octobre 2017 16
Dossier du participant
Restitution du programme national de recherche environnement santé travail
Rencontres scientifiques l’Ansesde
Maison de la RATP Espace du centenaire 189 rue de Bercy - 75012 Paris
Effets des molécules seules ou en mélange :
des biomarqueurs
aux modèles
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Éditorial
Le Programme national de recherche environnement santé travail (PNREST) est dédié à la production des connaissances utilisables indispensables à l’évaluation de risques, à court et moyen termes et il contribue également avec d’autres programmes, à soutenir la recherche sur la thématique des agents chimiques et à renforcer le vivier d’experts.
Le nombre important de projets traitant de la question des agents chimiques, près de la moitié des 254 lettres d’intentions soumises à l’appel à projets 2017, témoigne de l’importance du sujet, qu’il soit lié à l’exposition de la population générale ou à l’exposition professionnelle.
Les Rencontres scientifiques, organisées par l’Anses deux fois par an, ont pour objectif de présenter les connaissances acquises dans le cadre des projets de recherche financés par le PNREST et de favoriser les échanges entre les chercheurs et les divers acteurs de la société afin de contribuer à l’appropriation et à l’utilisation des connaissances produites.
A l’occasion de cette deuxième édition de l’année 2017, seront présentés les résultats de projets de recherche récemment achevés sur les molécules chimiques seules ou en mélange.
De par la diversité des molécules, de leurs effets potentiels et de leurs mécanismes d’action, les chercheurs présenteront des outils tels que des modèles mathématiques prédictifs ou de biomarqueurs. Seront également exposés les progrès méthodologiques réalisés dans le contexte réglementaire européen relatif aux substances actives phytopharmaceutiques et aux biocides ainsi que les travaux d’évaluation des risques sanitaires des mélanges de substances chimiques menés par l’Agence.
L’Anses souhaite que cette journée de restitution du PNREST soit un espace d’échanges, simple et direct, entre les chercheurs, les acteurs de la société et les gestionnaires de risques.
Roger GENET Directeur général de l’Anses
Session 1 – Biomarqueurs précoces de toxicité Validation de ERalpha36 comme marqueur prédictif de susceptibilité aux nonylphénols in vivo et in vitro
Clémence CHAMARD-JOVENIN1, Charlène THIEBAUT1, Amand CHESNEL1, Emmanuel BRESSO2, Chloé MOREL1, Malika SMAIL-TABBONE2, Marie-Dominique DEVIGNES2, Taha BOUKHOBZA1 et Hélène DUMOND1
1CNRS/Université de Lorraine, UMR 7039, Centre de recherche en automatique de Nancy, Vandœuvre-lès-Nancy ; 2LORIA, CNRS UMR 7503, Inria, Villers-lès-Nancy. Contact : helene.dumond@univ-lorraine.fr
Introduction
Depuis une trentaine d’années, de nombreuses études épidémiologiques soulignent l’augmentation significative de l’incidence des pathologies de l’appareil reproducteur et des cancers hormono-sensibles. Les substances chimiques incriminées sont notamment des perturbateurs endocriniens possédant une activité œstrogénique. Le projet NONYLER36, s’est focalisé sur l’impact de faibles doses d’un mélange réaliste d’alkylphénols présent dans de nombreux produits de la vie quotidienne. Les organes étudiés ont été le testicule et la glande mammaire puisque leur développement commence pendant la vie fœtale et s’achève après la puberté sous le contrôle des hormones stéroïdes. De plus, nous avons ciblé les voies de signalisation dépendante d’ERα36, un variant du récepteur ERα, décrit comme un acteur clé de la réponse non génomique aux estrogènes dans les tumeurs mammaires.
Matériels et méthodes
Nous avons étudié l’impact d’une exposition aux alkylphénols de cellules de cancer testiculaire d’origine germinale, séminomateuses (TCam-2) ou de carcinome embryonnaire (NT2/D1) in vitro et in vivo selon une approche multi-échelles. Selon la même stratégie expérimentale, nous avons ensuite exploré les conséquences d’une exposition aux alkylphénols de cellules épithéliales mammaires saines ou cancéreuses. Dans une dernière phase du projet, nous avons surexprimé ERα36, à la fois in vitro dans les cellules épithéliales mammaires saines ou cancéreuses et in vivo dans la glande mammaire ou la lignée germinale chez la souris transgénique pour ERα36, afin d’évaluer sa participation aux conséquences d’une exposition transgénérationnelle aux alkylphénols.
Résultats
In vitro, les cellules de cancer testiculaire d’origine germinale ont été exposées en cinétique ou dose réponse au mélange : la prolifération, la migration et le transcriptome ont été analysés. Nous avons ainsi montré que le mélange induit la prolifération des cellules de cancer testiculaire selon une courbe dose réponse non monotone.
Les effets observés dépendent de voies de signalisation PI3k/Akt/CREB, déclenchées par ERα36.
In vivo, nous avons également montré qu’un traitement aux alkylphénols accélère la croissance tumorale de greffons de cellules TCam2 chez la souris Nude. Afin de confirmer le rôle clé d’ERα36 dans les processus évoqués ci-dessus, nous avons produit un modèle unique de souris KI transgéniques pour ERα36, spécifiquement exprimé dans la lignée germinale.
Une seconde lignée transgénique exprimant spécifiquement ERα36 dans la glande mammaire, nous a permis d’explorer l’impact d’une exposition de la glande mammaire aux alkylphénols, montrant qu’ils (i) entrainent l’apparition d’un phénotype pré-néoplasique dans les cellules épithéliales mammaires saines et (ii) conduisent à une augmentation de l’agressivité de cellules cancéreuses mammaires par des voies non génomiques de réponse aux œstrogènes impliquant le récepteur ERα36. In vivo, l’exposition transgénérationnelle de souris C57BL/6 au mélange d’alkylphénols entraine une anomalie de la structure épithéliale mammaire avant la puberté.
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Finalement, nous avons cherché à savoir si l’expression d’ERα36 était nécessaire et/ou suffisante pour déclencher les voies de signalisation non génomique et les processus néoplasiques décrits précédemment en réponse au mélange d’alkylphénols.
Conclusion
L’ensemble des résultats obtenus dans le cadre du projet NONYLER36 a permis de dresser un tableau détaillé des effets de faibles doses d’alkylphénols et confirme le rôle clé joué par ERα36 dans le contrôle de leur mécanisme d’action. Il apparait ainsi que les alkylphénols seraient bien des perturbateurs endocriniens :
- agissant in vivo et in vitro à des doses inférieures aux NOAEL actuelles pour moduler des fonctions cellulaires ;
- capables de moduler des voies de signalisation œstrogéniques de type non-génomiques ; - présentant des effets transgénérationnels majeurs sur l’appareil reproducteur ;
- susceptibles d’être promoteurs d’altérations pré-néoplasiques sous condition d’exposition fœtale ou transgénérationnelle en lien avec les mécanismes décrits ci-dessus.
Il semble donc nécessaire de revoir à la baisse les doses acceptables d’exposition aux alkylphénols, en particulier pour les populations sensibles. L’aspect transgénérationnel est capital car il implique une prise en compte et une gestion du risque à long terme ainsi qu’une surveillance des générations futures.
Projet PNREST réalisé entre janvier 2013 et juin 2016.
Effets de l’exposition seule et multiple aux faibles
doses de phtalates et nonylphénol à l’âge adulte sur les réponses neuroendocrines et comportementales mâles
Daphné CAPELA1, Carlos DOMBRET1, Kevin POISSENOT2, Caroline PARMENTIER1, Hélène HARDIN- POUZET1, Valérie GRANGE-MESSENT1, Matthieu KELLER2, Isabelle FRANCESCHINI2,
Sakina MHAOUTY-KODJA1
1Sorbonne universités, UPMC Université Paris 06, Inserm, CNRS, Neuroscience Paris Seine, Institut de biologie Paris Seine ;
2Inra/CNRS UMR 85, Université François Rabelais, Nouzilly. Contact : sakina.mhaouty-kodja@upmc.fr
Introduction
Un constat alarmant des dernières décennies est l’augmentation de l’incidence de dysfonctionnements du système reproducteur, qui semblent associés à l’exposition aux perturbateurs endocriniens. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés au di(2-éthylhexyle) phtalate (DEHP) et nonylphénol (NP) dont l’utilisation résulte en une large contamination environnementale et qui présentent, respectivement, une activité anti-androgénique et œstrogénique. Or, la testostérone régule, via les voies de signalisation œstrogénique et androgénique, le circuit neural impliqué dans l’expression des comportements mâles. Les objectifs de ce projet ont été d’étudier les effets de l’exposition adulte seule ou combinée sur les réponses comportementales mâles et d’identifier les cibles de l’exposition à la dose à laquelle un effet a été observé.
Matériels et méthodes
Pour l’exposition seule, quatre groupes de souris mâles adultes C57BL/6J ont reçu oralement pendant 1 mois le véhicule, le DEHP ou le NP aux doses 0.5, 5 ou 50 µg/kg poids corporel/jour. La dose de 50 μg/kg/jour correspond à la dose journalière tolérable (DJT) alors que les deux autres doses encadrent la fourchette estimée pour l’exposition environnementale. A l’issue de l’exposition, les mâles ont été soumis à des tests comportementaux (accouplement, préférence olfactive, choix du partenaire, vocalisations ultrasonores…). Le système GnRH/
kisspeptine contrôlant la libération de testostérone a été également analysé par immunohistochimie et qRT- PCR. Une analyse de l’expression des récepteurs des androgènes et des œstrogènes a été effectuée. Par ailleurs, une analyse protéomique a été réalisée dans le cadre de l’exposition au DEHP. L’effet du mélange a été testé pour les deux doses les plus faibles.
Résultats
L’exposition adulte au DEHP aux doses 5 et 50 μg/kg/j altère la phase précopulatoire/motivationnelle du comportement sexuel en diminuant l’émission des vocalisations ultrasonores en présence de femelles sexuellement réceptives et l’attractivité des mâles, et en augmentant la latence de la première intromission.
L’analyse protéomique de la région préoptique hypothalamique indique la présence de protéines différentiellement exprimées entre les groupes exposés au véhicule ou au DEHP. De manière intéressante, une majorité de ces protéines se retrouve dans un réseau d’interaction avec le récepteur des androgènes, dont l’expression est « down-régulée » chez les mâles exposés au DEHP. Notre hypothèse est donc que l’exposition au DEHP exerce un effet anti-androgénique local au niveau du cerveau, puisque les niveaux circulants de testostérone et de l’axe gonadotrope ne sont pas affectés. Cela résulte en des modifications cellulaires dans le circuit neural impliqué dans l’expression du comportement sexuel, responsables des altérations comportementales observées.
L’exposition aux NP induit également des altérations comportementales, en particulier à la dose 5 μg/kg/j.
Ces altérations sont également associées à des niveaux circulants inchangés de testostérone, suggérant un effet au niveau central sur les voies de signalisation de cette hormone.
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Les études neuroanatomiques montrent, en effet, des changements dans les niveaux protéiques des récepteurs des œstrogènes et des androgènes dans le circuit neural impliqué dans l’expression du comportement sexuel.
Par ailleurs, certains effets sur des réponses non liées à la reproduction comme le poids corporel ou l’état d’anxiété ont été notés pour le NP à la dose de 5 μg/kg/j et pour le DEHP à la dose 50 μg/kg/j. Les résultats de l’exposition au mélange DEHP/NP viennent d’être analysés et seront discutés lors de la présentation orale.
Conclusion
Les résultats obtenus montrent une vulnérabilité du circuit neural impliqué dans l’expression du comportement sexuel à l’exposition adulte, période sous-estimée dans les études sur les perturbateurs endocriniens. Ces résultats sont pertinents pour les processus de reproduction, y compris chez l’humain car la régulation par la testostérone des fonctions sexuelles au niveau central est un processus assez bien conservé chez les mammifères. Le récepteur des androgènes neural représente la voie de signalisation majeure dans les effets adultes de la testostérone. De plus, la dysfonction érectile et la diminution de libido chez plusieurs individus infertiles ne semblent pas toujours liées à des altérations des niveaux hormonaux. Cette similitude avec nos données montrant que les souris exposées au DEHP ou NP présentent une dysfonction sexuelle malgré des niveaux normaux de testostérone suggère fortement que le récepteur des androgènes neural pourrait constituer l’une des cibles majeures de ces perturbateurs endocriniens. Par ailleurs, les effets que nous observons sont obtenus à de faibles doses d’exposition, ce qui repose la question des valeurs de référence actuelles pour ces deux molécules.
Projet PNREST réalisé entre avril 2013 et novembre 2016.
Effets multigénérationnels des perturbateurs
endocriniens (PE) à doses faibles (environnementales) et en mélanges et intégrité épigénétique
des spermatozoïdes
Jacques AUGER1, Florence EUSTACHE1, Badria BENNANI SMIRES1, Daniel VAIMAN1, Joan BARAU2, Julian IRANZO2, Déborah BOURC’HIS2
1Inserm U1016, Équipe génomique, épigénétique et physiopathologie de la reproduction, Institut Cochin et Université Paris Descartes, Paris ; 2Institut Curie, Unité de génétique et biologie du développement, Paris. Contact : jacques.auger@inserm.fr
Introduction
Le programme SPEPI fait suite aux travaux de l’équipe 1 ayant montré quelques modifications du phénotype développemental et reproductif chez des rats mâles non exposés aux PE (F2) issus de pères exposés de la conception à l’âge adulte à plusieurs PE (F1), seuls ou associés à des doses pertinentes par rapport aux expositions humaines. L’hypothèse de travail de SPEPI est que les spermatozoïdes en F1 sont le «vecteur»
des anomalies trouvées en F2, l’état des connaissances actuelles suggérant une dérégulation épigénétique des gamètes. SPEPI a pour but d’étudier principalement l’impact des expositions sur les niveaux d’expression des gènes testiculaires dans la progéniture mâle non exposée (F2) et le capital en petits ARN et les profils de méthylation génomique des spermatozoïdes (F1 et F2).
Matériels et méthodes
Les PE, bisphénol A (B, 5 µg/kg/j), génistéine (G, 1000 µg/kg/j) et vinclozoline (V, 1 µg/kg/j) ont été administrés par voie orale (B seul et mélanges VB, GB et GVB). Les testicules prélevés (F1 et F2) ont été conservés à différentes étapes du développement, néonatal, pré et post-pubère et jeune adulte, stade auquel des suspensions de spermatozoïdes (F1 et F2) ont été flushées dans les épididymes et conservées en vue du programme SPEPI. Les ARN testiculaires en F1 et F2 ont été extraits et quantifiés. Des pools d’échantillons ont été réalisés et l’analyse de l’expression des gènes testiculaires a été effectuée (puces Affymetrix). Une validation par RT-qPCR a été faite pour certains gènes d’intérêt modifiés. Les profils de petits ARN des spermatozoïdes ont été analysés par RNA-seq. Trois individus par catégorie d’exposition ont été séquencés individuellement.
Les profils de méthylation génomique de ces mêmes individus ont été analysés par Whole Genome Bisulfite sequencing (WGBS) en pool, avec en plus une analyse du groupe d’exposition B seul (aussi par pool de 3 individus).
La validation des régions identifiées a ensuite été réalisée par pyroséquençage en incluant de 12 à 15 individus par groupe d’exposition.
Résultats
Il existe en F2 non exposée des modifications significatives de l’expression d’un très grand nombre de gènes testiculaires aux différentes périodes du développement et jusqu’à l’âge adulte avec dans plusieurs conditions d’exposition, un plus grand nombre de gènes modifiés en comparaison à la F1 exposée. En F1, des modifications significatives de nombreux microARNs des spermatozoïdes - notamment des microARNs impliqués dans les structures et les fonctions des cellules germinales - ont été mises en évidence. L’analyse des fragments d’ARN de transfert (tfRNA) (F1) et celle du contenu en petits ARNs des spermatozoïdes de F2 est en cours. En ce qui concerne les profils de méthylation des spermatozoïdes en F1, un nombre restreint d’une vingtaine de régions différentiellement méthylées après exposition ont été identifiées par la méthode de pool. Afin de valider ces différences, nous avons analysé la méthylation de ces régions dans les spermatozoïdes de 12 à 15 individus par groupe d’exposition, par une méthode ciblée.
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De manière intéressante, ces régions réactives à l’exposition aux PE ont un taux de méthylation naturellement variable dans la population témoin en F1 ; chez les individus exposés, ces différences interindividuelles sont exacerbées ou au contraire, nivelées. Nous réalisons actuellement le séquençage génétique de ces régions, afin de cerner l’effet relatif de polymorphismes génétiques (fond non congénique de la lignée de rat Wistar) et de l’exposition aux PE sur les profils de méthylation.
Conclusion
L’exposition continue de rats mâles à de très faibles doses de PE isolés ou en mélanges modifie notablement l’expression dans la descendance de nombreux gènes testiculaires impliqués dans la structure et la fonction des cellules germinales. Après exposition au bisphénol A, seul ou associé à d’autres PE, il existe des différences très ciblées de méthylation des spermatozoïdes ainsi qu’une surexpression d’un certain nombre de micro- ARNs spermatiques impliqués dans les structures et fonctions testiculaires. Il faut souligner que les résultats originaux du programme SPEPI ont été obtenus dans des conditions s’approchant des conditions d’exposition de l’Homme (bien que les expositions environnementales concernent les générations successives chez ce dernier) à la différence de la plupart des études basées sur des doses d’exposition aux PE non réalistes. Ces résultats, s’ils ne permettent d’affirmer une implication fonctionnelle majeure de l’exposition environnementale aux PE sur la reproduction dans la descendance et de pointer des mécanismes d’action précis, invitent fortement à poursuivre et développer une recherche approfondie sur l’impact multi-/trans-générationnel des expositions environnementales aux PE, tant d’un point de vue fondamental que de santé publique.
Projet PNREST réalisé entre octobre 2013 et juillet 2017.
Comparaison des effets génotoxiques
de 160 mycotoxines sur des modèles cellulaires humains
Laure KHOURY, Daniel ZALKO, Marc AUDEBERT
Toxalim (Research Centre in Food Toxicology), Université de Toulouse, Inra/ENVT, INP-Purpan, Université Paul Sabatier, Toulouse. Contact : marc.audebert@inra.fr
Introduction
Les mycotoxines sont des composés issus du métabolisme secondaire de plusieurs espèces de moisissures.
Plus de 300 mycotoxines ont été identifiées à ce jour. Depuis quelques années, plusieurs rapports tendent à montrer que les mycotoxines représentent des dangers émergents en Europe. Notamment, l’Anses considère qu’un risque pour le consommateur ne peut être écarté. La nature des effets toxiques des mycotoxines est très variée. Certaines toxines exercent un pouvoir hépatotoxique, d’autres se révèlent néphrotoxiques ou neurotoxiques. Certaines mycotoxines sont reconnues ou suspectées d’être cancérogènes.
Cependant, seul un nombre limité de ces substances a fait l’objet d’études approfondies de toxicité, et encore moins en prenant appui sur des modèles cellulaires humains.
Matériels et méthodes
Le principal objectif du projet de recherche MYCO-TOX est de comparer les effets toxiques (cytotoxique et génotoxique) de 160 mycotoxines. Il doit permettre de mieux appréhender la toxicité de nombreuses mycotoxines, en prenant appui sur un test de génotoxicité innovant et quatre lignées cellulaires humaines issues des tissus cibles des mycotoxines.
La principale méthode mise en œuvre dans le projet MYCO-TOX est le test de génotoxicitéγH2AX/pH3 afin de comparer la génotoxicité et la cytotoxicité de 160 mycotoxines sur quatre lignées cellulaires humaines issues des tissus cibles des mycotoxines (foie, colon, rein et cerveau). Les lignées cellulaires rénale (ACHN) et neuroblastique (SH-SY5Y) sont dépourvues d’activité à l’inverse des lignées hépatique (HepG2) et issue de côlon (LS-174T) qui présentent toutes les deux une importante capacité de biotransformation des composés par les enzymes de phase I et II du métabolisme.
Résultats
Dans une première partie du projet, nous avons comparé la génotoxicité et la cytotoxicité de six mycotoxines et de six intermédiaires de la voie de biosynthèse des aflatoxines. La comparaison de nos résultats avec les données de cancérogenèse confirme le potentiel prédictif du test utilisé. En plus de la génotoxicité des produits finaux de la voie de biosynthèse des aflatoxines, on observe que certains précurseurs de cette voie de biosynthèse sont également génotoxiques. De plus certains de nos résultats nous laissent penser que certains composés pourraient être génotoxiques après une métabolisation particulière, non décrite à ce jour. Dans un deuxième temps, le criblage avec le test γH2AX/pH3 de 148 autres mycotoxines retrouvées dans l’alimentation a été réalisé.
Nous observons que seulement 71 (48%) n’ont pas de potentiel génotoxique, 59 (40 %) démontrent un potentiel clastogène, 13 (9%) un effet aneugène et 6 mycotoxines présentent des propriétés aneugène et clastogène.
Certaines mycotoxines présentent des potentiels génotoxiques plus importants que l’aflatoxine B1. L’analyse des résultats sur les différentes lignées cellulaires nous donne des indications importantes sur l’implication du métabolisme dans l’effet observé. Des travaux complémentaires pour déterminer les mécanismes génotoxiques particuliers mis en jeu (stress oxydant, adduits à l’ADN…) sont en cours.
Dans une dernière phase, nous étudierons le potentiel génotoxique de trois types de mélanges de mycotoxines. Seront analysés des mélanges de molécules issues de la même famille de mycotoxine, un mélange de molécules issues de différentes familles de champignons présentes sur les mêmes denrées et en dernier lieu
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un mélange des six mycotoxines recherchées dans les plans de surveillance nationaux et européens. Les données issues de ces expériences devraient nous permettre de déterminer s’il existe des effets de potentialisation, d’antagonisme ou de synergie d’action génotoxique entre les molécules testées.
Conclusions
A notre connaissance, ces travaux sont les premiers à comparer dans un même système biologique les potentiels toxiques de 160 mycotoxines sur des cellules humaines. Cette étude devrait apporter des éléments nouveaux permettant aux agences françaises et européennes d’évaluation du risque (Anses, Efsa…) de lever certaines incertitudes concernant le risque associé aux mycotoxines. En premier lieu, ces travaux devraient permettre de mieux cibler les mycotoxines à rechercher prioritairement dans l’alimentation. De plus, la modélisation des effets toxiques pourrait à terme aider à mieux caractériser le danger lié à la présence de ces composés pour les consommateurs par exemple en utilisant des facteurs d’équivalence toxiques pour ces contaminants.
Projet PNREST réalisé entre le novembre 2013 et juin 2017.
Session 2 – Conférences Anses
Risques cumulés des substances actives phytopharmaceutiques et biocides, travaux
méthodologiques dans le contexte réglementaire européen
Karine ANGELI
Anses, Maisons-Alfort. Contact : karine.angeli@anses.fr
Introduction
Une approche d’évaluation des risques « substance par substance » est actuellement systématiquement mise en œuvre pour les produits phytopharmaceutiques et biocides. Pour chaque substance active, des valeurs toxicologiques de référence spécifiques sont fixées et par comparaison aux expositions estimées, les risques pour la santé humaine sont quantifiés.
En outre les réglementations dédiées aux produits phytopharmaceutiques et biocides stipulent que la possibilité d’effets cumulés associés à une exposition combinée à plusieurs substances doit également être prise en compte pour l’évaluation de ces produits. Afin de développer des outils permettant d’appréhender cette problématique, des travaux méthodologiques ont été initiés au niveau européen.
Résultats
L’autorité européenne de sécurité des aliments (Efsa) a souhaité développer une approche permettant de réaliser des évaluations de risques associés à l’exposition à de multiples pesticides via l’alimentation. La méthodologie retenue repose sur l’identification de substances présentant des propriétés toxicologiques similaires pour un organe ou un système spécifique. Les groupes d’évaluation cumulative sont constitués selon les quatre étapes suivantes :
o L’identification du danger: identification d’effets toxiques spécifiques et non équivoques ayant une conséquence néfaste sur un organe ou un système cible.
o La caractérisation du danger : fixation pour chaque effet spécifique d’une dose sans effet néfaste observé et d’une dose minimale entraînant un effet néfaste observé.
o La collecte de données sur les indicateurs qui renseignent un effet toxique spécifique.
o La constitution de groupes de pesticides qui présentent un effet toxicologique similaire par organe ou système.
L’Anses en consortium avec le RIVM et l’IPCS a participé aux travaux d’identification de pesticides ayant des effets toxiques sur la thyroïde, le système nerveux, le système de reproduction/développement, le foie, les yeux et les glandes surrénales. Sur la base des monographies européennes, des rapports d’études ainsi que des données de la littérature, les effets spécifiques pour ces organes/systèmes de plusieurs centaines de substances phytopharmaceutiques ont été rapportés et caractérisés. Afin d’affiner davantage l’évaluation, les données mécanistiques renseignant le mode d’action sous-jacent ont également été rapportées lorsqu’elles étaient disponibles.
Une action additive est par défaut retenue par l’Efsa qui établira une substance de référence dans chaque groupe d’évaluation cumulative et calculera des facteurs de puissance relative pour les autres substances du même groupe.
Parallèlement à ces travaux portant sur les dangers, l’Efsa a développé pour le volet exposition un modèle probabiliste, le MCRA (Monte Carlo Risk Assessment).
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L’Agence européenne des produits chimiques (Echa) en partenariat avec les États membres, a également développé une méthodologie pour l’évaluation des risques associés à l’exposition combinée à plusieurs substances biocides. L’approche retenue repose également sur le concept d’additivité mis en œuvre par la méthode de l’indice de danger (HI). L’indice de danger consiste à additionner les quotients de danger (HQ) individuels de chaque substance visée par l’évaluation des risques cumulés. En première intention, le HQ est le rapport entre l’exposition à une substance individuelle et sa valeur de référence. En seconde intention afin d’affiner l’évaluation, des valeurs toxicologiques de référence sont établies pour chaque organe/système cible commun aux différentes substances.
La même démarche est suivie pour l’évaluation des risques cumulés associés à l’utilisation d’un produit phytopharmaceutique à base de plusieurs substances actives.
Conclusion
Un enjeu majeur de l’évaluation des risques est la prise en considération de l’exposition aux mélanges de substances chimiques. Dans le contexte règlementaire européen des produits phytopharmaceutiques, des outils sont actuellement développés pour mettre en œuvre une évaluation des risques cumulés associés à l’exposition à de multiples pesticides via l’alimentation.
Pour les produits phytopharmaceutiques et biocides contenant plusieurs substances actives une évaluation des risques cumulés consécutifs à leur utilisation est également réalisée avant homologation.
Les démarches préconisées sont des approches par étapes avec affinement progressif de l’évaluation des dangers et de l’exposition. Actuellement, le manque de données mécanistiques permettant d’établir les modes d’action sous-jacents aux effets spécifiques communs limite la mise en œuvre de niveaux supérieurs d’évaluation des dangers et la génération de telles données apparait cruciale.
Une harmonisation des approches s’avère en outre nécessaire pour permettre la prise en considération des substances et/ou usages relevant de réglementations différentes.
Mélanges de substances chimiques : comment les identifier et évaluer les risques pour la santé ?
Amélie CREPET
Anses, Maisons-Alfort. Contact : amelie.crepet@anses.fr
Introduction
Par son alimentation, son environnement ou dans le cadre de son travail, la population est quotidiennement exposée à un grand nombre de substances. Ces substances, considérées soit individuellement soit en mélange, peuvent avoir un effet néfaste sur la santé. Si les méthodes pour évaluer le risque lié aux substances prises individuellement sont aujourd’hui bien maitrisées, l’évaluation du risque lié à des mélanges de substances reste un enjeu majeur pour les années à venir. Elle pose de nombreuses questions méthodologiques comme par exemple : existe-t-il un effet mélange ? Est-il potentialisateur, synergique, additif ? Parmi l’ensemble des combinaisons possibles de substances, quels sont les mélanges prioritaires à étudier ? Comment évaluer le risque lié aux mélanges ?
Résultats
Cette présentation traite la question de la définition du mélange et celle de l’évaluation du risque. Une approche novatrice permettant de sélectionner les mélanges prioritaires à partir de données d’exposition uniquement ou en les combinant à de l’information sur les effets toxicologiques des substances sera présentée.
L’originalité de cette approche par rapport aux méthodes actuellement utilisées est qu’elle tient compte non seulement de la toxicité des substances mais également des niveaux des expositions et de leur concomitance.
En effet, dans le cas d’une exposition alimentaire, les méthodes statistiques utilisées permettent d’identifier, à partir d’un grand nombre de substances, celles qui se retrouvent dans un même régime alimentaire à des doses d’exposition élevées. Afin d’intégrer les caractéristiques toxicologiques des substances, celles-ci sont classées en sous-groupes d’exposition cumulée (Cumulative assessment groups, CAGs) et des facteurs de toxicité relative sont calculés à partir des doses sans effets (NOAELs) des différentes substances. L’exposition est ensuite multipliée par ces facteurs et les méthodes statistiques sont alors appliquées à ces expositions modifiées afin de définir des mélanges qui tiennent compte à la fois des niveaux d’exposition et de la toxicité des substances. Cette approche rend aussi possible d’associer les mélanges identifiés à des sous-groupes de populations avec des régimes alimentaires spécifiques. Il sera également expliqué comment estimer le risque lié à plusieurs substances à partir des facteurs de toxicité et sous l’hypothèse d’additivité des doses ou des effets. Ces approches seront illustrées par des applications sur des résidus de pesticides dans l’alimentation et sur différentes substances de l’étude de l’alimentation totale (EAT) réalisée par l’Anses.
Conclusion
Les travaux présentés apportent des éléments méthodologiques afin de prioriser les substances à étudier en mélanges pour leur toxicité et leurs effets sur la santé. Ils permettent aussi de proposer une évaluation du risque sous l’hypothèse d’additivité. Bien que la validité de cette hypothèse fasse consensus au niveau européen, celle-ci reste controversée et n’est pas systématiquement applicable à tous les mélanges.
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Session 3 – Modélisation d’effets des substances chimiques
Effets combinés de mélanges d’anti-androgènes chez l’homme
Pierre GAUDRIAULT1,2 , Séverine MAZAUD-GUITTOT1,2, Vincent LAVOUÉ3, Isabelle COIFFEC1,2, Laurianne LESNÉ1,2, Nathalie DEJUCQ-RAINSFORD1,2, Martin SCHOLZE4, Andreas KORTENKAMP4, Bernard JÉGOU1,2,5
1Irset/Inserm UMR1085, Rennes ; 2Université de Rennes 1, Rennes ; 3CHU de Rennes, Rennes ; 4Université de Brunel, Londres ;
5École des hautes études en santé publique, Rennes. Contact : bernard.jegou@inserm.fr ou bernard.jegou@ehesp.fr
Introduction
La question du risque lié à l’utilisation cumulée de produits chimiques a récemment pris de l’importance.
Ceci résulte du fait que l’homme est exposé simultanément à de multiples produits chimiques. Continuer à focaliser les recherches sur les produits chimiques « individuels » amènerait à sous-estimer le risque inhérent à l’utilisation de plusieurs produits chimiques simultanément. Il existe chez l’animal des preuves que les produits chimiques peuvent interagir : c’est le concept du « something from nothing » dont on n’a jamais démontré qu’il pouvait s’appliquer aux tissus humains. L’objectif principal de ce projet a été d’établir la preuve de concept que l’approche du « something from nothing », est applicable sur le testicule humain fœtal et adulte.
Matériels et méthodes
Le premier objectif de ce projet a consisté en l’établissement des courbes doses-réponses individuelles pour chacune des molécules sélectionnées, afin de déterminer leur plage de concentrations sans effet sur nos deux modèles culture ex vivo de testicules fœtaux (FEGA : FEtal Gonad Assay) et adultes (TEXAS : Testicular EXplant ASsay). Cette première étape a servi de pré-requis au deuxième objectif consistant, en collaboration avec le groupe du Pr A. Kortenkamp, à établir la composition de mélanges, testés ultérieurement sur le testicule humain.
La testostérone a été choisie comme paramètre central pour ce projet. Pour les deux modèles, l’effet de chaque molécule a été évalué par dosage de la testostérone dans les milieux de culture. La NOEL (No Observed Effect Level) de chaque molécule dans les deux modèles de culture a été déterminée. Les données ont été intégrées et modélisées mathématiquement pour être utilisées dans les calculs de prédiction.
Résultats
Ce projet a rempli ses deux objectifs, le premier étant la génération de données toxicologiques humaines sur 27 molécules, dont certaines (K11) se sont révélées exercer des effets anti-androgéniques. Le second, que ces perturbateurs endocriniens sont capables d’agir de concert sur un tissu biologique humain en exacerbant leurs propriétés anti-androgéniques. L’applicabilité de l’approche dite d’addition des concentrations dans la prédiction de tels effets chez l’homme a été démontrée. Les résultats de ce projet montrent pour la première fois que l’approche classique d’addition de doses permet de prédire de façon précise les effets combinés d’anti-androgènes aussi bien sur un tissu humain complexe en développement (fœtal) que sur un tissu humain totalement différentié (adulte). Nous avons démontré sur les tissus humains que les effets des mélanges expérimentalement obtenus sont prévisibles par l’utilisation de la théorie de l’additivité des doses. L’analyse informatique de ces effets combinés a permis de mettre en évidence à quel point les effets individuels des PEs mélangés sont potentialisés par la présence concomitante d’autres molécules.
Conclusion
Nous avons démontré que les effets de différentes molécules chimiques sur des testicules humains, adultes ou fœtaux, pouvaient être différents soit par nature, soit par les concentrations efficaces. Ce type d’évaluation sur les organes humains pour des molécules à haut risque suspecté s’avère donc pertinent pour l’évaluation des risques sanitaires liés à des candidats perturbateurs endocriniens pour lesquels il existe des faisceaux d’évidence.
L’approche expérimentale innovante que nous avons choisie, croisant méthodologies in silico et ex vivo, ouvre ainsi la voie vers une évaluation prédictive du risque cumulé en santé humaine. Ces résultats permettent d’entrevoir une meilleure évaluation du risque cumulé pour des polluants environnementaux chimiques. Prospectivement, ce travail ouvre donc la voie à une évaluation du risque cumulé entièrement prédictive, le test de toutes les combinaisons possibles devenant inutile.
Projet PNREST réalisé entre décembre 2012 et juin 2017.
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Analyse toxicogénomique des risques
neurodéveloppementaux associés aux retardateurs de flamme poly-bromo-di-phényl-éthers
Romain GUYOT, Fabrice CHATONNET, Benjamin GILLET, Sandrine HUGHES, Frédéric FLAMANT Institut de génomique fonctionnelle de Lyon, École normale supérieure de Lyon CNRS/Inra
Contact : frederic.flamant@ens-lyon.fr
Introduction
Le tetrabromobisphenol A (TBBPA) et les polybromodiphényls (PBDEs) sont des agents ignifugeants soupçonnés d’agir comme des perturbateurs thyroïdiens, en raison de leur analogie structurale avec l’hormone thyroïdienne. Ils pourraient donc en particulier présenter un danger pour le neurodéveloppement.
Nous avons trouvé que le TBBPA et l’un des PBDEs (BDE209) sont capables d’interagir avec la fonction des récepteurs nucléaires de l’hormone, dans des cellules rapporteurs. L’analyse du transcriptome par RNAseq de cellules neurales exposées, a permis d’atteindre une vision globale de la réponse cellulaire à ces agents ignifugeants. Ce type d’analyse pangénomique s’avère procurer une puissance statistique incomparable, et permet de quantifier des effets de très faible amplitude.
Matériels et méthodes
L’analyse du transcriptome d’une lignée de cellules neurales humaines permet d’appréhender globalement l’état des cellules et d’analyser l’intégralité des réponses à la stimulation par l’hormone thyroïdienne (T3). Le RNAseq, effectué sur un séquenceur SOLID, a été analysé avec les logiciels Bowtie, htseq et Deseq2, pour identifier les gènes inductibles par T3 et mesurer précisement le taux d’induction en présence de T3. Elle a été complétée et confirmée par une analyse en RT-qPCR.
Résultats
Des lignées rapporteurs ont été dérivées pour tester la capacité des agents chimiques à perturber le fonctionnement du récepteur nucléaire de la T3 TRα1. L’une est dérivée d’une lignée de fibroblastes humains et exprime un récepteur hybride Gal4-TRα1. L’autre est une lignée neurale murine C17.2 porteuse d’un transgène dérivé du gène cible de TRα1 Hairless. Nous avons testé sur ces lignées cellulaires diverses concentrations des divers composés, en présence de concentrations variables d’hormone thyroïdienne. Nous avons ainsi choisi des conditions d’exposition au TBBPA et de BDE209, dans lesquelles la réponse cellulaire à l’hormone thyroïdienne était décelable pour une analyse en RNAseq. Ceci a permis de quantifier très précisément la perturbation de la réponse hormonale.
Le TBBPA n’a un effet perturbateur que lorsqu’il est utilisé à 10-5 M, ce qui excède de loin les niveaux d’exposition plausibles de la population générale. A cette dose le TBBPA perturbe également l’expression d’un grand nombre de gènes dans les cellules neurales, sans rapport avec la signalisation thyroïdienne. Le BDE209, moins soluble, a également un effet significatif à 10-6 M, mais de très faible amplitude.
Ces données in vitro illustrent l’intérêt de la méthode RNAseq, appliquée dans un modèle cellulaire dont la réponse hormonale est parfaitement connue, qui permet d’atteindre une vision globale et non biaisée de l’état physiologique de la cellule.
Parce qu’elle repose sur l’analyse simultanée de l’expression de tous les gènes cibles des récepteurs nucléaires de l’hormone thyroïdienne, elle procure une puissance statistique incomparable, et permet de quantifier des effets de très faible amplitude. Notre équipe utilise désormais cette approche pour tester d’autres molécules, analyser l’effet des mélanges.
Elle tente également de transposer cette approche in vivo, ce qui permettrait d’évaluer plus directement les atteintes neurodéveloppementales induites par l’exposition aux produits chimiques.
Conclusion
Les concentrations actives dans nos tests sont très élevées, et l’amplitude des effets souvent très faible.
Dans ces conditions, nous avons renoncé à effectuer les tests in vivo prévus.
Projet PNREST réalisé entre février 2014 et février 2016.
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Effet du DDT, perméthrine et leur mélange sur des hépatocytes de rat cultivés en biopuce microfluidique : identification des biomarqueurs d’hépatotoxicité
par métabolomique et transcriptomique
Rachid JELLALI1, Françoise GILARD2, Patrick PAULLIER1, Marie-José Fleury1, Sébastien JAQUES3, Cécile LEGALLAIS1, Eric LECLERC1,4
1Sorbonne universités, Université de technologie de Compiègne, CNRS, UMR 7338, Biomécanique et Bioingénierie, Centre de recherche Royallieu, Compiègne ; 2Institut des sciences des plantes Paris-Saclay (IPS2), UMR 9213/UMR1403, CNRS, Inra, Université Paris-Sud, Université d’Evry, Université Paris-Diderot, Paris ; 3Inserm U1016, Plate-forme génomique, Institut Cochin, Paris ; 4CNRS/LIMMS/UMI 2820, Institut de science industrielle, Université de Tokyo, Meguro ku, Japon.
Contacts : cecile.legallais@utc.fr ; eric.leclerc@utc.fr
Introduction
Depuis plusieurs années, la Commission européenne insiste sur la nécessité de réduire l’expérimentation animale et de favoriser le développement des approches in vitro et in silico. Cependant, la majorité des tests de toxicité in vitro sont réalisés avec des cultures cellulaires en boites de Pétri, qui ne reproduisent pas les conditions physiologiques in vivo. La culture cellulaire dans des biopuces microfluidiques présente le potentiel pour surmonter les inconvénients des techniques de culture classiques : architectures 3D, cultures dynamiques, phénomène de zonation et possibilité de réaliser des co-cultures [1, 2].
Des études antérieures de notre équipe ont permis de développer une approche “omics-on-a-chip”, qui permet d’identifier les marqueurs de toxicité d’une substance en déterminant le profil métabolomique, transcriptomique et protéomique des cultures cellulaires en biopuces [3-5]. Dans cette étude, nous avons utilisé cette approche pour identifier les biomarqueurs spécifiques de la réponse cellulaire à une exposition aux pesticides, DDT et permethrin (PMT).
Matériels et méthodes
Les hépatocytes de rat fraichement extraits ont été cultivés dans des biopuces microfluidiques en utilisant la plateforme « Cultures Cellulaires Dynamiques Intégrées en Microsystèmes » (CCDIM) développée dans notre laboratoire [6]. Les expériences ont été réalisées pour une durée de 72h : 24h de culture en conditions statiques (adhésion cellulaire), suivies de 48h de culture sous perfusion dynamique. Les hépatocytes ont été exposés au DDT (15 et 150 µM), PMT (15 et 150 µM) et des mélanges DDT/PMT. A la fin de chaque expérience, le milieu de culture et les cellules ont été collectés et stockés à -80°C. La viabilité cellulaire a été estimée par comptage après marquage au bleu trypan. Des marquages au 2’,7’-dichlorofluorescine-diacetate (DCFDA) et calcéine AM/
iodure de propidium ont été effectués pour évaluer, respectivement, le stress oxydant et la viabilité/nécrose cellulaire. Le métabolisme de base a été estimé en mesurant la consommation de glucose et les productions d’albumine et d’urée [7]. Les analyses métabolomiques ont été réalisées par chromatographie gazeuse couplée à un spectromètre de masse en utilisant le milieu de culture récolté [8]. Enfin, les analyses transcriptomiques ont été effectuées selon la méthode décrite précédemment par Prot et al. [3].
Résultats
Après 24h d’exposition, les hépatocytes traités avec 15 µM de DDT ou PMT présentent des morphologies similaires au témoin. De plus, le nombre de cellules était proche du nombre de cellules déterminé après la phase d’adhésion. En revanche, l’exposition aux concentrations élevées (150 µM DDT ou PMT) et au mélange de pesticides (DDT15 µM/PT15 µM, DDT15 µM/PT150 µM and DDT150 µM/PT15 µM) entraine une diminution importante du nombre de cellules vivantes (25 à 50% de cellules en moins par rapport au témoin).
Le marquage au DCFDA a révélé une augmentation de la concentration en espèces réactives oxygénées (ROS) indiquant un stress oxydant pour tous les échantillons exposés aux pesticides. Dans les hépatocytes traités avec des concentrations élevées (150 µM), la production de ROS a été 3 fois supérieure à la concentration mesurée chez le témoin.
Les analyses métabolomiques ont révélé que l’exposition des hépatocytes au DDT150 µM, DDT150 µM/
PMT15 µM, PMT150 µM, DDT15 µM/PMT150 µM et DDT150 µM/PMT150 µM, entraine d’importantes modulations des intermédiaires de la voie de glutathion et du cycle de Krebs, des acides aminés et des biomarqueurs d’apoptose. Ces changements ont été plus importants après des expositions à des mélanges de pesticides.
L’exposition au DDT à 150 µM entraine une augmentation significative des niveaux de benzoate, decanoate, octanoate, palmitate, stearate et tetradecanoate, ce qui illustre une modulation de la voie des œstrogènes.
L’analyse métabolomique a permis également de mettre en évidence les interactions DDT/PMT dans le cas des mélanges (effets additifs, antagonistes et synergiques).
Enfin, l’analyse transcriptomique a montré une modulation des gènes impliqués dans le stress oxydant, métabolisme des xénobiotiques, métabolisme des acides gras/lipides et l’inflammation du foie et la mort cellulaire. Les faibles concentrations de DDT et PMT (15 µM) n’avaient pas d’effets significatifs sur les profils métabolomique et transcriptomique.
Conclusion
En conclusion, dans le cadre de cette étude, nous avons étudié l’effet de deux pesticides (DDT et PMT) et de leur mélange sur des hépatocytes de rat cultivés en biopuce microfluidique. L’utilisation de biopuce microfluidique permet de mimer un environnement proche des conditions physiologiques in vivo. Les signatures métabolomique et transcriptomique des effets de DDT et PMT sur les hépatocytes ont été déterminées. Les résultats obtenus sont en accord avec les analyses de viabilité cellulaire, stress oxydant et métabolisme (glucose, urée et albumine).
Actuellement, les résultats présentés (combinés avec d’autres résultats) sont utilisés dans des modèles mathématiques in silico pour l’évaluation de la toxicité et de la toxicologie prédictive.
Références
[1] D. Huh, G.A. Hamilton, D.E. Ingber, From 3D cell culture to organs-on-chips, Trends Cell Biol. 21 (2011) 745-754.
[2] S.N. Bhatia, D.E. Ingber, Microfluidic organs-on-chips, Nat. Biotechnol, 32 (2014) 760-772.
[3] J.M. Prot, A. Bunescu, B. Elena-Herrmann, C. Aninat, L. Choucha Snouber, L. Griscom, F. Razan, F.Y. Bois, C. Legallais, C.
Brochot, A. Corlu, M.E. Dumas, E. Leclerc, Predictive toxicology using systemic biology and liver microfluidic “on chip” approaches:
Application to acetaminophen injury. Toxicol. Appl. Pharmacol., 259 (2012) 270-280.
[4] L. Shintu, R. Baudoin, V. Navratil, J.M. Prot, C. Pontoizeau, M. Defernez, B.J. Blaise, C. Domange, A.R. Péry, P. Toulhoat, C.
Legallais, C. Brochot, E. Leclerc, M.E. Dumas, Metabolomics-on-a-Chip and Predictive Systems Toxicology in Microfluidic Bioartificial Organs, Anal. Chem. 84 (2012) 1840-1848.
[5] D.A. Ouattara, J.M. Prot, A. Bunescu, M.E. Dumas, B. Elena-Herrmann, E. Leclerc, C. Brochot, Metabolomics-on-a-chip and metabolic flux analysis for label-freemodeling of the internal metabolism of HepG2/C3A cells, Mol. BioSyst. 8 (2012) 1908-1920.
[6] R. Baudoin, G. Alberto, P. Paullier, C. Legallais, E. Leclerc, Parallelized microfluidic biochips in multi well plate applied to liver tissue engineering, Sens. Actuator. B, 173 (2012) 919-926.
[7] R. Jellali, P. Paullier, M.J. Fleury, E. Leclerc, Liver and kidney cells cultures in a new perfluoropolyether biochip. Sens. Actuator.
B, 229 (2016) 396-407.
[8] P. Zeller, A. Legendre, S. Jacques, M.J. Fleury, F. Gilard, G. Tcherkez, E. Leclerc, Hepatocytes cocultured with Sertoli cells in bioreactor favors Sertoli barrier tightness in rat, J. Appl. Toxicol., 37 (2017) 287-295.
Projet PNREST projet réalisé entre janvier 2015 et juin 2016.
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Identification et classification de composés
reprotoxiques par des approches de toxicogénomique prédictive
Thomas DARDE1,2, Estelle LECLUZE1, Emmanuelle BECKER1, Victoria POTDEVIN1, Clément LANCIEN1, Olivier SALLOU2, Olivier COLLIN2, Bernard JEGOU1, Antoine ROLLAND1, Frédéric CHALMEL1
1IRSET/Inserm U1085, Rennes ; 2Genouest Bioinformatics Platform, IRISA, Rennes. Contact : frederic.chalmel@inserm.fr
Introduction
Une des hypothèses centrales dans le domaine de la toxicologie prédictive est que des substances possédant des signatures moléculaires proches présentent les mêmes effets toxicologiques (Steiner et al., 2004). L’objectif du projet ChemPSy était d’appliquer ce concept de manière systématique, en explorant les données toxicogénomiques disponibles dans les banques publiques via des approches bio-informatiques et bio-statistiques. Cette étude de faisabilité incluait notamment trois étapes permettant : i) de regrouper les composés sur la base des gènes dont ils affectent l’expression ; ii) d’associer les classes obtenues à des toxicités sur la base des substances toxiques connues au sein de celles-ci ; iii) d’associer de nouveaux composés à ces classes afin de prédire leur toxicité.
Matériels et méthodes
Un jeu de données transcriptomiques a été constitué à partir d’expériences toxicogénomiques utilisant la même technologie. Les données brutes ont été normalisées par la méthode RMA avec les environnements CDF BrainArray. Pour chaque condition expérimentale (un composé testé à une dose, un temps et dans un tissu donné) (CE), les échantillons exposés ont été comparés à leurs contrôles afin d’identifier les gènes dont l’expression était altérée. Les CEs présentant une signature toxicogénomique proche ont ensuite été regroupées en combinant analyses exploratoires multivariées et méthodes de classification non-supervisées. Les classes obtenues ont été associées à des effets toxiques par des calculs d’enrichissement (loi hypergéométrique) à partir des informations fournies par la Comparative Toxicogenomics Database (CTD). Enfin, des validations in vitro et ex vivo sont en cours pour confirmer l’effet perturbateur endocrinien et repro-toxique potentiel de certaines substances.
Résultats
Dans son ensemble, le jeu de données assemblé inclut la réponse transcriptionnelle de sept tissus de rat (foie, rein, cœur, muscle lisse et dans une moindre mesure cerveau, testicule et ovaire) après une exposition à 452 composés chimiques (plusieurs doses et temps d’exposition), pour un total de plus de 26 357 fichiers bruts.
La filtration statistique des données a permis d’obtenir 7 076 signatures toxicogénomiques (une pour chaque CE) dont 3 022 contenaient au moins dix gènes dérégulés. L’ensemble de ces données a été résumé sous la forme de deux matrices, l’une reportant les différentiels d’expression (fold-change), l’autre des informations discrétisées.
Cinq méthodes de classifications ont été évaluées et l’une d’entre elles a donné des résultats prometteurs sur les deux matrices préalablement traitées par des approches exploratoires (ACP). Au final, 95 classes ont été obtenues et ont été associées individuellement à de multiples effets toxicologiques. Trois classes d’intérêt ont particulièrement attiré notre attention puisqu’elles contenaient un nombre significatif de perturbateurs endocriniens ou de substances repro-toxiques. Au total, 22 substances appartenant à ces trois groupes ont été retenues pour des validations expérimentales actuellement en cours de réalisation.
Cette étude de faisabilité a été valorisée par la mise à disposition de deux outils web : the ReproGenomics Viewer (Darde et al., 2015, NAR) et the TOXsIgN repository (Darde et al., en cours de soumission).
L’outil de prédiction/priorisation sera soumis dans quelques mois lorsque les validations seront achevées et sera mis à disposition de la communauté via TOXsIgN (Darde et al., manuscrit en préparation).
Conclusion
Cette étude de faisabilité a notamment permis d’étendre le postulat énoncé par Steiner et ses collaborateurs en 2004. En effet, nos approches ont permis le regroupement de substances chimiques ayant des toxicités proches. Nous avons notamment démontré une corrélation linéaire très significative entre similarité toxicogénomique et similarité toxicologique pour des milliers de CE (Darde et al., en cours de soumission dans l’article sur TOXsIgN).
Afin de mettre à la disposition de la communauté scientifique l’ensemble des 7 076 signatures identifiées dans ce projet, nous avons développé l’espace de dépôt TOXsIgN : http://toxsign.genouest.org (Darde et al., en cours de soumission). Ce dernier a également pour vocation d’héberger les outils de toxicologie prédictive développés dans le cadre de ce projet.
Enfin, les méthodologies mises en place ont permis d’identifier une vingtaine de substances chimiques dont l’effet perturbateur endocrinien est en cours de validation.
Projet PNREST réalisé entre septembre 2014 et septembre 2017.
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Identification d’analogues de composés industriels dépourvus d’activité résiduelle hormonale à l’aide
d’outils biologiques, biochimiques et bio-informatiques
Audrey DEYAWE1, Jean-Luc PONS1, Gilles LABESSE1, Vanessa DELFOSSE1, William BOURGUET1, Abdel BOULAHTOUF2, Marina GRIMALDI2, Patrick BALAGUER2
1Centre de biochimie structurale, Inserm/CNRS-UM, Montpellier ; 2Institut de recherche en cancérologie de Montpellier, Inserm/
UM, Montpellier. Contact : bourguet@cbs.cnrs.fr
Introduction
L’exposition à des perturbateurs endocriniens (PEs) comme les bisphénols, les phtalates, les parabènes, les benzophénones ou les pesticides est suspectée de perturber la reproduction (infertilité, puberté précoce), le métabolisme (obésité, diabète) et de conduire à des cancers (sein, ovaire, prostate). Les actions de ces PEs passent généralement par la liaison à des récepteurs nucléaires (RN) tels que les récepteurs des estrogènes (ERα/β) ou le récepteur activé par les proliférateurs des peroxysomesγ (PPARγ). L’identification ou le développement de nouveaux composés conservant leurs propriétés industrielles mais dénués d’activité hormonale pourrait être facilitée par des études structurales révélant, à l’échelle atomique, les modes de liaison des PEs à leurs récepteurs cibles.
Matériels et méthodes
Dans ce projet nous avons utilisé et/ou développé des outils biologiques, biophysiques, biochimiques, structuraux et bio-informatiques afin de caractériser et de prédire les modes de liaisons de n’importe quel composé chimique avec les RN ainsi que l’affinité des interactions.
Plus précisément, nous avons (i) développé un serveur capable de modéliser l’interaction des récepteurs ERα, ER β et PPARγ avec plusieurs familles de PEs, (ii) validé les résultats obtenus in silico par des tests d’activation transcriptionnelle à l’aide de lignées cellulaires bioluminescentes, (iii) réalisé des études cristallographiques afin d’enrichir la banque de modèles structuraux utilisables pour la modélisation ou de valider les prédictions bio- informatiques, et (iv) complété la caractérisation des interactions par des méthodes biochimiques/biophysiques (anisotropie de fluorescence pour mesurer l’interaction avec les coactivateurs transcriptionnels, mesures de l’affinité des composés par compétition contre un ligand radioactif, estradiol tritié par exemple).
Résultats
Nous avons caractérisé les activités ERα/β et PPARγ d’un grand nombre de PEs. Nous avons pu comparer les activités de ces PEs dans les mêmes modèles cellulaires et les classer par ordre d’activité. Nous avons également caractérisé les activités d’analogues de ces PEs et pouvons ainsi proposer des substituts dénués d’activité hormonale. Pour les ERs, les molécules les plus actives sont les mycoestrogènes (zéaralénone) et certains phytoestrogènes (férutinine, génistéine). Parmi les molécules anthropiques, celles qui sont les plus affines sont les bisphénols et alkylphénols. Pour certaines familles nous avons identifié plusieurs composés peu ou pas actifs (les bisphénols BPAP, BPFL, BPPH, le phtalate MEHP, la benzophénone BP3 ou encore le méthylparabène) qui pourraient constituer des substituts aux molécules utilisées actuellement. Des résultats similaires ont été obtenus avec PPARγ pour lequel nous avons pu identifier le phtalate de di-butyle (DBP) et l’acide perfluoroundécanoïque (PFUnDA) comme substituts, respectivement, des phtalates et composés perfluorés.
Le serveur EDMon (Endocrine Disruptor Monitoring) a été testé sur les trois récepteurs et une grande variété de ligands. Le serveur a bénéficié tout au long de l’étude de diverses optimisations et principalement de l’augmentation de la base de structures expérimentales déterminées au laboratoire permettant d’améliorer les prédictions. Pour la majorité des composés, le serveur a détecté une pose considérée comme correcte d’après les paramètres de qualité utilisés. Les évaluations a posteriori par cristallographie ont confirmé la qualité des prédictions. Le point faible du serveur réside dans le calcul de l’affinité de liaison par les fonctions de scores.
EDMon n’estime actuellement que les termes enthalpiques de l’interaction récepteur-ligand. Nous envisageons une prise en compte des coûts entropiques mais de nouveaux outils méthodologiques seront alors nécessaires (prédicteurs de conformations multiples, simulation de la flexibilité du ligand et des récepteurs).
Conclusions
Nous avons mis au point et validé un panel de techniques cellulaires, biochimiques et cristallographiques de caractérisation des activités ERα/β et PPARγ de PEs et de certains de leurs analogues structuraux. Ces différentes techniques nous ont permis d’améliorer notre méthode de modélisation et de compléter notre batterie d’outils de caractérisation. Nous avons résolu de nouvelles structures venant enrichir la banque de structures utilisée par le serveur EDMon. L’apport des mesures expérimentales nous a permis d’affiner les protocoles utilisés par le programme afin de minimiser l’écart entre les prédictions et les mesures. Pour certaines familles de composés (bisphénols, parabènes, perfluorés, …), nos travaux ont permis d’identifier les molécules présentant les activités ERα/β et PPARγ les plus faibles et de donner ainsi des indications sur les molécules qui pourraient être utilisées en substitution. Cette démarche pourrait être réalisée pour d’autres RNs cibles de PEs comme les récepteurs stéroïdiens (AR, GR, MR et PR), PPARα, les récepteurs des xénobiotiques (PXR et CAR), ou des récepteurs non encore étudiés pour leur capacité à interagir avec les molécules environnementales (LXRα/β, RARα/β/γ).
Projet PNREST réalisé entre novembre 2013 et mars 2016.
