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Déterminisme génétique de l’allongement intestinal des
souris PRM/Alf
Sabrine Hammiche
To cite this version:
Sabrine Hammiche. Déterminisme génétique de l’allongement intestinal des souris PRM/Alf. Sciences du Vivant [q-bio]. 2007. �hal-02821726�
Table des matières
Table des matières ... I Table des illustrations ... III
Résumé... 1
Introduction... 2
1. Dolichomégalie intestinale des souris de la lignée PRM/Alf... 2
1.1. Origine de la lignée PRM/Alf... 2
1.2. Mise en évidence de la dolichomégalie intestinale des souris PRM/Alf... 3
1.3. Analyse phénotypique de la dolichomégalie intestinale des souris PRM/Alf... 4
2. Analyse physiologique de la motricité intestinale des souris PRM/Alf ... 5
2.1. Détermination du temps de transit intestinal des souris PRM/Alf... 5
2.2. Etude du péristaltisme intestinal des souris PRM/Alf... 5
2.3. Mesure des ondes lentes intestinales ... 5
2.4. Nombre de cellules interstitielles de Cajal ... 6
3. Analyse génétique de la dolichomégalie intestinale des souris PRM/Alf ... 6
3.1. Mode de transmission... 6
3.2. Influence du sens de croisement ... 7
3.3. Interaction des génomes maternels et zygotiques ... 7
4. Problématique : étude du déterminisme génétique de la dolichomegalie intestinale des souris PRM/Alf... 7
4.1. Critères de sélection de gènes candidats pour la dolichomégalie intestinale des souris PRM/Alf... 8
4.2. Igf1/Igf1r : un excellent couple candidat pour le phénotype de dolichomégalie intestinale des souris PRM/Alf ... 8
4.3. Projet de stage de deuxième année de master... 9
Matériels et méthodes ... 10
1. Souris ... 10
2. Croisements ... 10
3. Phénotypage des souris ... 10
4. Extraction d’ADN... 11
5. Recherche de polymorphisme pour les gènes Igf1 et Igf1r entre les lignées PRM/Alf, DBA/2J et 129/Sv... 11
6. Génotypage... 12
6.1. Génotypage pour Igf1 par amplification PCR ... 12
6.2. Génotypage pour Igf1r par pyroséquençage... 12
7. Tests statistiques ... 13
8 Dosage RIA ... 13
8.1 Préparation des échantillons ... 13
8.1.1 Prélèvements ... 13
8.1.1 Traitement des échantillons de lait... 13
8.1.2 Dosage de Bradford et ajustements des concentrations d’IGF1 ... 14
8.2 RadioImmunoAssay (RIA)... 14
Résultats ... 15
1. Augmentation des effectifs de souris... 15
2. Recherche de polymorphismes dans les gènes Igf1 et Igf1r entre les lignées PRM/Alf, DBA/2J et 129/Sv... 15
2.1. Polymorphismes dans Igf1... 15
2.2. Polymorphisme dans Igf1r... 17
3. Génotypage des individus BC1, F2 et congéniques pour Igf1 et Igf1r... 18
3.2. Validation des résultats de génotypage pour Igf1 ... 19 4. Recherche d’une association entre le génotype pour Igf1 et/ou Igf1r et la longueur du tube digestif ... 19 4.1. Association entre le génotype pour Igf1 et la longueur du tube digestif... 19 4.2. Association entre le génotype pour Igf1r et la longueur du tube digestif ... 19 4.3. Interaction entre l’effet du génotype pour Igf1 et pour Igf1r dans la population BC1 20
4.4. L’effet du génotype pour Igf1r sur la taille du tube digestif dans la population BC1 est un biais lié à la direction de croisement... 21 5. Recherche d’un « effet maternel » dans le phénotype d’allongement intestinal des BC122 6. Recherche d’une interaction entre le génotype pour Igf1 et l’ « effet maternel » dans l’allongement du tube digestif chez les individus BC1 sur PRM/Alf ... 24 Conclusions et perspectives ... 27 1. Analyse génétique :... 27
1.1. Une association entre le génotype pour Igf1 et la longueur du tube digestif
uniquement chez les BC1 sur PRM/Alf... 27 1.2. Un effet du sens du croisement sur la longueur intestinale chez les BC1 sur
PRM/Alf ... 28 2. Analyse de la quantité d’IGF1 dans le lait et le plasma de souris allaitantes ... 28
2.1. Le taux d’IGF1 plasmatique est-il supérieur uniquement chez les souris PRM/Alf allaitantes ou quel que soit l’état physiologique ?... 28 2.2. Le rôle d’IGF1 dans l’allongement intestinal des souris PRM/Alf est-il uniquement quantitatif ou également qualitatif ? ... 29 Bibliographie... 30
Table des illustrations
Figure 1 : Comparaison de la longueur intestinale de souris de plusieurs lignées consanguine 3 Figure 2: Moyennes des longueurs intestinales dans différentes lignées consanguines... 4 Figure 3: Distributions des longueurs intestinales dans les populations BC1 (A) et F2 (B) .. 16 Figure 4: Produits d’amplification PCR du microsatellite situé dans l’intron 1 d’Igf1... 17 Figure 5: Pyrogrammes de génotypage du SNP dans Igf1r... 18 Figure 6 : Moyennes des longueurs intestinales en fonction du génotype pour Igf1 et pour Igf1r dans la population BC1 ... 20 Figure 7 : Moyennes de longueur intestinale en fonction du génotype pour Igf1 dans la
population BC1 sur PRM/Alf... 22 Figure 8 : Moyennes des longueurs intestinales des individus BC1 sur PRM/Alf en fonction du sexe de leur parent F1 ... 23 Figure 9 : Moyennes des longueurs intestinales des individus BC1 sur PRM/Alf en fonction de la catégorie... 24 Figure 10 : Moyennes de longueurs intestinales dans la population BC1 sur PRM/Alf en fonction de la catégorie et du génotype pour Igf1... 25 Figure 11 : Moyennes des concentrations d’IGF1 dans le lactosérum et le plasma de femelles allaitantes PRM/Alf et DBA/2J... 26 Tableau 1 : Effectifs et longueurs intestinales moyennes des souris étudiées ... 16 Tableau 2 : Polymorphismes dans le premier intron du gène Igf1... 17 Tableau 3 : Répartition des souris étudiées en fonction du croisement et de leur génotype pour Igf1 et Igf1r ... 18
Résumé
Les souris de la lignée consanguines PRM/Alf sont caractérisées par la couleur « poivre et sel » de leur pelage, mais aussi par une dolichomégalie intestinale, autrement dit un allongement de leur intestin de 30% par rapport aux autres lignées. L’allongement intestinal de ces souris est un caractère polygénique, influencé par un « effet maternel ».
Dans le but de mieux comprendre le déterminisme génétique de la dolichomégalie intestinale, une approche gènes candidats a été choisie. Le but de mon stage de M2 était de déterminer si le couple Igf1/Igf1r, identifié comme candidat potentiel par une recherche bibliographique, pouvait intervenir dans la dolichomégalie intestinale.
Deux approches complémentaires ont été entreprises:
• une approche génétique pour tester une association éventuelle entre le génotype pour Igf1 et Igf1r et la longueur intestinale d’individus issus de croisements en retour ou d’un intercross entre les lignées PRM/Alf et la lignée témoin DBA/2J, et d’individus congéniques 129/Sv.PRM/Alf-pwk/pwk.
• une approche biochimique dont le but était de savoir si la quantité de protéine IGF1 dans le lait et le sang de souris allaitantes PRM/Alf était augmentée par rapport à celle de souris allaitantes témoins DBA/2J.
Nous avons montré qu’il existait une association entre le génotype pour Igf1 et la longueur intestinale uniquement dans la population de croisement en retour sur la lignée PRM/Alf. Dans cette même population, nous avons trouvé un effet du sens du croisement sur la longueur intestinale, mais pas d’association entre le génotype pour Igf1 et le sens du croisement. Nous n’avons pas trouvé d’association entre le génotype pour Igf1r et la longueur intestinale. Enfin, il y avait une augmentation significative de la quantité d’IGF dans le plasma des souris allaitantes PRM/Alf.
Introduction
Les mécanismes contrôlant la taille du corps des mammifères adultes sont aujourd’hui bien connus (1-5). Par comparaison, on sait très peu de choses sur les gènes et les mécanismes qui contrôlent la taille des organes et tissus chez les mammifères. L’intestin, par exemple, est composé de lignages cellulaires différents (des neurones entériques, des cellules musculaires lisses, des entérocytes, etc.), dérivés de chacun des trois feuillets de l’embryon (l’ectoderme, le mésoderme et l’endoderme). Quels sont les mécanismes qui contrôlent la taille de structures composées de cellules appartenant à des lignages différents ? La taille et la forme d’un organe pourraient être le résultat d’un équilibre entre l’activation des cellules souches, le nombre des progéniteurs et/ou la prolifération des précurseurs. Des gènes spécifiques sont-ils impliqués dans ce processus d’activation des cellules souches et de différenciation des précurseurs ? Finalement, le contrôle de la taille est-il spécifique de chaque organe ?
Pour tenter de répondre à ces questions, l’UMR 955 de Génétique Moléculaire et Cellulaire travaille sur un modèle animal d’allongement intestinal dans une lignée de souris appelée PRM/Alf.
1. Dolichomégalie intestinale des souris de la lignée PRM/Alf
1.1. Origine de la lignée PRM/Alf
La lignée PRM/Alf (pour Pretty Mouse Alfort) a été initialement établie pour étudier le phénotype de pelage propre à cette lignée. Ce phénotype de pelage est dû à la mutation spontanée patchwork (pwk), transmise sur un mode autosomique récessif. Les souris homozygotes pwk/pwk ont un pelage poivre et sel. Des souris homozygotes pwk/pwk et de fonds génétique indéterminé ont été introduites par Karen Moore dans l’animalerie du National Cancer Institute de Fredericks, Maryland. En Août 1993, trois femelles et quatre mâles homozygotes pour la mutation ont été envoyés dans le laboratoire de génétique moléculaire et cellulaire de Maisons-Alfort. Des croisements frères-sœurs ont été systématiquement réalisés dans le but d’obtenir la lignée consanguine PRM/Alf. Au cours de l’établissement de la lignée, la seule pression de sélection effectuée a été la couleur du pelage. Les souris PRM/Alf sont actuellement à plus de cinquante générations de croisements
consanguins. Le locus patchwork a été cartographié sur le chromosome 10 murin, dans un intervalle génétique de 0,3 cM.
1.2. Mise en évidence de la dolichomégalie intestinale des souris PRM/Alf
Outre leur phénotype de pelage, les souris PRM/Alf présentent une distension abdominale. Il a été montré que la distension abdominale observée chez les souris PRM/Alf n’était pas due à une augmentation de la masse adipeuse intra-abdominale (6).
L’hypothèse selon laquelle elle serait due à une dolichomegalie intestinale (c’est-à-dire un allongement intestinal) a alors été testée. Ainsi la partie intra-abdominale du tube digestif de souris adultes de la lignée PRM/Alf a été comparée à celle des souris des lignées 129/Sv, DBA/2J, C57BL6/J, C3H/He. Les souris PRM/Alf avaient un tube digestif de longueur supérieure de 30% par rapport aux longueurs des tubes digestifs des lignées témoins (Figure 1 et Figure 2).
Figure 1 : Comparaison de la longueur intestinale de souris de plusieurs lignées consanguines
A : la souris PRM/Alf (à droite) présente un abdomen distendu comparé aux autres souris. Son pelage poivre et sel est dû à la mutation patchwork. B : partie intraabdominale du tube digestif des souris de A. L’intestin de la souris PRM/Alf est nettement plus long que celui des autres souris.
Figure 2: Moyennes des longueurs intestinales dans différentes lignées consanguines
Le nom de la lignée est indiqué sur chaque histogramme, ainsi que le nombre de souris testées. La lignée PRM/Alf présentait un intestin significativement plus long que celui des autres lignées.
1.3. Analyse phénotypique de la dolichomégalie intestinale des souris PRM/Alf
Pour savoir si la dolichomégalie intestinale était due à l’allongement de l’intestin grêle, du colon, ou des deux parties de l’intestin, les longueurs d’intestin grêle et de colon ont été mesurées chez des souris PRM/Alf, 129/Sv, DBA/2J, C57BL6/J, C3H/He. L’intestin grêle et le colon des souris PRM/Alf étaient tous deux significativement plus longs que dans les autres lignées. La taille relative de l’intestin grêle et du colon était constante dans toutes les lignées, y compris PRM/Alf. En conclusion, les souris PRM/Alf sont caractérisées par un allongement homothétique du tube digestif.
Au cours de cette étude, il a été remarqué que les tubes digestifs des femelles reproductrices étaient plus longs que ceux de femelles nullipares. L’allongement intestinal des reproductrices était particulièrement important dans la lignée PRM/Alf (longueur intestinale moyenne : 84,76 cm chez les reproductrices contre 74,84 cm chez les nullipares). Il existait également dans la lignée DBA/2J, quoiqu’en moindre mesure (longueur intestinale moyenne : 56,02 cm chez les multipares contre 53,79 cm chez les nullipares).
Pour savoir si l’allongement intestinal résultait d’anomalies du développement embryonnaire ou post-natal, une cinétique de croissance du tube digestif des souris PRM/Alf et DBA/2J a été effectuée. Il n’existe pas de différence de taille des tubes digestifs entre les deux lignées à la naissance (longueur intestinale moyenne : 10 pour les PRM/Alf contre 10,1cm chez les DBA/2J). La longueur de l’intestin devient significativement différente à 15
0 10 20 30 40 50 60 70 80 L on gu eu r d e l’i nt es tin (c m ) DBA/2J (59) C3H/He (39) PRM/Alf (43) C57BL/6 (48)
jours, la différence est accrue au sevrage (longueur intestinale moyenne : 59,0 cm pour les PRM/Alf contre 36,7cm pour les DBA/2J), et reste constante à l’âge adulte.
La dolichomégalie intestinale des souris PRM/Alf apparaît donc entre la naissance et le sevrage.
2. Analyse physiologique de la motricité intestinale des souris PRM/Alf
L’allongement intestinal des souris PRM/Alf a-t-il des répercussions physiologiques sur leur motricité intestinale ? Pour répondre à cette question une analyse de la physiologie intestinale des souris PRM/Alf a donc été entreprise (7).
2.1. Détermination du temps de transit intestinal des souris PRM/Alf
Pour savoir si l’allongement intestinal avait une répercussion sur le temps de transit, ce temps a été évalué. Le même temps de transit intestinal a été retrouvé pour les souris PRM/Alf et pour les souris témoins DBA/2J, malgré l’allongement intestinal d’environ 30% chez les PRM/Alf. Il en découle que la vitesse de transit des souris PRM/Alf est supérieure à celle des souris DBA/2J.
2.2. Etude du péristaltisme intestinal des souris PRM/Alf
Si la vitesse de transit intestinal des souris PRM/Alf était augmentée par rapport à celle de souris témoins, le péristaltisme intestinal des souris PRM/Alf devait lui-aussi être augmenté. La contractilité de portions d’intestins isolées a été mesurée dans des cuves à électromyographie. La fréquence des contractions mécaniques intestinales était augmentée de façon significative (passant de 39 contractions/minutes en moyenne chez les souris DBA/2J à 45 contractions/minute chez les souris PRM/Alf) dans les portions d’intestins PRM/Alf par rapport aux DBA/2J.
2.3. Mesure des ondes lentes intestinales
Les cellules musculaires lisses intestinales se contractent phasiquement en réponse aux ondes lentes électriques. Pour savoir si l’augmentation du péristaltisme intestinal était liée à une augmentation de la fréquence des ondes lentes, l’activité électrique spontanée de portions d’intestin isolées a été enregistrée. La fréquence des ondes lentes était significativement plus
élevée dans les portions d’intestin PRM/Alf par rapport aux DBA/2J (20% supérieure chez les PRM/Alf par rapport aux DBA/2J).
2.4. Nombre de cellules interstitielles de Cajal
Dans l’intestin, les cellules interstitielles de Cajal (ICC) ont une activité électrique « pacemaker » et sont à l’origine du déclenchement des ondes lentes. Pour savoir si l’augmentation de fréquence des ondes lentes intestinales chez les souris PRM/Alf pouvait être corrélée à une augmentation du nombre d’ICC, les ICC ont été marquées et comptées dans différentes portions du tube digestif de souris PRM/Alf et DBA/2J. Chez les souris PRM/Alf, le nombre d’ICC était significativement plus élevé dans toutes les parties de l’intestin (le nombre d’ICC est doublé chez les PRM/Alf par rapport aux lignées contrôles). En conclusion, malgré l’allongement intestinal des souris PRM/Alf, leur temps de transit est inchangé par rapport aux souris témoins. Il en résulte une augmentation de la vitesse de transit, elle-même due à l’augmentation de fréquence des ondes lentes intestinales, peut-être corrélée à l’augmentation du nombre de cellules interstitielles de Cajal.
3. Analyse génétique de la dolichomégalie intestinale des souris PRM/Alf
Les souris des différentes lignées étudiées au laboratoire étant élevées dans les mêmes conditions environnementales, on peut en déduire que la dolichomégalie intestinale des souris PRM/Alf a une composante génétique.
3.1. Mode de transmission
Le mode de transmission génétique a été déterminé en étudiant la distribution des longueurs intestinales des lignées parentales PRM/Alf et DBA/2J, ainsi que de leur descendance F1 (PRM/Alf x DBA/2J ou DBA/2J x PRM/Alf), F2 (intercross : F1 x F1), et BC1 (croisements en retour sur PRM/Alf (F1 x PRM/Alf ou PRM/Alf x F1) ou sur DBA/2J (F1 x DBA/2J ou DBA/2J x F1)) (Geneviève AUBIN-HOUZELSTEIN et al.2003) Les courbes gaussiennes obtenues dans les générations F2 et BC1 étaient caractéristiques d’un caractère quantitatif à transmission polygénique.
3.2. Influence du sens de croisement
L’analyse des distributions de longueur de tube digestif des générations F1 et F2 a permis de constater que la variance des individus F2 n’augmentait pas par rapport à celle des F1. Or, étant donné le brassage génétique chez les F2, la variance des F2 devrait être supérieure à celle des F1. Une hypothèse pour expliquer ces résultats était que la population F1 était hétérogène selon le sens de croisement (PRM/Alf x DBA/2J ou DBA/2J x PRM/Alf).
Pour tester cette hypothèse, les individus F1 ont été séparés en fonction du sens de croisement. Une différence de longueur intestinale a été mise en évidence entre les F1 à mère PRM/Alf et les F1 à mère DBA/2J. Les premiers avaient un intestin significativement plus long que les seconds. Le génome de la mère joue donc un rôle dans le phénotype d’allongement intestinal observé chez les descendants.
3.3. Interaction des génomes maternels et zygotiques
Pour s’assurer de l’influence du génome de la mère sur la longueur intestinale des petits, des expériences d’adoptions croisées ont été réalisées. Ces expériences ont montré que :
• un petit PRM/Alf adopté par une mère DBA/2J a un intestin plus court que s’il était
élevé par sa mère PRM/Alf : le génome de la mère intervient dans le phénotype de dolichomégalie intestinale.
• un petit PRM/Alf élevé par sa mère PRM/Alf a un intestin plus long qu’un petit DBA/2J adopté par une mère PRM/Alf : le génome du petit intervient dans le phénotype de dolichomégalie intestinale.
• la taille d’intestin maximale est obtenue lorsque la mère allaitante et le petit sont PRM/Alf. Cette taille est supérieure à celle obtenue par l’addition des effets du génome PRM/Alf de la mère et du petit. Donc, dans le phénotype de dolichomégalie intestinale, il existe une interaction positive entre le génome PRM/Alf de la mère et du petit.
En conclusion, la dolichomégalie intestinale est un caractère à déterminisme génétique complexe, où le génome de la mère et du petit interagissent.
4. Problématique : étude du déterminisme génétique de la dolichomegalie intestinale des souris PRM/Alf
Devant la complexité du déterminisme génétique de la dolichomégalie intestinale des souris PRM/Alf, et grâce aux données d’analyse physiologique, une approche gènes candidats a été privilégiée.
4.1. Critères de sélection de gènes candidats pour la dolichomégalie intestinale des souris PRM/Alf
Les critères de choix des candidats ont été les suivants :
• .Le phénotype de dolichomégalie se met en place pendant la période d’allaitement. Il
paraît donc judicieux de rechercher des gènes candidats codant des facteurs impliqués dans la croissance du tube digestif après la naissance.
• L’allongement intestinal étant homothétique, il convient de s’intéresser à des facteurs
jouant un rôle intestinotrophique dans l’ensemble de l’intestin.
• La dolichomégalie intestinale fait intervenir une interaction entre le génome de la mère
allaitante et celui de son petit. Des gènes codant des facteurs intestinotrophiques sécrétés dans le lait peuvent être de bons candidats.
• Des souris congéniques 129/Sv.PRM/Alf-pwk/pwk ont été produites par croisement en
retour de souris PRM/Alf-pwk/pwk sur la lignée 129/Sv. Les souris congéniques ont un intestin 2,5 cm plus long que les souris 129/Sv +pwk/+ pwk. Un ou plusieurs gènes intervenant dans le phénotype pourraient donc se trouver à proximité du locus patchwork, et avoir été sélectionnés avec patchwork lors de l’établissement de la lignée congénique.
4.2. Igf1/Igf1r : un excellent couple candidat pour le phénotype de dolichomégalie intestinale des souris PRM/Alf
Pour rechercher des gènes candidats, une analyse bibliographique a été entreprise. Parmi les candidats potentiels, seul le couple Igf1/Igf1r remplit tous les critères de sélection définis ci-dessus :
En effet, IGF1 :
• a un effet sur la croissance de l’ensemble du tube digestif. IGF1 est en effet produit
par le foie mais aussi localement dans l’intestin. La surexpression d’IGF1 dans les cellules musculaires intestinales accroît la longueur de l’intestin grêle de souris transgéniques de 23% (8). L’administration prolongée d’IGF1 à des rats ayant subi une résection partielle de leur intestin provoque l’allongement du tube digestif dans son ensemble (9).
• intervient dans la croissance postnatale. L’inactivation d’Igf1 a des effets sur la croissance postnatale, notamment sur la taille de l’intestin (10-11). De même sa surexpression provoque une croissance accrue. Ainsi des souris de 16 jours allaitées par des souris
transgéniques exprimant l’IGF1 humaine dans leur lait ont des intestins plus longs de 15 à 20 % par rapport aux souris témoins (12).
• est présent dans le lait. En effet IGF1 a été identifié dans le colostrum, autrement dit le lait secrété par les femelles mammifères en fin de gestation et dans les premiers jours suivant la parturition (13).
• son récepteur est exprimé dans l’intestin (14)
• est localisé sur le chromosome 10, à seulement 5 cM de patchwork. La proximité des
locus patchwork et Igf1 pourrait avoir entraîné leur co-sélection durant l’établissement de la lignée PRM/Alf.
4.3. Projet de stage de deuxième année de master
Il a consisté à tester l’implication du couple Igf1/Igf1r dans le phénotype de dolichomégalie intestinale des souris PRM/Alf. Pour ce faire, deux approches ont été entreprises en parallèle :
• une approche génétique : pour rechercher une association entre la taille du tube digestif et le génotype d’Igf1et d’Igf1r, des polymorphismes ont été recherchés pour les gènes Igf1 et Igf1r entre les lignées PRM/Alf et DBA/2J. Des souris F2 et BC1, déjà produites avant mon arrivée au laboratoire, ainsi que générées au cours de mon stage, ont été génotypées pour ces deux gènes et leurs intestins ont été mesurés. Une analyse de liaison a été effectuée entre le phénotype de longueur intestinale et le génotype pour ces deux gènes.
• une approche biochimique : pour tester s’il existait une différence quantitative d’IGF1
entre les mères PRM/Alf et les mères DBA/2J qui pourrait être impliquée dans l’« effet maternel » PRM/Alf, la quantité d’IGF1 présent dans le sang et le lait de femelles PRM/Alf et DBA/2J allaitantes a été déterminée par radioimmunoassay.
Matériels et méthodes
1. Souris
Les souris utilisées dans cette étude appartenaient aux lignées consanguines DBA/2J, 129/Sv et PRM/Alf, et à la lignée congénique 129/Sv.PRM/Alf-pwk/pwk. Les souris DBA/2J ont été achetées chez Charles River France ; les autres souris provenaient de l’élevage de l’animalerie de l’UMR955.
2. Croisements
Des croisements en retour et un intercross ont été préalablement réalisés. Dans les croisements en retour, il n’avait pas été tenu compte du sens du croisement.
Pendant mon stage, huit types de croisements en retour ont été réalisés entre des souris des lignées PRM/Alf et DBA/2J pour obtenir tous les sens de croisements possibles. Les schémas de croisements étaient : (par convention les femelles sont placées en premier)
1) PRM/Alf x F1 (PRM/Alf x DBA/2J) 5) DBA/2J x F1 (PRM/Alf x DBA/2J)
2) PRM/Alf x F1 (DBA/2J x PRM/Alf) 6) DBA/2J x F1 (DBA/2J x PRM/Alf)
3) F1 (PRM/Alf x DBA/2J) x PRM/Alf 7) F1 (PRM/Alf x DBA/2J) x DBA/2J
4) F1 (DBA/2J x PRM/Alf) x PRM/Alf 8) F1 (DBA/2J x PRM/Alf) x DBA/2J
Une lignée de souris congéniques 129/Sv.PRM/Alf-pwk/pwk a été établie en croisant en retour des souris PRM/Alf sur la lignée 129/Sv, et ce, pendant 10 générations. A chaque génération, les souris hétérozygotes pwk/+ ont été sélectionnées par génotypage pour deux microsatellites entourant le locus patchwork et mises à la reproduction avec des souris 129/Sv
+pwk/+ pwk. A mon arrivée au laboratoire, des souris BC10 129/Sv.PRM/Alf-pwk/+ ont été
accouplées entre elles pour obtenir des souris 129/Sv.PRM/Alf-pwk/pwk, caractérisées par leur dépigmentation du pelage.
3. Phénotypage des souris
Les souris ont été euthanasiées à 90 jours après la naissance par dislocation cervicale. Elles ont été pesées sur une balance précise au 1/10 éme de gramme. La taille des souris a ensuite été mesurée (allongées sur le ventre) à l’aide d’une règle graduée de 40 cm, du
museau jusqu’à la racine de la queue. Pour chaque animal, la rate a été disséquée puis congelée et la partie intraabdominale du tube digestif (de l’estomac jusqu’à l’anus) a été retirée. Les souris ont été pesées après dissection pour donner le poids éviscéré. Leur tube digestif a été déroulé sur la table et mesuré à l’aide de la règle graduée de 40 cm.
4. Extraction d’ADN
Les rates ont été plongées dans de l’azote liquide puis hachées. Les morceaux ont été placés dans du tampon de lyse (10 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8, 10 mM NaCl, 0,5% SDS) contenant 100 µg de protéinase K (Sigma). Après incubation sous agitation la nuit à 55C°, les protéines ont été extraites volume à volume (V/V) dans une solution V/V de phénol-chloroforme. Après centrifugation à 15000 tours par minute à 4C° pendant 20 min, et récupération des surnageants, l’ADN a été précipité dans 2,5 volume d’éthanol 100% froid. Les pelotes d’ADN ont été lavées dans deux bains d’éthanol à 75%, le premier de 15 minutes et le deuxième d’1 heure. Puis elles ont été séchées et resuspendues dans une solution de TE (10 mM Tris Cl pH 8, 1 mM EDTA pH 8). La mesure de concentration d’ADN a été effectuée à l’aide d’un spectrophotomètre (Eppendorf).
5. Recherche de polymorphisme pour les gènes Igf1 et Igf1r entre les lignées PRM/Alf, DBA/2J et 129/Sv
La séquence des gènes Igf1 et Igf1r et leur structure exons/introns a été cherchée sur le
site Ensembl Mouse (http://www.ensembl.org/Mus_musculus/index.html). Des
polymorphismes de nucléotide simple (SNPs) ont été recherchés dans la banque de donnée de
SNPs du NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP ) puis confirmés par PCR et
séquençage. Pour cela, des amorces PCR ont été dessinées pour amplifier des fragments introniques d’environ 600 bp, centrés sur le SNP, à l’aide du logiciel Primer3 (version 0.3.0) (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi).
Les fragments correspondants ont été amplifiés par PCR à partir de 100 ng d’ADN de souris PRM/Alf, DBA/2J ou 129/Sv, avec 1 unité de Taq polymérase Eppendorf, 0,4 mM d’une solution équimolaire de dNTPs, 0,4 µM de chaque amorce, dans un volume final de 25 µL. La température d’hybridation utilisée variait avec la température de fusion des amorces. Les fragments PCR des trois lignées ont été envoyés à séquencer chez MWG France.
6. Génotypage
6.1. Génotypage pour Igf1 par amplification PCR
Cent nanogrammes d’ADN ont été amplifiés par PCR sur un thermocycleur Eppendorf avec 1 unité de Taq polymérase (Eppendorf), 0,4 mM d’une solution équimolaire de dNTPs, 0,4 µM de chaque amorce (sens : GGGTCTGATCTTGGATTGATATTTA ; antisens : TAGGATTTTAGAACCCCTCTTTGTT), 0,75 mM de MgCl2, dans un volume final de 25 µL. Les conditions de PCR étaient les suivantes : dénaturation initiale :95C° pendant 5 min ; puis 35 cycles avec dénaturation à 95C° pendant 15 sec ; hybridation en « touch down » de 68C° à 58C° pendant 30 sec, élongation à 72C° pendant 30 sec ; puis élongation finale à 72C° pendant 5 min. Les produits PCR ont été migrés sur gel d’agarose 3%. La taille des amplicons était de 112bp pour l’allèle DBA/2J et 129/sv et de 128bp pour l’allèle PRM/Alf.
6.2. Génotypage pour Igf1r par pyroséquençage
Cent nanogrammes d’ADN ont été amplifiés par PCR sur un thermocycleur Eppendorf dans un volume final de 50 µl avec 0,8 mM d’une solution équimolaire de dNTPs, 0,8 µM d’amorces sens (de séquence : TTGCGTGTGAGCAGTCATGTTC) et anti-sens (de séquence : AGATGCAGCACGCAGAGGAC), 1,5 mM de MgCl2, et 1 unité de Taq Polymérase (Eppendorf). Les conditions de PCR étaient les suivantes : dénaturation initiale : 95 C° pendant 5 min 45 sec ; puis 45 cycles avec : dénaturation à 95 C° pendant 15 sec ; hybridation à 60 C° pendant 30 sec ; élongation à 72 C° pendant 30 sec ; puis élongation finale à 72 C° pendant 5 min. La taille de l’amplicon était de 70 bp.
La préparation des échantillons pour le pyroséquençage s’est faite avec le kit PyroGoldSNP Reagent kit de Biotage selon les instructions du fabricant. En bref, les produits de PCR ont été immobilisés sur des billes de sépharose couplées à de la streptavidine. L’ADN a été dénaturé dans une solution de soude. Les produits PCR simple brin ont été lavés puis
hybridés avec 1.6 µM de l’amorce de pyroséquençage (de séquence :
CACGCAGAGGACCCA). Puis ont été ajoutés les dNTPs, le substrat S et l’enzyme E (les quantités de ces derniers étant fournies par le logiciel PSQ 96 MA (Biotage)). L’analyse des fragments a été faite dans le pyroséquenceur PSQ 96 MA (Biotage). Les résultats du pyroséquençage étaient obtenus au bout de 10 min sous forme de pyrogrammes.
7. Tests statistiques
Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel StatView (Abacus Concept).
La normalité des distributions a été vérifiée graphiquement. L’égalité des variances a été testée à l’aide d’un test F. Lorsque les variances étaient égales, un test paramétrique a été appliqué pour comparer les moyennes de distribution : ANOVA ou test-t.
Lorsque les distributions n’étaient pas normales et/ou que les variances n’étaient pas égales, nous avons utilisé des tests non paramétriques pour comparer les distributions :
Test de Mann-Whitney lorsque le facteur dont on testait l’effet sur la variable d’intérêt était bimodal, test de Kruskal-Wallis lorsque le facteur comportait au moins 3 classes.
8 Dosage RIA
8.1 Préparation des échantillons
8.1.1 Prélèvements
Des échantillons de lait et de sérum ont été prélevés sur 12 souris PRM/Alf et 8 DBA/2J à un stade de lactation situé entre 3 jours et 5 jours post-natal. Les mères ont été séparées des petits 2 heures avant le prélèvement, elles ont été anesthésiées par injection d’une solution (Imalgéne 10%+Rompun 2%) à raison de 0,1mL pour 10g de poids de souris. Elles ont ensuite été injectées avec 0,2 ml d’une solution d’ocytocine (à 1U/ml). Leur lait a été prélevé 30 minutes après l’injection d’ocytocine par traite de la souris. Pour chaque femelle, une prise de sang a été effectuée dans le sinus rétro-orbital. Le prélèvement de sang s’est effectué à l’aide d’une pipette pasteur contenant de l’anticoagulant (EDTA).Les échantillons de sang ont ensuite été centrifugés à 5000g pendant 5 minutes. Le surnageant, qui correspondait au plasma, a été récupéré puis congelé à –4C°.
8.1.1 Traitement des échantillons de lait
Les échantillons de lait ont été dilués 4 fois dans de l’eau, puis centrifugés 15 min à
5000 g. La fraction située entre le culot de caséines et la couche de crème a été prélevée. Cette fraction a été à son tour centrifugée 15 min à 5000 g afin de faire précipiter le reste de caséine. Le surnageant obtenu a été assimilé au lactosérum.
8.1.2 Dosage de Bradford et ajustements des concentrations d’IGF1
Les échantillons de plasma et de lactosérum ont été dilués au 1/5000ème et au 1/1000ème respectivement dans de l’eau. Un volume de cette dilution a été ajouté à un volume de réactif de Bradford. Le dosage des protéines a été effectué dans un spectrophotomètre Eppendorf. Une gamme étalon a permis de déduire les concentrations en protéines des échantillons. Les concentrations moyennes en protéines du plasma étaient de 37,6 µg/µl pour les souris PRM/Alf, et de 32,5 µg/µl pour les DBA/2J ; Celles du lactosérum étaient de 8,4 µg/µl pour les PRM/Alf et de 9, 0 µg/µl pour les DBA/2J. Ces concentrations en protéines ont été ensuite ajustées de sorte à avoir 150 µg dans les échantillons de lactosérum, et la même masse de protéines dans les échantillons de plasma. Les ajustements ont été réalisés grâce à l’addition de BSA.
Les échantillons de lactosérum et de plasma (25microlitres) ont été incubés dans 2 ml de d’une solution de HCl 0,01M pendant 30 minutes afin de dissocier les IGF1s des IGFBPs, puis centrifugés (1h à 3500 g) dans une colonne Centricon 30 (Amicon, Eperon, France) afin de ne conserver dans le filtrat que les protéines dont la masse moléculaire est inférieure à 30 kDa (donc sans les IGFBPs),afin de dissocier les IGF1s des IGFBPs. Tous les échantillons ont été lyophilisés puis conservés à température ambiante avant le dosage par RIA.
8.2 RadioImmunoAssay (RIA)
Le dosage par RIA a été réalisé à l’INRA-Nouzilly en collaboration avec le Dr Philippe Monget. Le kit utilisé pour le dosage de protéines était le « Coomassie Protein Assay Reagent » de PIERCE.
Les échantillons lyophilisés de plasma comme de lactosérum ont été resuspendus dans 500 µL du tampon (0,03M de NaH2PO4, 500 µM de Tween-20, 200mg/L de protamine sulfate, 200mg/L de NaNO3 et 3,72g/L d’EDTA). Les échantillons resuspendus ont été incubés durant 2 jours avec un anticorps anti-IGF1humaine (anti-hIGF1) en compétition avec un excès d’hIGF1 marqué à l’iode 125 (125I-hIGF1, 10 000 cpm/tube). L’iodination de l’hIGF1 avait été réalisée au préalable par la méthode iodogene. Deux dilutions différentes de chaque échantillon ont été incubées, chacune en triplicats. Une gamme étalon a été réalisée par dilutions successives d’un échantillon témoin, dont la concentration en IGF1 était connue, et qui a servi à établir la courbe de référence. Suite à l’incubation, les IGF1 libres et liés à l’anticorps ont été séparés à l’aide de charbon lié à l’albumine. Pour chaque échantillon, la quantité d’125I-hIGF1 libre résiduelle a été dosée dans un compteur à radioactivité. La courbe de référence a été établie et a permis de déduire la quantité d’IGF1 de chaque échantillon.
Résultats
1. Augmentation des effectifs de souris
A mon arrivée au laboratoire, des souris issues de croisements en retour et un intercross entre les lignées consanguines PRM/Alf et DBA/2J avaient déjà été produites, et la lignée consanguine 129/Sv.PRM/Alf-pwk/pwk était en cours d’élaboration. Le Tableau 1 présente les effectifs de souris disponibles au début de mon étude ainsi que la taille moyenne de la partie intraabdominale de leur tube digestif.
Ces premiers croisements avaient été réalisés avant que l’effet maternel intervenant dans le phénotype de dolichomégalie intestinale ne soit connu. Les sens de croisements n’avaient donc pas été particulièrement pris en compte.
Afin de pouvoir mettre en évidence un éventuel effet maternel dans les croisements, de nouveaux croisements en retour ont été lancés afin d’augmenter les effectifs dans les 8 classes possibles. Etant donné qu’il avait été montré qu’une femelle F1 ne pouvait pas conférer d’effet maternel dans le phénotype de dolichomégalie, il a été choisi de ne pas augmenter les effectifs de F2.
Les effectifs des souris produites pendant mon stage et les effectifs totaux disponibles sont présentés dans le Tableau 1. La Figure 3 donne les distributions de longueurs intestinales dans les populations BC1 et F2. Ces distributions ont été trouvées normales.
2. Recherche de polymorphismes dans les gènes Igf1 et Igf1r entre les lignées PRM/Alf, DBA/2J et 129/Sv
2.1. Polymorphismes dans Igf1
La recherche de polymorphisme s’est faite comme indiqué dans la section Matériel et
Méthodes. Dans le 1er intron d’Igf1, nous avons trouvé 2 SNPs polymorphes entre PRM/Alf et
Tableau 1 : Effectifs et longueurs intestinales moyennes des souris étudiées
Pour le sens du croisement, les femelles sont indiquées en premier. Abréviations : BC1, BC8, BC10 : 1ère, 8ème et 10ème générations de croisements en retour ; F2 : intercross ; D=DBA/2J ; P=PRM/Alf. Noter qu’il manque des classes de F2, et que certaines classes de BC1 sont sous-représentées.
A
B
Figure 3: Distributions des longueurs intestinales dans les populations BC1 (A) et F2 (B)
Le nombre de souris est donné en ordonnée. En noir : distribution pour l’ensemble des souris BC1 ; en rouge : distribution pour les souris du croisement en retour sur PRM/Alf, en vert : distribution pour les souris du croisement en retour sur DBA/2J ; en orange : distribution pour les souris F2. Les distributions sont normales.
L’insertion était une amplification dans un microsatellite de type TTTA. Nous avons choisi de génotyper les souris pour Igf1 à l’aide de ce microsatellite pour lequel nous avons défini des amorces spécifiques (cf. section matériel et méthodes). La Figure 4 présente les produits de PCR obtenus avec les ADNs des lignées parentales et F1.
disponible en 2006
produit
en 2007 total Moyenne Ecart-type
(PxD)xP 86 50 136 66,7 4,3 Px(PxD) 111 45 156 65,0 5,0 (DxP)xP 5 7 12 60,9 4,7 Px(DxP) 0 31 31 64,0 3,1 (DxP)xD 32 0 32 57,8 3,7 Dx(DxP) 40 0 40 54,3 3 (PxD)xD 75 48 123 58,4 4,4 Dx(PxD) 41 32 73 54,5 3,4 (PD)x(PD) 280 280 63,4 4,8 (DP)x(PD) 36 36 62,3 5,6 BC8 129/Sv.PRM/Alf (pwk/pwk) 24 24 60,6 4,3 129/Sv.PRM/Alf (pwk/pwk) 6 6 58,2 3,4 129/Sv.PRM/Alf (pwk/+) 14 14 58,8 2,7 129/Sv.PRM/Alf (+/+) 2 2 55,0 1,4 Parentale 129/Sv +/+ 129/Svx129/Sv 10 10 59,6 2,9 Génération BC10 F2 Sens du croisement Longueur intestinale en cm BC1 Effectif N om br e de s ou ri s Longueur intestinale (cm) 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 10 20 30 40 50 60 70 N om br e de s ou ri s 50 55 60 65 70 75 80 Longueur intestinale (cm)
N° du SNP
amplifié Amorces utilisées pour l'amplification l'amplicon Taille de Nature du polymorphisme de la lignée PRM/Alf
F AAGAATCGGGAATTCTTTGCATTC SNP1
R AAGTAGGGCCAGTGATCAAAAGAG 460 bp Transition A→G
F GAAACACGTGTTGTGAATTCTG SNP4 R AGCTACAGCCTTTGAGGAGTTCACC 479 bp Délétion de 6 bp F ATGTCTGTACCCGCAGTTGACATT SNP5 R CCAGCAAACCAGCTAATCTCTGCTA 632 bp Insertion de 16 bp TTATTTATTTATTTAT F GGGGTCCTTTTCAGTTTTAAGAGTC SNP6
R TTGCAACCTAGATGTCAAGTCAAGT 500 bp Transition A→G
Tableau 2 : Polymorphismes dans le premier intron du gène Igf1
Figure 4: Produits d’amplification PCR du microsatellite situé dans l’intron 1 d’Igf1
DBA : DBA/2J ; PRM : PRM/Alf ; 129 : 129/Sv : H2O : témoin négatif. Dans la lignée PRM/Alf, l’amplicon fait 128 bp, alors qu’il a une taille de 112 bp dans les lignées DBA/2J et 129/Sv. La différence de taille permet de visualiser sans ambiguïté les individus hétérozygotes (pistes DBA+PRM et PRM+129).
2.2. Polymorphisme dans Igf1r
Pour Igf1r, nous avons trouvé un seul SNP polymorphe entre la lignée PRM/Alf d’une part et les lignées DBA/2J et 129/Sv d’autre part. Il s’agit d’une transition T→C située dans le deuxième intron du gène. Des amorces ont été choisies pour génotyper les individus par pyroséquençage. La Figure 5 présente les pyrogrammes pour un individu homozygote pour
l’allèle PRM/Alf d’Igf1r (Igf1rp/p), un individu hétérozygote (Igf1rp/d), et un individu homozygote pour l’allèle DBA/2J ((Igf1rd/d).
Igf1rp/p Igf1rp/d Igf1rd/d
120 140 160 180 200 220 E S A G C T C G A G A C/C 5 104 106 108 110 112 114 E S A G C T C G A G A C/T 5 110 120 130 E S A G C T C G A G A T/T 5
Figure 5: Pyrogrammes de génotypage du SNP dans Igf1r
Le génotype de l’individu est indiqué au-dessus du pyrogramme. La séquence du produit PCR est indiquée en abscisse. La région où se situe le SNP est surlignée en jaune. L’allèle PRM/Alf est caractérisé par la présence d’un C, l’allèle DBA/2J par celle d’un T.
3. Génotypage des individus BC1, F2 et congéniques pour Igf1 et Igf1r
3.1. Résultats des génotypages
603 individus BC1 entre les lignées PRM/Alf et DBA/2J, 316 F2 entre les lignées PRM/Alf et DBA/2J, 46 congéniques 129/Sv.PRM/Alf et 10 129/Sv ont été génotypés pour Igf1 et Igf1r. Le résultat des génotypages est donné dans le Tableau 3.
Croisement Effectif génotypé pour Igf1 Effectif génotypé pour Igf1r Génération Direction Total
de génotype p/p de génotype p/d de génotype d/d total de génotype p/p de génotype p/d de génotype d/d PRM 340 170 170 - 325 171 154 - BC1 DBA 263 - 145 118 239 - 135 104 F2 316 66 158 92 316 76 177 63 BC8 congéniques 129/Sv 24 24 - - 24 24 - - BC10 congéniques 129/Sv 22 6 14 2 22 N.D. N.D. N.D. Parentale 129/Sv 10 - - 10 10 - - N.D.
Tableau 3 : Répartition des souris étudiées en fonction du croisement et de leur génotype pour Igf1 et Igf1r
3.2. Validation des résultats de génotypage pour Igf1
Le fait que patchwork et Igf1 soient liés génétiquement nous a permis de vérifier la validité des génotypages pour Igf1. En effet, les deux locus sont à 5 cM l’un de l’autre (données non publiées). Nous devions retrouver une distance similaire dans nos croisements. Pour vérifier la distance génétique, et donc le taux de recombinaison entre patchwork et Igf1, nous avons comparé le génotype pour Igf1 et le génotype pour patchwork des individus BC1 sur PRM/Alf. Dans ce croisement, les individus à phénotype patchwork étaient homozygotes pwk/pwk et les individus à phénotype de pelage sauvage étaient hétérozygotes pwk). Nous avons étudié les distributions des haplotypes à l’aide du logiciel MapManager QT. Sur les 340 individus BC1 sur PRM/Alf, il y avait 13 recombinants entre patchwork et Igf1, d’où une distance génétique de 3,84+/- 1,02 cM. Cette distance est comparable à celle attendue. La probabilité d’avoir fait des erreurs de génotypages pour Igf1 était donc faible.
4. Recherche d’une association entre le génotype pour Igf1 et/ou Igf1r et la longueur du tube digestif
4.1. Association entre le génotype pour Igf1 et la longueur du tube digestif
Pour tester l’influence du génotype pour Igf1 sur le phénotype d’allongement intestinal, nous avons recherché une association entre le génotype pour Igf1 et la longueur intestinale dans chaque type de croisements. Nous avons trouvé que :
• dans la population BC1 totale (BC1 sur PRM/Alf et sur DBA/2J), il existait une association significative entre le génotype pour Igf1 et la longueur du tube digestif (test de Kruskall-Wallis, p<0,0001).
• dans la population F2 entre PRM/Alf et DBA/2J, il n’existait pas d’association entre le génotype pour Igf1 et la longueur du tube digestif (ANOVA, test non significatif))
• dans la population congénique 129/Sv.PRM/Alf et 129/Sv témoin, il n’existait pas d’association entre le génotype pour Igf1 et la longueur du tube digestif (test de Kruskall-Wallis non significatif)).
4.2. Association entre le génotype pour Igf1r et la longueur du tube digestif
De même, nous avons recherché une association entre le génotype pour Igf1r et la longueur intestinale dans chaque type de croisements. Nous avons trouvé que :
• dans la population BC1 totale, il existait une association significative entre le génotype pour Igf1r et la longueur du tube digestif (ANOVA, p<0,0001).
• dans la population F2 et dans la population congénique il n’existait pas d’association entre le génotype pour Igf1 et la longueur du tube digestif (tests de Kruskall-Wallis non significatifs).
4.3. Interaction entre l’effet du génotype pour Igf1 et pour Igf1r dans la population BC1
Nous avons recherché s’il existait une interaction entre les génotypes pour Igf1 et Igf1r sur la longueur du tube digestif. Il existait une interaction positive entre les deux facteurs. (ANOVA, p>0,0001).
L’ensemble des résultats pour la population BC1 est présenté dans la Figure 6.
A
B
Figure 6 : Moyennes des longueurs intestinales en fonction du génotype pour Igf1 et pour Igf1r dans la population BC1
p/p p/d d/d L on gu eu r in te st in al e (c m ) Igf1 Igf1r 66,0 (163) 60,9 (291) 56,9 (101) 52 56 60 64 68 65,3 (169) 61,5 (282) 56,2 (104) 52 56 60 64 68 L on gu eu r in te st in al e (c m ) Igf1p/p, Igf1rp/d Igf1 p/p, Igf1rp/p Igf1 p/d, Igf1rp/p Igf1 p/d, Igf1rp/d Igf1 d/d, Igf1rp/d Igf1 p/d, Igf1rd/d Igf1 d/d, Igf1rd/d 66,3 (82) 65,7 (81) 65,0 (88) 60,5 (142) 57,5 (58) 56,2 (61) 56,1 (43)
Génotypes trouvés dans le BC1 sur PRM/Alf
Génotypes trouvés dans le BC1 sur DBA/2J
A : moyennes des longueurs intestinales en fonction soit du génotype pour Igf1 (en bleu), soit du génotype pour Igf1r (en rouge). p/p : génotype homozygote pour l’allèle PRM/Alf ; d/d : génotype homozygote pour l’allèle DBA/2J ; p/d : génotype hétérozygote
B : moyennes des longueurs intestinales en fonction à la fois des génotypes pour Igf1 et pour Igf1r.
Les chiffres sur les histogrammes sont les moyennes de longueur intestinale, ceux entre parenthèses sont les nombres de souris de chaque classe. Les barres représentent les erreurs standard.
4.4. L’effet du génotype pour Igf1r sur la taille du tube digestif dans la population BC1 est un biais lié à la direction de croisement
Pour s’assurer que l’association entre le génotype pour Igf1 et Igf1r et la longueur du tube digestif mise en évidence dans la population BC1 n’était pas simplement due à la direction du croisement, nous avons refait les tests statistiques sur les deux populations BC1 séparées.
En effet, suivant la direction de croisement, les BC1 comportaient en moyenne 75% d’allèles PRM/Alf ou 75% d’allèles DBA/2J. Les individus homozygotes Igf1p/p Igf1rp/p provenaient tous du BC1 sur PRM/Alf et avaient donc une plus grande probabilité d’être homozygotes pour l’allèle PRM/Alf sur les autres locus impliqués dans l’allongement du tube digestif propre à cette lignée.
Cette réévaluation statistique a montré que :
• Il y avait bien une association entre le génotype pour Igf1 et la longueur du tube digestif dans la population BC1 sur PRM/Alf (ANOVA, p=0,01), mais aucune dans la population BC1 sur DBA/2J (ANOVA, test non significatif).
• Il n’y avait aucune association entre le génotype pour Igf1r et la longueur du tube digestif dans les populations BC1, sur PRM/Alf comme sur DBA/2J (ANOVA, test non significatif).
En conclusion, il existe un effet du génotype pour Igf1 sur la longueur du tube digestif uniquement dans la population BC1 sur PRM/Alf. Cet effet est limité (Figure 7).
Plusieurs hypothèses peuvent être avancées pour expliquer que le rôle du génotype pour Igf1 ne soit visible que dans la population BC1 sur PRM/Alf :
• pour conférer un intestin plus long, Igf1 doit peut-être être associé à un ou plusieurs autres locus, tous devant être homozygotes pour PRM/Alf. Parmi nos croisements, cette configuration ne peut être trouvée que dans le BC1 sur PRM/Alf.
• Igf1 interviendrait dans l’ « effet maternel » PRM/Alf. Or les expériences d’adoptions croisées ont montré que l’ « effet maternel » ne peut être conféré que par une mère
PRM/Alf (cf. page 7). Dans nos croisements, seul le BC1 sur PRM/Alf faisait intervenir des mères PRM/Alf.
Pour tester cette deuxième hypothèse, nous avons d’abord recherché s’il existait un « effet maternel » dans nos croisements.
Figure 7 : Moyennes de longueur intestinale en fonction du génotype pour Igf1 dans la population BC1 sur PRM/Alf
Les chiffres sur les histogrammes sont les moyennes de longueur intestinale, ceux entre parenthèses sont les nombres de souris de chaque classe. Les barres représentent les erreurs standard. Bien que la différence entre les deux groupes était faible, elle était significative (ANOVA, p=0,01).
5. Recherche d’un « effet maternel » dans le phénotype d’allongement intestinal des BC1
Pour rechercher s’il existait un « effet maternel » dans l’un ou l’autre des croisements, nous avons testé l’effet du sens de croisement dans le BC1 sur PRM/Alf et dans celui sur DBA/2J. Nous ne nous sommes pas intéressés à la population F2 étant donné que près de 90% (280 sur 316) des F2 provenaient de croisements entre deux individus F1 (PRM/Alf x DBA/2J).
• Dans le BC1 sur DBA/2J, nous n’avons pas mis en évidence d’effet du sens du croisement (ANOVA, test non significatif).
• Dans le BC1 sur PRM/Alf, il existait une association entre le sens de croisement et la taille du tube digestif (ANOVA, p<0,0001). De façon surprenante, les individus BC1 à mère F1 avaient un intestin plus long que ceux à mère PRM/Alf (Figure 8).
63,5 64 64,5 65 65,5 66 66,5 Igf1p/p Igf1p/d
Génotype pour Igf1
L on gu eu r in te st in al e (c m ) 65,9 (170) 64,7 (170) **
Pour préciser l’ « effet maternel » mis en évidence chez les BC1 sur PRM/Alf, nous avons regardé s’il y avait une association entre la taille du tube digestif et la catégorie d’individus. La catégorie prend en compte à la fois le sens de croisement du BC1 et le sens de croisement du parent F1. Nous avons trouvé que l’effet du sens du croisement était hautement significatif lorsque le parent F1 était lui-même issu d’une mère PRM/Alf et d’un père DBA/2J (Figure 9).
Figure 8 : Moyennes des longueurs intestinales des individus BC1 sur PRM/Alf en fonction du sexe de leur parent F1
Les chiffres sur les histogrammes sont les moyennes de longueur intestinale, ceux entre parenthèses sont les nombres de souris de chaque classe. Les barres représentent les erreurs standard. Bien que la différence trouvée entre les deux groupes était faible, elle était hautement significative (ANOVA, p<0,0001).
Pour préciser l’ « effet maternel » mis en évidence chez les BC1 sur PRM/Alf, nous avons regardé s’il y avait une association entre la taille du tube digestif et la catégorie d’individus. La catégorie prend en compte à la fois le sens de croisement du BC1 et le sens de croisement du parent F1. Nous avons trouvé que l’effet du sens du croisement était hautement significatif lorsque le parent F1 était lui-même issu d’une mère PRM/Alf et d’un père DBA/2J (Figure 9).
En conclusion, il existerait un « effet maternel » jouant sur la taille du tube digestif de la population BC1 sur PRM/Alf. Il ferait intervenir non seulement le sens de croisement pour l’obtention du BC1 mais aussi le sens de croisement pour l’obtention du parent F1. De façon surprenante, le tube digestif le plus long est retrouvé lorsque le BC1 a une mère F1 et une grand-mère maternelle PRM/Alf (Figure 9).
63 64 65 66 67 Femelle Mâle Sexe du parent F1 L on gu eu r in te st in al e (c m ) 66,6 (148) 64,6 (187) ***
Figure 9 : Moyennes des longueurs intestinales des individus BC1 sur PRM/Alf en fonction de la catégorie
P : PRM/Alf ; D : DBA/2J ; entre parenthèses : parent F1 ; les femelles sont toujours indiquées en 1er. Les chiffres sur les histogrammes sont les moyennes de longueur intestinale, ceux entre parenthèses sont les nombres de souris de chaque classe. Les barres représentent les erreurs standard. Significativité de l’ANOVA : *** :p=0,001 ; NS : non significatif. Noter que les deux dernières classes sont très faiblement représentées.
6. Recherche d’une interaction entre le génotype pour Igf1 et l’ « effet maternel » dans l’allongement du tube digestif chez les individus BC1 sur PRM/Alf
Pour savoir si le génotype d’Igf1 pourrait intervenir dans l’ « effet maternel », nous avons testé si le cumul de l’effet du génotype pour Igf1 et de l’effet de la mère sur la longueur intestinale des BC1 sur PRM/Alf était supérieur à la somme des effets pris indépendamment. Nous avons observé les moyennes de longueur de tube digestif des BC1 sur PRM/Alf en fonction à la fois de leur catégorie et de leur génotype pour Igf1 (Figure 10). Nous avons trouvé qu’il n’existait pas d’interaction entre les deux facteurs (ANOVA, test non significatif).
Cette étude a néanmoins permis de montrer que pour les BC1 sur PRM/Alf homozygotes pour l’allèle PRM/Alf d’Igf1 (Igf1p/p), il y avait un effet du sens de croisement BC1 (PRM/Alf x DBA/2J) x PRM/Alf ou PRM/Alf x (PRM/Alf x DBA/2J) (ANOVA, p=0,006) (Figure 10A). De même, pour les BC1 à mère F1 et grand-mère PRM/Alf, il y avait une association entre le génotype pour Igf1 et la longueur intestinale (ANOVA, p=0,001 ; Figure 10B).
En conclusion, nous n’avons pas pu mettre en évidence d’implication du génotype pour Igf1 dans l’ « effet maternel » dans notre étude.
58 60 62 64 66 68 (PD)P P(PD) P(DP) (DP)P Catégorie L on gu eu r in te st in al e ( cm ) 66,7 (136) 65,0 (156) 64,0 (31) 60,9 (12) *** NS NS
7. Dosage d’IGF1 dans le plasma et le lait de souris PRM/Alf
Nous avons choisi une approche complémentaire à l’étude génétique afin d’évaluer qualitativement l’importance de la protéine IGF1 dans le phénotype d’allongement intestinal chez la souris PRM/Alf. Nous avons réalisé un dosage d’IGF1 à la fois dans le sang et dans le lait de souris PRM/Alf et DBA/2J allaitantes, afin de quantifier une éventuelle différence de concentration d’IGF1 entre les deux lignées.
A
B
Figure 10 : Moyennes de longueurs intestinales dans la population BC1 sur PRM/Alf en fonction de la catégorie et du génotype pour Igf1
A : effet de la catégorie à génotype pour Igf1 constant. B : effet du génotype pour Igf1 à catégorie constante. P : PRM/Alf ; D : DBA/2J ; entre parenthèses : parent F1 ; les femelles sont toujours indiquées en 1er. Les chiffres sur les histogrammes sont les moyennes de longueur intestinale, ceux entre parenthèses sont les nombres de souris de chaque classe. Les barres représentent les erreurs standard. Significativité de l’ANOVA : ** :p≤0,001 ; NS : non significatif. Noter que les 4 dernières classes sont très faiblement représentées.
Même si aucune interaction n’a pu être mise en évidence entre les deux facteurs, ces histogrammes montrent bien l’effet à la fois de la catégorie et du génotype pour Igf1.
** NS NS NS 58 60 62 64 66 68 70 (DP)P Igf1p/d (PD)P Igf1p/p (PD)P Igf1p/d P(PD) Igf1p/p P(PD) Igf1p/d P(DP) Igf1p/p P(DP) Igf1p/d (DP)P Igf1p/p L on gu eu r in ts tin al e (c m ) 67,6 (62) 65,6 (66) 65,5 (78) 64,4 (75) 64,1 (17) 63,7 (12) 61,8 (5) 61,6 (6) 58 60 62 64 66 68 70 (DP)P Igf1p/d (PD)P Igf1p/p (PD)P Igf1p/d P(PD) Igf1p/p P(PD) Igf1p/d P(DP) Igf1p/p P(DP) Igf1p/d (DP)P Igf1p/p L on gu eu r in te st in al e (c m ) 67,6 (62) 65,6 (66) 65,5 (78) 64,4 (75) 64,1 (17) 63,7 (12) 61,8 (5) 61,6 (6) NS NS NS ** NS NS
Nous avons recherché une éventuelle élévation de la concentration d’IGF1 chez les femelles PRM/Alf en lactation car:
• dans le lactosérum, une augmentation de la quantité d’IGF1 pourrait contribuer à l’ « effet maternel » de la lignée PRM/Alf.
- dans le plasma, une augmentation de la quantité d’IGF1 pourrait contribuer à l’allongement intestinal observé chez les femelles reproductrices PRM/Alf (cf. page 4).
Nous avons dosé l’IGF1 par RIA, en collaboration avec l’équipe du Dr Philipe Monget à Tours. Les résultats sont présentés dans la Figure 11.
Figure 11 : Moyennes des concentrations d’IGF1 dans le lactosérum et le plasma de femelles allaitantes PRM/Alf et DBA/2J
Les chiffres sur les histogrammes sont les moyennes des concentrations d’IGF1, ceux entre parenthèses sont les nombres de souris de chaque classe. Les barres représentent les écarts moyens.
Il n’y avait aucune différence significative des concentrations d’IGF1 dans le lactosérum des PRM/Alf par rapport aux DBA/2J (test de Mann-Whitney non significatif). En revanche, il y avait une différence significative des concentrations d’IGF1 dans le plasma chez les PRM/Alf par rapport aux DBA/2J (p=0,04).
En conclusion, au vu des résultats de RIA, il semble qu’il n’y ait pas d’augmentation de la concentration en IGF1 dans le lait des souris PRM/Alf. En revanche, la concentration d’IGF1 est significativement plus élevée dans le sang des souris PRM/Alf par comparaison avec des souris témoins (+ 37%).
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 lactosérum plasma PRM/Alf DBA/2J Co nc en tra tio n en IG F1 (n g/ m L ) 104 (12) 123 (8) 59 (12) 43 (8) * NS
Conclusions et perspectives
1. Analyse génétique :
L’analyse génétique effectuée sur les BC1 et F2 entre les lignées PRM/Alf et DBA/2J et sur les congéniques BC8 et BC10 129/sv.PRM/Alf a permis de mettre en évidence :
1.1. Une association entre le génotype pour Igf1 et la longueur du tube digestif uniquement chez les BC1 sur PRM/Alf.
L’association, bien que significative, ne permet d’expliquer qu’une différence de moyennes de longueur intestinale de 1,2 cm dans ce croisement. Cette faible différence peut être due à:
• un effet expérimentateur, les dissections ayant été faites par des personnes différentes pour les souris produites avant mon stage et celles que j’ai produites.
• la nécessité d’être homozygote pour l’allèle PRM/Alf sur plusieurs autres locus qu’Igf1 pour potentialiser l’effet du génotype d’Igf1.
• ou bien le fait que cette association n’a pas de signification biologique.
Il faut bien noter que notre étude ne permet de mettre en évidence qu’une association entre le génotype pour Igf1 et la longueur intestinale, sans donner aucune indication sur la liaison entre les deux facteurs, ni sur la causalité du génotype Igf1 dans le phénotype de dolichomégalie. Pour mettre en évidence la liaison génétique, il faudra effectuer un « genome scan » complet sur les ADNs des croisements produits, et trouver un QTL de lodscore supérieur à 3 dans la région d’Igf1. Pour rechercher un lien causal, il est prévu de comparer la séquence ADNc Igf1 des lignées PRM/Alf et DBA/2J, et la quantité d’ARN Igf1 produite par le foie et l’intestin dans les deux lignées.
Aucune association entre le génotype pour Igf1 et la longueur intestinale n’a été trouvée dans les croisements BC1 sur DBA/2J et F2, ni chez les congéniques 129/Sv.PRM/Alf-pwk/pwk. Les raisons peuvent être :
• l’implication d’Igf1 dans l’« effet maternel » PRM/Alf, qui n’a été mis en évidence dans aucun autre croisement que le BC1 sur PRM/Alf. Cependant, nous n’avons pas pu montrer d’interaction entre le génotype pour Igf1 et cet « effet maternel » chez les BC1 sur PRM/Alf. Ceci peut être dû à la faible représentativité de 4 des 8 catégories possibles
parents reproducteurs F1 des BC1, le croisement (DBA/2J x PRM/Alf) a été très infructueux, d’où un déficit en reproducteurs F1 de ce type, et la sous-représentativité des classes les faisant intervenir. En augmentant ces effectifs, nous pourrions peut-être trouver une interaction.
• le fait qu’Igf1 seul n’a pas d’effet sur la longueur intestinale. Chez les F2, le brassage génétique est supérieur à celui des BC1 et diluerait encore l’effet d’Igf1 qui, de faible, deviendrait invisible. Cette hypothèse est renforcée par les résultats sur les congéniques BC8 et BC10 129/Sv.PRM/Alf, qui doivent être homozygotes pour les allèles 129/Sv dans tout le génome, hormis la région contenant pwk et Igf1 où ils sont homozygotes pour les allèles PRM/Alf. Ces résultats semblent montrer que la région contenant pwk et Igf1 seule n’a pas d’effet sur la longueur intestinale.
1.2. Un effet du sens du croisement sur la longueur intestinale chez les BC1 sur PRM/Alf
On retrouve donc un « effet maternel », comme ce qui avait été identifié dans les expériences d’adoptions croisées (6). Néanmoins, de façon surprenante, l’intestin était plus long chez les individus BC1 sur PRM/Alf dont la mère était F1 que pour ceux dont la mère était PRM/Alf. Dans les adoptions croisées, une mère F1 ne peut pas conférer d’ « effet maternel » et l’« effet maternel » est maximal entre une mère PRM/Alf et un petit PRM/Alf (6). Dans le croisement BC1 sur PRM/Alf, les petits n’étaient pas de génotype constant, contrairement aux petits des expériences d’adoptions croisées. L’interaction entre les génomes maternels et zygotiques se trouve peut-être modifiée.
L’effet maximal sur la longueur intestinale des BC1 sur PRM/Alf a été retrouvé lorsque non seulement la mère était F1, mais la grand-mère était PRM/Alf. (cf Figure 10 page 25). Cette observation a-t-elle une réalité biologique ? S’il s’agissait d’empreinte parentale, on devrait retrouver un effet de la grand-mère dans d’autres catégories, ce qui n’est pas le cas. Là encore, la taille des effectifs de certaines catégories est peut-être en cause.
2. Analyse de la quantité d’IGF1 dans le lait et le plasma de souris allaitantes
2.1. Le taux d’IGF1 plasmatique est-il supérieur uniquement chez les souris PRM/Alf allaitantes ou quel que soit l’état physiologique ?
Le dosage d’IGF1 dans le sang des femelles PRM/Alf allaitantes semble confirmer le rôle de ce facteur de croissance dans le contrôle de la taille de l’intestin chez l’adulte.
Néanmoins, il serait intéressant d’évaluer la concentration sanguine d’IGF1 chez les souris ni gestantes, ni allaitantes. En effet, l’augmentation de concentration observée pourrait être due au stade physiologique (allaitement). Si ce résultat se confirme, il pourrait permettre d’expliquer l’augmentation particulièrement importante de la taille de l’intestin que l’ont observe chez les souris PRM/Alf ayant eu des portées (cf. introduction). Inversement, si une telle augmentation est également observée chez les femelles vierges (ou même chez des mâles), cela pourrait indiquer un rôle plus général d’IGF1 dans l’allongement intestinal.
2.2. Le rôle d’IGF1 dans l’allongement intestinal des souris PRM/Alf est-il uniquement quantitatif ou également qualitatif ?
Les valeurs de concentration d’IGF1 dans le lait des souris PRM/Alf ne sont pas en faveur d’une implication d’IGF1 dans l’ « effet maternel ». Ce résultat confirme ceux de l’étude de Burrin et al. (12) montrant que la surexpression d’IGF1 dans le lait de souris n’a qu’un effet très mineur sur la croissance du tube digestif des souriceaux.
Néanmoins, à ce stade nous ne pouvons pas exclure une activité spécifique d’IGF1 qualitativement plus élevée chez les souris PRM/Alf. Une comparaison de séquences et des propriétés physico-chimiques (par exemple les propriétés de mobilité électrophorétique ou chromatographiques) entre les IGF1 provenant des différentes lignées de souris (dont PRM/Alf) pourrait nous renseigner sur une telle possibilité.
Nous pouvons aussi nous interroger quant à la disponibilité de l’IGF1. En effet, la protéine IGF1 est régulée par une famille protéique comprenant une dizaine de membres appelés IGF Binding Proteins (IGFBPs). Ces protéines modulent l’action d’IGF1 en régulant la quantité d’IGF1 libre, qui est la forme biologiquement active. Des études seront conduites en collaboration avec le Dr Monget afin de quantifier ces IGFBPs dans le sang des souris PRM/Alf pour détecter d’éventuelles fluctuations de concentration qui pourraient potentialiser l’effet déjà observé sur la quantité total d’IGF1. En outre, plusieurs gènes codant des IGFBPs sont connus pour être sensibles à la méthylation (Igfbp 2, 3, 4 ,7) (15,16). Or, G.Aubin-Houzelstein a montré dans une expérience d’administration d’un aliment hyperméthylant à des souris PRM/Alf que les souris ayant reçu l’aliment hyperméthylant avaient l’intestin 2,5 cm plus long que les souris PRM/Alf ayant reçu l’aliment témoin (G. Aubin-Houzelstein, communication personnelle). Le niveau de méthylation des gènes Igfbp 2, 3, 4 ,7 des deux groupes de souris va être testée. Une perspective de ce travail sur IGF1 est donc l’étude du rôle des IGFBPs sur la régulation du taux d’IGF1 circulant dans la lignée PRM/Alf.
