Correction mai 2009
Pour répondre à ce sujet, il fallait connaître un peu de biologie des apicomplexa. Notez que les peptides cycliques des champignons ne sont pas synthétisés via la traduction (cf chapitre des métabolismes secondaires) et qu'il ne servait à rien de m'expliquer comment on montre le rôle de FR235222 en tant qu'inhibiteur de HDAC. Connaître la structure et le rôle de la chromatine aidait fortement à résoudre le problème...
- Pour montre le rôle inhibiteur du peptide cyclique, il suffit d'incuber des fibroblastes humains préalablement infectés par divers apicomplexans (dont un plasmodium et T.
gondii) en présence et en absence du peptide. Il est alors facile de compter au microscope le nombre de parasite et suivre ainsi l'évolution de leur population. Un marquage des parasites avec de la thymidine était aussi possible mais moins simple à mettre en oeuvre.
(2 points)
- Pour montrer que le FR235222 est le plus efficace des inhibiteurs, il suffit de répéter l'expérience avec les autres inhibiteurs déjà utilisés et de comparer leurs effets avec FR235222. (1 point)
- Pour montrer que le génome de T. gondii contient 5 gènes codant pour des HDAC, il suffit de faire un blast sur la banque du génome de ce parasite (dont la séquence complète est connue) en utilisant une séquence protéique de HDAC déjà connue. Notez que l'amplification par PCR avec des amorces dégénérées peut aussi marcher. (2 points)
- Pour montrer que la cible est HDAC3, il existe plusieurs méthodes. La plus simple est de sélectionner des mutants résistants au FR235222 et de séquencer les gènes HDAC de ces mutants. Seules des mutations dans le gène HDAC3 sont trouvées. Plus spécifiquement une mutation de la thréonie 99. Alternativement, on peut déléter les 5 gènes et voir que seule la délétion de HDAC3 entraîne la résistance. Pour mettre en évidence le rôle de la thréonie, il faut alors faire une mutagenèse dirigée de ce résidu et réintroduire l'allèle mutant dans la souche délétée. Contrairement, à l'introduction de l'allèle sauvage, cet allèle ne restaure pas la sensibilité au FR235222 (4 points, Notez que
la formulation du sujet pouvant prêter à confusion, j'ai mis des points aux étudiants qui ont expliqué (correctement) comment mettre en évidence une modification des histones sur le gène HADC3).
- Pour montrer la conservation de la thréonine, il suffit de comparer les séquences protéiques des différentes HDAC avec des logiciels adaptés (clustal par exemple). (1 point)
- Pour voir l'effet sur la différenciation, il suffit de regarder les échantillons de fibroblastes infectés avec et sans peptide au microscope. (1 point)
- Pour voir l'effet sur l'expression de 370 gènes, le plus simple est de faire une analyse du transcriptome avec des puces à ADN représentant la totalité des gènes de T. gondii en hybridant avec des messagers issus de cellules traitées par le FR235222 et de cellules non traitées (2 points)
Ce que l'on pouvait conclure de ces expériences,
- d'un point de vue évolutif, les régulations globales de la différenciation par la structuration de la chromatine semblent générales chez les eucaryotes puisque les apicomplexa qui sont très éloignés des animaux et des plantes présentent aussi ce type de régulation chromatinienne. (2 points)
- d'un point de vue pratique, cette étude montre que des inhibiteurs de HDAC pourraient être utilisé pour traiter de nombreux apicomplexa. Mais, il faut voir si dans le contexte de l'organisme, les produits utilisés qui vont altérer la gestion de la chromatine de l'hôte vont agir de manière désirée, c'est à dire pénétrer jusqu'aux parasites qui sont intracellulaires, sans trop perturber l'organisme humain (ou animal).
De plus, il est déjà possible de voir l'émergence éventuelle de résistance car les parasites mutés pour la théorine 99 sont résistants. Enfin, les souches délétées pourraient être utilisées pour vacciner les populations. (5 points)
