Réf.15 TP19 : La régénération de l’ATP par les cellules.
Comment les cellules régénèrent-elles l’ATP nécessaire à leur fonctionnement ?
L’étude de cultures de levures permet de caractériser les voies métaboliques de régénération de l’ATP. Les levures utilisent en permanence de l’ATP, notamment pour croitre est se multiplier.
On cherche à montrer
- que le glucose est utilisé pour la respiration.
- la localisation cellulaire de cette respiration
Ressources
Deux souches de levures (à gauche des levures Rho- et à droite des levures Rho+)
Matériel disponible
- Une chaîne d’acquisition ExAO comportant une sonde à dioxygène, avec dispositif d’agitation.
- Un logiciel d’acquisition des données.
- La fiche technique du logiciel utilisé.
- Une solution de glucose à 10 g.L-1.
- Une suspension de levures Rho+ (10 g.L-1) préparée avec de l’eau du robinet, aérée par un aérateur d’aquarium durant 24h à 48 heures (levures « affamées » qui ont perdu la quasi-totalité de leurs réserves glucidiques).
- Une suspension de levures Rho- (10 g.L-1) préparée avec de l’eau du robinet, aérée par un aérateur d’aquarium durant 24h à 48 heures (levures « affamées » qui ont perdu la quasi-totalité de leurs réserves glucidiques).
- Une seringue de 1 mL, une pipette et une propipette.
- Papier absorbant.
1. Proposer, en utilisant le matériel mis à disposition et la fiche document un protocole permettant de montrer que le glucose est utilisé par voie respiratoire et localiser cette respiration au niveau cellulaire.
2. Paramétrer les mesures puis réaliser le montage en suivant les consignes de la fiche protocole
3. Acquérir les données pertinentes pour la résolution du problème selon le protocole proposé dans la fiche protocole
4. Présenter les résultats obtenus pour cela annoter le graphique (ou le document de secours) de la manière la plus complète possible en utilisant les fonctionnalités du logiciel d’acquisition.
5. Exploiter les résultats des deux premières expériences pour déterminer si les levures utilisent le glucose par voie respiratoire.
6 . Exploiter les résultats des 3 expériences pour localiser au niveau cellulaire la respiration
PROTOCOLE
Organiser le poste de travail de façon à manipuler proprement et en accord avec les consignes de sécurité.
Paramétrage des mesures et réalisation du montage
1. Paramétrer
Logger Pro (dans expérience et paramètres de mesures)
- mesure du temps = 6 min (ou 300 secondes)
- fréquence d’échantillonnage = 10 échantillon/s
2. Remplir l’enceinte avec la quantité de milieu nécessaire en utilisant une pipette et mettre un barreau aimanté ;
3. Installer dans l'enceinte la sonde à dioxygène.
4. Lancer l'agitation à vitesse modérée.
(agitateur magnétique)
5. Préparer une seringue avec la solution de glucose à 10 g.L-1.
Protocole d’acquisition des mesures
− Lancer la mesure,
− à t = 1 minute, ajouter très doucement dans le réacteur 1 mL de la solution de glucose et insérer un repère légendé sur le graphique, (rque :
− Poursuivre l’enregistrement durant le temps restant ;
− Présenter les résultats de façon optimale en jouant sur les fonctionnalités du logiciel.
Refaire la même manipulation en changeant le milieu : milieu B puis milieu C contenant les suspensions de levures Rho- ou Rho+
ATTENTION : ne pas jeter le barreau aimanté !
− Enregistrer vos résultats et imprimer puis ranger le poste de travail et fermer le logiciel.
Sonde à O2
On a réalisé des cultures de levures (champignons unicellulaires).
On utilise deux souches génétiquement différentes, l’une est capable d’utiliser le saccharose en présence de dioxygène et pas l’autre. On les appelle souche « Rho+» (souche sauvage) et souche
«Rho-» (souche mutante)
A l’aide d’un dispositif EXAO, on mesure la concentration en dioxygène dans 3 milieux de culture : - milieu A : eau + sels minéraux => témoin
- milieu B : eau + sels minéraux + levures de souche « Rho+ » ; - milieu C : eau + sels minéraux + levures de souche «Rho-»
- au temps t1 (1min), on injecte 0,5 ml de glucose dans le milieu.
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
0,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
6,0 Concentration en O2 (mg/L)
Temps (min) Milieu B
Milieu A Milieu C
injection
