STRESS OXYDANT DE LA CELLULE : PARTIE 2

Texte intégral

(1)Anna Izabel Victor-Olivier Jacquet P2. 22/09/20 UE 6.1 : Biologie cellulaire, Pr. O. Sergent. STRESS OXYDANT DE LA CELLULE : PARTIE 2 Récap : Le radical hydroxyle est le plus réactif. Des traces de métaux et d'H2O 2 doivent être présents pour le former. C'est la réaction de Fenton. L'intérêt de l'anion superoxyde ( ''plutôt réducteur'') est de faciliter le passage du fer ferrique en fer ferreux. Ce dernier aide à son tour le H2O2 à passer à °OH. Cette réaction s'appelle la réaction d'Haber-Weiss.. Schéma de la prof au tableau :. III - Sources cellulaires de production des ERO III - A - Rôle des métaux de transitions : génération de °OH III - A - Réactions chimiques mises en jeu rappel phrappe précédente Pour la (1) la même réaction pourrait avoir lieu avec le cuivre. 1.

(2) III - B - Compartiments cellulaires impliqués par rapport à la libération de fer Entrée du fer dans les Cellules: ● Via endocytose à clathrine sous forme fer ferrique Le fer est lié à la transferrine sous forme ferrique (fe3+) dans le milieu extra-cellulaire (MEC) Le fer ferrique associé à la transferrine se fixe sur les récepteurs à transferrines présents au niveau de la membrane plasmique. La liaison de son récepteur avec la transferrine entraîne une endocytose à clathrine. Les récepteurs de la transferrine et le fer associé migrent dans les puits recouverts de clathrine. On les retrouve ensuite dans les endosomes via le mécanisme d'endocytose. Dans la lumière des endosomes le pH est acide permettant la libération du fer de sa liaison à la transferrine (la transferrine reste liée au récepteur et sera ensuite recyclée). Le fer libéré dans la lumière des endosomes passe sous forme Fe2+ (fer ferreux) et sera ensuite transloqué dans le cytosol via le transporteur DMT1 ( Divalent Metal Transporter). Il se retrouve ainsi dans le pool de fer du cytosol. ● via DMT1 sous forme fer ferreux Le fer Fe2++ peut aussi directement entrer dans le cytosol via DMT1. Le fer, maintenant présent dans le cytosol, peut déclencher la production du radical hydroxyle (via reaction de Fenton et Haberweiss) et donc déclencher un éventuel stress oxydant. Le radical hydroxyle est très réactif et peut oxyder toutes les molécules présentes dans son environnement proche.. 2.

(3) Fer de bas poids moléculaire (fer BPM) (dénomination impropre en chimie, mais intéressante pour la biocell) est le nom donné au fer lié à des petites molécules de faible poids moléculaire (citrate, ATP, ADP...) mais la nature exacte de ces petite molécules n'est pas encore réellement décrite. Seul le fer BPM peut catalyser les réactions de production du radical hydroxyle. Par au position au fer présent dans les protéines (fer de haut poids moléculaire) : ● Ferritine : stockage du fer, protéine contenant jusqu'à 4500 atomes de fer ● Transferrine : protéine de transport du fer ● le fer contenu dans les protéines est comme “à l’abri dans les protéines” car le fer stocké dans les protéines n’est pas capable de catalyser les réactions de productions de radicaux hydroxyle. Devenir du fer BPM dans les cellules : ● ● ●. ● ●. Formation radical hydroxyle (réactions de Fenton et Haberweiss). e Export hors de la cellule via le transporteur ferroportine Stockage du fer dans la Ferritine ( jusqu’à 4500 atomes de fer ) sous forme ferrique fe3+ ○ Dans certaines conditions particulières : lorsque la cellule est dans un état réduit en présence d’ascorbate (vit C) ou lors d’apport de NADH conséquent : peut entraîner la réduction du fer ferrique contenu dans la ferritine en fer ferreux qui est alors liberé. Il y a donc un risque de production de radical hydroxyle. Participer à la synthèse des ferroprotéines qui sont importantes pour la chaîne respiratoire mitochondriale contenue dans la membrane interne de la mitochondrie. Sous certaines conditions particulières, la cellule peut déclencher de l’autophagie. Pour la mitochondrie on parle de mitophagie : digestion de la mitochondrie. L’autophagie peut aussi concerner certaines protéines dont la ferritine. L’autophagie conduit à la digestion / lyse des organites ou protéines concernées dans les lysosomes. Dans ce cas le fer est ainsi libéré sous sa forme fer BPM. On peut donc considérer le lysosome comme un organite important par rapport à sa quantité de fer BPM.. 3.

(4) Cas de maladie génétique: l'hémochromatose et fer BPM L'hémochromatose est une maladie génétique autosomale récessive. Cette maladie est plus fréquente chez les bretons, le CHU de rennes est le référent concernant cette pathologie. Plusieurs gènes peuvent être atteints, cependant la mutation la plus fréquente se trouve sur le gène HFE. Les malades présentent une surcharge en fer, dans différents organes tels que le foie, le cœur et le pancréas. Cette surcharge déclenche des dommages de nature oxydatif importants dans ces organes. Traitements : élimination du fer de la circulation sanguine par des saignées, ou des chélateurs du fer spécifiques du fer de bas poids moléculaire (desferrioxamine, défériprone …) Bilan pour le radical hydroxyle ( °OH) : ● Le plus réactif ( oxyde toutes les molécules dans un environnement proche) ● Pas de source cellulaire directe de production ○ Il faut auparavant la production d’anion superoxyde O2°- ou peroxyde d’hydrogène H2O2, et la présence de métaux (étant les catalyseurs, seules des traces suffisent.) ○ Dès qu'il y a une source cellulaire d’anion superoxyde ou de H2O2 il y a de grande chance qu'il y ait °OH.. Exemple : supplémentation en fer d’une culture cellulaire de neurones Maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer) : chez ces patients il peut y avoir accumulation de fer dans certaines régions du cerveau. il est donc intéressant de pouvoir cultiver des cellules humaines de neuroblastomes en présence de fer. Etude in vitro: étude sur l'effet de la surcharge en fer sur des cultures de cellules humaines de neuroblastome (lignée SH-SY5Y) ●. ● ●. supplémentation en fer-NTA (nitrilotriacétate= petit complexe de fer) rentre facilement dans les cellules ○ différentes concentrations ○ différents temps d’incubation évaluation de la viabilité cellulaire par le test MTT (très utilisé en biocell qu’on verra souvent et qu'il faut connaître ) évaluation de la production d’ERO (par fluorescence) utilisé aussi et à connaître aussi. 4.

(5) Test MTT (test de viabilité cellulaire): ( à connaître ) Relativement simple de mise en oeuvre Ce test permet l'étude de l'activité de l'enzyme mitochondriale (=succinate DSH) uniquement présente dans les cellules vivantes. La succinate DSH peut métaboliser le MTT (substrat qu’on ajoute aux cellules) en Formazan, cela donne un précipité violet (que l'on dissout dans le DMSO). Ceci rend très facile l’etude du nombre de cellules vivante par spectrophotométrie. On mesure la densité optique à 570nm. La DO étant proportionnelle à l’activité de l’enzyme et donc proportionnelle au nombre de cellules vivantes. Evaluations des ERO par la sonde DCF (H2DCF-DA) (IMPORTANT) Cette sonde est la plus utilisée mais il en existe d’autres dont le principe de fonctionnement est le même. Sa formule permet de comprendre le mécanisme d’action. H2DCF-DA : 2’7’ dichlorodihydrofluorescein diacetate: fluorochrome Dihydro : sonde sous forme réduite Diacétate: parce que c’est un ester, elle rend la molécule liposoluble, ce qui permet de lui faire franchir la membrane et passer dans la cellule. Dans les cellules, les estérases vont couper le diacétate on obtient alors le H2DCF (dichlorodihydrofluorescein) qui ne peut plus alors franchir les membranes. En présence d’ERO, le H2DCF est oxydé et devient DCF qui est le seul composé fluorescent. l’apparition de la fluorescence signe une oxydation et la présence d’ERO. On mesure l’intensité de fluorescence qui est proportionnelle à la quantité d’ERO présent dans la cellule.. Resultats de l’etudes sur cultures de neuroblastome. 5.

(6) 1er graphique ( % viabilité cellulaire et concentration en fer en fonction du temps de traitement en jour)(Chaque courbe= une concentration) : ● ●. En fonction du temps, il y a une perte de viabilité augmentant avec la concentration en fer. concernant la cinétique : plateau atteint au bout de 6-8 jours, voire recupération de la viabilité. 2ème graphique : (fluorescence de la DFC en fonction de la concentration de Fe et en fonction du temps de traitement) ● ●. en fonction de la concentration : augmentation de la production des ERO en fonction du temps (cinétique) : augmentation de la production des ERO (cinétique) jusqu'à un plateau de production des ERO pour les fortes concentrations de fer. Ces phénomènes de plateau seront étudiés dans le cours de signalisation redox. Ils sont dus à l’adaptation au stress de la cellule qui réagit pour lutter contre ce stress. Mais il arrive un moment où cette adaptation est perdue. Cependant il manque des expériences pouvant conclure que la concentration en fer est impliqué dans la production des ERO. Ici on ne voit que des corrélations : corrélations entre augmentation de la concentration en fer et la perte de viabilité et avec la production des ERO. La démonstration de l'implication n’est pas démontrée. Pour démontrer que le fer est impliqué par exemple dans la perte de viabilité, il aurait fallu utiliser des chélateurs de spécifiques du fer BPM qui aurait mis la cellule à l’abri du fer BPM et regarder si on retrouve ou non une viabilité correct. De la même façon pour dire que la perte de viabilité est dûe au stress oxydant il aurait fallu tester des antioxydants.. 6.

(7) III – C - Rôle du métabolisme cellulaire Le métabolisme cellulaire normal ( sans stress) produit des facteurs pro-oxydants déclenchant un déséquilibre de la balance en faveur des oxydations. Mais la production des ERO reste faible, le déséquilibre est juste transitoire : les antioxydants sont en quantité suffisantes pour éliminer les facteurs pro-oxydants et permettre le retour à l’équilibre. Dans une vie cellulaire normale : il y production de facteurs pro-oxydants mais il n’y a pas de stress oxydant. Dans des situation physiopathologiques (maladies, vieillissement) il peut y avoir augmentation du métabolisme entraînant une augmentation importante des facteurs pro-oxydant voire une production excessive ce qui entraine un déséquilibre prolongé : on parle alors de stress oxydant entraînant un dommage cellulaire par oxydation. métabolisme normal -> pas de stress oxydant métabolisme augmenté -> stress oxydant et dommage cellulaire. Compartiments cellulaires impliqués Pratiquement tous les compartiments cellulaires ont une possibilité de production des ERO: ● ● ● ● ●. mitochondrie cytosol membrane plasmique peroxysome réticulum endoplasmique. Remarque : pas de système de production des ERO au niveau du noyau, pour éviter l'oxydation du génome. Il peut tout de même être exposé aux oxydations via les facteurs pro oxydants provenant des autres compartiments ou via l’oxydation des lipides.. 7.

(8) III – C - 1 - Mitochondrie La mitochondrie a une membrane interne dans laquelle se trouve la chaîne respiratoire. NB : la respiration mitochondriale est censé être connue. → réviser la m itochondrie de PACES. Une des origines de la production de l’anion superoxyde c’est la chaîne respiratoire mitochondriale. membrane mitochondriale interne : fuite d’électrons. La chaîne respiratoire est composée de 4 complexes (en violet) entre lesquelles circulent des électrons ainsi que des éléments mobiles ubiquinone et cytochrome C. Les apports d'électrons se font grâce à NADH (cédés au complexe I) et FADH2 (cédés au complexe II). Les électrons circulent dans ces complexes et les protéines s’y trouvant passent d'un état réduit ou oxydée en fonction qu'ils reçoivent ou donnent des électrons. L'accepteur final des électrons est l'O2 et il y a production d'H2O au niveau du dernier complexe. Lorsque la chaîne respiratoire fonctionne normalement l’O2 reçoit 4e- pour donner de l’eau. Certains complexes sont plus favorables à la fuite d’e-. La fuite d'électron sera toujours monoélectronique : un seul électron vient réduire l'oxygène pour obtenir de l’anion superoxyde. La fuite d’e- peut avoir lieu dans la matrice ou espace intermembranaire selon les complexes : ● complexe I : la fuite d’e- s'effectue vers la matrice. ● complexe II : réduction dans la matrice ● ubiquinone : dans espace intermembranaire (EIM) ● complexe III : dans EIM et dans la matrice La mitochondrie peut provoquer la sortie des ERO. (cf schema recapitulatif TD1 : production et sortie ERO, p26). 8.

(9) L'anion superoxyde ne peut pas franchir les membranes (à cause de sa charge -), mais plusieurs systèmes font qu’il va réussir à les franchir ( 2 possibilités): ● ●. Soit il va participer à la signalisation cellulaire redox, ou il peut déclencher du stress oxydant .. Dans la mitochondrie, on peut avoir une transformation de l’anion superoxyde en radical hydroperoxyle HOO° en présence de proton. Le radical hydroperoxyle peut franchir les membranes, donc il peut franchir les membranes internes et externes de la mitochondrie. L'autre possibilité est que l'anion superoxyde de la matrice puisse être transformé par une superoxyde dismutase manganèse (MnSOD) en peroxyde d'hydrogène H2O2. Le peroxyde d'hydrogène peut ensuite franchir les membranes et rejoindre le cytosol. Ce n'est pas représenté ici, mais il y a aussi une superoxyde dismutase (Cu, Zn SOD) dans l'espace intermembranaire. Le °OH de l’EIM peut donc aussi être transformé en H2O2. Positionnés sur les membranes externe et interne, il existe des canaux capables de prendre en charge le transport des anions superoxydes de la matrice vers l’EIM et de l’EIM vers le cytosol. Sur la membrane interne, on retrouve le canal IMAC. Il permet à l' anion superoxyde de la traverser et d’aller vers l’EIM.. 9.

(10) Puis l'anion superoxyde sort dans le cytosol via le canal VDAC (=porine) positionné sur la membrane externe de la mitochondrie. (rien à voir avec VCAM ET ICAM) Le phénomène de respiration et le phénomène de la réduction mono-électronique de l'oxygène: Les 2 utilisations de l’oxygène peuvent avoir lieu simultanément. ●. ●. 95 à 98 % de l'oxygène va être engagé dans la respiration cellulaire. Donc au niveau du cytochrome c oxydase (au dernier complexe), l'accepteur final (O) reçoit 4 électrons. C'est la réduction tétra-électronique de l'oxygène qui entraîne la formation de l'eau. Systématiquement, au cours du métabolisme, il y a des fuites d'électrons. 2 à 5 % de l'oxygène subit une réduction mono-électronique, ce qui engendre la production d'anion superoxyde et par la suite du radical hydroxyle.. Normalement, la mitochondrie n'est pas trop impactée par ces radicaux puisqu'elle a un bon système antioxydant. Si la cellule se trouve dans une situation où il y a augmentation de la respiration, il y aura forcément augmentation en parallèle de l’oxydation mono-électronique. → Donc si la cellule consomme plus d'oxygène, on a forcément plus d'anion superoxyde de produit. Exemple : exercice physique intense Une dysrégulation est une condition physiologique et pas une pathologie. Quand on fait du sport, les cellules vont être très oxygénées → une augmentation des facteurs pro-oxydants. On se retrouve alors avec une dysrégulation pourtant on est bien en condition physiologique. Il y aura une forte augmentation de la consommation en oxygène dans le muscle (respiration cellulaire). Simultanément il y a augmentation de la production de d'anion superoxyde (ce qui représente un risque). Au cours de l'exercice physique intense, on peut mesurer le risque de dommage oxydatif.. 10.

(11) ● ● ● ● ●. rats courent sur un tapis roulant de manière très importante jusqu'à épuisement sacrifice des rats on prélève leurs muscles de jambes homogénéisation évaluation des ERO avec le test au fluorochrome DCF (vu précédemment). On peut observer une augmentation de la production d'ERO (qu'on pourrait associer à des dommages oxydatifs, mais ce n'est pas l'objet de l'étude). Histogramme. ● ●. blanc : résultat chez les rats qui n'ont pas subi l'exercice, au repos noir : résultat chez les rats qui ont fait le sport. Les résultats ont été complétés avec une étude en fonction de l'âge. Le même exercice a été réalisé chez des rats jeunes (5 mois) et chez des rats âgés (25 mois), ce qui est intéressant. En ordonnée on a l’oxydation du DCF → On observe une augmentation de l’oxydation chez les rats soumis à l’exercice. Au repos, on observe une augmentation de la production d'anion superoxyde chez le rat âgé, lié à la diminution des systèmes antioxydants (vieillissement). Lors de l’exercice intense, la production d’ERO augmente par rapport au repos ( basal ), et cette production est encore plus intense chez le rat âgé.. Production d’ERO à partir de la membrane externe : Dans la membrane externe, il y a un enzyme appelée la mono amine oxydase (MAO). La MAO consomme de l’O2 pour oxyder et désaminer les substrats, et produit des acétaldéhydes et du peroxyde d'hydrogène (et non pas l’anion superoxyde). à noter : les réactions s’effectuent du côté du cytosol, le site actif de l’enzyme étant du coté du cytosol : aldéhyde et H2O2 sont donc produits dans le cytosol. 11.

(12) Il y a 2 types de substrats possible : ●. ●. amines endogènes = amines biogènes ○ neurotransmetteur, qui, dégradés en aldéhydes n'auront plus d'effet ○ ex : sérotonine, dopamine, noradrénaline amines exogènes ○ dans cellule en lien avec l’alimentation/nutrition (intestin, foie, rein) ○ ex : tyramine trouvée dans les aliments (chocolat, viande, poisson, oeufs…) ou les produits de digestion ■ Un régime un peu déséquilibré, peut entraîner un excès d'apport en tyramine, et donc une production excessive H2O2.. NON FAIT CETTE ANNEE Exemple : effets des glucocorticoïdes sur les muscles Un excès de médicaments glucocorticoïdes (GC) (AIS = anti inflammatoires stéroïdiens) peut entraîner des dommages musculaires. On peut s’interroger sur les mécanismes mis en jeux pour déclencher ces dommages (stress oxydant?).. Étude mécanistique dans les cellules : ● ● ● ●. cultures de myocytes sont réalisées en présence de dexaméthasone (Glucocorticoïde) évaluation de la production d'ERO au cours du temps en présence ou non de molécules capable d'inhiber la mono amine oxydase (MAO) certaines cultures : inhibition de MAO par des inhibiteurs pharmacologiques ○ Clorgyline : MAO de type A ○ Pargyline : MAO de type B. NON FAIT CETTE ANNEE Effet de la dexaméthasone (DEX) sur la production de H2O2 : Au cours du temps, la déxaméthasone entraîne une production d’ERO, il y a donc le développement d’un dommage oxydatif qui peut altérer les muscles. ● ●. L'inhibiteur de MAO B (pargyline) n'a pas trop d'effet sur la production d’ERO à l'inverse de l 'inhibiteur de MAO A (clorgyline) qui inhibe complètement la production d'ERO.. → C’est donc la MAO A qui est impliquée dans la production d’H2O2 (→ dommage musculaire) Induction d'un stress oxydant par la dexaméthasone (médicament). Des expériences complémentaires ont permis de mettre en évidence un mécanisme : la dexaméthasone (GC) peut franchir les membranes, et se fixer sur les récepteurs nucléaires, et donc se fixer éventuellement sur un gène et modifier son expression.. 12.

(13) La dexaméthasone peut ainsi modifier l'expression du gène MAO A et donc a ugmenter son expression. Donc la protéine MAO A est plus exprimée lorsque les cellules sont exposées à la dexaméthasone. C'est comme ça qu'il y a augmentation de production de H2 O2 , et donc un stress oxydant et dommages musculaires.. III – C – 2 Cytosol Dans le cytosol : 2 sources d'ERO (=2 grands systèmes) ● ●. catabolisme des bases puriques synthèse des prostaglandines et des leucotriènes. Le catabolisme des bases puriques : (pas vraiment à savoir, cf biochimie, juste pour restituer) (permet de savoir ce qu'on obtient à partir du catabolisme des bases puriques) A partir des bases puriques, il y a tout un système de cascade enzymatique qui entraîne la production des bases Xanthiques. Il s’agit des bases puriques GMP et AMP, ainsi que IMP (inosine mono phosphate qui provient de l’AMP grâce l’adénylate désaminase). Par l’action de la nucléotidase on obtient la guanosine, l’adénosine et l’inosine. Puis, à partir de ces nucléosides, des nucléosides phosphorylases va entraîner la formation de xanthine et hypoxanthine (bases xanthiques). 13.

(14) Si il y a une augmentation du catabolisme des bases puriques dans la cellule (pour un raison ou une autre), on aura une augmentation de la quantité en xanthine et hypoxanthine, et une favorisation de la production d'ERO. Tout ce qui peut favoriser ce métabolisme, peut augmenter de manière excessive la production de xanthine et hypoxanthine. L'hypoxanthine et la xanthine sont les substrats d'une même enzyme qui présente une double activité : ● ●. activité XD : xanthine déshydrogénase activité XO : xanthine oxydase. Ces deux activités s'excluent mutuellement, l'enzyme ne peut pas présenter les 2 activités simultanément.. La xanthine déshydrogénase (XD) utilise le co-facteur NAD+ et produit NADH. Le produit final de la réaction est l’acide urique. Rappel : L'acide urique peut poser problème chez l'Homme car on sait mal s' en débarrasser : ça peut entraîner une crise de goutte, maladie inflammatoire, avec des douleurs très importante. La xanthine oxydase (XO) ne cède pas ses électrons à NAD+, mais à l’oxygène. Ainsi, on a une réduction mono-électronique de l’oxygène, et donc la production de l’anion superoxyde → XO participe à la signalisation cellulaire.. Le produit final de la réaction sera ainsi l'acide urique. Il existe aussi des déviations du métabolisme, où XD va être convertie XO. Condition normale du métabolisme : ● ● ●. 90% d’activité XD 10% d’activité XO → La production d’anion superoxyde à partir de cette enzyme (X0) est donc normale.. 14.

(15) Ischémie-reperfusion (situation physiopathologique très importante) C'est une situation courante où il y a une augmentation de l'activité xanthine oxydase : ● ●. transplantation d'organes (organe sorti de son organisme initial (= donneur), rentre dans un contexte d'ischémie (pendant la durée de transport), puis est réimplanté et reperfusé). chirurgie cardiaque avec une circulation extracorporelle (même chose, pendant un certain temps le cœur n'est plus branché (on est dans un cas particulier d’ischémie), sort de la circulation le temps de la chirurgie, puis on le rebranche, et il reçoit à nouveau le flux sanguin, et on a donc la reperfusion). C’est à ce moment là qu'il y a un risque de formation des ERO.. Il y a donc 2 périodes à bien distinguer : ischémie et reperfusion. Ischémie : première période : Dans le cas de l'ischémie, on a une diminution de l'apport en oxygène. La mitochondrie ne travaille plus à plein régime, on a une diminution de la respiration donc de la synthèse d'ATP. Par conséquent, les pompes ca2+ ATPase (qui dépendent de l'hydrolyse de l'ATP ) ne vont pas bien fonctionner. Il va donc y avoir une inhibition des pompes à calcium qui se trouvent la membrane plasmique et dans la membrane du RE. → Le calcium ne sort plus de la cellule et n’est plus stocké dans le RE, il reste dans le cytosol, on a une augmentation de la concentration cytosolique en calcium. Le calcium va donc activer les protéases calcium dépendantes qui vont cliver la XD et faire apparaître l’activité XO. Reperfusion : seconde période suivant l’ischémie : Lors de la reperfusion, la XO accumulée pendant l’ischémie devient brusquement active et produit de l’anion superoxyde en grande quantité → Cela provoque des dommages oxydatifs aux protéines, aux lipides. C’est pourquoi p lus la durée de l’ischémie est longue plus les risques de d'oxydation augmente D'où l'intérêt, au moment de la reperfusion, d'utiliser des antioxydants. Allopurinol Il existe un inhibiteur compétitif de XD/XO (enzyme) appelé Allopurinol. Il est hypo-uricémiant. Il est métabolisé par la XO. On obtient de l'oxypurinol, qui est encore plus inhibiteur de la XO que l’allopurinol. C'est un métabolite actif. Il peut participer au traitement de la goutte (inflammation liée à un dépôt de cristaux d’acide urique, en surcharge).. 15.

(16) ex : modèle in vitro d’ischémie reperfusion : cellules endothéliales de la lignée humaine HUVEC ● ● ●. ischémie (2 heures) : oxygène remplacé par de l’azote dans la chambre de culture : tension en oxygène faible reperfusion (1 heure) : retour à 21% oxygène =conditions normales = normoxie évaluation des ERO par la sonde DCF. La première période est la plus longue, elle correspond à la période d’ischémie (2h) sans production d’ERO mais production de XO a partir de XD (mais pas de O2 donc XO non fonctionnelle) La deuxième période est la reperfusion où on assiste à une explosion de la production d’ERO (dès les premières minutes, via action de la XO qui s’est accumulée pendant toute la période d’isch ). Il y a une 2e source d'ERO dans le cytosol, (toujours dans le cytosol) c'est lors de la synthèse des eicosanoïdes (prostaglandines, leucotriènes). Synthèse des prostaglandines et des leucotriènes : les eicosanoïdes : ● ●. ●. médiateurs chimiques locaux : effets autocrine (sur la cellule productrice) ou paracrine (sur une cellule voisine) se caractérisent par la présence de 20 atomes de C dérivés de l’acide arachidonique : ○ prostaglandine ○ leucotriènes ce sont de petites molécules, mais qui ont de très nombreuses fonctions physiologiques dont : ○ inflammation (déclencher la douleur, la fièvre, …) ○ contraction des muscles lisses (vaisseaux, bronches, intestin, utérus) ○ agrégation plaquettaire (TXA2) ○ Ils ont permis de trouver des médicaments. Comment se déroule la synthèse des prostaglandines et des leucotriènes ? Les espèces réactives de l'oxygène vont être produites au cours de la synthèse des eicosanoïdes à partir de l'acide arachidonique. L'acide arachidonique est libéré à partir des phospholipides membranaires, grâce à l'activation d'une phospholipase A2. Libéré de ses phospholipides, il peut subir deux mécanismes enzymatiques : l’un fait intervenir la cycloxygénase et l’autre la 5-lipoxygénase.. 16.

(17) A partir de l'acide arachidonique, on a ainsi : ●. ●. ●. via l'action de la 5-lipoxygénase : ○ formation de leucotriènes (LTB4, LTC4, LTD4), avec production directe du radical hydroxyle °OH (exception) : oxydation directe et dommages cellulaire via l’action de la cyclooxygénase ○ production de prostaglandines et thromboxane A2 (TXA2) avec production de °OH ou de l'oxygène singulet 1O2 (L'oxygène singulet est très peu produit par le métabolisme de base). On va donc assister à la formation d’ERO extrêmement réactives qui vont entraîner des dommages oxydatifs très rapides.. la voie de formation des eicosanoïdes a fait l’objet d’études : ● ● ●. les corticoïdes (anti-inflammatoires stéroïdiens (AIS)) peuvent inhiber la PLA2 les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) peuvent inhiber la cyclooxygénase on peut donc réguler via apport médicamenteux la production d’ERO. III - C - 3 Membrane plasmique. 17.

(18) Ce compartiment est très important par rapport à la signalisation cellulaire. Dans la membrane plasmique on trouve l’enzyme : NADPH oxydase (Nox) → enzyme qui peut contribuer au stress oxydant ou à la signalisation Redox → bien connaître cette enzyme !! Ce complexe multiprotéique est composé : ● ●. De protéines transmembranaires : gp91phox, p22phox De protéines qui se fixe côté cytosolique (protéine extrinsèque) : p67phox, p47phox, p40phox, RAC(petite GTPase) (= sous unités régulatrices). /!\ Ne pas confondre Nox avec NOS (elles n' ont rien à voir l' une avec l' autre, erreur fréquente à l'exam) Nox= NADPH oxydase NOS=Monoxyde d' azote synthase. La protéine transmembranaire gp 91 phox est la sous unité qui est responsable de l'activité catalytique de l'enzyme. Cette gp91phox reçoit des électrons qui proviennent du NADPH cytosolique pour les transmettre à l'oxygène entraînant sa réduction monoélectronique en anion superoxyde °O2- dans le MEC. Dans une cellule au repos : on trouve dans la membrane plasmique les sous-unités : gp91phox, p22phox et Rap1A. Sous cette forme le complexe NADPH oxydase (=Nox) n’est pas actif, il faut que soient recrutées des sous-unités cytosoliques pour qu’il soit activé. Si la cellule est activée : il y a recrutement du cytosol vers la membrane plasmique après phosphorylation pour une grande partie d'entre elles (marquée par les ronds roses sur le schéma) des sous-unités : p40phox, p47phox, p67phox et RacGTP (petite GTPase) : Nox actif La phosphorylation est liée à la signalisation cellulaire : lien très fort entre l’activation de Nox et la signalisation cellulaire.. 18.

(19) NADPH oxydase : famille de plusieurs protéines (NOX) Nox 1 à 5: on distingue 5 Nox qui dépendent du tissu dans lequel elles sont exprimées. Nox 2: 1ère Nox découverte. (on peut la retrouver dans les cellules phagocytaires (macrophages et PNN). C’est la 1ère NADPH oxydase mise en évidence, elle est particulièrement efficace (production d' ERO à très forte concentration), au départ on pensait qu'elle n’existait que dans les phagocytes. On sait maintenant que toutes les NADPH oxydases sont ubiquitaires, elles se trouvent dans de très nombreux types cellulaires (ex. cellule épithéliales, musculaires, cardiomyocytes...). Dans les cellules non-phagocytaires : leur rôle majeur est d'intervenir dans la signalisation cellulaire (la plupart du temps). Dans les cellules phagocytaires : le rôle majeur de la NADPH oxydase est d’intervenir dans la réponse immunitaire non spécifique, l’inflammation en déclenchant un stress oxydant (n'exclut pas la signalisation cellulaire via Nox). Production d’ERO au cours de la phagocytose :. Lors de la phagocytose : la cellule est activée par la reconnaissance de la bactérie (= stimulus) ce qui déclenche la modification du cytosquelette permettant l'émission de pseudopodes. Ces pseudopodes vont entourer progressivement la particule ou cellule à éliminer. Cette activation provoque l’activation de la Nox et donc la production dans le MEC où se situe la particule à éliminer de l’anion superoxyde. Lorsque la phagocytose avance, les pseudopodes fusionnent formant une vacuole d’endocytose dans laquelle il peut également y avoir production d’anions superoxydes. Bilan : lors de la phagocytose les ERO sont soit produites dans le MEC, soit dans la lumière des vacuoles d’endocytose. 19.

(20) L’anion superoxyde sera transformé en H2O2 via la superoxyde dismutase (SOD) que l'on peut retrouver dans le milieu extracellulaire. Dans le MEC on trouve des métaux de transition à l'état de traces (fer) permettant la production du radical hydroxyle ayant la réactivité suffisante pour provoquer l’oxydation des particules à éliminer. Cette production de radical hydroxyle est donc déterminante. En parallèle : la myéloperoxydase (MPO) contenue dans des granules intracytoplasmique est libérée dans le MEC lorsque le macrophage est activé. En présence de chlorure (Cl-) et de peroxyde d'hydrogène (H2O2) la MPO permet la formation de l’acide hypochloreux (HOCl) = eau de javel, très oxydant pouvant déclencher des oxydations au niveau de la bactérie. Il y a donc la coopération entre trois enzymes qui permettent la production d'espèces très oxydantes dans le milieu extra-cellulaire. Les inhibiteurs de la Nox: ● ● ●. permettent de savoir si la Nox est impliquée ou non dans les phénomènes observés Apocynine: inhibiteur sélectif : intéressant, empêche l’assemblage du complexe Nox. DPI (diphénylène iodonium) : plus vieux, toujours utilisé même s’il présente des inconvénients. ○ non spécifique : inhibe d'autres enzymes, (pourtant très utilisé) ■ NOS (monoxyde d’azote synthase) ■ NADPH ubiquinone oxydoréductase (chaine respiratoire mitochondriale) ■ la NADPH cytochrome p450 oxydoréductase dans le RE entres autres. III - C - 4 Peroxysomes C’est un organite majeur dans la consommation de l'oxygène et réalisant des oxydations (comme la mitochondrie) mais tout est dissipé sous forme de chaleur (et non d’ATP comme dans la mitochondrie). On y trouve deux types d’enzymes catalysant des oxydations ● les oxydases ○ entraînent la production de H2O2 ○ dégradent les AG, les AA, l’acide urique ● les catalases ○ élimination du H2O2, soit directement soit en servant à la détoxification de composés toxiques (ethanol, phénols, formaldéhyde) Sous certaines conditions physiopathologiques, notamment les surcharges en AG retrouvées chez des individus présentant une alimentation déséquilibrée, la catalase va être débordé et on aura une surproduction de H2O2 pouvant entraîner à terme un stress oxydatif. III - C - 5 - : Réticulum endoplasmique (++++imp pour pharmaciens). 20.

(21) Il existe 2 grands systèmes pour le RE : le CYP450 et la synthèse de protéines.. III - C - 5 - a: Système Cytochrome P450 : ERO cytosoliques Le CYP450 se situe dans le RE mais sa production se fait dans le cytosol. On va là aussi assister à la production d’ERO, notamment de l’anion superoxyde et du peroxyde d’hydrogène. C’est un système très important (revu plus tard en pharmaco et toxico) car il permet la détoxification des xénobiotiques ; de nombreux médicaments sont ainsi métabolisés, d'où l'intérêt pour de futurs pharmaciens. Ce système se situe dans le réticulum endoplasmique lisse (REL) et permet de rendre les xénobiotiques davantage polaires , facilitant ainsi leur élimination. Le Cytochrome P450 consomme du NADPH pour réaliser une oxydation, en utilisant de l’oxygène.. Les substrats peuvent être: ● ●. Des xénobiotiques (médicaments, substances toxiques, contaminants de l’environnement) Des molécules biogènes ( ex: acides gras.). Le système cytochrome P450 est une chaîne de transport d'électrons provenant du NADPH. Elle est composée de deux transporteurs : ● une réductase : (NADPH Cytochrome P450 Réductase (CPR) qui reçoit les électrons du NADPH ○ parfois remplacée par le cytochrome b5 (pour l’oxydation des AG ) ● et une oxydase terminale : Cytochrome P450 (les CYP) recevant les électrons transmis par la CPR. C’est au niveau du cytochrome P450 qu’a lieu l'hydroxylation du xénobiotique. Les cytochromes P450 sont une superfamille des hémoprotéines (protéine contenant un hème donc du fer) : elle contient plusieurs protéines codées par plusieurs gènes (étudiées en pharmaco, PK et toxico). Les différentes classe de cytochromes ne catalysent pas les mêmes substrats.. 21.

(22) Le NADPH fournit des e- à la CPR contenant plusieurs sites actifs (FAD, FMN) qui peuvent passer d’une forme réduite à oxydée (selon le fait qu’elle reçoit ou donne e-). Ensuite les e- sont transmis au cytochrome P450 qui va osciller entre Fe2+ et Fe3+ (hémoprotéine) selon le fait qu’il reçoit ou donne des e-. Finalement il y a hydroxylation du xénobiotique (par le cytochrome P450) lorsque l’oxygène aura reçu tous les e- nécessaires. Important : ces CYP450 peuvent être inductibles par leurs propres substrats. Ainsi, des médicaments sont capables d'entraîner une augmentation d'expression des CYP, et faciliter leur propre métabolisme. L'induction de CYP450 peut bien sûr augmenter la quantité d'ERO produite. Le système peut produire des ERO de manière relativement importante via deux mécanismes : ● Fuite d’électron entre la réductase et le cytochrome (c'est un risque à considérer pour toute chaîne de transport). ● Réaction de découplage dans le cytochrome La fuite d’électrons entre la réductase et le cytochrome : PRINCIPE : classiquement, des électrons s'échappent du premier transporteur (réductase) et se lient à l'oxygène : c'est une réduction mono-électronique en anion superoxyde. Transfert à l’oxygène : O2 + e- ---> O2°Plus rarement, des électrons peuvent être transmis à un substrat RH particulier : la quinone. Cette quinone est retrouvée dans les contaminants hydrocarbures aromatiques polycycliques (benzopyrene : contaminant de l'air), ou encore des anticancéreux (anthracycline= doxobuicine). Une quinone peut recevoir un électron et on obtient alors un radical semi-quinone (l’électron libre se situe sur l’oxygène), ce qui est très fréquent en chimie/biologie radicalaire. À son tour, le radical semi-quinone peut transférer son électron à l’oxygène pour produire un anion superoxyde (transfert indirect à l’oxygène par intermédiaire du substrat quinone). C’est une réduction mono-électronique.. 22.

(23) Réactions de découplage dans le cytochrome : Concerne plus particulièrement certains cytochromes Dans la situation normale :. 1. l'hème se trouve sous la forme Fe3+, le substrat arrive et se lie au cytochrome P450 2. la NADPH réductase (CPR) cède un électron, le fer passe sous forme fer ferreux fe2+ et l'oxygène se fixe. 3. le Fer ferreux peut céder un e- à l'oxygène : on obtient alors un fe”+ lié à un oxygène commençant à augmenter en réactivité (O2°- relié a l'hème) 4. NADPH reductase cede un second e-, fer ferrique devient fer ferreux 5. le fer ferreux cede un electron a l’anion superoxyde. 6. l’oxygene ayant recu deux electrons est encore plus réactif, dans cet etat particulier, il devient suffisament réactif pour declencher l’hydroxylation du substrat. 23.

(24) Dans certains cytochromes P450 : cycle futile ou cycle abortif. Il y a des ruptures de liaisons heme-oxygène. Le fer ferrique lie l'oxygène par des liaisons de faible énergie pouvant être facilement rompues. on obtient dès lors de l’anion superoxyde (en 3-4 : O2-°) et / ou du H2O2 (en 5-6 : O22-). le substrat ne sera jamais hydroxylé, le cycle étant court-circuité en 5 pour revenir directement en 1 (d'où son nom) Concerne notamment le CYP2E1 métabolisant l'éthanol et le paracétamol. 24.

(25) Tableau récapitulatif des acteurs moléculaires du stress oxydant Espèce Chimique. Symbole. Anion superoxyde. O °. Caractéristiques. Demi-vie. + abondant dans la ç mais ne sort pas, déclenche production H O et °OH dismutation (2x O ° + 2H → H O + O ) spontané ou SOD (MnSOD dans matrice mt) protonation (O ° + H → HOO°), à proximité des membranes 2. -. 2. -. 10 s -2. +. 2. -. 2. 2. 2. 2. +. 2. Radical hydroxyle. °OH. + toxique, agit sur lieu de product° (pas de source directe), oxyde environnement proche. Radical hydroperoxyle. °OOH. très réactif et oxydant, diffuse à travers les membranes. Peroxyde d’hydrogène. H O 2. antiseptique, produit °OH avec métaux catalyseurs, circule facilement réaction de Fenton : Métal + H O → Métal + OH + °OH réaction d’Haber-Weiss : O ° + H O → O + OH + °OH (besoin métaux transition). 2. +. 2+. 2. Qq minutes. -. 2. -. -. 2. Oxygène singulet. 1 ns. 2. 2. 2. O. très réactif mais + sélectif que °OH, réagit + AA et AGPI (direct °OOH) mais - Ac Nucléiques. Hydroperoxyde lipidique. LOOH. Très peu stable, dégradés par Fe / Cu en LO° + OH ou Fe / Cu en LOO° + H. Radical lipidique peroxyle. LOO°. format° dans mb par oxydation AGPI, moins réactif que LO°, peut réagir avec autre LOO°. 7s. Radical lipidique alkoxyle. LO°. format° dans mb par oxydation AGPI, très réactifs. 1 µs. Radical AG « C centré ». L°. Aldéhydes. LHO. très toxique et réactif, HNE (+), HEE (-), si 2 CHO : bis-aldéhydes (MDA 80x > HNE). Acide hypochloreux. HOCl. myéloperoxydase (MPO) : H O + Cl (extraçR) → HOCl (phagocytose), anti-microbien. Monoxyde d’azote. NO°. peut diffuser à travers la mb, gaz liposoluble, pas oxydant directement (entraine formation) participe au maintien du tonus musculaire, vasodilatateur. Qq secondes. Anion peroxynitrite. ONOO. très oxydant, grande réactivité, oxyde tout comme °OH. Qq secondes. 1. 2. 2+. +. -. 3+. 10 µs. 2+. +. -. 2. -. 2. MTT : viabilité cellulaire, MTT → succinate déshydrogénase → Formazan, intensité proportionnelle qt ç vivantes, spectrophotométrie à 570 nm Sonde DCF : H DCF-DA (forme ester, rentre dans la ç) → estérases → H DCF (réduit) → ERO → DCF (oxydé) fluo, intensité proportionnelle qt ROS 2. 2. DHE : plus spécifique de O °. -. 2. DAF-DA : plus spécifique NO Méthode des TBARS : mettre en évidence peroxydation lipidique, MDA + TBA (acide thiobarbiturique) → chaleur et acidité → complexe rouge fluo. 25.

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