TP14 PRODUCTION D'ETHANOL PAR SACCHAROMYCES CEREVISIAE
ORGANIGRAMME
Pré culture levure de boulangerie
↓
Ensemencement d'un milieu glucose et culture pendant 4 heures
↓
Prélèvements d'échantillons toutes les 30 min
↘
Détermination de la biomasse par turbidimétrie
↘
Dosage du substrat (glucose) par colorimétrie (3-5 DNS) ou GOD
↘
Dosage d'un produit apparu (éthanol) par CPG
1. Culture
1.1. Préculture (déjà réalisée)Réaliser en eau distillée une suspension non aseptique de levure de boulangerie à environ 25g en masse humide pour 100mL d'eau stérile (42g / 180mL).
1.2. Conditions de culture
** en fiole anaérobie : l'anaérobiose est réalisée après ensemencement par addition d'huile de vaseline à la surface du milieu.
** à 35°C
** sous agitation modérée (bain-marié agité)
** milieu de culture :
S1 : - extrait de levure 2,5g
- KH2PO4 12,5g
- (NH4)2SO4 0,3 g
- eau distillée qsp 150 mL - 1 barreau aimanté
Stérilisé 20 min à 100°C
S2 : - solution de glucose à 10g dans 50mL d'eau, stérilisée par filtration. Le milieu de culture est obtenu en ajoutant aseptiquement 50 mL de S2, aux 150 mL de S1 avant l'ensemencement.
1.3. Culture
Ensemencer 200 mL de milieu complet avec 25mL de la suspension de levure (préculture) dans une fiole de 250 mL. Ajouter l'huile de vaseline jusqu'au col de la fiole (environ 3 à 4 cm de hauteur).
Suivre la croissance par analyse d'échantillons prélevés (~ 2 mL), après homogénéisation sur agitateur magnétique (répétabilité des conditions de prélèvement), dans des conditions stériles, aux temps : 0 ; 30
; 60 ; 90 ; 120 ; 150 ; 180 ; 210 ; 240 min.
Centrifuger de suite, en petits tubes eppendorf, si ~1ml, 5 min, à vitesse maximum. Conserver le surnageant dans un tube bouché, dans la glace, avant dosage d'éthanol et glucose.
1.4. Dosages
1.4.1. Détermination de la biomasse par turbidimètrie
Sur 1 mL de prélèvement (si mesure différée, ajouter une goutte de formol pour arrêter la croissance, et) mesurer, si nécessaire après dilution, le logarithme du rapport de la lumière incidente sur la lumière transmise (assimilable à l'absorbance lorsque la mesure s'effectue avec un spectrophotomètre d'absorption moléculaire) à 600 nm contre un blanc constitué de milieu de culture non ensemencé, à la même dilution que le prélèvement.
Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 1/4
En déduire la concentration en biomasse sachant qu'une variation "d'absorbance" de 1 à 600nm, correspond à une variation de biomasse de 0,7 g/L. (Avec A compris entre 0,1 et 0,7 selon L.T St Louis et A compris entre 0,05 et 0,2 selon IBSG de Bx II). Se placer dés la première mesure à une dilution utilisable pendant les 4 heures.
1.4.2. Dosage du glucose
Utiliser la méthode à la GOD en adaptant la fiche technique.
Exprimer le résultat en grammes de glucose par litre de milieu.
1.4.3. Dosage de l'éthanol
Utiliser la méthode par CPG avec étalonnage interne avec du propan-1-ol. (Voir fiche jointe).
Exprimer le résultat en grammes d'éthanol par litre de milieu.
2. Résultats
2.1. Dresser un tableau complet des résultats 2.2. Cinétique de croissance
Tracer la courbe A = f(t) (ou biomasse en g/L) pour la culture non diluée ; .
Tracer la courbe In A = f(t) et déterminer les éventuelles phases de croissance (si elles apparaissent de manière évidentes car l'incertitude sur une telle mesure est supérieure" à 10% !). Calculer le temps de génération.
2.3. Cinétique d'utilisation du glucose
Tracer la courbe de consommation du glucose. S = f(t) sur le même graphe que A = f(t) en adaptant l'échelle.
2.4. Cinétique de production d'éthanol
Tracer la courbe de production d'éthanol. P = f(t) sur le même graphe que A et S = f(t).
De quelle classe de métabolite fait-il partie ?
3. Bilans
Calculer le rendement de transformation du glucose en éthanol, et comparer au rendement théorique.
Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 2/4
DOSAGE DE L'ETHANOL PAR C.P.G.
1. CONDITIONS OPERATOIRES :
* Colonne capillaire DB WAX (polaire)
* Gaz vecteur : Azote à un débit de 1 mL/mn (140 kPa)
* Gaz de la flamme du détecteur (FID° : - Hydrogène/ Air
* Températures : - injecteur : 250°C - four : 110°C - détecteur : 250°C
* Logiciel azur : atténuation 512
* Volumes injectés : 1µL mesurés à la seringue "Hamilton"
2. ETALONNAGE :
Le solvant utilisé est l'eau déminéralisée. Conserver toutes les solutions en flacons, fioles ou tubes bouchés et dans la glace.
Préparer par pesées (précises), 2 solutions étalon contenant environ 0,2 g d'éthanol ou de propan-1-ol pour 100 mL (soit 2 g/L ; ou utiliser les solutions déjà préparées). A partir de ces 2 solutions préparer une solution exacte à environ 1 g/L d'éthanol et de propan-1-ol (mélange volume à volume ; ex : 100µL).
Injecter cette dilution dans le chromatographe. (Noter les temps de rétention). Établir le rapport : Surface du pic de l'éthanol
Rs = --- Surface du pic du propan-1-ol
3. PREPARATION DE L'ECHANTILLON :
Réaliser une dilution, dans l'eau déminéralisée, de l'échantillon à analyser, dilution telle que la teneur présumée en éthanol soit comprise dans la zone de linéarité de la fonction 'd'étalonnage (de 0,1 à 2 g/L). Pour cette dilution, tenir compte de l'ajout de l'étalon interne dans la proportion de 1g pour 1 L de solution (soit une dilution au demi).
Exemple de réalisation à adapter selon les résultats expérimentaux :
Temps de prélèvement t = 0 et 30 min T = 60 à 150 min t= 180 à 300 min
échantillon en µL 100 20 10
eau en µl 80 90
Propan-1-ol en µL 100 100 100
Dilution finale
échantillon 1/2 1/10 1/20
Injecter dans le chromatographe tous les échantillons, correspondant au même temps de culture, sans arrêter l'intégrateur (programmer un run isotherme à 100°C de 30 min et injecter l'échantillon suivant dès la sortie du pic propanol) ; identifier les pics et établir les rapports de surfaces.
En déduire la concentration massique en éthanol des échantillons analysés.
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DOSAGE DU GLUCOSE PAR VOIE ENZYMATIQUE : GOD
1. ETALONNAGE
Protocole général : dans un tube à hémolyse ou une cuve de spectrophotomètre :
• à 100µL d'eau, d'étalon ou d'essai,
• ajouter 1 mL de réactif à la GOD,
• et 1 mL d'eau déminéralisée.
Réaliser 2 étalons identiques à 1 mmol/L; (valider selon ISO 5725-6 (manipulation peu coûteuse) avec un CV de 1,5% ).
Lire, au spectrophotomètre à 505 nm, contre un blanc réactif après 20min à température ambiante ou 10 min à 37°C. La coloration est stable 30min.
2. DOSAGES
Calculer la concentration massique et molaire en glucose du milieu à t = 0.
En déduire la dilution de la prise d'essai d'échantillon pour t = 0 et évaluer les dilutions des prises d'essai pour les temps ultérieurs.
Réaliser les essais comme les étalons, soit :
• à 100µL d'eau, d'étalon ou d'essai,
• ajouter 1 mL de réactif à la GOD
• et 1 mL d'eau déminéralisée.
Lire, au spectrophotomètre à 505 nm, contre un blanc réactif après 20 min à température ambiante ou 10 min à 37°C. La coloration est stable 30 min.
En déduire la concentration massique en glucose des échantillons analysés.
Donnée : dans les conditions opératoires décrites, la concentration de l'essai doit être comprise entre :
• limite de quantification 0,015 mmol/L (3 mg/L)
• limite supérieure de linéarité 2,22 mmol/L (0,4 g/L)