Comparaison de trois tests de toxicité sur bactéries (bioluminescence, respiration, minéralisation du glucose)

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Comparaison de trois tests de toxicité sur bactéries

(bioluminescence, respiration, minéralisation du glucose)

Christine Reteuna

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Christine Reteuna. Comparaison de trois tests de toxicité sur bactéries (bioluminescence, respiration, minéralisation du glucose). Bactériologie. Université Paul Verlaine - Metz, 1988. Français. �NNT : 1988METZ010S�. �tel-01775753�

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-la prévention des risques chimiques à 1'égard de Irenvironnement est i n f é o d é e à 1 t é v a l u a t i o n d e 1 ' é c o t o x i c i t é d e s s u b s t a n c e s c h i m i q u e s ' c e t t e connaissance peut notamment être appréhendée par la réalisation de tests de toxicité aiguë, qui constituent une approche simplifiée des effets à court t e r m e d e s s u b s t a n c e s c h i m i q u e s s u r l e s n i l i e u x é t u d i é s .

P a r m i l e s b i o e s s a i s d e t o x i c i t é a i g u ë a y a n t t r a i t à l r e n v i r o n n e m e n t a q u a t i q u e , I e s t e s t s b a c t é r i e n s s o n t e n c o r e p e u u t i l i s é s e t l e u r s p e r f o r m a n c e s s o n t t r è s p e u c o n n u e s . C o m p t e t e n u d e I ' i m p o r t a n c e q u a n t i t a t i v e e t q u a l i t a t i v e d u m o n d e p r o c a l y o t e , n o u s a v o n s c h o i s i d e n o u s i n t é r e s s e r a u i K e s s a i s d e t o x i c i t é s u r b a c t é r i e s e t d r é t u d i e r l e s p e r f o r m a n c e s d e 3 tests qui diffèrent p a r l e u r s m é t h o d o l o g i e s , à s a v o i r :

- Le test M i c r o t o x d o n t l e p r i n c i p e c o n s i s t e à e n r e g i s t r e r l a luminescence drune bactérie narine, Photobacterium phosphoreum'

- Le test Consonnation dtoxygène de boues activées q u i a f a i t l r o b j e t d r u n e n o r n a l i s a t i o n à I t I S 0 '

- Le test Minéralisation du glucose taux de C0^ libéré est mesuré'

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chez Escherichia coli dans lequel Ie

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A lrissu de ce travair bibliographique, nous avons voulu répondre à un c e r t a i n n o m b r e d e q u e s t i o n s , ê t e n p a r t i c u l i e r d é f i n i r l e s c o n d i t i o n s o p t i m a l e s d e r é a l i s a t i o n d e s t e s t s M i c r o t o x , C o n s o m m a t i o n d r o x y g è n e d e s b o u e s a c t i v é e s e t M i n é r a l i s a t i o n d u g l u c o s e c h e z E s c h e r i c h i a c o l i ; I r i n f l u e n c e d e divers facteurs physico-chimiques, composition du milieu, température d f i n c u b a t i o n , d u r é e d e l r e s s a i " ' a é t é r e c h e r c h é e '

L e s p e r f o r m a n c e s d e s 3 t e s t s d e t o x i c i t é b a c t é r i e n s o n t e n s u i t e é t é déterninées au travers drun screening portant sur 11 substances chimiques choisies parmi les polluants frequemnent trouvés dans lrenvironnement'

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e t a u t e n n e d e c e t t e d i s c u s s i o n , l e s a p p l i c a t i o n s p o s s i b l e s d e s t e s t s Hicrotox, Consonmation dtoxygène des boues activées et Minéralisation du a g l u c o s e o n t é t é ProPosées'

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1 - GENERALITES

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-Ia fabrication, Ie transport et Itutilisation en industrie mais également en agriculture de nonbreuses substances chiniques a pour conséquence une dissénination de ces substances dans lrenvironnement et nota^nment dans Ies milieux aquatiques.

L e s n u i s a n c e s à l t é g a r d d e I a f a u n e , d e l a f l o r e e t m ê n e d e l - ' h o n m e o n t été ignorées pendant de nombreuses années, et ce sont les grandes cetastrophes é c o l o g i q u e s t e l l e s q u e l e s n a r é e s n o i r e s e t l e s i n t o x i c a t i o n s m o r t e l l e s a u c a d m i u m e t a u m e r c u r e s u r v e n u e s a u J a p o n q u i f u r e n t à r t o r i g i n e d r u n e p r i s e d e conscience générale de la gravité des problèmes de pollution.

u n e s é r i e d e m e s u r e s l é g i s l a t i v e s o n t ê t ê p r i s e s p a r l e s p o u v o i r s publics, dont les plus importantes au niveau national concernent :

la polrution des eaux, loi du 16 décembre 116{, qui règremente les d é v e r s e m e n t s e t r e j e t s . L e d é c r e t d u 2 3 f é v r i e r 1 9 7 3 a i n s t i t u é u n n é c a n i s m e d r a u t o r i s a t i o n p r é a l a b l e à t o u t r e j e t . E t u n e t a t ( a t i o n e s t o p é r é e p a r l e s a g e n c e s d e b a s s i n à I . e n c o n t r e d e s p o l l u e u r s . - I a p r o t e c t i o n d e I a n a t u r e , l o i d u 1 9 iuillet 1 9 7 6 , q u i e x i g e l a r é a l i s a t i o n d ' u n e é t u d e d t i m p a c t p a r t o u t e e n t r e p r i s e s u s c e p t i b l e d r a v o i r u n e i n f l u e n c e s u r l e m i l i e u n a t u r e l ' - l e c o n t r ô I e d e s p r o d u i t s c h i m i q u e s , l o i d u 1 2 j u i l l e t 1 9 7 7 ' m o d i f i é e I e 2 t o c t o b r e : g 8 2 , q u i p r é v o i t p o u r t o u t e n o u v e l l e s u b s t a n c e 1 t é t a b l i s s e m e n t d r u n d o s s i e r c o m p o r t a n t n o t a m m e n t d e s i n f o r m a t i o n s s u r I a t o x i c i t é v i s à v i s d e I r e n v i r o n n e n e n t ' M a i s l t é t a b l i s s e m e n t d r u n e l é g i s l a t i o n a d é q u a t e n é c e s s i t e u n e connaissance approfondie des modalités de contamination, ainsi que des effets e t d e s m é c a n i s m e s d r a c t i o n t o x i q u e d e s p o l l u a n t s s u r l e s ê t r e s v i v a n t s ' L r é t u d e d e c e s p r o b l è m e s e s t d u r e s s o r t d e 1 t é c o t o x i c o l o g i e '

I I y a e n v i r o n 2 O a n s , l e s p r e m i e r s t e s t s d ' é c o t o x i c i t é a i g u ë s o n t apparus. Le principe de ces tests peut être résurné conme suit : dans des conditions standardisées, le modèle biorogique choisi est exposé à des c o n c e n t r a t i o n s c r o i s s a n t e s d u p r o d u i t à t e s t e r ' u n e r e l a t i o n d o s e - e f f e t e s t é t a b l i e e n r e t e n a n t c o m m e c r i t è r e d e t o x i c i t é l a l é t a l i t é ' l a c r o i s s a n c e o u u n e a c t i v i t é b i o c h i m i q u e t e l l e q u e l a r e s p i r a t i o n ' E t I a c o n c e n t r a t i o n i n h i b i t r i c e à 5O %, Cr5O, est recherchée, a s s o r t i e d r u n e e s t i n a t i o n d u s e u i l d e t o x i c i t é .

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-c e s b i o e s s a i s o n t p o u r o b j e c t i f d e d é t e r m i n e r l a t o x i c i t é à c o u r t t e r m e des substances chimiques sur des organismes aquatiques appartenant à différents niveaux trophiques du milieu hydrique. A cet égard peuvent être u t i l i s é s d i v e r s m o d è I e s b i o l o g i q u e s : b a c t é r i e s , a l g u e s , p r o t o z o a i r e s ' m o u s s e s , m i c r o c r u s t a c é s , p o i s s o n s " ' c o m p t e t e n u d e I a d i f f é r e n c e d e s e n s i b i l i t é d e s o r g a n i s m e s c o n s i d é r é s , l i é e à d e s n i v e a u x d r o r g a n i s a t i o n , d e s m o d e s n u t r i t i o n n e l s e t d e s m é t a b o l i s m e s s p é c i f i q u e s , i l s ' a v è r e n é c e s s a i r e d r u t i l i s e r u n e b a t t e r i e d e t e s t s p o u r t e n t e r d ' a p p r é c i e r I a t o x i c i t é d e s s u b s t a n c e s c h i m i q u e s ' E t b i e n q u e l e s e s s a i s e n l a b o r a t o i r e n e p u i s s e n t j a m a i s s i m u l e r l e s p h é n o n è n e s s u s c e p t i b l e s d , a p p a r a î t r e e n m i l i e u n a t u r e l ' c e s t e s t s p r é s e n t e n t u n i n t é r ê t é v i d e n t c a r i l s p e r m e t t e n t d t é t a b l i r d a n s d e s c o n d i t i o n s s t a n d a r d i s é e s u n e c o m p a r a i s o n s i g n i f i c a t i v e d e s e f f e t s t o x i q u e s d e s s u b s t a n c e s ' D u f a i t d e l e u r s i m p l i c i t é ' i l s p e u v e n t é g a l e n e n t ê t r e u t i l i s é s e n r o u t i n e d a n s l e c a d r e d u c o n t r ô l e d e l a q u a l i t é d e I , e n v i r o n n e n e n t , € t d u c o n t r ô I e d e s r e i e t s i n d u s t r i e l s o u u r b a i n s s o u p ç o n n é s d e p o l l u e r l e s m i l i e u x a q u a t i q u e s ' A c t u e l l e m e n t , I e s t e s t s s u r m i c r o c r u s t a c é s , p o i s s o n s e t a l g u e s u n i c e l l u l a i r e s s o n t l e s p l u s e m p l o y é s ; i l s f o n t d ' a i l l e u r s I t o b j e t d ' u n e n o r m a l i s a t i o n n a t i o n a l e o u i n t e r n a t i o n a l e ' C e p e n d a n t , d e p u i s q u e l q u e s a n n é e s u n i n t é r ê t c r o i s s a n t s e m b l e ê t r e p o r t é a u x t e s t s d e t o x i c i t é b a c t é r i e n s , c o n s é q u e n c e d e l a n a n i p u l a t i o n a i s é e d e s b a c t é r i e s q u i c o n s t i t u e n t u n e x c e p t i o n n e l o u t i l d e l a b o r a t o i r e , p e r m e t t a n t d e r é a l i s e r r a p i d e m e n t d e s m e s u r e s à f a i b l e c o û t , e t d r e n v i s a g e r l r a u t o m a t i s a t i o n d ' a p p a r e i l s . L e s b a c t é r i e s r e p r é s e n t e n t u n e p a r t i e i m p o r t a n t e d e I a b i o m a s s e t e r r e s t r e , p a r t i c i p e n t à l a t r a n s f o r m a t i o n d e s m o l é c u l e s , e t a u x c y c l e s d e l a m a t i è r e ( C , N , S ) , e t à c e t i t r e l e s e s s a i s d t é c o t o x i c i t é s u r b a c t é r i e s m é r i t e r a i e n t d e p r e n d r e p l a c e d a n s l r a r s e n a l d e s t e s t s i m p o s é s p a r l a I é g i s l a t i o n . L e u r u t i l i s a t i o n a u g m e n t e r a i t I | é v e n t a i l d e s b i o e s s a i s a c t u e l l e m e n t e n c o u r s , a s s u r a n t a i n s i u n e m e i l l e u r e é v a l u a t i o n d e I a t o x i c i t é ' E n f a i t , l e p r i n c i p a l g r i e f p o r t é à I ' e n c o n t r e d e s t e s t s b a c t é r i e n s e s t leur faible sensibilité. Ce manque de sensibilité apparent peut être inputable a u r é a c t i f b i o l o g i q u e , a u c r i t è r e d e t o x i c i t é r e t e n u , a u x c o n d i t i o n s d e r é a l i s a t i o n d e s t e s t s , a i n s i q u ' à n o s m o y e n s d e d é t e c t i o n '

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-Nous ferons dans la suite de cet exposé, une présentation sonmaire du O _{m a t é r i e l b a c t é r i e n , s u i v i e d r u n e é t u d e d e s c r i t è r e s d t é v a l u a t i o n} d e I a s c e p t i b l e s d ' i n f l u e r s u r l e r é s u l t a t d e s t e s t s , g u i p e r n e t t r o n t d e m i e u x d é f i n i r l e s l i m i t e s e t l e s q u a l i t é s d e s b i o e s s a i s b a c t é r i e n s .

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-2 - LES TESTS

DE TOXICTTE

SUR

BACTERIES

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-2.1. PRESENTAÎION DU MATTNIET BÂCTMIEN

Les bactéries comptent parmi les plus petits organismes connus doués de n é t a b o l i s m e e t c a p a b l e s d e c r o î t r e e t d e s e m u t t i p l i e r a u x d é p e n s d e s u b s t a n c e s n u t r i t i v e s .

La structure de la ceIIuIe bactérienne est relativenent simple ; Ia bactérie est en effet dépourvue des organites intracellulaires (nitochondrie, réticulum endoplasmique, membrane nucléaire... ) qti compartirnentent la cellule e u c a r y o t e , n a i s p a r c o n t r e I r e n s e m b l e d e s é q u i p e n e n t s e n z y n a t i q u e s responsables du fonctionnement des grandes voies de dégradation et de synthèse s o n t p r é s e n t s .

L a s t r a t é g i e d e b a s e d e l a c e l l u l e e s t d e f o r m e r , l o r s d e } a d é g r a d a t i o n d e s é l é n e n t s n u t r i t i f s , d e I ' 4 1 P , d u N A D ( P ) H 2 e t d e s m é t a b o l i t e s i n t e r m é d i a i r e s , 9 u i s e r o n t u t i l i s é s a u c o u r s d e s b i o s y n t h è s e s d e s m a c r o m o l é c u l e s n é c e s s a i r e s à I a v i e e t à I a d i v i s i o n d e s b a c t é r i e s '

La figure I schématise les principales voies métaboliques suivies par les b a c t é r i e s h é t é r o t r o p h e s a é r o b i e s , 9 u i s o n t l e s p l u s e n p l o y é e s d a n s l e s b i o e s s a i s b a c t é r i e n s . L r e x e m p l e d u g l u c o s e a é t é c h o i s i c a r c e s u b s t r a t a f a i t I t o b j e t d e n o m b r e u x t r a v a u x . I a v o i e g l y c o l y t i q u e e s t I a v o i e p r é f é r e n t i e l l e m e n t u t i l i s é e p a r l e s b a c t é r i e s p o u r l a p r o d u c t i o n d r é n e r g i e . E I l e c o n d u i t à l a f o r m a t i o n d e p y r u v a t e ' S e l o n l e s b e s o i n s d e I a c e l l u l e , l e g l u c o s e p e u t é g a l e m e n t ê t r e o r i e n t é v e r s l a v o i e d e s p e n t o s e - p h o s p h a t e s q u i a s s u r e l a p r o d u c t i o n d e N A D P H 2 e t d e s u c r e s e n C 5 , a c c o n p a g n é e d u r e j e t d e C O 2 ' L t a c é t y l C o e n z y m e A , f o r m é à p a r t i r d u p y r u v a t e e n t r e d a n s I e c y c l e tricarboxylique de Krebs, Qui otrtre son rôLe de fournisseur de rnétabolites interrnédiaires, conduit à la libération de C02 mais surtout à la production de NADHZ et de FADH2.

Ces coenzymes réduits vont être réoxydés au niveau de Ia chaîne respiratoire' s i è g e d e s r é a c t i o n s d r o x y d o - r é d u c t i o n q u i p e r m e t t e n t l e t r a n s f e r t d e s é l e c t r o n s j u s q u ' à l r a c c e p t e u r t e r m i n a l , I ' o x y g è n e m o l é c u l a i r e .

A l a c h a î n e r e s p i r a t o i r e e s t c o u p l é e I a s y n t h è s e d t A T P o u p h o s p h o r y l a t i o n oxydative.

Les voies cataboliques qui conduisent à Ia formation dIATP, de NADPH, et d e m é t a b o l i t e s i n t e r m é d i a i r e s s o n t l e p l u s s o u v e n t d i s t i n c t e s d e s v o i e s a n a b o l i q u e s q u i u t i l i s e n t c e s é l é m e n t s d a n s l e s r é a c t i o n s d e b i o s y n t h è s e s ' Mais un fonctionnement harmonieux de lrensemble des réactions enzyrnatiques est assuré par les nécanismes de régulation'

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-A partir de ce schéma général du nétabolisne bactérien, un certain nombre de fonctions, plus ou moins spécifiques peuvent être choisies pour apprécier l r a c t i o n i n h i b i t r i c e d e s p o l l u a n t s '

2.2. T.ES PRTNCTPAUX ÎF^STS DE ÎOXICITE BACTERIENS

I I e x i s t e u n t r è s g r a n d n o m b r e d e t e s t s d e t o x i c i t é b a c t é r i e n s , e t c e c h a p i t r e n ' a p a s p o u r a m b i t i o n d e p r é s e n t e r u n e l i s t e e x h a u s t i v e d e l r e n s e m b l e d e c e s t e s t s . N e s e r o n t a b o r d é s q u e l e s b i o e s s a i s q u i o n t f a i t l t o b j e t d e nombreux travaux et les bioessais qui bien que peu dévelopÉs présentent un intérêt quant aux réponses apportées dans des donaines bien particuliers'

L e s t e s t s d e t o x i c i t é p e u v e n t ê t r e r e g r o u p é s e n f o n c t i o n d e s c r i t è r e s c h o i s i s p o u r é v a l u e r u n e f f e t t o x i q u e ; c e s c r i t è r e s p e u v e n t c o n c e r n e r : - Ie fonctionnement globa1 production de chaleur, Ia - le fonctionnement de Ia consomnation d t oxYgène, d ' A T P . d e l a c e l l u l e , à s a v o i r l a c r o i s s a n c e ' l a n o b i l i t é . c h a i n e r e s p i r a t o i r e , e n p a r t i c u l i e r 1 a I ' a c t i v i t é d é s h y d r o g é n a s i q u e e t I a s y n t h è s e - Irassinilation d r u n s u b s t r a t c a r b o n é ' d e s m é c a n i s m e s p l u s p a r t i c u l i e r s t e l s q u e l a l u m i n e s c e n c e , l a f o r m a t i o n d e n i t r i t e s o u n i t r a t e s e t I a p r o d u c t i o n d e g a z '

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2 . 2 . 1 . Inhibition du fonctio4nernent global de la cellule bactérienne - Mesure de la croissance

P l a c é e s d a n s d e s c o n d i t i o n s o p t l n o l - e s , I e s b a c t é r i e s s e c a r a c t é r i s e n t p a r u n e v i t e s s e d e c r o i s s a n c e r a p i d e ( u n e division toutes les 20 ninutes) ' et sous l r a c t i o n d e s u b s t a n c e s t o x i q u e s , c e t t e c i n é t i q u e p e u t ê t r e a l t é r é e o u m ê m e annulée.

La croissance des bactéries peut être suivie par numération en milieu g é I o s é o u e n n i l i e u l i q u i d e , € D p r é s e n c e d u t o x i q u e o u a p r è s u n e p é r i o d e d , e x p o s i r i o n ( I Â F o N T et RoMAND, t983; L r u e t K I { A s N r E t { s K A , t 9 8 1 ; LOY gp al"

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1 2 -L a m u l t i p l i c a t i o n c e l l u l a i r e e s t l a r é s u l t a n t e d e n o m b r e u s e s r é a c t i o n s b i o c h i n r i q u e s , e t l e c o n t r ô l e d e l a c r o i s s a n c e b a c t é r i e n n e r e p r é s e n t e d o n c u n c r i t è r e d t a p p r é c i a t i o n d e I a t o x i c i t é s u r l e f o n c t i o n n e m e n t g l o b a l d e l a c e l l u l e . - Mesures calorimétriques

Les réactions biochiniques qui ont lieu au sein de la cellule libèrent de 1 , é n e r g i e s o u s f o r m e d e c h a l e u r , c o n s é q u e n c e d r u n r e n d e m e n t i n f é r i e u r à l ' E t l a q u a n t i t é d e c h a l e u r a i n s i p r o d u i t e e s t p r o p o r t i o n n e l l e à l r a c t i v i t é m é t a b o l i q u e d e s b a c t é r i e s . L a d i m i n u t i o n d e c h a l e u r c o n s é c u t i v e à I ' a d d i t i o n d e s u b s t a n c e s t o x i q u e s r e n s e i g n e s u r I ' e x i s t e n c e d e p h é n o m è n e s d ' i n h i b i t i o n c o n c e r n a n t I e m é t a b o l i s m e b a c t é r i e n d a n s s o n e n s e m b l e . B E A U B T E N e t J O L I C o E U R ( r g 8 4 , 1 9 8 5 ) e t B E A U B I E N e t a I . ( 1 9 8 5 , 1 Ç 8 6 ) o n t é t u d i é a u m o y e n d r u n m i c r o c a l o r i n è t r e à f l u x l a r é p o n s e t h e r n i q u e d e s b a c t é r i e s a u x t o x i q u e s , d a n s d e s c o n d i t i o n s e n d o g è n e s o u d a n s d e s c o n d i t i o n s d e s a t u r a t i o n e n s u b s t r a t .

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C e p e n d a n t , l e s m e s u r e s c a l o r i m é t r i q u e s a p p a r e i l l a g e s o p h i s t i q u é , e t c e t e s t e s t e n c o r e r e s t e n t d é P e n d a n t e s d r u n I i m i t é à l a r e c h e r c h e . - Mesure de la mobilité L a m o b i l i t é d e s b a c t é r i e s t r a d u i t i n d i r e c t e m e n t l e r b o n f o n c t i o n n e m e n t d e l a c e l l u l e . U n t e s t d e t o x i c i t é s u r dès 1974 par BOWDRE et KRIEG

Spirillum volutans est flagelles dont le mouvement p r é s e n c e d e t o x i q u e s .

l a m o b i l i t é d e S p i r i l l u m v o l u t a n s a é t é p r o p o s é

( c i t é p a r B I T Î O N , 1 9 8 3 ) . une bactérie en bâtonnet

devient anarchique ou

portant à chaque Pôle des e s t t o t a l e m e n t i n h i b é e n A p r è s I a p é r i o d e d ' e x p o s i t i o n , I ' o b t e n t i o n d e s r é s u l t a t s p a s s e p a r u n e é t a p e d r o b s e r v a t i o n a u m i c r o s c o p e ' 2 . 2 . 2 . r n h i b i t i o n d u f o n c t i o n n e n e n t d e l a c h a î n e r e s p i r a t o i r e L e s t e s t s b a s é s s u r I t i n h i b i t i o n d u f o n c t i o n n e m e n t d e l a c h a î n e q u e l e s n i c r o o r g a n i s m e s d o u é s d e

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à des fins énergétiques (dans IIARCHAL et aL, 1982)'

- Bactéries aérobies strictes : a , - b - c - d - e = v o i e c y t o c h r o m i q u e

a é r o b i e

- Bactéries aérobies ou anaérobies facultatives :

. en aérobiose : a - b - c - d - e + I : f

. e n a n a é r o b i o s e : a - f ( f e r n e n t a t i o n s )

a - b - c - i ( r e s P i r a t i o n a n a é r o b i e )

- Bactéries anaérobies strictes : a - f ( f e r m e n t a t i o n s )

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a - b - t ( e n P r é s e n c e d ' 0 2 ) '

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1 4 -L a c h a î n e r e s p i r a t o i r e c h e z l e s b a c t é r i e s e s t l o c a l i s é e a u n i v e a u d e I a membrane cytoplasmique et son fonctionnement se traduit par Ia consommation d t o x y g è n e , l a n o b i l i s a t i o n d e s d é s h y d r o g é n a s e s e t I a s y n t h è s e d r A T P '

- Mesure de la consommation droxygène

L r o x y g è n e e s t l r a c c e P t e u r l o n g d e I a c h a î n e r e s P i r a t o i r e , c e l l u l e ( F i g u r e 3). Membrane Flavoproteln 2 H + -\. t e r m i n a l d u f l u x d r é l e c t r o n s q u i t r a n s i t e e t q u i r é s u l t e d e I ' a c t i v i t é c a t a b o l i q u e d e I e I a C y t o p l a s m . - r N A D H + H + t \ r NAD+ F e S ' p r o t e l n - r ' Flavo proteln ,/' Coenzfie Q Cyt b556 - \ C Y t o ttz oz + 2 H + d ' E s c h e r i c h i a c o l i e n m i l i e u a é r o b i e Figure 3 : Chaîne respiratoire

(cortscl'ilrN, 1986).

U n e d i m i n u t i o n d u t a u x d t o x y g è n e c o n s o n m é , s o u s l r a c t i o n d e s u b s t a n c e s toxiques, reflète Conc un ralentissement dans Ie fonctionnement de la chaîne r e s p i r a t o i r e .

D a n s l e s b i o e s s a i s , I a c o n s o m n a t i o n d ' o x y g è n e p a r l e s b a c t é r i e s e s t g é n é r a l e m e n t n e s u r é e e n p r é s e n c e d r u n s u b s t r a t n o n l i m i t a n t , P â r d o s a g e

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_ 1 5 _

Mesure de l.tactivité déshydrogénasique

Les déshydrogénases sont des enz3mes qui participent aux réactions d f o x y d o - r é d u c t i o n d e s m o l é c u l e s p a r t r a n s f e r t d t h y d r o g è n e .

D a n s 1 a c h a i n e r e s p i r a t o i r e , e I I e s a s s u r e n t l e s t r a n s f e r t s d t h y d r o g è n e e n t r e l e s c o e n z y m e s q u i l e u r s o n t a s s o c i é s , N A D , f l a v o p r o t é i n e s , c o e n z y m e Q, e t l e u r a c t i v i t é r e f l è t e I r i n t e n s i t é d u f l u x d r é l e c t r o n s .

L t a c t i v i t é d é s h y d r o g é n a s i q u e p e u t ê t r e m e s u r é e a u n o y e n d e m o l é c u l e s organiques, qui du fait de leur potentiel droxydo-réduction vont jouer le rôIe d r a c c e p t e u r a r t i f i c i e l d r é l e c t r o n s , c o m n e l e b l e u d e m é t h y t è n e , l a r é z a z u r i n e ( l t U , l 9 8 l ) I e s s e l s d e t é t r a z o l i u m , e n p a r t i c u l i e r l e c h l o r u r e d e t r i p h é n y l tétrazolium ou TTC (RYSSOw-MELSEN, 1975), €t le chlorure de 2 - ( p - i o d o p h é n y 1 ) - 3 - ( p - n i t r o p h é n y 1 ) - S - p h é n y l t é t r a z o l i u m o u f N T ( B I T T O N e t â 1 . , 1 9 8 6 ) ( F i g u r e 4 ) .

INT rédult .= FORIIAZAN

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E44 : Principe de Ia mesure de lractivité déshydrogénasique au m o y e n d e l r I N T .

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1 6

-- Mesure de Ia teneur en ATP

L t A T p e s t u n n u c l é o t i d e , c o m p o s é d t a d é n i n e , d e r i b o s e e t d e p h o s p h a t e , qui agit conme nétabolite internédiaire donneur d'énergie dans de nombreuses a c t i v i t é s c e l l u l a i r e s t e l l e s q u e l e s r é a c t i o n s d e b i o s y n t h è s e , l e s t r a n s p o r t s a c t i f s , l a m o b i t i t é . . . L a s y n t h è s e d t A T P e s t c o u p l é e a u f o n c t i o n n e m e n t d e l a c h a î n e r e s p i r a t o i r e . S e l o n I a t h é o r i e c h i n i o s m o t i q u e d e M i t c h e l l ( 1 9 6 6 ) , Ie transfert d t é l e c t r o n s l e l o n g d e I a c h a î n e r e s p i r a t o i r e s r a c c o n p a g n e d e I a c r é a t i o n d r u n g r a d i e n t d e p r o t o n s d e p a r t e t d r a u t r e d e I a m e m b r a n e , n é c e s s a i r e a u f o n c t i o n n e n e n t d u s y s t è m e A T P a s i q u e ( F i g u r e 5 ) .

F i g u r e 5 : Synthèse d'ATP selon la théorie chimiosmotique de Mitche[ ( d ' a p r è s G o T Î S C X I A L K , 1 9 8 6 ) . L T A T P s y n t h è t a s e e s t c o n s t i t u é e d e s s o u s - u n i t é s F o e t F l _t a s s u r e l e p a s s a g e d e s p r o t o n s à t r a v e r s l a n e m b r a n e , e t I i A T P s y n t h é t i s é a u n i v e a u d e F 1 . L e d o s a g e d e I T A T P e s t r é a 1 i s é p a r b i o l u m i n e s c e n c e , a p r è s e x t r a c t i o n d u m i l i e u c e l l u l a i r e . C e t t e m é t h o d e u t i l i s e l a c a p a c i t é d u s y s t è m e e n z y m a t i q u e l u c i f é r a s e à o x y d e r , e n p r é s e n c e d t A T P , l a l u c i f é r i n e ; c e t t e o x y d a t i o n s r a c c o m p a g n e d ' u n e p r o d u c t i o n d e p h o t o n s p r o p o r t i o n n e l l e à l a t e n e u r e n A T P d u 2 l r ' I I I I I I ll I I I I I I I I I I F o e s t

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1 7

-Eu égard à son turn-over extrêmement élevé (I'ATP est consommé dans la ninute qui suit sa fornation), toute perturbation de Ia synthèse drATP par des agents toxiques se traduira imrédiatement par une dirninution de la concentration. Ainsi, Ia teneur en ATP peut être un indicateur de la vitalité d e s c e l l u l e s b a c t é r i e n n e s ( M A R T f N , 1 9 8 3 ) .

2 . 2 . 3 . f n h i b i t i o n d e l r a s s i m i l a t i o n d e s u b s t r a t c a r b o n é

L t u t i l i s a t i o n d e s u b s t r a t c a r b o n é e s t s p é c i f i q u e d e s b a c t é r i e s h é t é r o t r o p h e s .

D a n s l e s b i o e s s a i s , l e s u b s t r a t g é n é r a l e m e n t a p p o r t é e s t I e g l u c o s e uniforménent narqué, et I'effet inhibiteur des substances toxiques est évalué au travers des mesures de carbone radioactif fixé par les bactéries et de C0, m a r q u é r e j e t é . P o u r l e s m i c r o o r g a n i s n e s a é r o b i e s s t r i c t s e t a é r o b i e s - a n a é r o b i e s f a c u l t a t i f s p l a c é s d a n s d e s c o n d i t i o n s d r a é r o b i o s e , I e C O Z l i b é r é p r o v i e n t p r i n c i p a l e m e n t d e l a g l y c o l y s e , d u c y c l e d e K r e b s , € t d e l a v o i e d e s p e n t o s e s - p h o s p h a t e s , e t i l r é s u l t e d e I a m i n é r a l i s a t i o n d u s u b s t r a t ( F i g u r e l ) . U n e a n a l y s e d é t a i l l é e d e s t e s t s b a s é s s u r l r a s s i n i l a t i o n d e s u b s t r a t c a r b o n é e s t p r é s e n t é e a u c h a p i t r e J . J . 2 . 2 . 4 . I n h i b i t i o n d e m é c a n i s m e s p a r t i c u l i e r s Mesure de Ia bioluminescence

La bioluninescence résulte drun ensenble de réactions observées principalement chez des bactéries appartenant à 2 genres et Photobacteriun.

Un test de toxicité qui met à profit cette propriété a été rnis au point, et il est présenté au chapitre J.1.

Hesure de Ia formation des nitrites ou nitrates

La fornation de nitrites ou de nitrates à partir drions amnonium résulte d e l r a c t i v i t é d e b a c t é r i e s n i t r i f i a n t e s a u t o t r o p h e s , N i t r o s o m o n a s s p . e t N i t r o b a c t e r s p . :

Ntrn+ + 3/2

O2->N02- + 2H+ + HrO (Nitrosonronas sp.) Or *N0r- ( Nitrobacter sp. ).

biochimiques : Vibrio

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1 8 -C e s b a c t é r i e s c h i m i o l i t h o t r o p h e s t i r e n t l e u r é n e r g i e d e 1 ' o x y d a t i o n d e c o m p o s é s m i n é r a u x , e n I r o c c u r e n c e l r a n m o n i a q u e o u l e s n i t r i t e s , e t I t a c c e p t e u r t e r m i n a l d t é I e c t r o n s e s t I t o x y g è n e . L t e f f e t d e s s u b s t a n c e s t o x i q u e s p e u t ê t r e é v a l u é e n s u i v a n t l e s c i n é t i q u e s d e d i n i n u t i o n d u s u b s t r a t r p â r e x e m p l e l e s n i t r i t e s p o u r N i t r o b a c t e r ( w t t t t A I , { s o N et NELSON, 1983).

- Mesure de la production de gaz

L a p r o d u c t i o n d e g a z ( m é t h a n e + C 0 2 ) c o n c e r n e l e s b a c t é r i e s m é t h a n o g è n e s , r a r e m e n t é t u d i é e s p r i n c i p a l e m e n t p o u r d e s r a i s o n s t e c h n i q u e s c a r e l l e s s e d é v e t o p p e n t e n a n a é r o b i o s e . P o u r t a n t l e s b a c t é r i e s d e s h a b i t a t s a n o x i q u e s s o n t c a p a b l e s d ' i n t e r v e n i r d e f a ç o n p r é p o n d é r a n t e d a n s I a b i o d é g r a d a t i o n d e s g r o s s e s m o l é c u l e s t e l l e s q u e la c e l l u l o s e , € t d e s s u b s t a n c e s p e u s o l u b l e s q u i s r a d s o r b e n t s u r l e s s é d i m e n t s . L t i n h i b i t i o n d e l a p r o d u c t i o n d e g a z p a r l e s s u b s t a n c e s c h i m i q u e s n r a cependant été envisagée que dans Ie cadre de travaux de recherche (JOHNSON et Y O U N G , 1 9 8 3 ; P I Â Y N E e t S M I T H , 1 9 8 3 ) , e t l e s b i o e s s a i s p r o p o s é s s e c a r a c t é r i s e n t p a r d e s p é r i o d e s d ' i n c u b a t i o n r e l a t i v e m e n t l o n g u e s ( I à p l u s i e u r s j o u r s , v o i r e p l u s i e u r s s e m a i n e s ) , c o n s é q u e n c e d e s f a i b l e s t a u x d e c r o i s s a n c e d e s a n a é r o b i e s .

RET.IARQTIES SUR TOXICIÎE BACTERIENS

S u i t e à c e t t e p r é s e n t a t i o n d e s p r i n c i p a u x t e s t s d e t o x i c i t é b a c t é r i e n s , nous concluerons par quelques réflexions sur les critères d | évaluation et les m e s u r e s d e l a t o x i c i t é , I e c h o i x d u r é a c t i f b a c t é r i e n , e t I t i n f l u e n c e d e s c o n d i t i o n s e x p é r i m e n t a l e s s u r l e s r é s u l t a t s d e s t e s t s .

2 . 3 . r .

C r i t è r e s d r é v a l u a t i o n e t m e s u r e d e l a t o x i c i t é L a c l a s s i f i c a t i o n P r é c é d e n t e d e s b a s é e s u r I a n a t u r e d u c r i t è r e c h o i s i distingué : t e s t s d e t o x i c i t é s u r b a c t é r i e s e s t p o u r é v a l u e r l a t o x i c i t é . N o u s a Y o n s

- _{les critères} généraux liés au fonctionnenent c r o i s s a n c e , é m i s s i o n d e c h a l e u r , m o b i l i t é .

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_ 1 9 _ L e c h o i x d ' u n s i g n a l t e l q u e I a c r o i s s a n c e p e u t s e m b l e r à p r i o r i p l u s j u d i c i e u x c a r i 1 i n t è g r e t o u t e p e r t u r b a t i o n s u s c e p t i b l e d e s e p r o d u i r e à n ' i m p o r t e q u e l n i v e a u d u n é t a b o l i s m e c e l l u l a i r e ' M a i s m ê n e l e s m e s u r e s c o n s i d é r é e s c o n m e p l u s s p é c i f i q u e s t e l l e s q u e I a b i o l u m i n e s c e n c e , r e f l è t e n t é g a l e m e n t l e s e f f e t s i n h i b i t e u r s d e s s u b s t a n c e s chimiques ; en effet, toute perturbation importante en un point de Ia cellule s e r é p e r c u t e r a s u r l e s d i f f é r e n t e s v o i e s m é t a b o l i q u e s p a r l r i n t e r n é d i a i r e d e s m é c a n i s m e s d e r é g u l a t i o n q u i é t a b l i s s e n t d e s p a s s e r e l l e s e n t r e l e s m i l l i e r s d e r é a c t i o n s s e p r o d u i s a n t â u s e i n d e s b a c t é r i e s '

P a r c o n t r e , n o s m o y e n s d e d é t e c t i o n d e l a r é p o n s e d e s b a c t é r i e s a u x toxiques interviennent probablement pour une part inportante dans Ia s e n s i b i l i t é e t I a d u r é e d e s t e s t s ' A i n s i , l â m e s u r e d r u n e f f e t i n h i b i t e u r s u r l a c o n s o n m a t i o n d ' o x y g è n e n é c e s s i t e u n e v a r i a t i o n i m p o r t a n t e d e I a c o n c e n t r a t i o n e n o x y g è n e d i s s o u s d a n s I e r n i l i e u r é a c t i o n n e l p o u r q u e n o u s p u i s s i o n s l a d é t e c t e r ' I l e s t d o n c n é c e s s a i r e d ' e x p o s e r d e s p o p u l a t i o n s d e n s e s d e m i c r o o r g a n i s m e s a u t o x i q u e p e n d a n t d e s p é r i o d e s r e l a t i v e n e n t l o n g u e s ' a v e c p o u r c o n s é q u e n c e u n e p o s s i b i t i t é d e m u l t i p l i c a t i o n e t u n r i s q u e a c c r u d e s é I e c t i o n n e r d e s m u t a n t s r é s i s t a n t s . D e m ê m e r u t r e f f e t i n h i b i t e u r s u r l a c r o i s s a n c e n e s e r a m i s e n é v i d e n c e q u ' a p r è s d e t r è s n o n b r e u s e s d i v i s i o n s ' L e s m e s u r e s d e r a d i o a c t i v i t é , d e b i o l u m i n e s c e n c e , d ' A Î P o u d ' a c t i v i t é e n z y m a t i q u e s e n b l e n t p r é s e n t e r u n s e u i l d e d é t e c t i o n p l u s f a i b l e '

2 . 3 . 2 .

C h o i x d u r é a c t i f b a c t é r i e n

- Nature des bactéries

P o u r d e s r a i s o n s a v a n t t o u t p r a t i q u e s , I e s b a c t é r i e s h é t é r o t r o p h e s a é r o b i e s s t r i c t e s e t a é r o b i e s - a n a é r o b i e s f a c u l t a t i v e s r e p r é s e n t e n t I e g r o u p e l e p l u s u t i l i s é d a n s l e s t e s t s d e t o x i c i t é ( P s e u d o m o n a s , aeromonas' E s c h e r i c h i a c o l i , l e s b o u e s a c t i v é e s " ' ) ' L t e f f e t t o x i q u e d e s s u b s t a n c e s c h i n i q u e s p e u t é g a l e m e n t ê t r e r e c h e r c h é s u r d e s b a c t é r i e s p l u s s p é c i a l i s é e s t e l l e s q u e l e s b a c t é r i e s n i t r i f i a n t e s o u l e s b a c t é r i e s n é t h a n o g è n e s .

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A u s e i n d r u n g r o u p e , r e p r é s e n t a t i v i t é v i s à v i s d e m a i s n e r e p o s e P a s r é e l l e m e n t r e s t e t r è s Peu connue. I e c h o i x d e s s o u c h e s e s t f o n c t i o n d e l e u r l r e n v i r o n n e m e n t e t d e s h a b i t u d e s d u l a b o r a t o i r e ' s u r l e u r s e n s i b i l i t é s p é c i f i q u e a u x t o x i q u e s q u i

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2 0

-- Souche Pure ou PoPulation nixte L e s t e s t s d e t o x i c i t é s o n t r é a l i s é s l a b o r a t o i r e , o u s u r p o p u l a t i o n s m i x t e s

s u r s o u c h e s Pures cultivées e n l e p l u s s o u v e n t Prélevées dans les

peuvent varier de façon m i l i e u x n a t u r e l s .

Travailrer sur un échantillon d'eau avec sa propre population bactérienne parait évidernment plus représentatif des évènements qui peuvent survenir dans lrenvironnenent. Néanmoinsr ce choix pose un certain nombre de problènes'

D , u n e p a r t , i l e s t e x t r ê n e m e n t d i f f i c i l e d e c o n s e r v e r e n l a b o r a t o i r e d e t e l s é c h a n t i l l o n s . I l s é v o l u e n t o b l i g a t o i r e n e n t e t l e s e f f e t s d e p a r o i d u matériel de prélèvement ne sont pas négligeables'

D r a u t r e p a r t , l e s c a r a c t é r i s t i q u e s d u r n i l i e u i n p o r t a n t e d r u n é c h a n t i l l o n à l t a u t r e ' b a c t é r i e s , 9 u i b i o c h i m i q u e ' v a s e c a r a c t é r i s e n t ( B I O C K e t a l . ,

1 9 8 8 ) .

A I ' o p p o s é , l e s t e s t s s u r s o u c h e s p u r e s p r é s e n t e n t u n e p l u s f a i b l e v a l e u r p r é d i c t i v e m a i s u n e r é p é t a b i l i t é c o r r e c t e à c o n d i t i o n t o u t e f o i s q u e l e s c u l t u r e s e n l a b o r a t o i r e s o i e n t p a r f a i t e m e n t s t a n d a r d i s é e s ' c r e s t p o u r q u o i ' i I e s t a b s o l u n e n t i n d i s p e n s a b l e d e r é a l i s e r l e s b i o e s s a i s s u r d e s c o n c e n t r a t i o n s p r é c i s e s e n b a c t é r i e s p r é s e n t a n t d e s c a r a c t é r i s t i q u e s p h y s i o l o g i q u e s d é f i n i e s p a r l e s c o n d i t i o n s d e c r o i s s a n c e , 1 ' â g e d e l a c u l t u r e " ' ( T R E I I o R S e t a l . ' 1 9 8 1 ) . 2 . 3 . 3. Conditions expérimentales D r u n e f a ç o n g é n é r a r e , l e s c a r a c t é r i s t i q u e s p h y s i c o - c h i m i q u e s d u m i r i e u r é a c t i o n n e l , e n p a r t i c u l i e r l a t e m p é r a t u r e , I e p H , l a d u r e t é , I a c o n c e n t r a t i o n e n o x y g è n e , e t e n s u b s t r a t . . . v o n t i n t e r f é r e r s u r I a r é p o n s e d u t e s t ' d r u n e p a r t e n a g i s s a n t d i r e c t e m e n t s u r I l é t a t p h y s i o l o g i q u e d e s b a c t é r i e s , € t d r a u t r e p a r t e n m o d i f i a n t I a s p é c i a t i o n d e s t o x i q u e s e t d o n c p a r v o i e d e c o n s é q u e n c e l e u r b i o d i s p o n i b i l i t é e t l e u r t o x i c i t é v i s à v i s d u r é a c t i f b i o l o g i q u e .

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U n a u t r e f a c t e u r i m p o r t a n t e t i n c o n n u e s t l e p a s s é d e s c o m p t e t e n u d e l e u r s c a p a c i t é s d ' a d a p t a t i o n e t d e l e u r m é n o i r e n é c e s s a i r e n e n t i n t e r f é r e r s u r l e u r s r é p o n s e s a u x t o x i q u e s ' I I e n r é s u l t e q u e l e s t e s t s s u r p o p u l a t i o n s n a t u r e l l e s p a r u n e b o n n e v a l e u r p r é d i c t i v e m a i s u n e m a u v a i s e r é p é t a b i l i t é

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2 1 -A t i t r e d r e x e m p l e , I e s b i o e s s a i s t e l s q u e l e s t e s t s d e c r o i s s a n c e ' d r é m i s s i o n d e c h a l e u r o u d e c o n s o m m a t i o n d r o x y g è n e q u i n é c e s s i t e n t u n s u b s t r a t abondant, vont engendrer des phénonènes de complexation notamment avec les nétaux, ce qui a pour conséquence de dirninuer les effets inhibiteurs de ces t o x i q u e s . D a n s I a m e s u r e d u p o s s i b t e i l s e r a i n t é r e s s a n t d r é v a l u e r I ' i m p o r t a n c e d e c e s p h é n o m è n e s d r i n t e r a c t i o n n o t a m l e n t p o u r I ' i n t e r p r é t a t i o n d e s r é s u l t a t s ' e t e n t o u t é t a t d e c a u s e l e s e s s a i s d e v r o n t ê t r e r é a l i s é s s e l o n d e s r n é t h o d o l o g i e s p a r f a i t e m e n t s t a n d a r d i s é e s '

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2 2

-3 - A N A L Y S E

B I B L I O G R A P H I O U E

:

. I n H I B I T I o N D E L A B I o L U M I N E S c E N c E

D E

P x o r o g e c r e R

I u M P H o S P H o R E U M

. I N H I B I T I o N D E L A c o N s o M M A T l o N

o ' o x Y G E N E

, I T T H I B I T I O N

D E L A M I N E R A L I S A T I 0 N

D U G L U C o S E

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a

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O

_ 2 3 _

A p r è s c e t t e p r é s e n t a t i o n g é n é r a l e d e s t e s t s d e t o x i c i t é b a c t é r i e n s ' n o u s allons maintenant aborder I'analyse bibliographique relative aux 3 bioessais q u i f o n t I t o b j e t d e c e t t e t h è s e '

3.r. TrutrF]iTTON

pE t BI:OLVTûI:NESCENCE

DE PlnToB/4CT€MUri

Plns?lffil€iln

3 . 1 . 1 . P r i n c i p e

s i l a c a p a c i t é d e c e r t a i n e s b a c t é r i e s à é m e t t r e d e l a l u m i è r e e s t c o n n u e d e p u i s l o n g t e m p s , c r e s t à p a r t i r d e 1 9 7 8 q u e B U L I C H e t G R E E T { E o n t m i s à p r o f i t c e t t e p r o p r i é t é e n p r o p o s a n t u n t e s t d e t o x i c i t é , a p p e l é t e s t M i c r o t o x I l e u r choix srest porté sur photobacterium phosphoreum, aclrronobacter luninescent qui s e d é v e l o p p e d a n s l r e a u d e m e r e t d a n s l e s o r g a n e s l u m i n e s c e n t s d e c e r t a i n s

p o i s s o n s .

Le princiPe du test consiste à avant et après addition de substances

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O

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c o n p a r e r l a l u n i n e s c e n c e d e s b a c t é r i e s t o x i q u e s .

3 . r . 2 .

La luminescence bactérienne

NEALSON et HASTINGS ( 1979) ont étudié le nécanisne de Ia luminescence b a c t é r i e n n e , e t i l s o n t p r o p o s é u n s c h é m a d a n s l e q u e l I e s y s t è m e l u m i n e s c e n t e s t e n c o n c u r r e n c e a v e c I a c h a î n e r e s p i r a t o i r e p o u r I t u t i l i s a t i o n d e s c o e n z y n e s r é d u i t s N A D H (F i g u r e 6 ) ' N A D H + H ' N A D H + H . F i g u r e 6 : M é c a n i s m e b i o c h i m i q u e d e ] a l u m i - n e s c e n c e ( c l a n s C O T T I I C I ! A L l ( ' 1 9 8 6 ) '

o

Les

o

_{s o n t}

_ 2 4 _

enzymes qui interviennent dans Ie cycle de production de Ia lumière

u n e l u c i f é r a s e q u i e n p r é s e n c e d e F M I { H 2 ' d ' o x y g è n e e t d t a l d é h y d e v a p e r m e t t r e 1 ' é m i s s i o n d e l u m i è r e . u n e p e t i t e p r o t é i n e , I a l u m a z i n e p a r t i c i p e r a i t à l a f o r m a t i o n d u c o m p l e x e e x c i t é f i n a l ( V E R V O 0 R T ' e t aI',

1983).

l e s N A D ( P ) H , F M N o x y d o r é d u c t a s e s q u i a s s u r e n t l a r é d u c t i o n d e I a F M N e n u t i l i s a n t s o i t l e N A D H ' s o i t l e N A D P H ' a l d é h y d e s , l e s a c i d e s r é d u c t a s e s , q u i p r o d u c t i o n d ' a l d é h y d e à l o n g u e c h a î n e à ( C l r n n et HASTINGS, L974).

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- Ies enzJrmes du métabolisme des seraient irnpliquées dans la p a r t i r d e I t a c i d e c o r r e s P o n d a n t

o

L a l o c a r i s a t i o n d e r a l u c i f é r a s e r e s t e i m p r é c i s e . B i e n q u r e l l e s o i t généralement retrouvée dans la fraction soluble du cytoplasme, de nombreux a u t e u r s p e n s e n t q u ' e l l e a g i t e n l i a i s o n a v e c l e s y s t è m e m e m b r a n a i r e ( D A N I t o v e t a l . , | g 8 2 ) ; BALAKRISHNAN e t L A N G E R M A N , | 9 7 7 ; NE'EMAN s ! : , | 9 7 7 ' E N G E T B R E C H T e t a l . , 1 9 8 3 ) . L e s i o n s p h o s p h a t e s s t a b i l i s e r a i e n t 1 a s t r u c t u r e d e 1 a l u c i f é r a s e ( H 0 L Z M A N e t B A L D I { r N , 1 9 8 0 ) . 3 . 1 . 3 . I n f l u e n c e d e s c o n d i t i o n s e x p é r i m e n t a l e s D e p u i s s a m i s e a u p o i n t , I e t e s t M i c r o t o x a ê t ê u t i l i s é a f i n d ' é v a l u e r l a t o x i c i t é d e s u b s t a n c e s c h i n i q u e s p u r e s , o r g a n i q u e s e t n i n é r a l e S , a i n s i q u e d t e f f l u e n t s c o n p l e x e s . E t d e n o m b r e u x t r a v a u x o n t p e r m i s d e p r é c i s e r l , i n f l u e n c e d e l a d u r é e e t d e I a t e m p é r a t u r e d e l t e s s a i s u r l a r é p o n s e a u x toxiques de Photobacterium phosphoreun'

- Ih.rrée dtexposition

D a n s l e s p r e m i è r e s p u b l i c a t i o n s s u r I e t e s t M i c r o t o x p r é s e n t é e s p a r B U L I C H , l a d u r é e d e l r e s s a i ( c o n t a c t toxique-bactéries) é t a i t f i x é e à 5 n i n ' p a r la sui-te, de nonbreux auteurs ont étudié ltévolution d e l a r é p o n s e

o

o

o

_ 2 5 _

I æ s t a b l e a u x 1 a , l b e t 1 c r e g r o u p e n t l e s r é s u l t a t s d ' e s s a i s M i c r o t o x s u r d e s s u b s t a n c e s c h i m i q u e s p u r e s , p o u r d i f f é r e n t s t e m p s d r e x p o s i t i o n c o n p r i s e n t r e 5 et 60 minutes. E t u n e c l a s s i f i c a t i o n a ê t ê é t a b l i e e n f o n c t i o n d e l a r a p i d i t é d r a c t i o n d e s t o x i q u e s s u r I a b i o l u m i n e s c e n c e :

o

o

o

o

o

o

o

l e s s u b s t a n c e s d i t e s maxinum après 5 min. généralenent de nature p h é n o l e t s e s d é r i v é s , c y c l i q u e s , I t a c é t o n e , minéral qui ait montré

à action rapide montrent un effet inhibiteur d t i n c u b a t i o n ( T a b l e a u la). C e s t o x i q u e s s o n t o r g a n i q u e e t I t o n p e u t c i t e r c o n m e e x e m p l e I e l e s h y d r o c a r b u r e s b e n z é n i q u e s , I e s a l c a n e s l e m é t h a n o l . . . L e c r 3 + e s t l e s e u l t o x i q u e u n e a c t i o n r a P i d e . l e s s u b s t a n c e s d i t e s à a c t i o n i n t e r m é d i a i r e v o i e n t I e u r s e f f e t s inhibiteurs augmenter surtout durant les 1$ premières ninutes (Tableau l b ) . C e t t e c l a s s e r e g r o u p e d e s t o x i q u e s o r g a n i q u e s t e l s q u e l e s d é t e r g e n t s , 1 e l a u r y l s u l f a t e d e s o d i u m , I e d o d e c y l s u l f a t e d e s o d i u n " ' m a i s é g a l e m e n t d e s t o x i q u e s m i n é r a u x c o m m e l r a r s e n i c e t I e p l o n b '

- Ies substances dites à action lente ont un effet toxique maximal après J O m i n . d r i n c u b a t i o n ( T a b l e a u lc). Ces toxiques sont essentiellement de n a t u r e m i n é r a 1 e : s e l s d e c u i v r e , c a d m i u m , z î n c , n i c k e l , s é l é n i u m e t l e s c y a n u r e s . L e C r 6 * e t l e H g * + a p p a r a i s s e n t d a n s l e s t a b l e a u x l b e t l c . C e s r é s u l t a t s d i v e r g e n t s s o u l i g n e n t l a n é c e s s i t é d e t r a v a u x s u p p l é m e n t a i r e s a f i n d e d é f i n i r I e c o m p o r t e m e n t d e c e s 2 s u b s t a n c e s v i s à v i s d e P h o t o b a c t e r i u m p h o s p h o r e u m ' L a c l a s s i f i c a t i o n é t a b l i e p r é c é d e m n e n t à p a r t i r d r é t u d e s s u r d e s s u b s t a n c e s c h i m i q u e s p u r e s a é t é c o n f i r n é e p a r d e s t r a v a u x s u r d e s m i l i e u x c o m p l e x e s ( D A N o U x , l Ç 8 2 ; C A L L a I A e t a I . , 1 9 8 6 ) ' L o r s d e I a d é t e r m i n a t i o n d e l a t o x i c i t é d t é c h a n t i l l o n s d e c o m p o s i t i o n chimique inconnue au noyen du test Microtox, il conviendra donc de rechercher l a d u r é e d r i n c u b a t i o n q u i a s s u r e l a s e n s i b i l i t é o p t i n a l e d e s e s s a i s '

i

o

o

2 6

-O lableau la : fnfluence de Ia durée d'exposition sur Ia toxicité exprimée par t a C I 5 O e n m g / I ( 0 = 15oC) ; substances dites à action rapide.

Substance chimique cl5g (ng/I) pour différents

t e n p s d r e x p o s i t i o n e n m i n .

5

1 0 1 5 20

₃₀

60

R é f é r e n c e s 3-5 dichlorophénol PhénoI

3,2 3

2,9

28

_{3r,9 U,3}

DUTKA

-eÎ-aL, 1983

loluène Xylène Ethylbenzène Chlorobenzène Cyclohexane Cyclohexanone

2r8

216

75

73

5 ' 5 6 ' r

14,6 18

85,5 93

2 5

2 t , 3

F E R A R D e t a l . , 1 9 8 3 A c e t o n e Méthanol

r z M - 1 2 6 r

- r p r 3

l s o m - 2 & 4 æ - p 3 9 m

G R E E N E e t a l . , 1 9 8 5 FhÉnol

c.3*

?4,5 8,1 %,3 %,4

to,7 12,6 15,3 15,8 16

Q U R E S H I e t a I . , 1 9 8 4 Phénol Cyclohexanone 2 5 - 2 8 - 3 2 1 0 - 1 1 - 1 2 MICROTOX APPLICATION N o T E S - M . 1 0 2 - 1 9 8 1

o

o

o

o

o

o

o

o

L l

-o

o

o

T a b l e a u l b : f n f l u e n c e d e I a d u r é e d r e x p o s i t i o n s u r l a t o x i c i t é e x p r i m é e p a r t a C I 5 O e n m g / l ( O = 1 5 o C ) ; substances dites à action intermédiaire

o

o

o

o

o

o

o

o

o

R é f é r e n c e s ffS (Ind) Pour d-ifféreits

t6rps d'oçosition en rnin'

5

ro

15= 20

30

60

Substance chinique DUTKA _{99 aI., 1983} 3119 2't

0,064

0,049 -

0,046

1,35

o,s

-

o,&

Chlorure de cetyl trimethyl anrnonium Lauryl sulfate de sodium Hg** GREENE _@, 1985

3,57

1,73

1,0

24,67

18,39 -

16,m

7 3 , 7 3 - 4 3 , # - 3 , 3 9

.lrsenate de sodiun A r s e n i t e d e s o d i Arsenic trioxYde e t a l . ,

t,fr trgl o,9o 0,78

2,6 O,ft O,M 0,39 0,31

D o d e c y l s u l f a t e de Nâ Pb++ MICROTOX APPLICATION N 0 Î E S - M . 1 0 2 - 1 9 8 1 l r 2 o , 7 o r 5 1 - o,7 0,6

) 2 6 ? Â

z - 1 8 1 5

lr4

0,6

0,4

Lauryl sulfate de sodium PentachloroPhenate de sodiun Na As O, conne A"5+ 6+ K^Cr.O- comme Cr' a . l Pb(No.). comnrc Pb++ J .

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

2 8

-Tableau lc : Influence de Ia durée d'exposition sur Ia toxicité exprimée par l a C I . ^ € D m g / f ( e = 1 5 o C ) I s u b s t a n c e s d i t e s à a c t i o n l e n t e .

)u

Substance chinique

cr çg (mg/I) Pour diffèrents te'mPs drexPosition en nin'

5 1 0 1 5 2 0 3 0

60

Références Cu** l +

c d '

'

cN-Hg**

zn+*

cu+*

! +

c d '

'

c.6*

! + N i ' '

se4*

zn*+

l,2l - o,E - OrzJ OrLz

to2r6 - 25,4 - 1318 3r8 4,77 - 1,4o 0,61 016 r0rÛ2 - 0101

1lrs

-

L,#

-

o,s o16

GREENE .9q-4:, 1985

1,84 lrs

o,8 0,18

orl3

ty

70,8

41,4 27,2

14,9

8,6

39,5

%,9 U

16,8

los

fi73

251 16

42,2

2t5,2 53,9

33,4 E,L

t9'5

55,5 @,7

6,S 3,6

r,M

QURESHI et al., 1984 cd++

44,2

-

r9,5

RoBRA, 1979 VASSEUR et al.; 19844

cu**

1^ ç 1.05 0'62 0,5 VASSEUR 9!.-ù., 1986 ! +

c d '

'

zn**

4

) r o

5

2 , 5

1,7

-

1

o,75

4 +

C u '

'

cd++

cN-Ni++ zn++

3 , 5 - 0 , 8 - 0 ' 4

l m n - 8

t 2 - 4 - 2 ' 5

4 1 0 l m - ? n

û 4 - 2

MTCROTOX APPLICATION N 0 T E S - M . 1 0 2 - 1 9 8 1

o

o

_ 2 9 _

- TemÉrature dtexPosition

Les données bibliographiques concernant lrinfluence de la tenpérature drexposition sur Ia réponse de Photobacteriun phosphoreun aux toxiques sont

p e u n o m b r e u s e s , e t I a p l u p a r t d e s e s s a i s s o n t e f f e c t u é s à 1 5 o C .

FERARD et al. ( 1983) ont nontré que la toxicité des nétaux' cadmium' C u i v r e e f e r , z i n c , p l o m b à l r e x c e p t i o n d u c h r o m e , e s t a u g m e n t é e s i I r o n p a s s e d e 1 5 à 2 0 o C , I a d u r é e d ' e x p o s i t i o n é t a n t d e l 0 m i n u t e s .

D f a p r è s V A S S E U R e t a I . ( 1 9 8 4 ), lraugmentation du facteur tenpérature de 1 5 à 2 0 o C a p o u r c o n s é q u e n c e d ' a c c r o î t r e l a s e n s i b i l i t é d e s b a c t é r i e s a u cadmium et au zinc mais reste sans effet sur Ia toxicité du chrome et du c u i v r e , I e s e s s a i s é t a n t r é a l i s é s a p r è s 2 0 m i n . d r e x p o s i t i o n . P o u r l e b e n z è n e u n e t e m p é r a t u r e d e 2 o o c f a v o r i s e l a v o l a t i l i s a t i o n d u t o x i q u e e t s r o p p o s e d o n c à l a d é t e r n i n a t i o n d r u n e C I 5 0 ( V A S S E U R e t a I ' , 1 9 8 6 ) ' L r a u g m e n t a t i o n d e 1 a t e m p é r a t u r e e s t d o n c à p r o s c r i r e p o u r l e s c o m p o s é s v o l a t i l e s . E t l e p l u s s o u v e n t , c e f a c t e u r n e m o d i f i e q u e f a i b l e m e n t l e s r é s u l t a t s . 3 . 1 . 4 . I n f l u e n c e d e s p a r a m è t r e s p h y s i c o - c h i m i q u e s L r i n t e r a c t i o n d e s f a c t e u r s p h y s i c o - c h i m i q u e s s u r l a t o x i c i t é d e s s u b s t a n c e s t e s t é e s a é t é é v o q u é e p a r D U T K A e t K W A N ( 1 9 8 1 ) , B U L I C H e t a l ' ( 1 9 8 1 ) a i n s i q u e Q U R E S H I e t a l . ( 1 9 8 2 ) . C e s a u t e u r s o n t m i s l r a c c e n t s u r l e s p r o b l è m e s q u e p o u v a i e n t p o s e r l a c o l o r a t i o n d e s é c h a n t i l l o n s , I e u r t e n e u r e n o x y g è n e a i n s i q u e c e r t a i n e s v a l e u r s d e s a l i n i t é , d u r e t ê e t p H d a n s 1 r é v a l u a t i o n d e l a t o x i c i t é . - Coloration E n c e q u i c o n c e r n e I ' a b s o r p t i o n p o s s i b l e d e l a l u m i n e s c e n c e p a r l e s é c h a n t i l l o n s d e c o u l e u r b r u n - r o u g e , u n e s o l u t i o n a ê t ê t r o u v é e d a n s I ' a d o p t i o n drun système double cuve qui permet de prendre en compte la diminution de la l u m i n e s c e n c e b a c t é r i e n n e d u e à I a c o l o r a t i o n '

a

o

o

o

o

o

a

o

I I

a

- Teneur en oxygene La teneur en oxYgène n e s u r é e . D A N O U X ( 1 9 8 2 ) a m i l i e u r é a c t i o n n e l d e v a i t b i o l u n i n e s c e n c e . d e l ' é c h a n t i l l o n p e u t i n t e r f é r e r s u r I a t o x i c i t é d é m o n t r é q u e I a c o n c e n t r a t i o n e n o x y g è n e d a n s l e ê t r e s u p é r i e u r e à 3 n g / I p o u r n e p a s a f f e c t e r l a

o