait notre cellule primitive, en laissant passage aux électrodes et à l’agitateur. En effet, ce bou­ chon devient humide au cours des mesures (la réaction se passe à 40°) et se recouvre d’un film conducteur qui constitue xme résistance de fuite entre les deux électrodes, d’où la perturbation importante des mesures. Nous avons réussi à réaliser une celliile en verre Pyrex fermée par un bouchon rodé, en Pyrex également. Ce bouchon est muni d’un rodage pour le modèle d’électrode de verre à rodage que fournit la maison BECKM.IT5 un trou avec bordure de 2 mm est prévu pour 1’électrode de calomel, que l’on peut fixer à l’aide de paraffine Cérésine de résistivité élevée; enfin, un capillaire fait corps avec le couvercle et sert de guide à l’agitateur de platine ... Le tout est maintenu dans le thermostat par un statif de cuivre spécialement conçu pour l’usage et relié à la terre. On trouvera, à la figure 5> photo de la cellule démontée et de son saturateur, et à la figure 5 bis une photo de leur assemblage.

Ainsi, tout en réalisant notre réaction en cellxxle quasi fermée, nous avons éliminé de sa construction toute substance de résistivité trop faible. Par surcroît de précaution, nous avons recouvert l’inté­ rieur du couvercle de Pyrex et la partie supérieure de l’électrode d’une couche organo-silicique (le "Desicote" BECKMAN); cette couche

25.

non plus d*un film liquide continu, mais de petites gouttelettes non confluentes,

III. RESULTATS EXPERIMENTAUX.

Conditions opératoires j

Toutes les mesures ont été réalisées dans tm mélange KCl 0,2 M/alcool, 50/50, v/v. En effet, des essais d’orientation effectués dans l'eau seu­ le ou dans un mélange eau/alcool, 50/50, se révélèrent peu concluants. Par contre, les mesures faites dans le mélange considéré furent facilement répr.oductibles. L'action de l'alcool sur la tension superficielle facilite la saturation en phénylisothiocyanate, très peu soluble; le chlorure de potassium confère à la solution une force ionique suffisante povir assurer la stabilité de la chaîne d'électrodes.

La température a été maintenue à 40®, 0 i 0,1“ par immersion dans le ther­ mostat à huile. Le pH a été mesuré au moyen du pH-mètre Radiomètre, type PHM 22; cet appareil permet la détermination de 1-2 centièmes d'uni­ tés pH,

27.

Constantes cinétiques expérimentaloa s

La réaction gloLale de condensation peut être décomposée en deux stades qui nécessitent chacun l'adjonction d'ions basiques pour main­ tenir le pH constant.

Le premier stade comporte la titration du groupe aminé du peptide envisagé, pour 1'amener du point isoélectrique au pH de l'expérience :

^000“ ^ COO"

La réaction de condensation est en effet réalisée à des pH supé­ rieurs au pH isoélectrique, pour assurer une vitesse réactionnelle suffisante.

Le second comporte la libération d'ions hydrogène requise pour achever de désioniser les groupes aminés consommés par la réaction de 1'amino-acide ou peptide envisagé avec le CgH^NCS, comme nous le montre­ rons plus loin (p.35 )•

Par conséquent, la courbe donnant la consommation de base en fonction du temps comporte deux parties distinctes :

1® - avant l'introduction du CgH^NCS, le milieu réactionnel qui renferme une concentration Co en groupe réactionnel est neutralisée par une quan­

tité de base Co où est le degré d'ionisation déterminé par le pH de l'expérience et le pK du groupe ionisable considéré.

2® - après l'introduction du CgH^NCS, sation.

conden-En isolant de la courbe cinétique globale l'effet de titration initiale du groupe aminé considéré, on obtient donc la cinétique de la réaction de condensation proprement dite.

A pH et concentration en CgH^NCS constants, l'expérience montre que cette réaction est apparemment d'ordre 1 par rapport au groupe aminé, La justi­ fication de ce fait en fonction du mécanisme réactionnel sera donnée par après. Sa vérification expérimentale a été faite dans tous les cas étu­ diés, en portant en diagramme le logarithme des concentrations résiduel­ les en fonction du temps. On trouvera dans la figure 6, à titre exempla- tif, une des courbes expérimentales de la valine et aux figures 7 à 16, les diagrammes logarithmiques d’une série de nos courbes.

Nous établissons plus loin que la réaction envisagée obéit plus précisément à la relation suivante t

/

B. « Co (1 -o< ) 1 - e-Kobs. t

où B désigne la base consommée au temps t , depuis l'addition do CgH^NCS,

et la constante cinétique de la réaction de condensation.

La quantité maximum de base consommée par la réaction est représentée par

B^ = Co (l - o< ) pour t --- i ïc

Le diagramme donnant log (B^ - B^’) en fonction de t est donc une

droite dont la pente permet de calculer Nous discuterons plus loin

quelle est la relation entre cette grandeur et les constantes cinétiques des processus élémentaires.

L'ensemble dos résultats obtenus est donné dans le TABLEAU I . Les valeurs de utilisées furent déterminées électrotitrimétriquement par R, BUYLE dans des conditions identiques à celles de l'étude cinétique

est la différence des pK calc\ilés pour une même substance, selon que l'on considère dans le diagramme log ("*’)/(-Mg ) = pK - A. pH une pente A strictement unitaire, ou la pente qui satisfait le mieux à la régression linéaire. Les constes K sont calc\ilées en logarithmes népériens; l'écart type est celui de la pente des droites log B = f(t), diterminée par l’étude de la régression linéaire.

L'imprécision sur les valeurs de est en grande partie impu­

table aux incertitudes sur la valeur exacte du pH durant l'expérience; nous ne nous attarderons pas ici à cet effet, puisqu'il est discuté par LEONIS (1955). Il est à noter qu'une autre cause d'erreur peut être due au réactif lui-même. En effet, la stabilité de l'électrode de verre paraît décroître lorsqu'on passe du sulfure de carbone au paraiodo- phénylisothiocyanate, et de celui-ci au phénylisothiocyanate. Le vieil­ lissement de ces électrodes paraît d'ailleurs plus rapide dans ce der­ nier milieu. Il faut également noter que l'électrode s'habitue en quel­ que sorte au réactif et, inversément, le passage du milieu réactionnel à un tampon aqueux, par exemple, demande un certain temps (de l'ordre do 5-10 minutes) pour l'équilibration correcte au pH du milieu. Ajoutons encore que les électrodes de verre requièrent un temps d'adaptation très notable lorsqu'on les change de réactif parmi les trois envisagés (CS2» I-CgH^IICS, CgH^NCS). Il n'est évidemment pas exclu que ces réactifs for­ ment sur l'électrode des films qui auraient des propriétés et une vitesse de formation différentes.Ceci n'entraîne, d'ailleurs, à part une impré­ cision parfois plus grande sur les résultats expérimentaux, aucune in­ certitude supplémentaire sur les données que l'on tire, les mesures étant en somme comparatives.

31.

Dg même, malgré de multiples essais à des pH différents et, notamment,

dans ■une zone compatible avec la réaction du paraiodophénylisothiocyanate et du CSg, nous n'avons obtenu pour la glutamine et l'asparagine q.ue des résultats absoluments erratiques.

'og (

"

)

i°g(^oo“B)

50

temp s

(minutes)

10-Réactions de I acide a-cmmobutynique

iog (B

i

log(Bco- b)

32.

IV. INTERPRETATION CINETIQUE DE LA REACTION .

a. Influence du pH sur la vitesse réactloimelle.

Dans la discussion de la réaction envisagée, il est essentiel de dé­ terminer si le phénylisothiocyanate réagit avec la forme ionisée ou la forme non ionisée de la fonction amine du peptide. Une première indica­ tion expérimentale est fournie par 1*influence du pH sur la vitesse réactionnelle. Les résultats obtenus montrent que la vitesse réaction­ nelle est une fonction croissante du pH.

s'attendre au contraire à une diminution de la vitesse réactionnelle avec l'augmentation du pH, puisque ce facteur diminue le nombre de molécules

tesse réactionnelle favorise l'hypothèse que c'est la molécule non

char-est confirmée par l'étude cinétique plus approfondie de la réaction.

Si l’on, admet que la réaction on doit

Td, Equation cinétique de la réaction.

L’influence du pH suit la vitesse réactionnelle nous a déjà montré qu’à tout le moins la forme chargée ne pouvait être la seule forme moléculaire à entrer en réaction. Nous allons voir, en établissant l’équation cinétique complète, si l'hypothèse qui tient compte de la réaction des deux formes moléculaires à la fois, n’est pas justifiée.

L’interprétation la plus simple des réactions consiste à envisager avant tout l’équilibre d’ionisation i

R- f=*aa^ R

-qui progresse vers la droite à mesure que le pH augmente; on peut ad­ mettre alors que le phénylisothiocyanate réagit avec l’une ou l’autre des deux formes en solution i

R- NH_ + C.H.NCS ....R- RH - CS-NH - C,H.

2 6 5 D 5

ou

R- + CÆNCS ----» R- RH - CS - RH C,H_ +

3 6 5 6 5

En principe, trois cas peuvent donc se présenter t

1) k est fini, k’ = 0 .

2) Je =» 0, k’ est fini .

5) k et k’ diffèrent de 0 (k k') .

34.

ionisés est donnée par : - d(R-ÏÏE2)

dt = k (R-Mg) (CgH^RCS) = KCR-HHg)

si l«on pose K = k(OgH^RCS).

C’est-à-dire, si l'on assure la saturation en phénylisothiocyanate comme nous l'avons fait. De même, la vitesse de disparition des groupes ami­ nés ionisés sera représentée par j

- dCR-MH,"^) _____________

dt = k‘(R-KH2)(CgH^ITCS) K»(R-m^''')

en posant encore K' = k'(CgH^NCS).

En désignant par o( le degré de dissociation de la fonction amine au pH envisagé, on peut écrire q,ue 1

(h-BEj) . CX X 0^^^

(E-KHj+) . (1 - «)

OÙ représente la concentration totale en fonction amine, ionisée

et non ionisée.

La vitesse de disparition des deux fonctions amines, ionisée et non ionisée, sera donnée par ;

= kU-KHj) . ^ K X + (1 - c<

OU encore :

dt 0( K + (l - (X ) K»

L'expérience a montré que la réaction est bien d'ordre un par rapport au groupe aminé, et obéit à la relation similaire ;

“ ^ °tot_{^ ^ ^ IT}

dt ~ '“‘obs

Nous sommes donc justifiés à admettre l'identité

K + (1 - ) K'

L'équation cinétique générale peut s'écrire :

(

)

+ d C tôt 'tôt

dt

Par intégration, on en déduit la relation s

ou

-K , .t 0. = 0 e

t O

0,-0, -0„{l-e )

(Cq et représentent les valeurs de 0^^^ au temps zéro et au temps t,

respectivement). Si l'on se rappelle que la titration préliminaire à

la réaction requiert \ine quantité de base , on verra que la

56.

Connaissant les valeurs de et de KQ-j^g pour chaque amino-acide et chaque pH utilisés, on peut, grâce à la relation (l), déduire les valeurs de K et K* correspondant à chacun des trois mécanismes considé­ rés plus haut. Bans le cas du premier mécanisme, la relation (l) se réduit à K^i^g = K : on obtient donc pour chaque pH la valeur de K,

en divisant par K 5 de même, dans le cas du mécanisme (2), la

constante K' est donnée par le quotient de et (l - ),

Bans le cas du troisième mécanisme, enfin, on tire les valeurs de K et de K' en résolvant le système de deux équations à deux inconnues, à partir des valeurs de K^-j^g pour deux pH différents. Ces données sont réunies dans les TABLEâUX II et III.

En examinant les résxfLtats repris dans le TàBLEA.U II, on constate que le mécanisme 2 est moins favorable à l’interprétation des résultats expérimentaux. En effet, la cohérence entre les valeurs obtenues à des pH différents est nettement moins bonne dans le cas du mécanisme 2 où l'on suppose que la fonction réagissante est l'amine ionisée. Les écarts moyens fo sont en effet systématiquement, supérieurs, sauf dans trois cas que nous discuterons par après, ceux de la lysine, de la thréonine et de la glycine.

On peut considérer, d’autre part, que le mécanisme (5) est valable et que les deux formes participent à la réaction. Le TABLEAU III montre que, dans cette hypothèse, la constante K', attribmble à la forme io­ nisée, est toujours inférieure à 10 do la valeur de K, et peut donc être considérée comme négligeable. Bans les 2/5 des cas étudiés, K’ représente moins de 2 ^ de K, ou même est négative. Ceci, à nouveau, avec l’exception des trois cas précités.

Acides pH

aminés de l'exp. K fini Ecart K = 0 Ecart

L’interprétation cinétiq^ue de la réaction recoupe donc parfaitement les résultats qualitatifs fournis par l’influence du pH sur la vitesse réactionnelle.

Considérons maintenant de plus près les résultats qui se trouvent en dehors de la norme commune.

On constate que, dans le mécanisme 5> thréonine et, dans une cer­ taine mesure, la sérine, présentent une contribution non négligeable de K'. De même, dans la comparaison du mécanisme 1 au mécanisme 5, les écarts sont déjà moins élevés qu’on ne s’y attendrait.

La glycine présente également des résultats moins favorables, à la fois dans la comparaison des mécanismes 1 et 2 et dans le mécanisme 3« Ceci est à rapprocher du point de vue que nous avons développé plus haut que les groupements fonctionnels pourraient influencer la régularité de la cinétique. Rappelons, à ce propos, que nous ne sommes pas arri­ vés à des valeurs expérimentales cohérentes poiir les amino-amides, l’asparagine et la glutamine.

Le cas de la lysine est un peu plus particulier, par suite de l'existence de deux sites réactionnels dans la molécule. En effet, les points

obtenus en traçant le diagramme logarithmique des concentrations rési­ duelles en fonction du temps pourraient, à la rigueur, s’interpréter

en supposant qu’il y a deux droites et, par conséquent, deux constan­ tes cinétiques correspondant atix pentes de ces droites. Nous avions rejeté cette hypothèse lors de nos calculs parce que la pente de la deuxième droite était plus grande que celle de la première s c'est-à- dire que la vitesse réactionnelle, au lieu do diminuer au cours du temps, semblait en fait augmenter. Cependant, nous ne pouvons pas, à priori, abandonner cette hypothèse, car il n’est pas impossible que la substitution du groupe (y -aminé facilite la réaction ultérieure du

40.

c. Interprétation électronique de la réaction.

IfouB sonunes donc arrivés à la conclusion que la réaction a lieu

entre la molécule non chargée R-NHg phénylisothiocyanate. Ce

ty.pe de réaction apparaît dès l’abord comme l'addition nucléophile de l'amine à 1'isothiocyanate. En effet, l'hypothèse la plus simple sur le mécanisme à l'échelle moléculaire consiste à supposer que la paire libre d'électrons de l'atome d'azote du groupe aminé attaque le car­ bone du groupe thiocarbonyl. Celui-ci peut, en effet, être représenté par des structures de résonance telles que :

+ „ “ +

- N - S . et CgH^ - N - C = S

ou même par des structures où se manifestent des phénomènes de pola­ risation comme :

CgH^ - N = C

r

et TTtr C Trfgl S

6 5

Il est d'ailleiors intéressant de rapprocher de la réaction du phényl- isothiocyanate avec les peptides ou acides aminés, la transformation du cyanate d'ammoniùm en urée.

ïïn des mécanismes envisagés implique que ce sont les ions ammonium et cyanate qui réagissent selon :

Une première série d'études cinétiques de cotte réaction favorisèrent .d'abord ce mécanisme (WALKER and HAMBLY, 1895 ~ WALKER and APPLEïARD, 1896). L’effet de la force ionique sux la vitesse réactionnelle fut notajiiment mis en accord avec l'équation do BRONSTED-BJERRUM-CHRISTIAIEEÎI relative à la réaction entre deux ions de charge opposée (WARNER and STITT, 1953). De même, le changement de solvant et de constante diélec­ trique fut trouvé en accord avec ce point de vue (cf., par exemple, WARNER and WARRICK, 1955 - SVIRBELY and WARNER, 1935).

Cependant, on montra par la suite que l'effet de la force ionique sur les coefficients d'activité pouvait tout aussi bien rendre compte des résultats expérimentaux dans l'hypothèse où les molécules réagissantes

sont des molécules neutres (WEIL and MORRIS, 1949). Or, il y a alors un schéma réactionnel simple qui peut rendre compte de la transforma­

tion du cyanate d'ammonium en uréei c'est le suivant (lOWRY, 1934)

La paire d'électrons libres de l'atome d'azote s’additionne au Carbone polarisé positivement de l'acide (écrit sous sa forme tautomérique indiscernable d'acide isocyanique).

Il suffit, alors d'un échange de protons pour obtenir l'urée t

\

H - N = C = 0 --- > H - N = C - 0 —N H - C 0

• •

I

t

HNE HNH"^ NH

H HH

Ce nécanisme est identique à celui de la réaction d'un isocyanate d'alkyl avec l'ammoniac, pour donner une urée substituée.

42.

En réalité, ceci représente le schéma général d’addition des réactifs basiques au groupe carbonyle.

D'un autre côté, envisageons ce qui se passerait en cas de réaction entre deux ions î la liaison carbone-azote qui devrait être établie est

bloquée par les 4 hydrogène autour de l'azote.

La seule possibilité pour les ions est celle de former un complexe à liaison d'hydrogène : H 1 + H-r-H...-...IT = C = 0 ( H

qui se réarrangerait alors en donnant le même produit d'addition que le mécanisme précédent. Cependant, ce réarrangement paraît moins fa­ cile à réaliser. Par conséquent, l'analyse stétéochimique favorise plutôt la réaction entre molécules neutres, ce que les résultats expé­ rimentaux ne contredisent pas.

En résumé, on peut établir un très large parallélisme entre la condensation du phénylisothiocyanate avec les amino-acides, et la réaction des isocyanates avec l'ammoniaque s dans un cas comme dans l'autre, se dégage l'idée d'un processus qui met en jeu les molécules sous leur forme non chargée.

-oOo-Y. CONCLUSION.

On voit donc que cette étude a permis d'établir une équation cinétique satisfaisant aux données expérimentales. Elle a également montré que la réaction met on jeu le groupe aminé du substrat sous sa forme non ionisée.

Ceci recoupe les conclusions de l'étude cinétique entreprise par LEONIS (1948) à l'aide du sulfure de carbone, réactif apparenté au phénylisothiocyanate. Toutefois, les résultats de cette étude furent obtenus, à l'époque, au moyen d'une technique expérimentale moins éla­ borée qu'actuellement. En effet, la constance de la force ionique du milieu n'avait pas été assurée; en plus, le pH était maintenu constant non par un dispositif automatique utilisant l'électrode de verre, mais manuellement, à l'aide d'indicateurs colorés, ce qui diminuait évidem­ ment la précision des mesures.

44.

des deux réactions présente également de grandes analogies.

On peut encore envisager d*autres réactifs apparentés, tel le para - iodophénylisothiocyanate récemment étudié dans ce laboratoire. BUYLB a montré que, dans ce cas également, les réactions suivent dans l’ensemble un mécanisme identique. Bien entendu, cette étude cinéti­ que ne constitue qu^um premier pas vers le but que l’on se propose ; en étudiant systématiquement le comportement vis-à-vis des acides aminés d’une série do réactifs apparentés, arriver à une interpréta­ tion plus quantitative de l’influence des radicaux des acides aminés sur leur réactivité. Nous avions déjà fait une tentative de ce genre (van RïlîENAHT, 1954) eii utilisant l’équation de TAFT. Cela consistait, pour l’essentiel, à définir, à partir des constantes cinétiques expé­ rimentales, deux facteurs. L’un, la constante de substitution polaire, dépend du radical par lequel la substance réagissante se distinguo d’une substance de même classe prise comme standard. La deuxième, ou constante de réaction, dépend du réactif et des conditions de milieu. BUYLE a montré également que les constantes de substitution polaire

ainsi obtenues sont en bon accord avec les valeurs correspondantes

obtenues par 1étude cinétique de la réaction du para-iodophénylisothio- cyanate ou de la condensation de certains amino-acides avec la glucose (KATCHALSKY et SHARON, 1955).

Depuis lors, il est devenu apparent que l'on ne pouvait négliger cer­ tains facteurs, d’ordre stérique principalement, et qu'il faut considé­ rer une équation du type de celle d’HAMMET, mais plus générale.

de nouvelles substances standards; nous ne reproduirons donc pas ici les valeurs que nous avions dégagées à l'époque.

Le calcul complet, tenant des effets d'origine stérique et d’autres effets plus spécifiques encore, ne peut être entrepris qu'à la lumière d'une comparaison tout à fait générale. Le phényl- isothiocyanate est le premier terjae de cette comparaison; les deux autres, sulfure de carbone et para-iodophénylisothiocyanate'sont l'objet des recherches de lEONIS (1955) et <ie BTJYLE (1955) respec­ tivement. C'est dans leurs travaux que seront discutés les aspects plus généraux du problème.

Il est certain que le présent travail et ceux poursuivis parallèlement dans ce laboratoire ne constituent qu'un essai de systématisation des réactions des acides aminés, Seixle la confron­ tation des résultats obtenus par l'étude plus large encore de nom­ breux réactifs apparentés, permettra de pénétrer mieux la raison du comportement réactiojinel des araino-acides. Quoi qu'il en soit, les premières conclusions font bien augurer de l'avenir de ce genre nouveau d'investigation, première étape sur la voie de l'interpréta­

tion rationnelle des interactions des polypeptides et protéines.

oOo-DEUXIEME PARTIE

E T A B L I S S E M E N T____ _______________ î?_î_°_LO_l_ï_L2_?_5

p_o_u_R____ ?_5_î_§_5_îî_î_î?_l_5____ î?è____ §_5-S_?_5_lî_2_5

DES ACIDES AMINES

I. INTRODUCTION.

Il est inutile de s'appesantir longuement sur l'intérêt que présente la mise au point d'une microméthode d'utilisation facile pour la caractérisation des séquences d'acides aminés dans les peptides et protéines. Les quantités de composés peptidiques obte­ nues à partir des sources naturelles sont souvent petites et elles s'amenuisent encore au cours des divers procédés de purification utilisés? généralement, quelques milligrammes de produit pur consti­

48.

la méthode une fois établie peut se révéler à la fois plus simple et plus rapide qu'à l’échelle macroanalytique.

LEONIS (1952) fut le premier à mettre au point une microméthode pour la détermination de la séquence des acides aminés dans les pep­ tides, en utilisant le sulfure de carbone comme réactif.

Le principe de la technique était de réaliser la réaction sur une bandelette de papier, ce qui confère une rapidité et une sensi­ bilité plus grandes à l'opération.

Il no semble pas inutile, avant d'entrer dans le détail, de rappeler brièvement ici la suite des réactions qui aboutissaient à l'isolement de l'acide aminé N-terminal du peptide.

Au cours de l'étape de condensation, le peptide réagit, en milieu alcalin, avec le sulfure de carbone pour donner un dithiocarbamate selon le schéma ;

H+

R'-I'IÏÏ-CO-CHR-ÎIHj'*’ + CSg . ) R'-NH-CO-CHR-M-CSS“ + 2 H'*'

OH"

Par acidification, le composé obtenu libère l'acide aminé N-terminal, sous forme d'une thiothiazolidone; c'est l'étape de cyclisation %

H" CO - CHR

R'-RH-CO-CHR-NH-CSS’ R'HH_ +

5 S_\ jJH

L’acidification plus enfin, 1’acide aminé

poussée de la thiothiazolidone obtenue régénère,

qui portait le groupe libre dans le peptide.

CO — CHR I I

S

m

s

Après l’étape de condensation, on réalise facilement la cyclisation en acidifiant directement la bandelette, puis on en élue la thiothia­ zolidone, en tirant parti de la solubilité très grande de ces sub­ stances dans les solvants organiques, dans lesquels, au contraire, le peptide résiduel R-NH_'^ n’est pas soluble.

5

L’utilisation de papier comme support de la réaction présente de multiples avantages. La surface offerte par le papier favorise le contact intime du réactif et du substrat ce qui, dans le cas de deux phases liquides immiscibles, ne pourrait être obtenu qu’au prix d’une agitation généralement difficile à réaliser dans un microtube. En plus, la manipulation de quantités de substance très petites est grandement facilitée grâce au fait que le papier constitue un support tangible à des quantités de matière à peine visibles.

L'élution des produits do la réaction est également facilitée, con­ trairement à ce qui se passerait dans le cas d'une décantation entre des quantités de liquide de l'ordre du microlitre.

D’autres avantages de la méthode concernent l’utilisation du réactif lui-même. Par exemple, l’acidification des dithiocarbamates

50.-il est très fac50.-ile de séparer l’un de l'autre les produits de la réaction, peptide résiduel et thiothiazolidone, l’extraction de ces dernières ne nécessitant d’ailleurs que des quantités minimes de solvant.

Au passif de la méthode, il n’y a, sous l'angle technique, à lui reprocher que la délicatesse de l’élution. Celle-ci consiste, on effet, à aspirer à l’aide d'une pipette capillaire, appliquée«contre la pointe de la "bandelette, le liquide qui la "baigne et qui entraîne ainsi le produit intéressant. Déjà, lorsque, les quantités d’éluat

à recueillir sont minimes, de l’ordre de

25

quiert une attention soutenue et fatiguante :de la part du cherchevir; elle requiert également une certaine ha"bitude et le respect strict de tous les détails opératoires. Si la substance à extraire est un peu moins soluble et qu’elle exige des quantités plus importantes de solvant d’extraction, on est facilement astreint à une après-midi de travail fastidieux poixr l’élution de quelques bandelettes. Si, par sixrcroît, la tension superficielle n'est pas favorable, (par exemple, dans le cas de l’acétone eu do l'éther) cette élution par pipette devient m6me impraticable.

Pour toutes ces raisons, dont les principales tiennent en fait au réactif lui-même, il était nécessaire de rechercher la possibilité d’une microméthode utilisant un autre réactif, plus approprié, tout en conservant le schéma technique général.

Nous avons songé d'abord au xanthate préconisé par KHORANA (1951 et 1952) et nous avons préparé les réactifs nécessaires. Toute­ fois, comme nous l'avons signalé dans l'introduction et ainsi qu'on le verra plus loin, les essais que nous fîmes à l'échelle macroana­ lytique ne donnèrent pas un rendement satisfaisant.

Une tentative d'étude cinétique, entreprise par LEONIS, semblait éga­ lement indiquer que la réaction est plus complexe que l'équation stoechiométrique ne le laisserait croire. Depuis la publication ori­ ginale, ce réactif n'a, d'ailleurs, plus donné lieu à d'autres tra­ vaux et paraît assez oublié; peut-être faut-il y voir vine confirma­ tion des résultats obtenus dans ce laboratoire.

52.

Cependant, ce réactif présente également q^uelques inconvénients. Tout d’abord, certaines réactions d'acidification se réalisent trop rapidement, même à température peu élevée. Il est difficile, donc, de fixer des conditions optimales d'acidification, d'usage général, par suite de la sensibilité différente des thiohydantoînes obtenues à la destruction acide. Ensuite, les relations de solubilité des thiohydantoînes sont moins favorables que celles des thiothiazoli- donesî en effet, les thiohydantoînes sont moins solubles dans les solvants organiques peu polaires que ne l'étaient les thiothiazoli- dones, tandis que les composés qui leur donnent naissance ont un ordre de solubilité inverse. Il y a donc lieu d'effectuer une recherche plus soignée de. solvants sélectifs et d'envisager l'utilisation de quantités plus grandes d'éluant. Enfin, au cours des diverses réac­ tions, il se manifeste une série d'artefacts gênants qui peuvent don­ ner lieu à confusion et qu'il fut parfois très difficile d'éliminer.

Quoi qu'il en soit, la microraéthode au phénylisothiocyanate représente actuellement un progrès sensible par rapport à la méthode au CSg» Ce fait est attribuable non seulement au réactif employé, mais aussi à la simplification’ de la technique utilisée, qui paraît maintenant pouvoir être appliquée presque sans changement à n'importe quel réactif apparenté.

Notons encore que FRA.ENKEL-COHMT, suite à une visite de ce labora­ toire, a publié en 1954 me microméthode utilisant aussi le phényliso­ thiocyanate, et basée également sur l'emploi de bandelettes de papier. Nous verrons, par la suite, quelles sont ses principales caractéristi­ ques par rapport à la méthode que nous avons mise au point.

II. ESSAI D'ADAPTATION AUX PROTEINES DE LA MICROMETHODE AU CS^.

Cette méthode avait été appliquée peir LEONIS aux oligopeptides. Nous avons essayé de l’utiliser dans le cas des Protéines, en l'appli­ quant notamment à la -lactoglohuline, au lysozyme, à l’hémoglobine. Nos essais se sont révélés totalement infructueux. En effet, pour qu’un acide aminé obtenu après hydrolyse de la thiothiazclidone soit détectable par chromatographie sur papier, il faut isoler environ O.lyO/môle de thiothiazolidone. Or, la réaction se fait avec des ren­ dements inférieurs à 10 ^ dans le cas des protéines. Il fallait donc mettre en oeuvre de 20 à 40 mg. de matière protéique dans les cas précités. Or, ces quantités, auxquelles s'ajoutent les réactifs né­ cessaires, sont impossibles à fixer sur le papier qui finit par se racornir et n'accepte plus le dépôt de réactifs supplémentaires.

54.

faibles volumes utilisés (l0-20ytA.l de solution) seraient difficiles à équilibrer avec le réactif insoluble CS^.

De plus, on devrait dsms ce cas extraire la thiothiazolidone par des quantités relativement importantes de chloroforme| ceci provoque­ rait, lors de l’évaporation subséquente de ce solvant, une perte im­ portante en thiothiazolidone, comme l’a montré LEOÏÏIS.

-oOo-III. LE XA.NTHA.TE PRECONISE PAR KHORAKA.

D'après KEMER et KHORAIîA (1952), les xanthates réagissent aveo le groupe -NHg ü^i’e des composés peptidiques peur donner un N-thioncarbethoxypeptide, selon i

/

R-NHg + Cïïj - S ________ ^ CgH^O - C — M-CHR'-CO-NH-R"-COOH

C^H^O - C = S + CH-SH

25 5

56.

s

C^H^O - C - NH-CER'-CO-mi-CHR"-COOÏÏ + 2 HOl 2 5 HH - CHR* Il « C CO

/ \ X

i

(identique aiix thiotMazolidones> mais où C = S est remplacé par C = O).

Le traitement de ce produit cyclique par la soude, puis par HCl, permet d’obtenir l’acide aminé terminal t

HH - CHR’ / CO alcali --- - --- » HH - \ acide K

-coo" —---V +

cos

Nous avons préparé du 0-éthj3e iméthjïe xanthate selon VOGEL' (194S) avec le rendement prévu. Le produit obtenu avait la coulevir jaune caractéristique, l’odeur typique de choux, et le point d’ébul- lition requis 179°»

Nous essayâmes alors de réaliser la première étape de la réaction en suivant exactement le mode opératoire de KENNER et KHORANfi., et en utilisant le même peptide, 1’alanyl-glycine.

Cependant, quoique macroscopiquement la réaction se produisit comme l'auteur l’annonçait, nous ne parvînmes pas à reproduire les rende­ ments excellents que l'auteirr annonçait (-86 fo). En fait, la grosse

partie du produit final obtenu se 'révéla être le peptide de départ, ainsi que la chromatographie et le point de fusion le confirmèrent (®)

Une nouvelle expérience ne fut pas plus heureuse.

LEONIS fit à ce moment un essai d’étude cinétique du phénomène. Il s’est avéré que, dans des conditions de milieu strictement iden­ tiques, l'allure de la réaction pouvait varier d’une manière très considérable. En l'occurence, nous abandonnâmes ce réactif pour nous tourner vers le phénylisothiocyanate.

Cos résultats erratiques expliquent probablement qu'un réactif susceptible de fournir des rendements de 86 fe poior une réaction

aussi étudiée que celle du groupe -UHg des peptides, n'ait plus fait l’objet d’aucune publication depuis celle de KEHNER et KH0RAH6..

-oOo-IV. ETABLISSAIENT D'UNE MICROMETHODE AU PHENYLISOTHIOCYANA.TE,

Rappelons trièvement le schéma de la réaction du phénylisothio- cyanate avec un peptide.

- Etape de condensation : CÆ - N = C = S + NH^ - CHR - CO - NH ... COOH O P d. --- CÆ - NH-CS-NH-CHR-CO-NH ... COOH. 6 5 (Phérylthiouréidopeptide). - Etape de cyclisation t

I

R.CH-CO-NH ... COOH R.CH-CO

I .4. ^ I ^

NH NH-CgH^ H NH N-CgH^ + MJ ... COOH

^ cs'^ ^cs

Nous avons essayé d’adapter au phénylisothiocyanate la micro- méthode mise au point par LBONIS à l’occasion du CSg. A priori, ce passage d’un réactif à l’autre paraissait aisé à réaliser; en fait, il n’en fut rien. On le comprendra aisément par l’étude critique des divers aspects de la technique mise en service.

a. Choix du papier-support.

Dans le cas du CSg» le choix du papier filtre ne présentait pas de difficulté. En effet, il était apte à supporter les quantités peu importantes d’acide pendant le temps très court que nécessitait la cyclisation. Dans le cas du Ogïï^KCS, cependant, on utilise pour la cyclisation un milieu acide chlorhydrique/acide acétique auquel le papier résiste plus difficilement. Aussi, si la qualité Whatmah n®l peut donner satisfaction, il est parfois préférable d’utiliser le papier Schleicher et Sohüll n® 1573» q.ui résiste plus facilement aux acides. Cependant, il est à noter que ce papier libère plus de sub­ stances présentant -une absorption dans l’Ü.V.

b, Elution,

60.

complète des thlohydantoînes| ce résTOltat contraste avec les 25-30yx,l de chloroforme suffisants pour éluer les thiothiazolidones.

Nous essayâmes alors d*utiliser le système d’élution préconisé notamment par SANOER et TTJPPY (l95l)» consiste à serrer la ban­ delette entre deux lamelles de microscope, une partie du papier plon­ geant dans le liquide éluant, l'autre partie repliée laissant couler goutte à goutte le liquide qui a grimpé le long de la bandelette par capillarité. Quoiqu'il fut possible d'éviter l'évaporation en assurant l'étanchéité du système, la faible tension superficielle des solvants organiques utilisés empêchèrent l'emploi de cette méthode.

61.

En effet, celle-ci demandait qu'un travailleur expérimenté et très soigneux s'occupe de l'élution, tandis qu'actuellement elle peut être laissée entre les mains de n'importe quel technicien. D'autre part, le temps gagné par cette technique est certainement précieux; nous arrivons à effectuer le lavage de nos bandelettes en 1-2 heures au maximum, PRAEinCEL-COKRâT, par contre, se contente de laisser mariner sa; bandelette dans le solvant; l'opération requiert alors 24 h, pour éliminer l'excès des'Téactifs et produits gênants pour les étapes ultérieures.

On trouvera, à la figure I7, une reproduction de ce micro-extracteur.

c» Etape de condensation :

1 - Vérification par spectrophotométrie.

Un des premiers problèmes qui se posaient était de fixer les conditions optimales de la condensation du C,H_1TCS avec les

amino-b 5

Rg.16kik~Phénylisolhiocyanale.-VériricaMon de la loi de Beer-Lamberf.