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Chromatographie de pigments verts Chromatographie de pigments verts Chromatographie de pigments verts Chromatographie de pigments verts
I. INTRODUCTION
Les organismes chlorophylliens sont capables de synthétiser des molécules organiques simples sous l’action de la lumière visible. Cette synthèse nécessitant la lumière comme source d'énergie s'appelle la photosynthèse.
L'utilisation de l'énergie lumineuse est rendue possible grâce à l'existence de pigments : molécules capables d’absorber certaines longueurs d'onde lorsqu'ils sont éclairés par de la lumière blanche. Cette propriété leur donne une couleur déterminée.
La chlorophylle (mot grec composé chlorós : vert et phýllon : feuille) est le
principal pigment constituant des végétaux photosynthétiques.
La chlorophylle est contenue dans les chloroplastes : de minuscules organismes situés dans les cellules végétales vivantes, essentiellement dans les feuilles.
La chlorophylle est constituée de plusieurs molécules de structures chimiques très proches : les chlorophylles a, b, c et d, les xanthophylles et les caroténoïdes. Les chlorophylles a et b sont les plus abondantes chez les plantes supérieures et algues vertes, en proportions variables suivant l’espèce. Les chlorophylles c et d sont présentes chez les algues brunes et cyanobactéries.
o Chlorophylle a (vert-bleu) :
38 o Chlorophylle b (vert-jaune) :
o Phéophytine (vert-olive)
o ββββ-Carotène (jaune-orangé) :
o αααα-Carotène (orange) :
39 o Lutéine (jaune)
OH
HO
o Xanthophylles (jaune) :
• Viola xanthine
HO
O
OH O
• Néo xanthine
OH O
HO OH
Remarque : toutes ces molécules contiennent des liaisons doubles conjuguées qui sont essentielles pour l’absorption et le transport de l’énergie lumineuse.
En automne, la dégradation des chlorophylles a et b provoquent un changement de couleur des végétaux : les feuilles des arbres perdent leur teinte verte et prennent des couleurs allant du jaune au rouge sombre. Sous l’action d’enzymes, la chlorophylle verte se transforme en des molécules rouges puis incolores. Les autres pigments de la plante, les caroténoïdes (jaune-orange) ne seront plus cachés par le vert de la chlorophylle et seront responsables de la couleur rouge (ou jaune) que prendra la feuille.
II. PRINCIPE
Les pigments que l'on rencontre dans les feuilles des plantes vertes sont facilement séparés par chromatographie. Ils sont extraits par un solvant organique (l’éthanol : CH3CH2OH ou l’acétone CH3COCH3). Les constituants de l’extrait sont séparés par chromatographie sur colonne puis analysé par chromatographie sur couche mince (C.C.M).
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Les chlorophylles : sont très solubles dans les solvants polaires.
Les xantophylles: ont une solubilité plus ou moins importante dans les solvants polaires, mais elles sont aussi solubles dans les solvants apolaires.
Les carotènes: ne possèdent aucun groupement polaire et sont solubles dans les solvants apolaires.
III. MODE OPÉRATOIRE : Pour 4 binômes
• Prendre 5 feuilles d’une plante verte, les rincer à l’eau distillée puis les sécher avec du papier absorbant.
• Choisir la partie vert foncée, enlever les nervures et les tiges, puis les couper finement.
• Mettre les feuilles coupées dans un mortier puis ajouter une spatule de sable (qui facilite le broyage) et 10 mL d’acétone (ou d’éthanol).
• Broyer à l'aide du pilon jusqu'à ce que le solvant prenne une couleur vert- foncé.
• Filtrer la solution sur papier filtre (ou Büchner) : le filtrat obtenu doit avoir une couleur vert limpide.
• Evaporer le solvant à l’évaporateur rotatif (ou en chauffant modérément au bain-marie) : on obtient une pâte de couleur vert-foncé.
• Réaliser une chromatographie sur couche mince.
Feuilles après broyage Filtrat après broyage Après évaporation du solvant
IV. CHROMATOGRAPHIE
1) Chromatographie sur colonne :
a) Préparation de la colonne :
Introduire un petit morceau de coton au fond une colonne propre et sèche, munie d'un robinet à la base. Maintenir la colonne verticalement à l'aide d'une pince en bois fixée à un support (voir schéma). La remplir de poudre de silice. Imprégner la colonne d'éluant jusqu'en haut avant de déposer l'échantillon.
Remarque : Pendant la phase d’élution avec le solvant on veillera à ne pas assécher la partie supérieure de la phase fixe.
41 b) Dépôt de l’échantillon
A l'aide d'une pipette pasteur, prélever un peu de la solution à séparer et la déposer doucement sur le dessus de la colonne de silice (le long des parois de la colonne): attention à ne pas déformer la surface de la phase stationnaire pendant cette opération.
c) Développement de la colonne (élution) :
Lorsque le dépôt a bien imprégné la silice, verser un peu d'éluant sur la colonne, très doucement, pour ne pas déplacer la silice.
Ajouter régulièrement de l'éluant dans la colonne : le niveau d'éluant dans la colonne doit rester au dessus de celui de la silice jusqu'à la fin du développement.
Développer la colonne en recueillant les fractions dans des petits tubes à essais. Changer de tube (en déplaçant le portoir) dès que le niveau du liquide dans le tube atteint 2 cm pour le premier tube, 1cm pour les suivants ou dès qu'une couleur différente parvient en bas de la colonne: en traversant la colonne, l'éluant entraîne les composants du mélange les uns après les autres.
Lorsque la colonne de silice est pratiquement décolorée, arrêter l'expérience. Laisser évaporer un peu le solvant sous la hotte pour concentrer les fractions.
d) Analyse des fractions
Analyser les fractions par chromatographie sur couche mince, en déposant au même endroit plusieurs gouttes de chaque échantillon car les solutions sont très diluées. On identifiera chaque échantillon
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par le numéro de la fraction, indiqué légèrement au crayon sous la ligne de dépôt.
2) Chromatographie sur couche mince :
a) Préparation de la cuve :
L'atmosphère de la cuve doit être saturée en vapeur d'éluant. Ceci impose d'avoir une cuve bien fermée et préparée à l'avance.
Sous la hotte, verser l’éluant dans un bécher sec de 100 mL, sur une hauteur de ½ cm. Recouvrir la cuve avec une boîte à pétri :
• Eluant : Ether de pétrole/Acétone/Cyclohexane : 80/15/5% ou 75/20/5%
b) Préparation de la plaque chromatographique :
o Prendre une plaque d’aluminium recouverte de silice. Ne pas toucher avec les doigts.
o Découper avec un cutter, une plaque de (5 cm x 3 cm).
o Tracer au crayon sans appuyer, une ligne (ligne de dépôt), à 1 cm du bord inférieur de la plaque.
o Marquer légèrement au crayon sur cette ligne, l’emplacement du dépôt.
c) Dépôt de l’échantillon :
o A l’aide d’une pipette pasteur, d’un tube capillaire ou d’un cure- dent, prélever une goutte d’extrait vert, la déposer à l’emplacement marqué.
o Laisser sécher avant d’effectuer un nouveau dépôt.
o Effectuer une dizaine de dépôts au même endroit, en laissant sécher entre chaque dépôt.
d) Elution :
o Lorsque les dépôts sont secs, introduire la plaque verticalement dans la cuve (la ligne de dépôt ne doit pas tremper dans l’éluant) et refermer à l’aide de la boîte à pétri.
o Au cours de l’élution, l’éluant migre sur la plaque en imprégnant la silice.
o Retirer la plaque de la cuve avec des pinces, lorsque le front du solvant est à 1 cm du bord supérieur de la plaque.
o Repérer le front du solvant au crayon. Laisser l’éluant s’évaporer sous la hotte.
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e) Révélation (développement du chromatogramme):
Observer le chromatogramme et entourer au crayon, les différentes tâches colorées qui apparaissent.
f) Analyse du chromatogramme :
On met en évidence 4 sortes de pigments, du haut vers le bas :
• Carotènes (jaune-orange) : très peu polaires.
• Chlorophylle A (vert-bleu) : peu polaire.
• Chlorophylle B (vert-jaune) : moyennement polaire.
• Xantophylles (jaune) : polaires.
Remarque : lorsque les taches sont incolores, on les fait apparaître sous une lampe UV ou à l'aide d'un révélateur chimique mais dans le cas des pigments, ils apparaissent sous forme de taches colorées, visibles à l’œil nu.
o Les xantophylles (violaxanthine et néoxanthine) : sont des carotènes oxydés, ils sont polaires puisqu’ils comportent de nombreux atomes d’oxygènes qui vont pouvoir se lier avec les groupements hydroxyles (–OH) du support solide.
o Les chlorophylles a et b : sont des composés peu polaires.
La chlorophylle b se différencie de la chlorophylle a par la présence un groupement aldéhyde (-CHO) au lieu d’un méthyle (CH3). La chlorophylle b est donc plus polaire et plus retenue par le support solide que la chlorophylle a.
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o Les carotènes (β-carotène) : sont des composés apolaires, ne comportant pas d’atome d’oxygène et ne sont donc pas retenus par le support solide.
g) Rapport frontal :
On appelle rapport frontal Rf d'une espèce chimique, le rapport entre la distance x parcourue par l'espèce et la distance y parcourue par l'éluant pendant le même temps.
Rf dépend de la nature du produit, de l'éluant et de la phase fixe.
y x éluant
' l par parcourue ce
tan dis
ce tan susbs la par parcourue ce
tan
Rf = dis =
V. COMPTE RENDU
• Reproduire le chromatogramme obtenu. Identifier chaque pigment, en utilisant les indications données ci-dessus.
• Calculer les différents rapports frontaux.
• Comparer le chromatogramme obtenu à partir du pigment vert avec celui du paprika : Y a-t-il une substance commune aux deux extraits?
• Quelle est la technique qui nous permet de révéler le résultat d’une CCM lorsque les produits ne sont pas colorés ?
• On a broyé des feuilles de persil que l’on répartit dans 2 béchers :
Feuilles de persil broyées
5 mL d'eau 5 mL d'éthanol
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On agite, on laisse agir, puis on filtre dans 2 tubes à essai. On constate que :
dans le 1er tube, la couleur du filtrat est à peine verte (presque incolore).
dans le 2ème tube, la couleur du filtrat est vert foncé.
Quel est le meilleur solvant pour la chlorophylle ?
Références
• http://scienceamusante.net/wiki/index.php?title=La_chlorophylle
• http://fr.wikipedia.org/wiki/Chlorophylle
