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Submitted on 16 May 2020
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Mise en place et validation d’une méthode de
caractérisation de la matière organique dissoute dans les eaux résiduaires par chromatographie d’exclusion de taille (HP-SEC) couplée à un détecteur UV à barrette
de diode (PDA)
A. Ramgulam
To cite this version:
A. Ramgulam. Mise en place et validation d’une méthode de caractérisation de la matière organique dissoute dans les eaux résiduaires par chromatographie d’exclusion de taille (HP-SEC) couplée à un détecteur UV à barrette de diode (PDA). Sciences de l’environnement. 2017. �hal-02607057�
MAEP / LAMA / Laboratoire des paramètres majeurs
Mise en place et validation d’ une méthode de caractérisation de la matière organique dissoute dans des eaux résiduaires par chromatographie d’exclu sion de taille (HP-SEC) couplée à un détecteur UV à barrette de diode (PDA)
Mai – Juillet 2017 Audrey Ramgulam
Maître de stage: Matthieu Masson Irstea – Centre de Lyon-Villeurbanne 5 Rue de la Doua
69616 Villeurbanne
Tuteur IUT: Stéphane Dumas
Institut national de recherche en sciences et technologies pour l’environnement et l’agriculture
Remerciements
Je tiens d’abord à remercier Pascal BOISTARD, directeur du centre Irstea Lyon- Villeurbanne de m’avoir acceptée dans son entreprise et Marina COQUERY, responsable de l’équipe du Laboratoire de Chimie des Milieux Aquatiques pour son accueil au sein de son équipe.
Je souhaite plus particulièrement remercier Matthieu MASSON, responsable du laboratoire des paramètres majeurs et mon tuteur de stage de m’avoir permis d’effectuer ce stage et pour sa disponibilité et les multiples explications fournies tout au long du stage, ainsi que l’aide à la rédaction.
Je remercie également Corinne BROSSE, qui m’a accompagnée tout au long du stage, pour son temps consacré aux explications et à m’aider à mener à bien mes objectifs de stage.
J’aimerai ensuite remercier Marie BRETIER et Josselin PANAY, qui ont partagé leur bureau avec moi, pour leur bonne humeur quotidienne, ainsi que toute l’équipe LAMA pour leur accueil au sein de l’équipe, leur aide et leur bonne humeur.
Je remercie enfin Stéphane DUMAS, mon tuteur IUT, pour l’intérêt qu’il a porté à mon stage, et l’ensemble de l’équipe pédagogique du département Chimie pour l’apport des connaissances théoriques nécessaires pour effectuer ce stage. De même, je remercie l’IUT Chimie de Lyon, et plus particulièrement Yves PIPON, pour l’aide et le suivi dans la recherche de stage.
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Liste des figures
Figure 1: Carte des centres Irstea en France ... 2
Figure 2 : Schéma montrant le principe de fonctionnement de la HP-SEC ... 5
Figure 3: Schéma du principe de la HP-SEC [1] ... 5
Figure 4: Représentation du log (M) en fonction du volume d'élution ... 6
Figure 5 : Schéma d'un détecteur à barrette de diode ... 7
Figure 6 : Chromatogramme 3D du PSS 32 000 en phase mobile tampon phosphate... 7
Figure 7: Photo de la chaîne Alliance 2690 de Waters compartiments fermés (à gauche) et ouverts (à droite) ... 8
Figure 8 : Détecteur UV-DAD996 de Waters ... 9
Figure 9: Courbe d'étalonnage log (M) = f(tR) en phase mobile eau à 225,7 nm ... 12
Figure 10: Courbe d'étalonnage log (M) = f(tR) en phase mobile tampon phosphate ... 13
Figure 11 : Chromatogramme du NaN3 à 227 nm dans la phase mobile tampon phosphate ... 14
Figure 12 : Chromatogrammes superposés des PSS à 227 nm en phase mobile tampon phosphate ... 15
Figure 13 : Spectre UV-Visible du PSS 17 000 ... 15
Figure 14 : Chromatogramme du PEG 600 en phase mobile tampon phosphate à 227 nm .... 16
Figure 15: Spectre UV du PEG 300 ... 16
Figure 16: Spectre UV du PEG 12 000 ... 16
Figure 17 : Chromatogramme de l'érythromycine en phase mobile tampon phosphate à 227 nm ... 17
Figure 18 : Droite d'étalonnage tracée à partir des PSS et de l'ASB à 227 nm en phase mobile tampon phosphate ... 17
Figure 19 : Chromatogramme de l'ASB à 227 nm en phase mobile tampon phosphate ... 18
Figure 20 : : Spectre UV caractéristique des PSS obtenu avec le détecteur UV-DAD996 ... 19
Figure 21 : Chromatogramme du PSS 32 000 en phase mobile tampon phosphate à 227 nm 19 Figure 22: Droites d'étalonnage de 3 gammes analysées à 227 nm en phase mobile tampon phosphate ... 20
Figure 23 : Droite d'étalonnage log(M) = f(tR) avec BD et NaN3 à 227 nm en phase mobile tampon phosphate ... 21
Figure 24 : Droite d'étalonnage tracée sur le logiciel Millénnium32 à partir des PSS à 227 nm en phase mobile tampon phosphate ... 22
Figure 25 : Superposition des chromatogrammes de 3 eaux de Feyssine à 227 nm en phase mobile tampon phosphate ... 23
4 Figure 26 : Chromatogramme de l'échantillon 146-1 aux 3 derived channels en phase mobile tampon phosphate ... 24 Figure 27 : Chromatogramme de l'échantillon 147-4 aux 3 derived channels en phase mobile tampon phosphate ... 25 Figure 28 : Chromatogrammes des eaux 154-3 (à gauche) et 163-1 (à droite) aux 3 derived channels en phase mobile tampon phosphate ... 25 Figure 29 : Superposition des chromatogrammes de 3 eaux de rivière à 227 nm en phase mobile tampon phosphate ... 25
Liste des tableaux
Tableau 1: Tableau récapitulatif des étalons et leurs masses moléculaires ... 11 Tableau 2: Temps de rétention expérimentaux des étalons en phase mobile eau à λmax ... 11 Tableau 3: Temps de rétention expérimentaux des étalons en phase mobile tampon phosphate à λmax ... 12 Tableau 4 : Tableau regroupant les informations sur les étalons analysés à 227 nm sur
Millénnium32 ... 22 Tableau 5 : Tableau montrant les écarts relatifs entre les masses théoriques et recalculées .... 23
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Symboles et abréviations
BD : Blue Dextran
COD : Carbone Organique Dissous EMA : Ecarts Maximums Acceptables GPC : Gel Permeation Chromatography
HPLC : High Performance Liquid Chromatography
HP-SEC : High Performance Size Exclusion Chromatography IR : Infrarouge
M : Masse Moléculaire MO : Matière Organique PDA : Photo Diode Array PEG : Polyéthylène Glycol
PSS : Polystyrène Sulfonate de Sodium STEP : Station d’EPuration
tR : Temps de Rétention UV : Ultraviolet
V0 : Volume mort
VTot : Volume de perméation total
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Table des matières
I. Présentation d’Irstea ... 2
1. Irstea en France ... 2
2. Irstea à Lyon ... 2
II. Contexte et objectifs du stage ... 3
III. Matériels et méthodes ... 4
1. Principe de la HP-SEC ... 4
2. Appareillage, colonnes et logiciel ... 8
IV. Optimisation des conditions opératoires ... 9
1. Création d’une méthode d’analyse ... 9
2. Choix des paramètres ... 10
3. Choix de la phase mobile ... 10
4. Choix des étalons ... 14
5. Choix de la longueur d’onde de détection ... 18
V. Evaluation des performances ... 19
1. Linéarité et reproductibilité ... 20
2. Domaine d’application de la méthode définie ... 21
VI. Application de la méthode et résultats ... 22
1. Droite d’étalonnage ... 22
2. Passages d’échantillons ... 23
a. Eaux d’entrée de STEP ... 23
b. Eaux de rivières ... 24
VII. Mes observations et impressions ... 26
1. Relations humaines ... 26
2. Relations sociales et institutionnelles ... 26
3. Hygiène et sécurité ... 26
Conclusions et perspectives ... 28
Bibliographie ... 30 ANNEXES ... Erreur ! Signet non défini.
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I. Présentation d’Irstea
1. Irstea en France
Irstea (Institut national de recherche en sciences et technologies pour l’environnement et l’agriculture) est un Établissement Public Scientifique et Technologique (EPST), comme le CNRS et l’INRA, qui compte près de 1550 personnels permanents et non permanents (chercheurs, ingénieurs, doctorants, post-doctorants…). L’institut est sous la double tutelle des ministères de la recherche et de l’agriculture et comporte 3 grands départements : Eaux, Territoires et Ecotechnologies. Ces départements contribuent à relever 3 défis qui sont :
- Défi 1 : concevoir des méthodes et outils pour définir, comprendre et agir sur la qualité environnementale,
- Défi 2 : ressources naturelles et territoires : vers une approche multisectorielle et une gestion adaptative,
- Défi 3 : élargir l’approche des risques par l’étude de la viabilité des systèmes environnementaux.
Afin de répondre à ces défis, les recherches sont réparties dans 9 centres présents à travers la France métropolitaine (figure 1), dont le centre de Lyon-Villeurbanne :
Figure 1: Carte des centres Irstea en France
2. Irstea à Lyon
Le centre de Lyon-Villeurbanne est dirigé par Pascal Boistard. Les recherches du centre
3 portent sur le domaine de l’eau et sont divisées en 3 unités de recherches : HH (Hydrologie - Hydrolique), MALY (Milieux Aquatiques, Écologie et Pollutions - LYon) et GESTE (Gestion territoriale de l'eau et de l'environnement).
J’ai effectué mon stage dans l’équipe du Laboratoire de chimie de Milieux Aquatiques (LAMA) qui fait partie de l’unité de recherche MALY. L’équipe LAMA mène des recherches sur l’évaluation de la qualité chimique des eaux naturelles et des eaux usées et ainsi contribue à mieux appréhender les sources et le devenir des contaminants dans les hydrosystèmes (pollutions liées aux rejets urbains ou aux sources diffuses agricoles). Ces travaux visent à réduire les apports et les risques pour les écosystèmes aquatiques. Le LAMA est lui-même composé de 3 laboratoires :
- Le laboratoire des paramètres majeurs : ce laboratoire, où j’ai effectué mon stage, réalise des analyses pour définir la composition globale des eaux naturelles et résiduaires telles que pH, conductivité, concentrations en matières en suspension (MES), anions et cations majeurs (nitrates, nitrites, phosphates, ammonium, calcium…), carbone organique, azote total… Le laboratoire réalise aussi des analyses sur des matières solides du milieu aquatique (MES, sédiment) : analyses élémentaires (COP, Ctot, N et S), cations majeurs, distribution granulométrique… Les développements actuels sont liés à la caractérisation de la matière organique dissoute et particulaire.
- Le laboratoire des contaminants inorganiques : les travaux de recherche en cours concernent l’exposition et le transfert des métaux dans les cours d’eau et l’évaluation des flux géochimiques. Ce laboratoire dispose de techniques de préparation des échantillons et d’analyse des éléments majeurs et des métaux à l’état de traces : ICP-AES et ICP-MS (avec espace de travail ultra-propre classe 100). La spéciation du mercure et de l’arsenic sont respectivement étudiées à l’aide de la spectrométrie de fluorescence atomique et spectrométrie d’absorption atomique (avec préconcentration sur piège d’or) et à l’aide du couplage HPLC-ICP-MS. Les développements actuels concernent le développement, la calibration et l’application d’échantillonneurs passifs (DGT : Diffusive Gradient in Thin Film) pour l’échantillonnage in situ et la quantification et la spéciation de contaminants inorganiques traces (cations métalliques, arsenic, mercure) dans les eaux.
- Le laboratoire des micropolluants organiques : il participe aux travaux de recherche sur l’exposition et le transfert des produits phytosanitaires dans le milieu aquatique. Les recherches portent également sur la quantification de substances pharmaceutiques dans les effluents de stations d’épuration domestiques et dans le milieu aquatique. Le laboratoire développe des protocoles analytiques sur des techniques d’analyses ciblées, suspectées ou non ciblées par chromatographie en phase gazeuse avec détection par spectrométrie de masse avec tandem (GCMSMS trappe ionique) ; en phase liquide avec détection par spectrométrie de masse en tandem (UHPLC-MSMS triple quadripôle) et spectrométrie de masse haute résolution (UHPLC-HRMS).
II. Contexte et objectifs du stage
La matière organique (MO) est un composant majeur des eaux naturelles et usées qui regroupe une très grande variété de familles de constituants organiques comme les acides humiques, les acides fulviques, les protéines, les lipides, les polysaccharides… La MO peut-
4 être directement une source de pollution (par exemple : les rejets d’eaux usées, les problèmes d’eutrophisation) ou bien influencer la toxicité des polluants présents dans les eaux (comme les métaux). C’est pourquoi il est important de quantifier la MO dans les milieux aquatiques mais aussi d’avoir des informations sur sa composition. Il existe plusieurs techniques analytiques permettant d’obtenir des informations partielles et spécifiques sur la nature et la structure de la MO. Ces analyses peuvent être quantitatives, telles que la demande chimique en oxygène (DCO), le carbone organique total (COT), dosage sucres, ou renseigner sur la nature et la structure de la MO : RMN (fonctions chimiques), infrarouge (IR), fluorescence. Le croisement des informations de chaque technique contribue à une meilleure caractérisation de la MO.
Une des techniques de caractérisation de la MO dissoute est la chromatographie d’exclusion de taille (HP-SEC pour High Performance Size Exclusion Chromatography) couplée à un détecteur UV à barrette de diodes (PDA pour Photo Diode Array). Cette technique permet d’obtenir des informations globales sur la taille des molécules organiques dissoutes dans des eaux filtrées à 0,45 µm. Ces informations permettront une meilleure compréhension des processus de transformations de la MO lors des procédés de traitement des eaux, mais aussi de mieux caractériser la MO exportée vers le milieu récepteur (c.a.d. les rivières) après traitements.
La technique HP-SEC avait déjà été utilisée à Irstea il y a dix ans, mais l’application n’était pas la même. La supervision des analyses se fait grâce à un logiciel où sont répertoriées les différentes méthodes d’analyse appliquées à la chaîne HPLC, et dix ans plus tard, il n’existe pas de méthode dans ce logiciel adaptée à l’analyse d’eaux usées ou d’eaux de rivière. L’objectif de ce stage est donc de mettre en place au laboratoire une méthode d’analyse par HP-SEC de la MO dissoute principalement dans les eaux usées.
Ceci consiste à définir, dans un premier temps, le protocole général à mettre en place au laboratoire à partir de documents présélectionnés, puis réaliser les premiers tests permettant l’optimisation des conditions opératoires. Il faut ensuite évaluer les performances et le domaine d’application de la méthode définie. Enfin, la méthode définie et validée sera appliquée à quelques échantillons d’eaux usées brutes et traitées et quelques eaux de rivières.
III. Matériels et méthodes
1. Principe de la HP-SEC
La technique de HP-SEC (Chromatographie à exclusion stérique) ou GPC (Gel Permeation Chromatography) est une technique de chromatographie en phase liquide sur colonne. Le phénomène d’exclusion stérique est mis en jeu dans la séparation. Cette technique permet de fractionner des échantillons ou de caractériser des molécules, macromolécules ou polymères solubles dans l’eau (par exemple les protéines, les polysaccharides…). Nous l’appliquerons à la caractérisation de la MO. Elle est couplée à un détecteur, dans notre cas un détecteur UV à barrette de diodes (figure 2). Cependant, seulement une partie de la MO contient des fontions qui absorbent dans l’UV, à savoir les composés insaturés : double liaisons C=C (carbone-carbone) et les cycles aromatiques. Par exemple, il n’est pas possible de détecter les sucres (polysaccharides) par UV car ils n’absorbent pas, contrairement aux protéines, acides organiques, acides humiques et fulviques qui peuvent être détectés.
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Figure 2 : Schéma montrant le principe de fonctionnement de la HP-SEC
La séparation fonctionne de la manière suivante : la colonne comporte un gel avec des pores d’une certaine taille. Les molécules de plus petites et moyennes tailles (B et C) peuvent entrer dans ces pores qui les retiennent et sortent donc en dernier. Inversement, les grosses molécules (A) sont exclues des pores et éluées en premier (figure 3). Les solutés sont donc élués dans l’ordre inverse des masses moléculaires. [1]
Figure 3: Schéma du principe de la HP-SEC [1]
Ainsi, les molécules trop grosses et trop petites nous permettent de déterminer les volumes limites : le volume mort et le volume de perméation totale, respectivement. Au-delà de ces volumes, la colonne ne différencie plus les molécules et elles sont directement éluées.
Le domaine se situant entre ces deux volumes est appelé “domaine de linéarité”, il fait office de courbe d’étalonnage (figure 4). La HP-SEC est donc une technique qui se base sur les interactions physiques, contrairement aux autres types de chromatographie en phase liquide comme par exemple la chromatographie ionique, qui se base sur les interactions chimiques entre la phase stationnaire, la phase mobile et les composés à doser.
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Figure 4: Représentation du log (M) en fonction du volume d'élution
Pour détecter les molécules/macromolécules et polymères, un détecteur UV est installé en sortie de colonne (figure 2). La spectroscopie est l’étude des interactions entre la matière et la lumière. Les molécules absorbent des quantités d’énergie définies en fonction de leur structure, c’est-à-dire qu’elles vont absorber la lumière à des longueurs d’onde précises.
L’intensité de la lumière incidente (I0) est comparée à l’intensité mesurée après absorption par les molécules de l’échantillon pour différentes longueurs d’onde. Un spectre UV-Visible est le tracé de l’absorbance (A) en fonction des longueurs d’onde (λ en nm). L’absorbance A est calculée à partir de la relation de Beer-Lambert :
ܣ ൌ ߝ݈ܥ ൌ ݈݃ ቀூூబቁ,
avec ε : le coefficient d’absorption molaire (L.mol-1.cm-1) ; l : le parcours optique (cm) ; C : concentration de l’échantillon (mol.L-1) ; et I : l’intensité de la lumière.
Toutes les molécules n’absorbent pas dans le domaine de l’UV (200 – 400 nm). Par exemple, les cycles aromatiques et carbones conjugués absorbent aux alentours de 254 nm, les protéines contenant beaucoup de fonctions azotées auront tendance à absorber dans des longueurs plus faibles, les glucides (une partie importante de la matière organique dans les eaux usées et naturelles) n’absorbent pas dans l’UV-Visible et ne seront donc pas détectés.
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Figure 5 : Schéma d'un détecteur à barrette de diode
Le détecteur étant un détecteur à barrette de diode, il permet de mesurer l’absorbance d’une solution sur une gamme de plusieurs longueurs d’onde à la fois (dans notre cas 200 à 400 nm). L’acquisition est donc rapide. C’est grâce à cela que des spectres tridimensionnels (temps, absorbance, longueur d’onde) peuvent être produits. L’exploitation de ces spectres tridimensionnels permettra d’avoir des informations globales sur la matière organique dissoute non seulement sur leur taille, grâce à un étalonnage des temps de rétention, mais aussi de leur nature en comparant les absorbances à différentes longueurs d’onde.
Figure 6 : Chromatogramme 3D du PSS 32 000 en phase mobile tampon phosphate
La figure 6 nous montre un chromatogramme 3D d’un étalon qui sera utilisé pour les analyses (cf. IV.3) avec le temps de rétention (en minutes) en abscisse, l’absorbance en ordonnée et les longueurs d’onde (en nm) sur l’axe z.
Ce chromatogramme permet donc de voir le temps de rétention d’un composé, qui est fonction
8 de sa masse moléculaire, ainsi que le domaine de détection. En effet, on observe une zone de longueur d’onde où l’intensité du pic est la plus intense (entre 200 et 250 nm) ainsi que l’absence d’absorption pour les longueurs d’onde supérieures à 300 nm.
2. Appareillage, colonnes et logiciel
L’appareil utilisé est une chaîne de chromatographie liquide haute performance (HPLC) Alliance 2690 de chez Waters. Elle est composée d’un module de séparation Alliance qui comporte un plateau pour les solvants (voies A, B, C, D), un four à colonne, un passeur automatique pour les vials d’échantillon, une seringue d’injection, une vanne 10 voies et un tableau de contrôle (figure 7). En mode manuel, ce dernier permet de préparer la chaîne avant de lancer toute analyse mais aussi de contrôler ces dernières. En effet, il est possible de tout gérer à partir de ce tableau.
Figure 7: Photo de la chaîne Alliance 2690 de Waters compartiments fermés (à gauche) et ouverts (à droite)
On utilisera deux colonnes (cf. Annexe A) de porosités différentes en série. La première a un domaine de travail allant de 100 Da à 10 000 Da, soit en log (M) : 2 à 4 ; le domaine de la deuxième colonne est compris entre 250 Da et 75 000 Da, en log (M) : 2,398 et 4,875. Ceci permet d’augmenter la plage du domaine de travail total de 100 Da à 75 000 Da, et d’avoir une meilleure séparation (meilleure résolution en particulier pour les composés de faibles masses moléculaires).
La détection se fait à l’aide d’un détecteur à barrettes de diode UV-DAD996 de Waters (figure 8).
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Figure 8 : Détecteur UV-DAD996 de Waters
Il faut prendre des précautions particulières quant à l’utilisation de la chaîne Alliance.
Au démarrage il est nécessaire de rincer une première fois le système avec de l’eau ultra-pure:
les voies qui seront utilisées, les pistons, la seringue, les colonnes et l’injecteur. Certains de ces rinçages se font manuellement alors que d’autres peuvent être programmés sur le logiciel dans la sample set. Il faut aussi placer des blancs (eau ultrapure) entre chaque échantillon pour rincer les colonnes entre 2 analyses. Les derniers rinçages s’effectuent à la fin et sont d’autant plus importants si on utilise une phase mobile tampon. En effet, pour éviter que le système contienne des sels et soit endommagé, il faut à nouveau rincer l’injecteur, la colonne et la voie de cette phase mobile avec de l’eau ultra-pure (cf. Annexe B).
Bien que la chaîne Alliance ait un tableau de contrôle, il est préférable d’utiliser un logiciel de pilotage et d’acquisition : Millénnium 32 (Empower) en automatique. Ce logiciel permet de créer des méthodes d’analyse et de traitement, et de lancer les analyses. Il récupère les données qui sont automatiquement sauvegardées, et donc consultables et traitables à tout moment. Grâce à lui, on peut intégrer les pics à une longueur d’onde voulue et tracer des courbes d’étalonnages.
IV. Optimisation des conditions opératoires
1. Création d’une méthode d’analyse
Avant de débuter les analyses, il a d’abord fallu travailler sur la mise en place de la méthode d’analyse à partir d’un mode opératoire existant mais pas toujours complet.
La création d’une méthode se fait en plusieurs temps. Il faut d’abord créer un projet dans lequel on peut importer les méthodes d’autres projets existants. Dans ce projet on crée une method set qui sera composée de 3 autres méthodes : la méthode instrumentale (instrument method), la méthode de traitement (processing method) et la méthode de rapport (report method). Ces deux dernières ne sont pas indispensables pour commencer les analyses.
La méthode instrumentale concerne les paramètres instrumentaux tels que le débit de phase
10 mobile, température du four à colonne, la voie utilisée, le solvant correspondant à celle-ci ; et l’état de la lampe, c’est pourquoi elle est nécessaire pour les analyses.
La méthode de traitement regroupe les étalons utilisés et leurs temps de rétention, le volume mort et le volume total. Afin d’obtenir ces informations, il faut analyser une première fois les étalons, d’où la non-nécessité d’avoir cette méthode au début. Le logiciel associé à la chaîne possède une extension de logiciel, le mode GPC, dédiée uniquement aux analyses par HP-SEC. On peut donc choisir de travailler en mode HPLC ou GPC. La méthode instrumentale permet d’identifier les pics et de tracer des courbes d'étalonnage.
Avant de lancer une analyse il faut créer une sample set method (méthode d’analyse d’échantillons). C’est aussi lors cette étape que l’on choisit d’analyser en mode GPC. Lors de la création de la sample set method nous entrons les paramètres et caractéristiques des étalons : leurs masses moléculaires, le volume d’injection et temps d’analyse, le nombre d’étalons
« étroits » (narrow standards), dont la polydispersité est inférieure à 1,5, ou « larges » (broad standards).
La method set est modifiable au moment de démarrer une analyse : on peut ajouter ou enlever des étalons ou échantillons, modifier les volumes et temps d’analyse, choisir la méthode instrumentale pour chaque échantillon et enfin une méthode d’arrêt (pas obligatoire). Elle est aussi modifiable pendant l’analyse sans pour autant l’arrêter.
2. Choix des paramètres
Le choix des paramètres d’utilisation se fait lors de la création de la méthode instrumentale. Il s’agit pour la chaîne Alliance du débit de la phase mobile, de la température du four à colonne et le choix de la composition de la phase mobile. Pour le détecteur, les paramètres fixés sont les longueurs d’ondes d’acquisition minimum et maximum.
- Débit : Afin de ne pas abîmer les colonnes de chromatographie, nous choisissons d’imposer un débit de phase mobile de 0,8 mL.min-1, qui est celui qui figure sur les chromatogrammes tests fournis avec les colonnes et préconisé par le constructeur.
- Température : Bien qu’elle n’affecte pas significativement le mécanisme de séparation, il est préférable de maintenir la température du four à colonne constante et proche de la température ambiante, nous la réglons donc à 25°C.
- Longueurs d’onde : Le détecteur utilisé est un détecteur ultraviolet, le domaine de travail est donc de 210 nm à 400 nm. Il faudra cependant choisir 3 longueurs d’onde sur lesquelles les étalonnages pourront être réalisés.
3. Choix de la phase mobile
La chaîne étant équipée d’une pompe quaternaire on peut utiliser jusqu’à 4 solvants situés sur les voies A, B, C et D mais on travaille en isocratique, c’est-à-dire que la composition et le débit de la phase mobile restent constants. Lors des tests, deux voies (les voies A et B) seront utilisées pour tester 2 phases mobiles : l’eau ultra-pure et une solution tampon phosphate (cf. Annexe C), respectivement. Dans la méthode instrumentale il est possible d’entrer les proportions de chaque solvant voulues dans la phase mobile, mais dans notre cas, on utilisera toujours une phase mobile fixée à 100% car on travaille en isocratique.
11 Afin de sélectionner la phase mobile la plus performante pour les analyses futures, des gammes d’étalonnage ont été réalisées dans l’eau puis en tampon phosphate. Les étalons en sont des polymères de polystyrène sulfonate de sodium (PSS) de masses moléculaires différentes, le blue dextran (volume mort) et l’azoture de sodium NaN3 (volume de perméation totale), tous préparés dans l’eau ultrapure avec une concentration de 100 mg.L-1:
Etalons Masse moléculaire Log (M) (en Dalton, Da)
Blue Dextran (BD) 2 000 000 6,301
PSS 77 000 78 400 4,894
PSS 32 000 29 500 4,47
PSS 17 000 15 800 4,199
PSS 10 000 9740 3,989
PSS 6800 6430 3,808
NaN3 65 1,813
Tableau 1: Tableau récapitulatif des étalons et leurs masses moléculaires
A partir des temps de rétention des pics obtenus après analyse, des courbes d’étalonnage du logarithme de la masse moléculaire en fonction du temps de rétention (en minutes) ont été tracées pour chacune des phases mobiles. L’eau ultrapure a d’abord été testée avec le BD, les PSS 6800, 10 000, 17 000, 32 000 et 77 000. On obtient les résultats et la courbe suivants en prenant les temps de rétention des pics les plus intenses :
tR (min) λmax (nm)
Blue Dextran 9,482 /
PSS 6800 11,28 225,7
PSS 10 000 11,135 225,7
PSS 17 000 11,032 225,7
PSS 32 000 10,796 225,7
PSS 77 000 10,37 225,7
Tableau 2: Temps de rétention expérimentaux des étalons en phase mobile eau à λmax
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Figure 9: Courbe d'étalonnage log (M) = f(tR) en phase mobile eau à 225,7 nm
Le coefficient de régression de la droite d’étalonnage entre les temps de rétention et les logarithmes des masses moléculaires est bon : R² = 0,993 ; et le coefficient directeur de l’équation de la droite est de -1,36. On observe une différence de temps de rétention entre les deux étalons de plus haute (BD) et faible masse (PSS 6800) moléculaire de 2 minutes environ.
Les mêmes étalons ont ensuite été analysés en remplaçant la phase mobile d’eau ultra-pure par une solution de tampon phosphate.
tR (min) λmax (nm)
Blue Dextran 6,318 /
PSS 6800 17,431 225,7
PSS 10 000 15,808 225,7
PSS 17 000 16,068 225,7
PSS 32 000 15,165 225,7
PSS 77 000 13,546 225,7
Tableau 3: Temps de rétention expérimentaux des étalons en phase mobile tampon phosphate à λmax
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Figure 10: Courbe d'étalonnage log (M) = f(tR) en phase mobile tampon phosphate
Le coefficient de régression est moins bon qu’en phase aqueuse : R² = 0,977. Cela est dû au PSS 10 000 qui présente une incohérence : il sort plus tôt que le PSS 17 000 alors que sa masse est plus faible. La pente de la droite est de -0,23, ce qui est plus élevé qu’en phase eau ultra-pure, et correspond à une meilleure séparation. En effet, cela veut dire que la différence de temps de rétention entre les deux étalons de plus haute et faible masse moléculaire est plus élevée : elle est ici de 11 minutes contre 2 minutes avec l’eau ultra-pure. En ajoutant le NaN3
qui a un tR de 26,776 minutes on obtient un temps d’élution d’environ 20 minutes entre le volume mort et le volume de perméation total.
En effectuant les analyses en phase mobile tampon phosphate, la résolution des pics est améliorée et le temps total d’une analyse est de 30 minutes, ce qui conduit à un bon compromis entre résolution et temps de rétention.
On en conclut que la phase mobile la plus adaptée pour nos analyses est le tampon phosphate avec un temps d’analyse plus élevé et une bonne régression malgré le PSS 10 000.
Ceci peut être expliqué par le fait que les éluants ayant une force ionique relativement faible (comme le tampon phosphate) permettent une meilleure séparation/fractionnement que les éluants ayant une force ionique plus forte, comme l’a démontré Park dans une étude publiée en 2009 [2].
Il faut faire attention à bien ajuster et garder constant le pH à 6,8 lors de la préparation de la solution tampon phosphate car le pH peut avoir une influence sur la conformation des molécules et donc modifier les temps de rétention. En fonction des types d’eaux et des traitements appliqués sur les eaux usées, les eaux analysées pourront avoir des pH différents (entre 5 et 8,5). Un pH constant dans la phase mobile permettra de les mettre au même niveau et donc de les comparer entre-elles.
14 4. Choix des étalons
Tous les étalons ont été préparés dans l’eau ultrapure et, pour la plupart, à des concentrations de 100 mg.L-1. (cf. Annexes D et E)
Volumes limites :
L’étalon choisit pour déterminer le volume mort (V0) est le blue dextran, molécule la plus utilisée en HP-SEC. Pour le volume de perméation totale (VTot), l’acide salicylique (M = 134 Da) a été testé en premier mais celui-ci se dégrade trop rapidement. Le méthanol a ensuite été testé car il avait une masse plus faible que l’acide (M = 32 Da) mais il n’a pas du tout fonctionné : le chromatogramme ne comportait aucun pic et beaucoup de bruit. Enfin, le NaN3
(M = 65 Da) qui a très bien fonctionné et donné un pic gaussien (figure 11), c’est donc lui qui a été gardé. Les pics chromatographiques élués au-delà des temps de rétention de cette molécule ne seront pas pris en compte.
Figure 11 : Chromatogramme du NaN3 à 227 nm dans la phase mobile tampon phosphate
Polystyrènes sulfonate de sodium (PSS) :
Plusieurs étalons ont été choisis pour établir le domaine de linéarité, plus principalement les polymères PSS (4300, 6800, 10 000, 17 000, 32 000, 77 000), des narrow standards dont la polydispersité est inférieure à 1,2. Ceux-ci ont été choisis car ils sont facilement disponibles sur le marché et qui apparaissaient le plus souvent dans les publications étudiées [3]. De plus, leurs chromatogrammes présentent des pics satisfaisants, c’est-à-dire gaussiens et étroits (cf. Figure 12) et les temps de rétention montrent une bonne répartition des masses dans le temps, donnant ainsi une courbe d’étalonnage correcte et un temps d’analyse convenable. Leur conservation dans le temps était aussi un facteur déterminant pour les choisir. En effet, les PSS ont été renouvelés plusieurs fois au bout d’une dizaine de jours à chaque fois. Ils sont analysés le plus rapidement possible après préparation mais se conservent très bien au réfrigérateur et ne se dégradent pas pendant au moins 5 jours. On verra cependant que les petites masses ont tendance à se dégrader plus facilement (cf. V.1). Ils seront donc utilisés avec une concentration de 100 mg.L-1.
15
Figure 12 : Chromatogrammes superposés des PSS à 227 nm en phase mobile tampon phosphate
La détection se fait grâce à un détecteur UV, il est donc intéressant d’analyser un des PSS par spectrophotométrie UV-Visible. L’appareil utilisé est un spectrophotomètre Cary 1E de Varian.
L’acquisition se fait de 200 nm à 800 nm J’ai choisi le PSS 17 000 dont le spectre UV est le suivant :
Figure 13 : Spectre UV-Visible du PSS 17 000
On observe une forte absorbance à 220 nm, ce qui correspond au spectre UV caractéristique des PSS obtenu par HP-SEC (225,7 nm ; cf. Figure 20). Cela confirme que l’on détecte bien du PSS lors des analyses.
Polyéthylènes glycol (PEG) :
Les PEG (Polyéthylène Glycol) sont des étalons destinés à obtenir plus de points sur la courbe d’étalonnage, notamment en bas de gamme. Au début seul le PEG 300 était disponible avec une concentration de 100 mg.L-1. N’obtenant pas de chromatogramme convenable (pic inexistant ou de trop faible intensité) il a fallu augmenter la concentration de l’étalon à 5 g.L-1 et ajouter les PEG 600, 1000 et 12 000. Le PEG 300 a présenté un pic de faible intensité en phase aqueuse, qui était dans la linéarité des PSS et du BD et NaN3, mais en phase tampon phosphate il n’y avait que du bruit sur le chromatogramme (figure 14). Les PEG 600, 1000 et 12 000 n’ont fonctionné ni dans l’eau ni en tampon phosphate : comme c’est le cas pour le PEG 300, on n’observe que du bruit.
16
Figure 14 : Chromatogramme du PEG 600 en phase mobile tampon phosphate à 227 nm
Pour vérifier s’ils étaient bien présents dans la solution injectée en HP-SEC, les PEG 300 et 12 000 ont été analysés au spectrophotomètre UV-Visible (Varian Cary 1E).
Figure 15: Spectre UV du PEG 300
Figure 16: Spectre UV du PEG 12 000
On remarque une absorbance relativement élevée de l’ordre de 0,2 cm-1 entre 200 et 230 nm, ce qui n’est pas cohérent avec les résultats obtenus en HP-SEC. Il n’y a pas encore de véritable explication à cela. Ils ne seront finalement pas utilisés car la quantité d’étalon (1g) n’est pas suffisante pour continuer les essais. Les PEG étant été préparés dans l’eau, il faudrait tester à nouveau en les préparant dans du tampon phosphate ou en augmentant leur concentration.
Produits pharmaceutiques :
Pour avoir d’autres points intermédiaires (entre NaN3 et PSS 4300), deux antibiotiques en phase mobile eau, l’érythromycine (M = 734 Da) et l’azithromycine (M = 748 Da), avec une concentration de 100 mg.L-1, ont été analysés. Les deux masses étant très proches, il était inutile de garder les deux, on choisit donc l’érythromycine qui a une meilleure solubilité dans l’eau
17 pour l’analyser cette fois en phase mobile tampon phosphate. On remarque un pic de très faible intensité (0,00005 AU) (figure 17) dont le temps de rétention est cohérent avec les PSS, on suppose que c’est bien lui mais sa détection est trop faible pour le garder dans la liste des étalons.
Figure 17 : Chromatogramme de l'érythromycine en phase mobile tampon phosphate à 227 nm
Protéine :
L’albumine de sérum bovin (M = 66 000 Da), une protéine, a été analysée afin de tester si on pouvait l’utiliser comme étalon supplémentaire.
Figure 18 : Droite d'étalonnage tracée à partir des PSS et de l'ASB à 227 nm en phase mobile tampon phosphate
Même si cette molécule d’écarte légèrement de la droite de calibration (figure 18), cette protéine s’est révélée intéressante du fait qu’elle avait 2 pics : à 15,225 min et un autre à 26,28 minutes (figure 19). Sachant que le NaN3 sort à 26,776 min (cf. figure 11) et que l’ASB est en solution avec du NaN3, on peut voir une première séparation. La position de ce composé sur la courbe d’étalonnage implique qu’il faut faire une autre courbe à partir de protéines. En effet, en fonction de la nature des molécules et de leur conformation, il existe des différences d’étalonnage entre poids moléculaire et temps de rétention. Par exemple, une molécule avec un
18 poids moléculaire donné mais relativement linéaire sera plus volumineux qu’une molécule de même poids moléculaire mais avec une conformation repliée sur elle-même dû à des liaisons hydrogènes par exemple. Avec une même masse moléculaire, ces deux molécules auront des temps de rétention différents et donc des poids moléculaires apparents différents.
Figure 19 : Chromatogramme de l'ASB à 227 nm en phase mobile tampon phosphate
5. Choix de la longueur d’onde de détection
On utilise un détecteur UV à barrette de diode, on a donc la possibilité d’effectuer nos analyses à plusieurs longueurs d’ondes à la fois. Bien que l’appareil fasse une acquisition de tout le spectre entre 200 et 400, il n’est possible d’intégrer le signal que sur 3 longueurs d’onde déterminées au préalable
Pour intégrer des pics à une longueur d’onde donnée, il faut entrer celle-ci dans la method set.
Il y a un tableau où l’on peut choisir une ou plusieurs derived channels auxquelles l’intégration sera faite. On choisit 3 derived channels : 227 nm, 254 nm et 280 nm.
La première est choisie car les spectres UV des PSS montrent une forte absorbance à 225,7 nm (cf. figure 20).
19
Figure 20 : : Spectre UV caractéristique des PSS obtenu avec le détecteur UV-DAD996
Etant donné que ce sont nos étalons principaux, il semble logique de choisir une longueur d’onde proche, soit 227 nm. On remarque aussi que c’est à cette longueur d’onde que les autres composés présentent les meilleurs chromatogrammes. Les deux autres longueurs d’ondes sont celles qui sont caractéristiques des massifs de molécules organiques qui sont mon sujet d’étude.
En effet, les longueurs d’onde à 254 nm et 280 nm sont traditionnellement utilisées pour caractériser la MO dissoute par spectrophotométrie UV [4].
Figure 21 : Chromatogramme du PSS 32 000 en phase mobile tampon phosphate à 227 nm
V. Evaluation des performances
La validation de méthode au laboratoire se fait selon la norme NF T90-210 (2009) [5]. Il existe un fichier Excel regroupant les différents calculs à réaliser lors d’une validation de méthode. Parmi les différents tests précisés dans la norme, nous avons retenu uniquement l’étude de la fonction d’étalonnage.
20 1. Linéarité et reproductibilité
La linéarité est la capacité d’obtenir des résultats proportionnels à la concentration ou la quantité d’analyte dans l’échantillon ou dans notre cas, sa masse moléculaire. Elle peut être qualifiée par le coefficient de corrélation (R²) d’une droite de régression.
La reproductibilité s’évalue par rapport à la capacité de plusieurs gammes des mêmes étalons à fournir des résultats satisfaisant en changeant des conditions opératoires (étalons
« frais », jour d’analyse). Trois gammes, de PSS 4300, 6800, 10 000, 17 000, 32 000 et 77 000, préparées et analysées à des jours différents, serviront à réaliser ce test. Cependant le 10 000 n’étant pas aligné avec les autres quelle que soit la gamme, il est possible de l’exclure car nous avons assez de points pour les droites d’étalonnage. Ces dernières sont superposées sur la figure 22 ci-dessous :
Figure 22: Droites d'étalonnage de 3 gammes analysées à 227 nm en phase mobile tampon phosphate
Sur 3 séries effectuées les coefficients de corrélation ont toujours été supérieurs à 0,95.
Ces coefficients de corrélation sont très satisfaisants au regard de nos exigences et l’étalonnage en mode linéaire sera retenu.
Les pentes des trois droites d’étalonnages réalisées sont similaires avec des valeurs proches de -0,25 (les équations des droites de régression) sont similaires, ce qui reflète une bonne reproductibilité.
Il est possible d’évaluer la fonction d’étalonnage dans un domaine d’étalonnage par un test d’adéquation ou une comparaison :
ۛ soit en comparant l’erreur de modèle observée par rapport à l’erreur expérimentale observée (approche statistique) ;
21
ۛ soit en comparant les biais observés à des écarts maximum acceptables (approche EMA).
Dans cette étude, j’ai utilisé l’approche EMA (cf. Annexe F). Cette approche compare les biais obtenus pour chaque étalon, c.a.d. l’écart relatif entre les Log (M) théoriques et expérimentaux calculés à partir des droites d’étalonnage, avec une valeur maximum (EMA) qui a été fixé à 5% pour cette étude. On remarque que les masses se trouvant en bas de gamme (PSS 4300 et PSS 6800) ont des biais plus élevés que le PSS 17 000 qui lui-même est plus élevé que les deux derniers (32 000 et 77 000). Cela laisse supposer que la dégradation des étalons à petites masses est plus rapide que celle des masses fortes, d’où l’intérêt de les renouveler régulièrement.
Les volumes limites (le BD et le NaN3) seront aussi pris en compte dans les courbes utilisées pour les résultats afin d’avoir un domaine plus large.
Figure 23 : Droite d'étalonnage log(M) = f(tR) avec BD et NaN3 à 227 nm en phase mobile tampon phosphate
2. Domaine d’application de la méthode définie
Cette méthode sera plus tard appliquée à la caractérisation de la matière organique dans des échantillons d’eaux usées domestiques et de rivières.
Le domaine d’application de la méthode concerne tout d’abord les masses et donc les tailles des molécules organiques. En effet les colonnes utilisées donnent accès à un large domaine allant de 100 Da à 75 000 Da (cf. IV.1). Les pics se trouvant en dehors de ce domaine défini par l’étalonnage ne seront pas pris en compte.
De plus, il est essentiel de rappeler que seule une partie de la MO absorbe dans l’UV (210 – 400 nm) et que certaines molécules ne seront pas détectées, comme les polysaccharides, qui
22 représentent une fraction importante des eaux usées. Pour détecter des fractions plus importantes de MO, il faudrait changer de détecteur par un détecteur de fluorescence (mais qui ne va pas non plus détecter toutes les molécules organiques) ou un analyseur de carbone.
VI. Application de la méthode et résultats
1. Droite d’étalonnage
La droite d’étalonnage est composée du domaine de linéarité (cf. figure 4). En entrant les masses moléculaires des étalons (PSS) et les temps de rétention correspondants dans le logiciel, on obtient la droite suivante :
Figure 24 : Droite d'étalonnage tracée sur le logiciel Millénnium32 à partir des PSS à 227 nm en phase mobile tampon phosphate
Seuls les PSS 77 000, 32 000, 17 000 et 6800 figurent sur la droite d’étalonnage (de gauche à droite) car pour placer le PSS 4300, qui a été reçu plus tard, il faut créer une nouvelle sample set method et modifier la méthode instrumentale avant de repasser tous les étalons, choses que je n’ai pas eu le temps de faire.
Tableau 4 : Tableau regroupant les informations sur les étalons analysés à 227 nm sur Millénnium32
23 Le logiciel nous donne aussi l’équation de la droite : Log (M) = 9,07 – 0,312t ; le coefficient de régression linéaire : 0,9999, ainsi que les masses moléculaires (renseignées auparavant) de chaque composé identifié. Il recalcule les masses des composés à partir de l’équation. (cf.
tableau 4)
En calculant les écarts relatifs, on observe qu’ils sont très faibles et inférieurs à 5%, ce qui est cohérent avec les résultats obtenus lors de la validation de méthode.
tR (min) Mrecalculée (Da) Mthéo (Da) Ecart relatif
PSS 6800 16,85 6498 6450 0,74%
PSS 17 000 15,628 15639 15800 1,02%
PSS 32 000 14,758 29213 29500 0,97%
PSS 77 000 13,371 79147 78400 0,95%
Tableau 5 : Tableau montrant les écarts relatifs entre les masses théoriques et recalculées
2. Passages d’échantillons a. Eaux d’entrée de STEP
La première application à partir d’échantillons réels a été réalisée pour le laboratoire des micropolluants organiques. Le laboratoire utilise des cartouches de phase HLB (Hydrophilic- Lipophilic Balance) afin de retenir les micropolluants organiques présents dans un échantillon d’eaux usées d’entré de station de traitement. Cette extraction retient aussi une partie de la MO des eaux et le but de l’analyse est d’apporter des informations sur la nature de la MO qui est retenue par la phase HLB après chaque extraction. Pour cela, j’ai analysé 3 échantillons différents : une eau d’entrée pré-filtrée (146-1), la même eau passée 1 fois sur cartouche HLB (146-2) et une 2ème fois sur cartouche HLB (146-3).
Figure 25 : Superposition des chromatogrammes de 3 eaux de Feyssine à 227 nm en phase mobile tampon phosphate
Pour bien visualiser la perte de MO, les chromatogrammes des trois échantillons à 227 nm ont été superposés (figure 25). Les pics sortant avant V0 et VTot sont ignorés car ils sont en dehors de la zone d’acquisition. On observe la diminution, voire disparition, du pic à 19 minutes dans l’échantillon 146-3 (après 2 filtrations), ce qui montre bien que le cartouche HLB a retenu de
V0
VTot
24 la MO. Cependant, l’absorbance générale semble augmenter après chaque passage sur la cartouche. Il faudrait réaliser un blanc après passage sur la cartouche afin de le retrancher des échantillons 146-2 et 146-3, ou rectifier la ligne de base.
On peut émettre des hypothèses sur le type de MO présente dans ces eaux en superposant les chromatogrammes d’un des échantillons aux 3 longueurs d’onde définies dans la méthode (figure 26).
Figure 26 : Chromatogramme de l'échantillon 146-1 aux 3 derived channels en phase mobile tampon phosphate
On observe la baisse d’intensité de certains pics et massifs avec l’augmentation des longueurs d’onde. Cela nous indique que certains composés qui absorbent à 227 nm n’absorbent pas aux autres longueurs d’onde, ce qui permet d’émettre des hypothèses sur la nature des composés en question. La présence des temps de rétention des PSS permet aussi de mieux estimer les masses correspondant aux tR des pics chromatographiques de l’échantillon. On remarque, par exemple un pic de très faible intensité à 15 minutes pour 227 nm. Ce tR correspond à des masses de 32 000 Da environ, cela pourrait être des acides humiques ou des protéines qui peuvent avoir des poids moléculaires de cet ordre. Cependant le pic n’étant pas présent à 254 nm, on élimine l’hypothèse des acides humiques qui absorbent la lumière à 254 nm.
b. Eaux de rivières
Les eaux de rivières analysées proviennent de 2 sites différents. Il s’agit des échantillons 147-4 : rivière Madeleine (Jura), 154-3 : rivière Charlet (Puy de Dôme) et 163-1 : rivière de la Seille (Jura). Leurs chromatogrammes montrent des pics importants à 227 nm, mais pas à 254 nm, ni à 280 nm (figures 27 et 28). Les composés principaux repérés n’absorbent donc qu’à 227 nm, on s’intéressera donc plus tard à cette longueur d’onde pour ces 3 eaux.
L’échantillon 147-4, représenté sur la figure 27, présente tout de même une petite bosse de faible intensité à 18 min pour les 3 derived channels, qui ne figure pas sur les chromatogrammes des 2 autres eaux de rivières (figure 28). Ce pic dont la masse se situe entre 4300 et 6800 Da pourrait réprésenter des acides humiques ou fulviques, qui sont des polymères à haut poids moléculaire.
25
Figure 27 : Chromatogramme de l'échantillon 147-4 aux 3 derived channels en phase mobile tampon phosphate
Figure 28 : Chromatogrammes des eaux 154-3 (à gauche) et 163-1 (à droite) aux 3 derived channels en phase mobile tampon phosphate
En superposant ces 3 échantillons on s’aperçoit qu’ils présentent deux pics chevauchés aux mêmes temps de rétention (26 min) et à des absorbances différentes à 227 nm (figure 29).
Ils contiennent donc la même ou le même groupe de molécules ayant des masses similaires.
Figure 29 : Superposition des chromatogrammes de 3 eaux de rivière à 227 nm en phase mobile tampon phosphate
N’étant pas présents à 254 nm, ces pics ne sont pas caractéristiques de la MO contenant des cycles aromatiques. Cela pour être des protéines mais la masse moléculaire est faible à ces temps de rétention. On peut émettre l’hypothèse que ce sont des tensioactifs qui ont des masses de 200 – 300 Da. De plus, ces pics ne sont pas proportionnels à la teneur en carbone organique dissous (COD) : la teneur en COD de l’échantillon 147-4 est de 2,55 mg C/L, celle de l’échantillon 154-3 est de 3,70 mg C/L et celle de l’échantillon 163-1 est proche de 1 mg C/L (échantillon de référence très peu chargé en COD). La teneur en COD de l’échantillon 163-1 est la plus faible alors que ce n’est pas le plus petit pic. Cette incohérence est normale car la
V0
VTot
26 détection UV ne permet de voir qu’une partie de la MO. La MO qui n’est pas détectable par l’UV pourrait contribuer à des teneurs en COD plus ou moins élevées, ce qui explique l’absence de relation entre le COD et les pics observés. Afin d’observer une relation, il faudrait utiliser détecteur carbone.
On remarque que les chromatogrammes des eaux usées et ceux des eaux de rivières sont très peu semblables. En effets, les premiers montrent des massifs de pics indiquant un poids moléculaire élevé entre 65 et 50 000 Da environ alors que les eaux de rivières montrent des pics plus distincts et inférieurs à 4000 Da.
VII. Mes observations et impressions
1. Relations humaines
L’ambiance régnant dans l’équipe LAMA est une ambiance détendue. J’ai été rapidement intégrée par l’équipe. Tout le monde se tutoie et la présence de 3 laboratoires distincts n’empêche pas une bonne cohésion au sein du LAMA. L’ambiance conviviale est d’autant plus renforcée grâce aux moments passés au coin café, qui permet d’échanger sur divers sujets, et aux repas en équipe à la cantine du CNRS. J’ai beaucoup aimé cette ambiance mêlant travail à plaisanteries tout en gardant son sérieux. De plus, il y avait toujours quelqu’un pour répondre à mes questions ou me renseigner.
J’ai aussi trouvé amusant qu’il y ait quelques personnes qui avaient aussi effectué leurs études à l’IUT Chimie de Lyon.
2. Relations sociales et institutionnelles
Les relations humaines chaleureuses n’empêchent en rien les rapports hiérarchiques d’exister. Ces rapports restent tout de même dans l’humeur conviviale.
Les nouveaux arrivants (permanents, CDD, thésards, stagiaires...) sont tous intégrés lors d’une demi-journée d’information commune organisée tous les mois. Ils ont plusieurs formations à suivre. Le service documentation organise une présentation des produits et ressources documentaires mis à disposition : bases de données bibliographiques, périodiques électroniques, catalogue A to Z, Irsteadoc… La formation métrologie s’effectue aussi en début de stage, tout comme la formation sécurité : repérage de l’emplacement de l’armoire à pharmacie, douches portables, extincteurs, couvertures anti feu, espace de confinement sécurisé…
Au niveau des manipulations en laboratoire, il est nécessaire de garder à jour un cahier d’enregistrement qui permet de les retracer en cas de problème ou de recherche d’information.
3. Hygiène et sécurité
27 Au LAMA, tous les produits sont répertoriés. Avant toute manipulation il faut lire la fiche de données sécurité donnée par le fournisseur et se renseigner sur les restrictions d’utilisation du produit et les précautions à prendre. Les produits sont stockés par compatibilité dans des réfrigérateurs, congélateurs ou armoires spécifiques. Tous les produits et les préparations ou mélanges doivent être étiquetés convenablement. Les manipulations des produits doivent être réalisée avec les équipements de protections collectives EPC (sorbonnes, poste de pesée sécurisé, hottes, etc.) et le port des protections individuelles EPI (blouse, gants, lunettes) est obligatoire (pour les manipulations les plus dangereuses : masque à gaz, pantalons, chaussures fermées, etc.).
Après utilisation, ces produits et mélanges sont récupérés dans des bidons spéciaux et seront traités par une entreprise spécialisée. Les autres déchets (verre, plastique, papier) sont triés afin d’être recyclés. Il faut bien sûr nettoyer le poste de travail après chaque manipulation.
Des douches et rince-œil sont mis à disposition dans les laboratoires en cas d’accident, de même que des couvertures anti feu et des extincteurs en cas d’incendie. On a aussi accès à des trousses à pharmacie, ainsi qu’à la liste des sauveteurs secouristes du travail (SST) habilités.
Ces consignes et informations sont répertoriées dans un document interne « Fiches Santé et Sécurité ».
28
Conclusions et perspectives
L’objectif de mon stage était de mettre en place au laboratoire, développer et valider une méthode de caractérisation de la MO par HP-SEC couplée à un détecteur UV à PDA, et de tester la méthode sur quelques échantillons réels (eaux usées domestiques et eaux de rivières)
L’étude des documents à disposition (publications scientifiques, mode d’utilisation de la chaîne Alliance et du logiciel Millénnium 32…) m’a permis, dans un premier temps, de sélectionner deux phases mobiles et un ensemble d’étalons susceptibles d’être utilisés. Par la suite, différents tests m’ont permis de définir la phase mobile (tampon phosphate), les étalons (PSS) les plus adaptés et performants et les longueurs d’onde de détection (227, 254 et 280 nm).
Les tests effectués ont aussi permis de clarifier la méthode d’analyse et de créer les différentes méthodes (instrumentale, de traitement, sample set…) sur le logiciel. Ces méthodes n’auront plus besoin d’être créées lors d’une utilisation future de la HP-SEC, à moins de changer quelques paramètres, ce qui va permettre une utilisation régulière de cette méthode au laboratoire. J’ai aussi pu créer une méthode d’arrêt automatique permettant de lancer de longues analyses qui s’effectueront pendant la nuit : la chaîne HPLC (débit du solvant) et la lampe du détecteur s’arrêteront automatiquement.
La fonction d’étalonnage linéaire a pu être validée selon la norme NF T90-210 (2009) pour les PSS, en excluant le PSS 10 000.
En effet, la linéarité et la reproductibilité des étalonnages ont été vérifiées sur la base de l’analyse de trois gammes d’étalonnage réalisées dans des conditions de reproductibilité. Il serait intéressant, cependant, de trouver d’autres étalons en bas de gamme afin d’améliorer la droite d’étalonnage et de faciliter l’interprétation des chromatogrammes d’échantillons. Il faudrait aussi effectuer 2 gammes de plus afin d’avoir une validation qui se base sur un nombre de résultats plus élevé.
Suite au travail réalisé, la méthode mise en place et validée m’a permis de caractériser la MO dissoute dans des échantillons réels. Une première interprétation permet de montrer que les molécules organiques présentes dans les eaux usées et les eaux de rivières sont bien différents, avec des molécules de poids moléculaire généralement plus importants dans les eaux résiduaires.
L’analyse d’échantillons d’eaux réels a bien montré, comme on pouvait s’y attendre, qu’on ne pouvait pas caractériser toute la matière organique dissoute présente dans les eaux avec un détecteur UV. Pour élargir le domaine détectable, il faudrait utiliser d’autres types de détecteurs (spectromètre infrarouge, réfractomètre différentiel, détecteur carbone…).
D’un point de vue personnel, ce stage m’a permis de découvrir une nouvelle technique chromatographique pour moi : la HP-SEC. J’ai dû travailler sur une machine d’une quinzaine d’année, et avec un logiciel tout aussi vieux mais ce sont resté des nouveautés pour moi car la chaîne HPLC est du fabriquant Waters dont je ne connaissais pas les appareils. J’ai pu mettre en application certaines connaissances théoriques vues au cours de mes trois années passées à l’IUT, et les approfondir.
Ce stage m’a aussi permis de développer mon autonomie en manipulant et en prenant des décisions concernant les multiples problèmes rencontrés, qui ont finalement participé à
29 l’aboutissement de la création de méthode. Je me suis rendue compte que le partage d’idées et la discussion étaient importants pour bien travailler en équipe.
Cette expérience dans le domaine de la chimie analytique appliquée à l’environnement, bien que très intéressante et enrichissante, confirme mon choix de ne pas continuer dans ce milieu à la suite de l’obtention de mon diplôme.
30
Bibliographie
[1] Viton C, Chapitre 5 – Autres techniques – GPC SEC, Cours de Chimie Analytique DUT Chimie Semestre 4, diapositives 4 et 8.
[2] Park J-H (2009) Spectroscopic characterization of dissolved organic matter and its interactions with metals in surface waters using size exclusion chromatography. Chemosphere 77, 485-494.
[3] Perminova IV, Frimmel FH, Kudryavtsev AV, Kulikova N, Abbt-Braun G, Hesse S, Petrosyan VS (2003). Environ. Sci. Technol. 37, 2477-2485
[4] Masson M (2016) Synthèse bibliographique sur la faisabilité des sondes spectrophotométriques pour la caractérisation in situ de la matière organique. Rapport AQUAREF-Irstea, 23pp.
[5] NF T90-210 : Norme AFNOR Mai 2009, Qualité de l’eau – Protocole d’évaluation initiale des performances d’une méthode dans un laboratoire. 43pp.
31
ANNEXES
· ANNEXE A : Spécificités des colonnes utilisées ... 32
· ANNEXE B : Procédures de rinçage (basé sur le mode d’utilisation de la chaîne HPLC/DAD et du logiciel Millénnium32 WATERS – Réf : MUT/M/MAT/n°200)... 33
1. Avant chaque série d’analyse ... 33
2. A partir du logiciel ... 33
· ANNEXE C : Préparation de la solution tampon phosphate ... 35
· ANNEXE D : Tableau récapitulatif des étalons et leurs masses moléculaires ... 36
· ANNEXE E : Préparation des étalons ... 37
a. Divers ... 37
b. PSS ... 37
c. PEG ... 37
· ANNEXE F : Validation de méthode ... 38
32
· ANNEXE A : Spécificités des colonnes utilisées
Colonne 1 Colonne 2
Fabricant Phenomenex Phenomenex
Nom PolySep-GFC-P 2000 PolySep-GFC-P 3000
Dimensions 300 mm × 7,8 mm 300 mm × 7,8 mm
Domaine 100 – 10 KDa 250 – 75 KDa
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· ANNEXE B : Procédures de rinçage (basé sur le mode d’utilisation de la chaîne HPLC/DAD et du logiciel Millénnium32 WATERS – Réf : MUT/M/MAT/n°200)
1. Avant chaque série d’analyse
Allumer le détecteur DAD 996.
Le détecteur doit chauffer pendant au moins 30 minutes avant une analyse. S’assurer que les deux voyants « Lamp » et « Status » soient allumés et ne clignotent plus.
Allumer le module Alliance
- Réamorçage des crépines :
Dans le menu Status, sélectionne Direct Function et choisir Dry Prime pour amorcer
manuellement. Choisir la voie à amorcer (A, B, C ou D) et ouvrir la vanne et aspirer avec une seringue si besoin, sélectionner Continue, le système va purger la voie choisie pendant une minute.
Ne jamais amorcer avec une phase tampon à 100 % : amorcer avec de l’eau sur la même voie où se trouvera la phase tampon.
Toujours dans Direct Function, lancer un Wet Prime : 4 mL/min pendant 3 minutes.
Répéter le tout pour chaque voie utilisée.
- Rinçage des pistons
Dans le menu principal, choisir Diag puis Prime Sealwash et Start. Les pistons sont rincés à partir de la crépine notée Sealwash, immergée dans un flacon de rinçage contenant un mélange eau/acétonitrile, 90/10.
- Rinçage de l’extérieur de l’aiguilles
Toujours dans Diag, choisir Prime Needlewash puis Start. Rincer au moins deux fois pendant 1 minute.
Lorsqu’une analyse est finie, si on travaille en phase tampon, mettre la crépine de la voie concernée dans l’eau et effectuer un Dry Prime.
2. A partir du logiciel
Sur le logiciel, au début de la sample set, sélectionner Purge Injector pendant 6,50 minutes et Condition Column, pour conditionner la colonne, pendant 45 minutes. Le
conditionnement est à effectuer avec la méthode utilisée pour l’analyse, donc avec la phase mobile (phase tampon ou eau).
A la fin de la sample set, dans le cas où on utilise de la phase tampon suivre la procédure suivante :
- Purge Inj pendant 6,50 minutes - Wet Prime pendant 4 minutes
34 - Condition column pendant 60 minutes
Ces opérations sont à effectuer avec de l’eau, donc une autre méthode (méthode de rinçage par exemple). Elles servent à éliminer toute trace de sels résiduels qui pourraient autrement cristalliser et boucher le système.
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· ANNEXE C : Préparation de la solution tampon phosphate
Dans un bécher de 1 L, introduire les quantités indiquées de chlorure de sodium (NaCl), hydrogénophosphate de potassium (K2HPO4) et dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4). Bien dissoudre le tout dans 900 mL d’eau ultrapure et ajuster le pH à 6,8 au pH- mètre avec de la soude (NaOH) 2N (quelques gouttes). Transvaser la solution dans une fiole jaugée de 1 L et compléter à l’eau ultrapure. Stocker dans un flacon brun étiqueté et daté.
Solutés Masse (g) Masse molaire (g.mol-1) Concentration massique (mg.L-1)
NaCl 5,833 58,5 0,100
K2HPO4 0,358 174,2 0,002
KH2PO4 0,272 136,1 0,002
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· ANNEXE D : Tableau récapitulatif des étalons et leurs masses moléculaires
Etalons Masse
moléculaire (en Dalton, Da)
Log (M) Concentration massique (g.L-1)
Blue Dextran (BD) 2 000 000 6,301
0,1
PSS 77 000 78 400 4,894
PSS 32 000 29 500 4,47
PSS 17 000 15 800 4,199
PSS 10 000 9740 3,989
PSS 6800 6430 3,808
Azithromycine 748 2,866
Erythromycine 734 2,874
PEG 12 000 12 000
5
PEG 1000 1000
PEG 600 600
PEG 300 300
Acide salicylique 134 2,127
0,1
NaN3 65 1,813
Méthanol 32 1,505
Albumine de Sérum Bovin 66 000 4,82
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· ANNEXE E : Préparation des étalons a. Divers
Etalons Masse (mg) Volume final (mL) Concentration massique (mg.L-1)
BD 5 50 100
Azithromycine 5 50 100
Erythromycine 5 50 100
Acide
salicylique 5 50 100
Méthanol 5 50 100
NaN3 5 50 100
b. PSS
Etalons Masse (mg) Volume final (mL) Concentration massique (mg.L-1)
PSS 4300 5 50 100
PSS 6800 5 50 100
PSS 10 000 5 50 100
PSS 17 000 5 50 100
PSS 32 000 5 50 100
PSS 77 000 5 50 100
c. PEG
Etalons Volume
prélevé (µL) Volume final (mL) Concentration massique (mg.L-1)
PEG 300 100 20 5000
PEG 600 100 20 5000
Etalons Masse (mg) Volume final (mL) Concentration massique (mg.L-1)
PEG 1000 50 10 5000
PEG 12 000 50 10 5000
