Détection et identification des Trypanosomes africains par la PCR

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Submitted on 1 Jan 1994

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Détection et identification des Trypanosomes africains

par la PCR

A N’Zila Mouanda, B Oury, F Fournet, C Cadoux, P Grébaut, M Dia, Jl

Lemesre

To cite this version:

First,

composite primers

that contained

M13mp18

sequence

flanked

_by

the

_Tgondii

primer

sequence used in the PCR

amplifi-cation were

_synthesized.

The

_primary

PCR reaction with the

_{composite primers}

gener-ated a

_{M13mpl8 fragment}

with

_{T gondii}

sequence

incorporated

at the ends.

Approx-imately

5 molecules of this internal control

were added to each

_{amplification}

reaction. Because this control contains the same

primer

template

sequences, it

_competes

with the T

_gondii

_gene for

_{primer binding}

and

_{amplification.}

Thus a result was

_only

considered

_negative

if the

_{T gondii gene}

did

not

_amplify

but _{the control sequence did.} This control allows

_monitoring

of the

sensi-tivity

of the PCR reaction in each

_sample.

Knowledge

of technical

_problems

of PCR leads to a better

_{understanding}

of the

dis-crepancies

between

_previously

_published

studies

_(Noordhoek

et al, 1993;

Zaaijer

et

al, 1993).

Future studies should include

con-trol of contamination and evaluation of the presence of inhibitors of the

amplification.

References

Bretagne S, Costa JM, Vidaud M, Tran Van Nhieu J,

Fleury-Feith J ₍₁₉₉₃₎ Detection of _Toxoplasma gon-dii _{by competitive} DNA _{amplification} of bronchoal-veolar lavage samples. J Inf Dis 168, 1585-1588

Noordhoek GT, Van Embden JDA, Kolk AHJ (1993)

Questionable reliability of the _polymerase chain

reac-tion in the detecreac-tion of Mycobacterium tuberculosis.

N Eng J Med 329, 2036

Zaaijer HL, Cuypers HTM, Reesink HW, Winkel IN, Ger-ken G, Lelie PN (1993) Reliability of polymerase

chain reaction for the detection of hepatitis C virus. Lancet341,722-724

Détection et identification des

Trypano-somes africains par la PCR. A N’zilaA N’zila

Mouanda,

B Oury,

F

Fournet,

C Cadoux P

Grébaut M

_Dia,

JL Lemesre

_!ORSTOM,

UR Maladies infectieuses et

_{parasitaires,}

BP

5045, 34032

Montpellier, France)

Parmi les

_espèces

de

_Trypanosomes

sévis-sant en

_{Afrique, Trypanosoma}

brucei et T

congolense

appartenant

respectivement

aux sous-genres

Trypanozoon

et

Nanno-monas sont d’une

_grande

_importance,

par

leur

_{pouvoir pathogène}

pour de nombreux

animaux

_domestiques.

De

_plus,

T _b gam-biense et T b rodhesiense sont

respon-sables de la maladie du sommeil chez

l’homme,

les Mammifères

_domestiques

et

sauvages

ayant

un rôle de réservoir

impor-tant chez le second.

_Enfin,

T b brucei cir-cule exclusivement chez les animaux.

Actuellement,

les

différentes

méthodes de détection et d’identification des

trypano-somes africains aussi bien chez l’hôte

ver-tébré

_(l’homme

ou

_l’animal)

que chez les insectes vecteurs

_{(en particulier}

les

glos-sines)

manquent

de sensibilité.

Ainsi,

de

nombreux malades

échappent

au

_dépistage

et les taux d’infection des

_glossines

sont

certainement sous-évalués. Par

_conséquent,

les données

_{épidémiologiques}

obtenues lors des

_enquêtes

sur le terrain sont insuf-fisantes.

Nous avons

_développé

la

_technique

de détection et d’identification des

Trypano-somes africains

_{(T brucei et}

_{T congolense)}

après amplificaton génique,

par la

tech-nique

d’amplification

en _{chaîne par}

poly-mérase

_(PCR),

des

_séquences

_spécifiques

de l’ADN satellite décrites par Sloof et ai

(1983).

Les

_{oligonucléotides}

utilisés ont été

testés par Moser

_{et al (1989)}

et

_Masiga

et

al (1992).

L’originalité

du travail repose sur la mise

au

_point

d’une méthode de traitement des

échantillons,

facile à mettre en oeuvre,

qui

permet

leur conservation

_{pendant plusieurs}

mois et leur

_transport,

à

_température

ambiante

_(Oury,

_1989).

La contrainte de maintenir une chaîne de froid du lieu de

pré-lèvement au laboratoire est ainsi évitée.

Cette

_technique

de PCR est

reproduc-tible,

spécifique

et sensible. En

effet,

0,1

à à

1 pg d’ADN

(équivalent

de 1 à 10

_parasites),

1 à 10

_parasites

de culture et,

enfin,

10 à à

Les organes

(intestins, glandes

salivaires

et

_proboscis)

de 187

_glossines

infestées

expérimentalement

par T brucei brucei ont été

_analysés.

Une très bonne corrélation

des résultats

_positifs

a été observée entre

l’analyse parasitologique

(15

mouches)

et

la

_technique

de la PCR.

_Cependant,

70,5%

de mouches trouvées

_négatives

à l’examen

parasitologique

se sont révélées

_positives

en

PCR. En somme, seules

29,5%

des mouches

_{parasitologiquement négatives}

après

examen

_{microscopique}

ont

_présenté

des résultats

_négatifs

en PCR.

Ces

_premiers

résultats démontrent une

meilleure sensibilité de cette

_technique

par

rapport

aux méthodes

_{parasitologiques}

clas-siquement

utilisées. Cette

_technique

devrait être d’une

_grande

_importance

dans la

com-préhension

de la circulation des

trypano-somes chez l’hôte vecteur dans les

diffé-rents faciès

_{épidémiologiques}

de la

trypanosomiase

africaine. Références

Masiga KD, Smith AJ, Hayes P, Bromidge TJ, Gibson WC ₍₁₉₉₂₎ Sensitive detection of _Trypanosomes in tsetse flies _by DNA _{amplification.} lnt J Parasitol22,

909-918 8

Moser DR, Cook GA, Diane EO, Bailey CP, McKane

MR, Donelson JE (1989) Detection of Trypanosoma

congolense and TTypanosoma brucei subspecies by DNA amplification using the polymerase chain reaction. Parasitology99, 57-66

Oury B _{(1989) Clonage} et caractérisation des sondes ADN spécifiques de Plasmodium falciparum.

Appli-cation au dépistage du _paludisme. Thèse de docto-rat de biologie, Grenoble 1

Sloof P, Bos JL, Konings AFJM, Mehnke HH, Borst P,

Gutteridge WE. Leon W ₍₁₉₈₃₎ Characterisation of satellite DNA in _Trypanosoma brucei and Trypano-soma cruzi. J Mol Biol 167, 1-21 1

Obtention

_{d’anticorps}

monoclonaux vis-à-vis des

_espèces

Trichinella

_spiralis

et

Trichinella T5 : leur utilisation comme

marqueur

d’espèce.

P Boireau P Boireau

₁

_,

JFJF

Fabien M

_Vayssier

C Vallet C Per-ret

1 C Soule 1 _{JF Vautherot 2}

₍₁

_CNEVA,

laboratoire central de recherches

vétéri-naires,

22,

rue

Pierre-Curie,

94703

Mai-sons-Alfort ; 2

INRA, Virologie

et

immuno-logie

moléculaires,

domaine de

Vilvert,

78350

_{Jouy-en-Josas, France)}

Trichinella sp est un Nématode infectant les

Mammifères et les Oiseaux

_(Soule

et

al,

1991).

Après l’absorption

des larves L1 1

encapsulées,

le

_cycle

intestinal est très

rapide.

Les larves L1

_passent

en

_quelques

heures aux stades

L2,

L3 et L4 avant de se

transformer en adultes

_{(Despommier, 1990).}

Ceux-ci sont

_vivipares

et donnert des

_petites

larves dès le 4e

_jour

_après

l’infection. Les

larves nouveau-nées traversent la

_paroi

intestinale avant d’aller

_{s’encapsuler}

dans

les muscles striés. Plusieurs

_espèces

de trichine sont

identifiées,

parmi lesquelles

l’espèce

T5

_responsable

d’une

_épidémie

de

trichine chez l’homme en France

_(Soule,

1992),

et

_{l’espèce T spiralis}

infectant

_plus

fréquemment

le porc

domestique.

Nous avons obtenu des

_anticorps

mono-clonaux

_(AcM)

vis-à-vis de ces 2

_espèces

de trichine. Plus de 150

_{hybridomes positifs}

en

immunofluorescence ont été obtenus. Le

protocole

d’immunisation court ainsi que

l’utilisation de la voie locale nous ont

per-mis de sélectionner des AcM reconnaissant

différents organes

parasitaires.

Les

résul-tats

_présentés

_regroupent

les

_analyses

por-tant sur 40 de ces AcM.

_Cinq

AcM ont

_réagi

avec la seule

_espèce

T5 constituant des marqueurs

d’espèce

simples

à utiliser.

Références

Despommier DD (1990) Trichinella spiralis: the worm

that would be virus. Parasitoi _{Today 6. 193-196} Soulé C, Dupouy-Camet J, Ancelle T, Bouree P,

Tou-ratier L (1991) La trichinellose, une zoonose en évo-lution. OIE-CNEVA, Paris

Soulé _{C (1992)} Trichinellosis in France. _{Wiad Parazytol}

38, 3-4