L La recombinaison illégitime dans les cellules de mammifère

986

SYNTHÈSE

médecine/sciences 1 994 ; JO : 986-94

Anne Stary

ADRESSE

---•

A. Stary : chargée de recherche a u Cnrs. Laboratoire de génétique moléculaire, Institut de recherches sur le cancer, 7, rue Guy-Moquet, 94800 Villejuif, France.

La recombinaison illégitime

dans les cellules

de mammifère

La recombinaison illégitime (ou non homologue ) est

un

pro­

cessus cellulaire conduisant à la réunion de deux fragments

d'ADN ne présentant pas ou très peu d'homologie de sé­

quence. Elle est à l'origine de diverses anomalies du gé­

nome (délétion, insertion, translocation, amplification gé­

nique, intégration virale) impliquées dans l'apparition de

maladies génétiques ou le développement tumoral. Elle per­

met l'élimination des cassures double-brin accidentelles de

la chaîne nucléotidique, consécutives à des erreurs du méta­

bolisme normal de l'ADN (réplication, transcription, répara­

tion) ou à la présence de lésions sur l'ADN produites par les

agents génotoxiques. Certains motifs (séquences répétées

de type

A l u,

palindromes, séquences alternées de purines­

pyrimidines, site de clivage des topo-isomérases ... ) seraient

des points chauds de recombinaison illégitime, régions fra­

giles ou séquences régulatrices plus accessibles aux nu­

cléases capables d'introduire des cassures dans l'ADN.

L

a recombinaison génétique

désigne n'importe quel pro­ cessus au c o u rs d u q u e l l'interaction d 'au moins deux éléments différents d ' acide nucléique a pour conséquence un changement dans la liaison physique de gènes ou de parties de gènes. La nature des séquences qui interagis­ sent permet de distinguer trois types de recombinaison : ( 1 ) la recombi­ naison générale (ou homologue) qui nécessite une identité importan te en tre les séquences qui in teragis­ sent ; (2) la recombinaison spéciali­ sée qui intéresse des séquences

RECOMBINAISON HOMOLOGUE : au moins 1 4 nucléotides consécutifs communs entre les deux séquences parentales {P1 et P2) impliquées au site de recombinaison isolé dans la séquence réarrangée (R).

A P l GCTCATTGCAGTGGTACCGGTAATATGGGACGTT . ... . . .. . .

R GCTCATTGCAGTGGTACCGGTAAACTCGGATCCG

. . . . . . .. .... . .. . . .

P2 TGTAAGTGTAGTGGTACCGGTAAACTCGGATCCG

RECOMBINAISON NON-HOMOLOGUE : pas ou peu de nucléotides consécutifs communs entre les deux séquences parentales {P1 et P2) impliquées au site de recombinaison isolé dans la séquence réarrangée (R).

8 P l TTAGCTCATTGCAGTGGTAATCGTAGCCAAGCGG

R TTAGCTCATTGCAGTGGTACCGGTAAACTTGGAT

P2 GACTGTAAGCGTAATGGTACCGGTAAACTTGGAT

c Pl TTAGCTCATTGCAGTGGTAATGCCAGCCATGCGG R TTAGCTCATTGCAGTGGCGCCGGTAAACTTGGAT P2 GAATGTCTATGTAACCTCGCCGGTAAACTTGGAT

D Pl TAGCTCATTGCAGTGG CACTCCTCGCCATGC R TAGCTCATTGCAGTGGATCTACCGGTAAACTTGG P2 ACTGTAAGCGTAGTTC TACCGGTAAACTTGG

des phénomènes de recombinaison nécessite donc la détermination du degré d'homologie entre les deux séquences d'ADN impliquées au site de recombinaison (figure 1). Trois types de jonctions de recombinaison illégitime sont possibles suivant qu'il existe, sur le site de recombinaison, quelques nucléotides communs aux deux séquences recombinées (figure lB), aucun n ucléotide com­ mun aux deux séquences réarran­ gées (figure l C) ou des nucléotides supplémentaires n'étant auparavant présents sur auc u n e d e s d e ux

séquences impliquées dans la jonc­ tion de recombinaison (figure lD). L ' e xpression « très peu d ' h o­ mologie ,, est i mprécise e t n ' est généralement définie que par rap­ port à l 'identité minimale nécessaire à l a recombin aison homologue. Dans les cellules de mammifère, par reconstitution d'un gène à partir de deux copies tronquées de ce gène c o n t e n a n t de m o i n s en m o i n s d ' identité en tre elles, le nombre minimal .de nucléotides consécutifs identiques nécessaire à la recombi­ naison homologue est estimé à qua­ torze pour la recombinaison

intra-Figure 1 . Exemples de jonctions de recombinaison homologue et non homologue. Les points indiquent les n ucléotides c o m m uns a ux deux s é q u e n ces impliq uées da n s la recom binais o n . L es bases c o m ­ munes à la jonction d e recombinai­ son sont soulignées et les nucléo­ tides supplémentaires à cette jonc­ tion sont en gras. Les nucléotides en rouge correspondent a ux n ucléo­ tides communs aux deux séquences parentales.

moléculaire [ 4] et a VIngt-cinq pour la recombinaison intermoléculaire [5] (figure lA). La définition de la recombinaison i llégitime pou rrait donc s'appliquer à tout phénomène de réarrangem e n t e n tre des sé­ quences présentant moins de quator­ ze nucléotides consécutifs identiques au site de recombinaison ou dans les séquences proches de ce site (figures lB, l C, lD) . Cependan t, dans les cellules de mammifère, toutes les jonctions d e recombinaison non homologue, répertoriées en tant que telles dans la l ittérature, ne fon t intervenir a u plus que sept nucléo­ tides consécutifs d 'identité [ 1 ] .

Dans les cellules de mammifère, en utilisant des modèles d'étude per­ mettant de différencier les réarran­ gements de type homologue ou non h o m o l o g u e , il a p paraît q u e l a recombinaison illégitime se produit avec une fréquence plus élevée que la recombinaison homologue. Ainsi, le principal mode d'intégration dans le génome d'une séquence exogène et homologue à un gène cellulaire n'est pas le remplacement du gène endogène par recombinaison homo­ logue (recombinaison ciblée) mais l'intégration au hasard de la séquen­ ce par recombinaison illégitime et ce, avec une fréquence cent à mille fois supérieure [ 2 ] . La recombinai­ son illégitime est également la règle générale d a n s d e s sys t è m e s d e recombinaison extrachromosomique lorsque les conditions expérimen­ tales permettent de différencier les deux types de recombinaison [6] . La recombinaison i llégitime est donc un processus cellulaire i mportant dans les cellules de mammifère, qui peut être à l'origine de diverses ano­

malies du génome entraînant l'appa­ rition de maladies génétiques ou le développement tumoral . De plus,

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e l l e représente u n c o m p é t i t e u r majeur vis-à-vis d e s processus d e recombinaison homologue néces­ saires dans certains types d'expé­ r i e n c e s , telles q u e l a t h é r a p i e génique.

1

Conséquences biologiques et mécanismes de la recombinaison illégitime U n e des hypo thèses q u a n t a u x conséquences biologiques d e l a recombinaison illégitime est qu'elle permettrait une meilleure survie des cellules endommagées grâce à l'éli­ mination des cassures double-brin accidentelles de la chaîne nucléoti­ dique, consécutives à des erreurs du m é tabolisme normal de l 'A D (réplication , transcription , répara­ tion ) . Elle peut ê tre considérée comme un mécanisme de sauvegar­ de cellulaire permettant de réparer les coupures double-brin acciden­ telles au prix de la production de chromosomes endommagés.

La recombinaison i l légitime est impliquée dans différents types de réarrangements ( délétions, inser­ tions, translocations, amplifications géniques, intégrations virales) . Cela

implique que, sous le terme « recom­

binaison illégitime >>, sont regroupés des p h é n o m è n e s ne fai s a n t pas nécessairement appel à des méca­ n ismes moléculaires identiques. Un modèle de recombinaison développé pour un type de remaniement ne peut pas être automatiquement éten­ du à l'ensemble des phénomènes de recombinaison non homologue. I l n'existe donc pas d e modèle général de la recombinaison illégitime. U n processus en d e ux é tapes a cependant été proposé [ 2 ] , dans lequel des extrémités d 'AD sont d'abord créées puis réunies dans un second temps. Il pourrait donc exis­ ter des points communs aux diffé­ re n ts types de réarrange m e n ts , comme des facteurs provoquant l a cassure d e l a chaîne nucléotidique ou ceux permettant la réunion de deux extrémités créant une nouvelle séquence d 'AD . Par ailleurs, en s'appuyant sur l'analyse précise des jonctions impliquées dans les délé­

tions, Meuth [ 1 ] a constaté que

celles-ci présentaient, le plus sou­ vent, des nucléotides ·communs aux deux séquences parentales réarran­ gées ( 2-7 nucléotides) . Il a proposé quatre mécanismes de délétions simples (figure 2) basés sur l'apparie­ ment de petites séquences, répétées directes et éloignées, qui provoque­ rait la perte du matériel génétique localisé entre ces répétitions et la conservation, au site de recombinai­ son, de l'une de ces répétitions. On trouve ainsi l'échange intrachromo­ somique conduisant à la formation d'ADN circulaires extrachromoso­ miques (figure 2A), le crossing-over inégal entre courtes répétitions se trouvant sur deux brins d'ADN non liés (figure 2B), l 'erreur d'apparie­ ment de répétitions par glissement de l'un des brins de la double hélice lors de la réplication (figure 2C) et la dégradation exonucléasique de part et d'autre d'un point de rupture de la double hélice suivie d'une réasso­ ciation au niveau de petites répéti­ tions directes (figure 2D).

L ' an alyse e x p é r i m e n tale de l a recombinaison illégitime dans les cellules de mammifère n écessite, d'une part, l'isolement et la caracté­ risation moléculaire des jonctions de recombinaison engendrées par diffé­ rents types de réarrangement, dans différents systèmes et, d'autre part, la comparaison des séquences impli­ quées directement au site de recom­ binaison et dans les régions proches de ce site afin de déterminer des fac­ teurs communs susceptibles d'être responsables de la recombinaison non homologue. Les séquences du site de recombinaison et celles des deux régions parentales avant le réarrangement doive n t donc être déterminées afin de décider si le réarrangement est issu d'une recom­ binaison i llégitime . Du fait de la complexité du génome des mammi­ fères, les modèles d'étude sont large­ ment dépendants du développement de techniques d'analyse moléculaire des gènes eucaryotes et des difficul­ tés à cloner les régions génomiques réarrangées. C'est pourquoi l'étude des réarrange m e n ts n o n h o mo­ logues est, à l 'heure actuelle, limitée à des gènes de séquence nucléoti­ dique connue dont l 'altération ou l ' activation provoque l 'apparition d'un phénotype identifiable et sélec­ tionnable.

a -+ • <l-b -+ c •

<l-�

Appariement des petites répétitions directes c Echange

�

intrachromosomique et formation d'ADN extrachromosomique

0

a c • <l-1 a -+ b

4

c • • <l-

<l-�

Réplication 1 2 a -+ b -+ c • ---A c

1

A

:

riement des petites

f

_{répétitions directes par}

�m

oo< do " �""'

�

Réplication

Jl

<l-1

Coupure de la

f

boucle et réparation a

!._.

c _ _ _ _ _ _ _ _ JI[ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ <l-b

�

a a -+ b -+ c B • • <l- <l-a' -+ b' -+ c' • • <l-

<l-�

Appariement des petites répétitions directes a -+ b -+ c • • <l- <l-a' -+ b' -+ c' • • <l-

<l-�

Echange interchromosomique inégal -+ b _-+ b' _-+ c' • • • <l- <l- <l-a' -+ c • <l-D a -+ b -+ c • • <l-

<l-�

Cassure double-brin a -+ -+ c • • <l-

<l-�

Dégradation exonucléasique et alignement des petites répétitions directes

__f_

-+_{..o.----=-c­} •

a

�

Coupure des extrémités, remplissage des brêches et ligation

c

•

<l-1

Les modèles d'étude

des jonctions de recombinaison illégitime

Des jonctions de recombinaison illé­ gitime o n t été m i se s en évide n c e , dans l e s cellules germinales, lors d e réarrangeme n ts génomiques ayant entraîné l 'apparition de maladies gé­ nétiques h é ré d i taires. C e l a a tout d'abord été étudié chez les patients atteints de thalassémie [ 7 , 8] ou de persistance héréditaire de l ' hémoglo­ bine fœtale [ 9 ] . Plus récemment, la disponibilité de sondes moléculaires pour un nombre plus importan t de maladies génétiques ( hypercholesté­ rolémie familiale, dystrophie muscu­ l a i re de D u c h e n n e . . . ) a p e r m i s d ' accroître l e n ombre de données concernant ces réarrangements qui sont pri n c i palement des délétions. Bien que deux cas de recombinaison homologue aient été décrits [ 1 0, 1 1 ] , ce sont essentiellement des réarran­ gemen ts par recombinaison illégi­ time qui seraient à l ' origine de l ' ap­ pari tion de m a l a d i e s g é n é t i q u e s , lorsque celles-ci n e s o n t pas dues à des mutations ponctuelles ou à des expansions de courtes séquences ré­ pétées.

Certaines tumeurs peuvent être liées à des translocations d'on cogènes dominants (gènes c-MYC et c-ABL) ou de gènes potentiellement onco­ g é n i q u e s ( g è n e s J'A L-I e t MET

[ 1 2] ) . Les gènes des immunoglobu­ lines et des récepteurs des lympho­ cytes T sont fréquemment impliqués dans ces réarrangements en tant que Fig u re 2. Modèles de formation des délétions chromosomiques simples. Ces m o dè les s o n t basés s u r la présence des petites séquences ré-pétées directes (

.

_<!-) s u r les deux

partenaires de la recombinaison. Le trait en pointillé indique le brin en cours de réplication. A : échange in­ tra c h ro m o s o m iq u e et fo rma tion d 'ADN circulaire extra c h ro m oso­ mique ; 8 : crossing-over inégal entre courtes répétitions sur deux brins d'ADN non liés ; C : erreur d'apparie­ ment de répétitions par glissement de l'un des brins lors de la réplica­ tion ; D : dégradation exonucléasique de part et d'autre d'un point de rup­ ture double-brin et réassociation au n iveau de p e tites répé titions

di-rectes.(D'après Meuth [ 1].)

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sée. De plus, les séquences << signal '' complètes de la recombinaison spé­ cialisée ne sont pas nécessairement retrouvées sur les deux séquences parentales impliquées dans la recom­ binaison illégitime. Des erreurs lors du processus normal de recombinai­ son des immunoglobulines semblent également être la cause de transloca­ t i o n s c h ro m osom i q u e s c h e z les malades atteints d'ataxie télangiecta­ sie (AT) [ 1 8, 1 9 ] . L'analyse molécu­ laire d ' une translocation chez un malade AT atteint d'une leucémie des cellules T a permis d'identifier des séquences << signal " de la recom­ binaison spécialisée V-(D):J dans les deux régions impliquées dans l a translocation [ 19] . Les erreurs d e ce système de recombinaison ne sont pas limitées aux gènes des immuno­ globulines. En effet, en étudiant les d é l é t i o n s dans l e g è n e HPRT h u m a i n ( hypoxan t h i n e-gu a n i n e phosphoribosyltransférase) dans des lymphocytes T fœtaux, Fuscoe et al. [20 ] ont montré que les réarrange­ m e n ts non h omologues dans ce gène << de ménage " seraient égale­ ment provoqués par les recombi­ nases impliquées dans le système de recombinaison V-(D):J .

Dans les cellules de mammifère en culture, la sélection de phénotypes particuliers (résistance à des médica­ ments, transformatio n ) a permis d ' identifier, dans des gènes cellu­ laires [ 1 , 2 1 , 22] , des réarrange­ ments génomiques dans lesquels des jonctions de recombinaison illégiti­

me ont été décrites.

L'utilisation de sondes exogènes,

comme des virus ou des plasmides, a permis de déterm i n e r u n grand nombre de jonctions de recombinai­ son illégitime, soit de façon expéri­ mentale dans les cellules en culture [ 23] , soit au sein d'un organisme comme c'est le cas de l'intégration de certains virus dans les cellules humaines (virus d'Epstein-Barr [24] , virus de l 'hépatite B [25] ) . Ainsi , l'insertion de séquences virales dans le génome des mammifères s'effec­ tue généralement de manière non homologue au hasard dans le géno­ me [ 26] . Il faut, cependant, noter le cas de l'intégration des AAV (adeno­ associated virus) dans une région spé­ c ifi q u e d u g é n o m e h u main au niveau du chromosome 19 dans la bande 1 9q 1 3. 4-ter. L'analyse molécu­ laire des séquences impliquées a révélé que cette intégration ciblée s'effectuait néanmoins par recombi­ naison non homologue [27] . Enfi n , l ' u ti l isation d ' e xtraits nu­ cléaires de cellules humaines a per­ mis de caractériser précisément les proprié tés de refe r m e ture par recombinaison illégitime de molé­ c u l e s c o n t e n a n t d e s coup ures double-brin à des sites connus et d ' isoler certaines protéines impli­ quées dans ce processus [28, 29] .

1

Factf!urs �ommuns

aux JOnctions de recombinaison illégitime

Au point exact des sites de recombi­ naison, il n 'existe pas de séquence nucléotidique impliquée de manière préfé re n t i e l l e a u x j o n ctions de recombinaison non homologue [28-3 1 ] . Les cellules de mammifère ont en effet une capacité remarquable à joindre n'importe quel type d'extré­

mités. I l n ' est donc pas éton nant q u ' a u c u n e s é q u e n c e p r i m a i r e consensus n 'ait été rapportée, quel que soit le type de réarrangement ou le modèle d'étude.

pour créer un site de recombinaison illégitime puisque leur présence est loin d'être évidente dans tous les cas. Ainsi, comme l ' illustre le Tableau 1, le me mb re de la fam i l l e de é­ quence répétées de type A lu son t fréquemment retrouvés aux sites de recom binaiso n , so i t sur 1 ' u n e des deux équences impliquées, soit sur les deux et dans les différe n ts m o­ dèles d'étude des réarrangements par

recombinaison illégitime. La famille des séquences courtes répétées de typ e A lu [ 3 2 ] fai t partie des sé­ quences dispersées moyennement ré­ pétées dans l e génome de certains m a m m i fè r e s . Ces r é p é t i t i o n s de 300 pb son t retrouvées en moyenne toutes les 5 000 paires de bases dans le génome humain. Elles sont essen­ tiel lement distribuées au h asard le long du génome, bien qu' il existe des

Tableau 1

concen tration de répétitions A lu dans certaines régions. Les répéti­ tions de type A lu son t notamment caractérisées par la présence d ' une u n i t é p r o m o tr i c e r e c o n n ue par l 'ARN polymérase I II et d'une queue poly (A) à l e u r termin aison ; e lles sont, de plus, bordées par de courtes séquences répétées directes. Ces ca­ ractéristiques ont permis de suggérer que ces répétitions seraient des

élé-MOTIFS COM M U N S A CERTAIN E S SÉQUENCES RÉARRANGÉES

PAR RECOMBINAISON ILLÉGITIME

Motifs Types de Gène ou sonde Maladie

réarrangement

Délétion a-globine a-thalassémie

�-globine �-thalassémie

Récepteur des LDL Hypercholestérolémie familiale

Inhibiteur du composé C1 Angioedema héréditaire

du complément

Séquences HPRT

répétées

de type Alu Insertion E BV

Plasmide SV40/EBV Plasmide SV40 Plasmide Ad-5/SV40 Excision Plasmide SV40

Amplification am pd

Délétion a-globine a-thalassémie

�-globine �-thalassémie aprt

Séquences

palindromiques Insertion Polyome

Excision Plasmide SV40

Amplification am pd

Séquences Délétion SV40

alternées Insertion aprt

de purines- Excision _{Translocation} Plasmide SV40 _{BCL-2 Lymphome folliculaire}

pyrimidines _{Leucémie aiguë des cellules T}

Délétion SV40

Site de clivage Insertion Gène de la DMD Dystrophie musculaire de Duchenne

des Polyome

topo-isomérases SV40

1 et Il Translocation ALL-1/AF-9 Leucémie myéloïde aiguë

Amplification am pd

Séquences Insertion Plasmide SV40

riches en

nucléotides AT Amplification am pd

LDL : lipoprotéines de faible densité ; H PRT : gène de l'hypoxanthine phosphoribosyl transférase. EBV : virus d'Epstein-Barr ; SV40 : virus simien 40 ; Ad-5 : adénovirus-5.

am pd : gène de l'adénylate désaminase ; a p rt : gène de l'adénine phosphoribosyl transférase.

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E n raison du n o m bre é l evé d e copies d e ces répétitions l e long du génome humain, leur implication lors de la recombinaison est contro­ versée. Divers auteurs leur attribuent un rôle dans le processus de recom­ bin aison [ 7 , 3 3 , 34] , tandis que d'autres ne veulent pas généraliser leur importance [8] . Cependant, les cartes de distribution des délétions par rapport aux répétitions Alu dans le gène de l'a-globine [7] et dans le gène du récepteur des lipoprotéines de faible densité [35 ] , montrent que les points de cassure des remanie­ ments coïncident le plus souvent avec la position des séquences répé­ tées Alu.

U n e i n stab i l i té gén é t i q u e a é té observée dans des régions riches en séquences A lu [ 3 6] . Du fai t de l ' hypothèse de la mobilité de ces séquences, les régions aptes à inté­ grer des séquences Alu pourraient correspondre el les-mêmes à des zones préférentielles de recombinai­ son. Dans les régions réarrangées, les séquences A lu seraient révéla­ trices de l ' instabilité de la région plutôt qu'instigatrices de la recombi­ naison [ 37] . Il faut ajouter que la recombinaison n 'implique pas néces­ sairement un alignement entre les répétitions A lu puisque les deux séquences parentales impliquées ont rarement, toutes les deux, ces répéti­ tions au point de recombinaison ou dans les régions proches de ce site. Cependant, on ne peut pas exclure que, dans certains cas, on soit en présence de recombinaison homo­ logue entre séquences homologues, comme dans la levure [38] .

Les séquences répétées inversées adjacen tes ( séquences p a l i n d ro­ miques) qui pe uve n t former des structures secondaires cruciformes (ou en épingle à cheveux) ont été iden tifiées (Tableau I) dans d e s séquences parentales i m pliq uées dans le réarrangement mais aussi dans certaines séquences réarran­ gées. Bien qu'il n 'y ait pas de preuve directe pour la formation de ces structures cruciformes in vivo, leur participation lors de réarrangements par recombinaison illégitime est for­ t e m e n t suggérée [ 1 , 2 1 , 3 9 ] . Différentes hypothèses sur le rôle de

ces structures o n t e te avancées, comme celle de sites d'arrêt pour la progression de la fourche de réplica­ tion conduisant à des erreurs au cours de la réplication [ 2 1 , 39] et celle de sites de reconnaissance pré­ férentielle de n ucléases qui pour­ raient in troduire des cassures ini­ tiant ainsi la recombinaison [ 1 ] .

De longues alternances de purines­ pyrimidines ont également été mises en évidence aux points de cassure de translocations chromosomiques [ 40 , 4 1 ] ainsi que dans d ' autres modèles d 'étude de la recombinai­ son i l l é g i t i m e (Ta blea u !) . Les séquences alternées purines-pyrimi­ dines ont ceci de particulier qu'elles peuven t potentiellement adopter une structure en hélice tournant à gauche, ou ADN de forme Z. L'im­ plication de la structure potentielle en AD -Z dans la recombinaison illégitime résulterait d'un change­ ment de la structure de la chromati­ ne provoquant l'accès de l 'ADN aux enzymes impliquées dans la recombi­ n aison [ 40-4 2 ] . La fragi l i té des

séquences aux jonctions ADN-B 1

ADN-Z pourrait aussi provoquer une augmentation des cassures de l'ADN dans ces régions [ 43] .

L'intervention possible des topo-iso­ mérases (enzymes capables de modi­ fier l'état de superhélicité de l'AD et qui catalysen t des réactions de << coupure-fermeture , des liaisons phosphodiesters dans l 'AD ) dans les processus de recombinaison illé­ gitime fut suggérée par les travaux de Bullock et al. [ 44] . Ces auteurs ont observé une colocalisation entre les sites de recombinaison produits in vivo lors de l'excision de SV40 du chromosome cellulaire de cellules transformées par ce virus et les sites de clivage in vitro d'une topo-isomé­ rase eucaryote de type I sur l'ADN de SV40. Fondée sur les séquences consensus des sites de reconnaissan­ ce des topo-isomérases déterminés in vitro, la présence de sites de cliva­ ge de topo-isomérases de type I et II dans les séquences réarrangées par recombinaison illégitime est évoquée dans différentes études (Tableau !). Cependant, la comparaion de sites de recombinaison définis in vivo avec des sites de topo-isomérisation in vitro sur de l 'ADN nu n ' a pas grand sens.

A B c D E F

Figure 3. Exemple d'association entre sites de recombinaison illégitime et motifs particuliers d'ADN. Lors de l'exci­

sion d'un plasmide SV40 (A, partie hachurée) intégré dans l'ADN génomique humain (A, partie grise), de nom­ breuses jonctions de recombinaison illégitime ont été mises en évidence. La localisation des séquences impliquées dans ces jonctions est schématisée par les barres rouges en (A). Plusieurs régions présentent un grand nombre de ces séquences recombinées. Ce sont donc des régions de points chauds de recombinaison (bandes rouges verti­ cales). Les motifs retrouvés fréquemment dans des régions de recombinaison illégitime dans les cellules de mammifère ont été recherchés le long des séquences plasmidique et cellulaire. La position des sites de recombinai­ son est comparée à celle de ces motifs : (8) séquences répétées Alu ; (C) séquences palindromiques ; (D) séquences

d'homopurine-homopyrimidine ; (E) séquences alternées purine-pyrimidine ; (F) sites de reconnaissance de la topo­ isomérase 1.

naison non homologue. Ils ont pro­ posé un modèle dans lequel l'enzy­

me lierait l 'AD sous forme d 'un

complexe dimérique, couperait les deux brins d'AD , en formant une structure intermédiaire qui pourrait s'associer à un autre complexe dimé­ r i q u e l i é à u n e a u tre m o l é c u l e d'AD . L a dissociation de c e com­ plexe tétramérique provoquerait l ' éc h ange d ' u n e sous-u n i té pro­ téique, entraînant un échange entre les deux doubles brins d'AD .

Des segments riches en nucléotides A et T (Tableau I) ont été identifiés également dans des régions impli­ quées dans la recombinaison illégiti­ me. En particulier, il a été constaté que les répétitions A lu, élémen ts potentiellement mobiles, sont situées généralement dans des régions de ce type [32] et que l ' in tégration des rétrovirus dans le génome cellulaire montre également une préférence pour des régions riches en A/T dans la séquence réceptrice [26, 48] .

l'ouverture de la matrice double-brin et par conséquent l'en trée des enzy­ mes de recombinaison , est l 'hypo­ thèse la plus souvent invoquée sur le rôle de ces régions comme substrat préférentiel de la recombinaison illé­ gitime [ 2 1 ] .

Enfin, certaines structures particu­ lières de l 'ADN (comme des élé­ ments d'ADN courbé, conformation de l 'AD se produisant dans des s é q u e n c e s c o n te n a n t des s u i tes d'oligo (dA)-oligo (dT) et provoquant des courbures de l 'ADN en défor­ mant l'axe de la double hélice) ont été mises en évidence à proximité de régions génomiques réarrangées par recombinaison illégitime [ 49] .

1

Conclusion

La caractérisation des sites de recom-binaison non homologue et des

ré-gions proches de ces sites a permis de m ettre en évidence le fait q u e des

séquences particulières, comme les

dans la recombinaison illégitime est très attrayante puisque ces enzymes pourraient catalyser les deux étapes nécessaires à la recombinaison illégi­ time (cassure puis réunion) [45 ] . En comparant 496 jonctions de recom­ binaison illégitime, Konopka [ 46] a observé que, dans les 1 0 paires de bases adjacentes au site de réarran­ gemen t, 92 % des j o n c t i o n s de recombinaison i l l ég i t i m e c o n te­ naient les sites préfé r e n t i e l s de reconnaissance in vitro pour la topo­

isoméra e 1 de thymus de veau

(CAT, CTY, GTY, RAT où Y est une pyrimidine et R une purine) . Il faut, cependant, souligner que la probabi­ lité de trouver des sites de clivage de la topo-isomérase I dans une séquen­ ce d'ADN est très élevée (un site par sept paires de bases) [ 1 ] . La corréla­

tion << recombinaison illégitime-topo­

isomérase 1 ,, reste donc discutable.

En analysant la recombinaison in vitro entre deux molécules de phage Lambda, Bae et al. [47] ont montré que la topo-isomérase II de thymus

de veau intervenait dans la recombi- La faible énergie de fusion de l'AD riche en A/T qui pourrait faciliter séquences A lu, les séquences palin­dromiques, des alternances purine-

994

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pyrimidine, les site� de reconnai�­ sance des topo-isomerases ou les re­ gions riches en n ucléo�ides .A e� T, é taien t fréquemment I m p l iq u ees. L'hypothèse selon laquelle il e�iste­ rait des séquences plus susceptl.ble.s d 'être réarrangées par recombm al­ son illégitime s'est donc dévelo�pée

[ 1 ] . Ces << points chauds '' sera1en t

des régions fragiles et potentielle­ ment accessibles aux n ucléases ca­ pables d'introduire des cassures de la chaîne nucléotidique, points poten­ tiels d'initiation d'événements de re­ combinaison non homologue.

L'hypothèse de la << config�ration o�­

verte de l'ADN , comme CJble des re­ arrangeme n ts est le pl us so�ve � t avancée. Cette hypothese est etayee par plusieurs observations, bien. qu� son implication dans la recombmal­ son i llégitime ne soit pas certaine

puisque toutes les séque��es

�

e réa�­

rangement n ' o n t pas e te determl­ nées. Ainsi, les rétrovirus s'intègrent préférentiellement dans des régions sensibles à l ' ac tion de la D N ase 1 [50] . De même, il existe une corréla­ tion directe entre les sites chromoso­ miques fragiles [ 5 1 ] et l'in tégration de virus à AD dans des tumeurs hu­ maines ou dans des cellules transfor­

mées en culture. La stru c ture de la

chromatine peut également jouer un rôle comme cela a été proposé pour la formation des grandes délétions intra­ chromosomiques [ 7, 8] . Les régions permettant l'attachement des boucles de c h romosomes à la matrice n u­ cléaire, régions MAR (matrix associa­ tion region) riches en nucléotides A/T et contenant des sites de fixation et de

clivage de la topo-isomérase I I ainsi

que, probablement, les sites d'attache­ ment des enzymes de réplication, de transcription et de réparation, pou�­ raient constituer une des classes de se­ quences cibles de la rec?mbinaison illégitime comme le suggerent Sperry et al. [52] .

En conclusion , on peut envisager que des connaissances plus appro­ fondies sur les mécanismes impli­ qués dans la recombinaison illégiti­ me permettro n t de m i e u x com­ prendre pourquoi ce type de reco�­ binaison prédomine sur la recombi­ naison homologue dans les cellules de mammifères et ainsi de mieux orienter les techniques pour l 'inté­ gration de gènes dans le cas de la thérapie génique •

Summary

Illegitimate recombination in mammalian cells

I llegitimate recombination, defi­ ned operationally as the cellular process leading to the joining of DNA sequences with little or no homology, is often used in mam­ malian cells. This recombination process is involved in a variety of DNA rearrangements including deletion, insertion, chromosomal translocation, gene amplification and viral integration. These DNA modifications can produce several cellular abnormalities eventually Ieading to specifie genetic di.sease.s or to carcinogenesis. The bwlogl­ cal role and the molecular events that underlie this process are still unclear but illegitimate recombi­ nation may arise primarily from errors of DNA metabolism, that is, as mistakes in replication, repair or transcription. Severa! illegitima­ te recombination junctions from a variety of sources have been analy­ sed at the DNA sequence leve!. In sorne cases, this revealed the pre­ sence of sorne features, such as me rn bers of interspersed repetitive DNA families, i nverted repeats, alternating p u r i n e / pyri m idine runs, topoisomerase cleavage sites. This suggests that specifie geno­ mic regions could be prone to be i m p l i cated i n t h e i l l e g i t i mate recombination process.

Remerciements

L'auteur remercie Alain Gentil, Michel Lacasa et Alain Sarasin pour leurs cri­

tiques et leurs conseils pendant

�

a pré­

paration du manuscrit de cet article.

TIRÉS A PART

---A. Stary.