ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE

(1)

REPUBLIQUE DU BENIN

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MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI

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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI

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DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE Option : Analyses Biomédicales

RAPPORT DE FIN DE FORMATION POUR L’OBTENTION DU DIPLOME DE LICENCE PROFESSIONNELLE

THEME :

Présenté par :

Coryelle Hosana Fènou ADJAKOTAN

Sous la direction de :

Tuteur : Superviseur :

DrJérrold AGBANKPE

ANNEE ACADEMIQUE 2016-2017 10^ème promotion de Licence Professionnelle

ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE

a

Enseignant - chercheur au laboratoire de biologie appliquée à l’EPAC/UAC

Dr Victorien T. DOUGNON, PhD Enseignant-chercheur à l’EPAC/UAC

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ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE i

REPUBLIQUE DU BENIN

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MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI

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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI

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DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE

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Option : Analyses Biomédicales

DIRECTEUR DIRECTEURADJOINT

Professeur SOUMANOU Mohamed Professeur AHOUANNOU Clément

CHEF DE DEPARTEMENT Docteur Pascal S. ATCHADE

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ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE ii n° Noms et Prénoms Matières enseignées

1 AHOYO Théodora Angèle Microbiologie /

Santé publique et Hygiène hospitalière 2 AKPOVI Casimir Biologie cellulaire/

Physiologie des régulations/

Biochimie

3 ANAGO Eugénie Biochimie

4 ATCHADE S. Pascal Parasitologie/Entomologie médicale/Physiopathologie 5 BANKOLE Honoré Bactériologie appliquée

6 DOUGNON Victorien Informatique médicale/

Microbiologie /

Méthodologie de la Recherche 7 LOKO Frédéric Biochimie clinique

8 LOKOSSOU Gatien Immunologie

9 LOZES Evelyne Immunologie

10 SEGBO Julien Biologie moléculaire/

Biochimie clinique

11 YOVO Paulin Pharmacologie /Toxicologie

LISTE DES ENSEIGNANTS DU DEPARTEMENT DE GBH

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ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE iii ENSEIGNANTS VACATAIRES

n° Noms et Prénoms Matières enseignées

12 ABLEY Sylvestre Déontologie médicale 13 AGBANGLA Clément Génétique moléculaire 14 AGOSSOU Gilles Législation/Droit du Travail 15 AKOWANOU Christian Physique

16 ALITONOU Guy Chimie

17 ANAGONOU Sylvère Education Physique/Sportive 18 DESSOUASSI Noël Biophysique des solutions 19 DOSSEVI Lordson Techniques Instrumentales

20 DOSSOU Cyriaque Techniques d’Expression et Méthodes de Communication

21 GANDJI Sewes Anatomie générale 22 HOUNNON Hippolyte Mathématiques 24 HOUNSSOSSOU Hubert Biostatistique

25 KOFFI Aristide Anglais

26 Père MASLOKONOU Vincent Histologie générale

27 SECLONDE Hospice Immuno-hématologie et Transfusion sanguine

28 SENOU Maximin Histologie appliquée/Histologie générale 29 SOEDE Casimir Anglais technique

30 TOHOYESSOU Zoé Soins infirmiers 31 TOPANOU Adolphe Hématologie

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ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE iv DEDICACE

A DIEU Tout Puissant pour ses bienfaits.

DEDICACE

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ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE v REMERCIEMENT

A ma mère TANGBE Joséphine,

merci pour l’éducation et pour tous les sacrifices consentis à mon égard.

A mes frères et sœurs,

qui m’ont servi d’exemple à suivre et à dépasser ! A ADDA C. B. Oluwafèmi,

pour son soutien inconditionnel !

A l’endroit de notre superviseur Dr Victorien DOUGNON,

vous avez bien voulu superviser ce travail et donner de votre temps et de votre intelligence à la réussite de ce travail en dépit de vos multiples occupations. Vous avez été ouverts à nos nombreuses préoccupations. Ce travail représente pour nous un modèle de réussite et une source de motivation permanente. Trouvez ici l’expression de notre profonde gratitude !

A la sage famille : M. Blaise TCHEKPO, responsable du laboratoire ; M.

Fructueux ASSOGBA, surveillant du laboratoire ; Mme Peace ADIMOU ; M. Roland BOCO ;Aimé KANSOULO ;

merci pour vos conseils et votre disponibilité.

A tous les enseignants de notre département et tous les moniteurs des travaux pratiques ;

A tous mes camarades de licence promotion 2016-2017, pour cette bonne ambiance.

A tous ceux et à toutes celles qui de près ou de loin ont contribué à la réalisation de ce travail,

merci infiniment.

REMERCIEMENTS

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ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE vi HOMMAGES

 A l’endroit du Président du Jury,

C’est un grand honneur que vous nous faites en acceptant de présider notre Jury de soutenance du rapport de fin de formation. Nous vous rassurons que vos apports et critiques seront les bienvenus pour son amélioration. Veuillez trouver ici, l’expression de nos hommages respectueux.

 Aux Honorables membres du Jury,

Nous sommes touchées par l’honneur que vous nous faites en acceptant de siéger dans le Jury de soutenance de notre rapport de fin de formation. Vos remarques et suggestions contribueront à l’amélioration de la qualité scientifique de ce travail. Veuillez trouver ici, l’expression de notre profonde gratitude et de nos sincères considérations.

HOMMAGES

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ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE vii LISTE DES ABREVIATIONS

LISTE DES ABREVIATIONS

EPAC : Ecole polytechnique d’Abomey-Calavi CHD : Centre Hospitalier Départemental

°C : Degré Celsius

G : Gramme

µ : Micron

Ml : Millilitre

Mm : Millimètre

% : Pourcentage

GBH : Génie de Biologie Humaine

U.R.M.A.Pha : Unité de Recherche en Microbiologie Appliquée et Pharmacologie des substances naturelles

µL XLD

: :

Microlitre

Xylose-Lysine-Désoxycholate SCB : Bouillon Sérénite-Cystine

S : Salmonella

LISTE DES ABREVIATIONS

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ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE viii LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Photo de l’état frais de Shigella spp... 35 Figure 2 : Photo de l’état coloré de Shigella spp... 36 Figure 3 : Image du bouillon sélénite cystine (témoin négatif)…. 37 Figure 4 : Image du bouillon sélénite cystine (réaction)………... 37 Figure 5 : Photo des colonies de Shigella spp sur le milieu XLD. 38 Figure 6 : Image de la galerie API 20E (Témoin négatif)………. 39 Figure 7 : Image de la galerie API 20E de la souche bactérienne. 39

LISTE DES FIGURES

(10)

ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE ix SOMMAIRE

INTRODUCTION ... 1

PARTIE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ... 4

1.Caractères généraux des entérobactéries ... 5

2. Shigelles ……….7

PARTIE 2 : MATERIEL ET METHODES ... 11

1.Cadre de d’étude ... 12

2.Matériel ... 17

3.Méthodes ... 19

PARTIE 3 : RESULTATS ET COMMENTAIRE ... 24

1.Résultats ... 25

2. Commentaire ... 29

CONCLUSION ... 31

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 32

TABLE DES MATIERES ... 36

SOMMAIRE

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ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE x RESUME

La shigellose est par excellence une maladie de l’insuffisance d’hygiène le plus souvent transmise directement du malade à son entourage ou par l’intermédiaire d’eau et d’aliments souillés par Shigella spp.

Le présent travail a pour objectif de contribuer à une meilleure connaissance des souches pathogènes tout en maîtrisant les techniques d’identification de Shigella spp dans une matrice.

Ainsi, pour réaliser ce travail, une souche de référence Shigella spp a été utilisée. Des états frais et colorés ont été réalisés et observés. Une caractérisation bactériologique de la souche a été faite selon la méthode de l’Agence Française de Normalisation (AFNOR). Après le pré-enrichissement et l’enrichissement sélectif, les bactéries ont été isolées sur un milieu sélectif spécifique Xylose Lysine Désosycholate de sodium (XLD), puis identifiées avec la galerie API 20E. Cette souche a été incorporée dans une matrice, en l’occurrence la tomate.

Ensuite, elle est ré-isolée et identifiée avec la galerie API20E.

L’état frais a révélé des bactéries immobiles. Quand à l’état coloré, des bacilles Gram négatif ont été observés. L’isolement sur milieux XLD a montré des colonies rouges lisses et rondes. A l’identification avec la galerie API 20E, les caractères biochimiques ont été conformes à ceux de Shigella spp.

Mots-clés : Bactéries -Souche pathogène-Santé publique-Développement.

RESUME

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ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE xi ABSTRACT

Shigellosis is by excellence a disease of poor hygiene most often transmitted directly from the patient to those around him or through water and food soiled by Shigella spp.

The present work aims to contribute to a better knowledge of the pathogenic strains while mastering the techniques of identification of Shigellaspp in a matrix.

Thus, to carry out this work, a Shigellaspp reference strain was used. Fresh and colorful states were made and observed. A bacteriological characterization of the strain was made according to the method of the French Agency for Standardization. After pre-enrichment and selective enrichment, the bacteria were isolated on selective medium Xylose Lysine Sodium Desosycholate and identified with the API 20E gallery. This strain has been incorporated in a matrix, in this case tomato. Then, it is re-isolated and identified with the API 20E gallery.

The fresh state revealed immobile bacteria. When in the colored state, Gram negative bacilli were observed. Isolation on XLD media showed smooth, round red colonies. Upon identification with the API 20E gallery, the biochemical characteristics were consistent with those of Shigella spp.

Key words: Bacteria-Pathogen-Public Health-Development.

ABSTRACT

(13)

ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE 1 INTRODUCTION

INTRODUCTION

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ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE 2

La dysenterie bacillaire due à Shigella spp est répandue dans le monde entier mais elle sévit surtout dans les régions aux conditions d’hygiène précaires et est endémique en zone tropicale (Bennish , 1991 ; Bingen , 2004).

Les infections à Shigella occupent une place importante dans la morbidité et la mortalité liées aux maladies diarrhéiques chez les enfants de moins de 5

ans. Elles sont responsables annuellement de 163,2 millions d’épisodes de dysenterie bacillaire avec 1,1 millions de décès dans le monde (Taneja et al.

2005).

Dans les pays tropicaux en voie de développement comme le Bénin, la dysenterie bacillaire associée à la malnutrition est responsable d’une forte morbidité et mortalité. On estime chaque année à 140 millions le nombre de cas de shigelloses, parmi lesquels 60 % surviennent chez les enfants de moins de 5 ans. Les shigelloses tuent chaque année entre 600 000 et 1 million de personnes dans le monde (Guerin et al, 2004 ; Ewing ,1986).Elle est par excellence, une maladie de l’insuffisance d’hygiène le plus souvent transmise directement du malade à son entourage ou par l’intermédiaire d’eau ou d’aliments souillés par Shigella.

Les espèces les plus importantes sont Shigella flexneri,responsable des formes endémiques, et S. dysenteriae sérotype 1, responsable des épidémies brutales et graves, dans les pays en voie de développement (Guerin et al ,2004;

Ewing ,1986).Shigella sonnei, moins virulente, est présente dans les pays développés.

La surveillance des shigelloses est réalisée en effectuant l’identification et le sérotypage des souches de Shigella, reçues des laboratoires qui les ont isolées de selles d’origine humaine, et en collectant les informations sur les souches bien étudiées.

Le présent travail a pour objectif général de contribuer à une meilleure connaissance des souches pathogènes de Shigella spp.

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Spécifiquement, il s’est agi de :

1. maîtriser les techniques d’identification de Shigella spp dans une matrice.

2. mettre en application les notions acquises en situation de cours.

En dehors de l’introduction et de la conclusion, le présent document a été rédigé en trois parties essentielles. Il comporte dans sa première partie la synthèse bibliographique, et la deuxième partie prend en compte la méthodologie suivie de la dernière partie qui aborde les résultats avec le commentaire suscité.

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ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE 4 PARTIE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

PARTIE 1

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

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1. CARACTERES GENERAUX DES ENTEOBACTERIES 1.1. Définition des entérobactéries

La famille des entérobactéries se définit par les caractères suivants :

 bacilles à Gram négatif (2 à 4 microns de long sur 0,4 à 0,6 microns de large),

 mobiles avec ciliature péritriche ou immobiles,

 poussant sur milieux de culture ordinaires,

 aérobies - anaérobies facultatifs,

 fermentant le glucose avec ou sans production de gaz,

 réduisant les nitrates en nitrites,

 oxydase négatif.

Les entérobactéries sont une famille très hétérogène pour ce qui est de leur pathogénie et de leur écologie. Les espèces qui composent cette famille sont en effet soit parasites (Shigella, Yersinia pestis), soit commensales (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella spp), soit encore saprophytes (Serratia spp, Enterobacter spp). (DCEM1, 2003)

1.2. Répartition en genres

Au sein des entérobactéries, on distingue de nombreux genres à savoir Shigella, Escherichia, Enterobacter, Serratia, etc…. La distinction entre les genres se fait par l'étude des caractères biochimiques dont les plus importants sont : fermentation du lactose, production d'indole, production d'uréase, production d'acetoïne, utilisation du citrate, désamination du tryptophane.

(DCEM1, 2003)

(18)

1.3. Caractérisation des espèces

Au sein de chaque genre, on individualise des espèces, par l'étude des caractères biochimiques ou antigéniques.

Les entérobactéries possèdent toutes des antigènes de paroi (somatiques) ou antigènes O. Les entérobactéries mobiles possèdent en plus des antigènes de flagelle (flagellaires) ou antigènes H. Enfin, certains possèdent un antigène d'enveloppe ou antigène K. (DCEM1, 2003)

1.3.1. Antigène O

L'antigène O est l'endotoxine des bactéries à Gram négatif. Il est composé delipopolysaccharide(LPS) complexes, très toxiques, capables de provoquer dans l'organisme humain la fièvre, leucopénie, bradycardie, hypotension et choc, coagulation intra-vasculaire disséminée et mort (la dose létale pour la souris est de 200 mg). L'antigène O est constitué d'une mosaïque d'antigènes dont certains sont des constituants communs à toutes les entérobactéries et germes apparentés, et d'autres, des constituants spécifiques de chaque espèce. On peut identifier ces antigènes par plusieurs techniques dont la plus courante est l'agglutination sur lame avec des sérums spécifiques : la présence d'une agglutination indique qu'il y a correspondance entre le sérum utilisé et un antigène de la souche étudiée.

Au cours des infections systémiques à entérobactéries, il y a lyse bactérienne et libération d'antigène O. En raison de sa toxicité, celui-ci entraîne un certain nombre d'effetsphysiopathologiques. Etant antigénique, il entraîne aussi la formation d'anticorps spécifiques anti-O qui peuvent être dosés et dans certains cas fournir un moyen indirect de faire le diagnostic de la maladie, comme par exemple le sérodiagnostic de WIDAL et FELIX dans le cas des fièvres typhoïde et paratyphoïdes. (DCEM1, 2003)

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1.3.2. Antigène H

L'antigène H n'est pas toxique. De nature protéique, il est constitué comme l'antigène O d'une mosaïque d'antigènes avec des constituants communs à toutes les entérobactéries mobiles et des constituants spécifiques à chaque espèce. On peut les mettre en évidence par agglutination sur lame avec des sérums spécifiques. Au cours des infections systémiques à entérobactéries,

il y a formation d'anticorps anti H. Ces anticorps qui ne sont pas neutralisants (c'est-à-dire qui n'ont pas d'effet protecteur) peuvent être dosés et permettre alors, avec les anticorps anti-O, de faire le sérodiagnosticdes infections à entérobactéries. (DCEM1, 2003)

1.3.3. Antigène K

L'antigène K qui entoure la paroi de certaines entérobactéries peut masquer l'antigène O (ex : antigène Vi, pour virulence, de Salmonella typhi).

(DCEM1, 2003)

2. SHIGELLES

Shigella spp sont des entérobactéries immobiles extrêmement proches de Escherichia coli mais qui ne fermentent pas le lactose. Elles n’ont pas d’uréase et ne produisent pas de gaz. Elles sont des parasites de l’homme et entraînent une colite infectieuse endémo-épidémique, la dysenterie bacillaire. (DCEM1, 2003)

(20)

2.1. Habitat

Shigella spp sont des bactéries strictement humaines. Elles ne font pas partie de la flore intestinale normale. On ne les trouve que chez les malades, les convalescents et les rares porteurs sains. (Batoul, 2001).

2.2. Pouvoir pathogène 2.2.1. Physiopathologie

Après pénétration par voie orale, Shigella spp envahissent la muqueuse de la partie terminale de l'iléon et du gros intestin. Elles y forment des micro-abcès qui donnent naissance à des ulcérations superficielles qui saignent et se recouvrent d'une pseudo-membrane faite de mucus, de débris cellulaires, de leucocytes et de Shigellaspp. La virulence est liée à la présence de grands plasmides codant pour des protéines nécessaires à la phagocytose par les cellules M des plaques de Peyer et à la multiplication intracellulaire, et au passage de cellule à cellule. Certaines souches de Shigella spp produisent aussi une toxine à activité entérotoxiqueet neurotoxique, responsable du syndrome hémolytique urémique.

2.3Clinique

Les sujets atteints de shigellose se plaignent de douleurs intestinales paroxystiques (coliques), de diarrhée et de fièvre. Les selles sont liquides et contiennent du mucus, du pus et du sang. (DCEM1, 2003).

2.4 Diagnostic bactériologique

Shigella spp sont immobiles. Elles sont classées en 4 espèces elles-mêmes divisés en sérotype selon leurs caractères antigéniques :

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— Groupe A : S.dysenteriae

Il en existe 10 sérotypes différents, dont le type 1 s'appelle le bacille de Shiga. Celui-ci produit aussi une exotoxine protéique qui provoque des troubles paralytiques chez les sujets atteints.

— Groupe B : S.flexneri

Il en existe 6 sérotypes qui sont responsables de 20 % des shigelloses observées en France.

— Groupe C : S. boydii

Il en existe 15 sérotypes qui sont très répandus en Afrique mais ne se rencontrent pas en France sauf s'il s'agit de cas importés.

— Groupe D : S.sonnei

Il existe un seul type, responsable de 80 % des shigelloses observées en France.

Dans les infections à Shigella, il est très rare qu'il y ait passage de bactéries dans le sang ; les hémocultures sont donc le plus souvent négatives et le diagnostic repose sur l'isolement de Shigellaspp par coproculture.

L'examen macroscopique et microscopique des selles fournit souvent des éléments de présomption : présence de mucus, de sang et de pus. La coproculture se fait selon des techniques et sur des milieux sélectifs identiques à ceux qui sont employés pour la recherche des salmonelles. L'identification de la Shigella est complétée par un antibiogramme en raison de la fréquence de la résistance acquise aux antibiotiques chez ces bactéries. (DCEM1, 2003)

2.5 Diagnostic biochimique

Shigella spp sont des bactéries à oxydase négative et à catalase positive sauf le bacille de Shiga.

Elles ont un faible pouvoir métabolique, fermentant le glucose sans production de gaz sauf certaines souches de S.flexnerisérovar 06 et S.boydii 14.

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Le lactose, le saccharose, le H2S, le LDC, l’uréase, le TDA, l’ONPG sont négatifs pour les souches de Shigellaspp sauf S. sonnei, S. dysenteriae 1 et certains sérovars de S. boydii. (Batoul, 2001).

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PARTIE 2 : MATERIEL ET METHODES

PARTIE 2

MATERIEL ET METHODES

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1. CADRE D’ETUDE

1.1. Présentation du cadre institutionnel : EPAC

L’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi ex CPU, est un établissement public à caractère scientifique. Il comporte dix (10) départements répartis en deux secteurs :

 Le secteur industriel

 Département de génie Electrique

 Département de génie Mécanique et Energétique

 Département de génie Civil

 Département de génie Informatique et Télécommunication

 Le secteur biologique

 Département de Génie de la Biologie Humaine

 Département de Génie de l’Environnement

 Département de Génie de l’Imagerie Médicale et de la Radiologie

 Département de Production de Santé Animale

 Département de Génie de la Technologie Alimentaire

 Département de la Maintenance Bio-Hospitalière 1.2. Cadre de recherche

1.2.1. Situation géographique et présentation du CHD / ZOU- COLLINES

Le CHD / ZOU-COLLINES est un hôpital de référence dans la zone sanitaire Djidja-Abomey-Agbangnizoun(DDA) et se situe à quelques mètres du carrefour GOHO juste à l’entrée de la ville d’Abomey en venant de Bohicon.

Créé en 1985, l’année de sa mise en service, le CHD / ZOU-COLLINES constitue un hôpital départemental qui couvre les départements du Zou et des Collines.

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De nos jours, il dessert non seulement les départements du zou et des collines, mais aussi du plateau, de l’Atlantique, du couffo et parfois même du mono.

L’entrée principal du CHD / ZOU-COLLINES donne accès à une allée bordée de fleur sur une centaine de mètres. Dirigé par Thomas DJEKPE, l’hôpital du CHD / ZOU-COLLINES comporte deux grands services à savoir, l’administration et les services médico-techniques.

 Administration

Elle est un service possédant trois embranchements. Il s’agit du service des affaires administratives et économiques, du service des affaires financières et du secrétariat administratif.

 Services médico-techniques

Cette rubrique est composée de trois grandes séparée classes à savoir :

Les services médicaux que sont : la pédiatrie, la chirurgie et le bloc opératoire, la gynécologie obstétrique, l’ophtalmologie, la stomatologie, la kinésithérapie, l’ORL, le service de diabétologie, le service de la rééducation et la médecine interne.

Les services para-médicaux sont au nombre de trois et accompagnent les services cliniques dans leurs tâches. Il s’agit de : l’imagerie médicale, la pharmacie et les laboratoires d’analyses biomédicales où la partie analytique de notre travail a été effectuée.

Les services techniques dont : la morgue, la buanderie, l’atelier technique, le magasin et la cuisine.

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1.2.2. Présentation et fonctionnement des laboratoires d’analyses biomédicales du CHD/ZOU-COLLINES.

1.2.2.1. Laboratoire du Service Départemental de Transfusion Sanguine : SDTS

Le service du SDTS est constitué des pièces suivantes : une salle de prélèvement, une salle de manipulation, une salle pour la banque de sang appelée salle de cession, la salle de garde, des bureaux, une salle de comptabilité, la cuisine et les toilettes. Pour son bon fonctionnement, il est doté d’un plateau technique adéquat et dispose de techniciens qualifiés pour la fonction. Ce laboratoire s’occupe essentiellement des analyses nécessaires pour la validité d’une poche de sang destiné à être transfusé. Les analyses qui y sont réalisées sont entre autres l’hématocrite, le GS-RH, les tests sérologiques tels que TPHA, HIV, AgHbs, HCV, et le VDRL.

1.2.2.2. Laboratoire de la pédiatrie

Le centre pédiatrique Sèdovikon du CHD / ZOU-COLLINES a été construit en 1994 par la fondation Terre des hommes. Depuis le 1^er juillet 2000, ce centre est devenu le Service de Pédiatrie du CHD / ZOU-COLLINES. Le laboratoire de la pédiatrie, est situé au rez-de-chaussée à l’aile Est du bâtiment.

Ce laboratoire comptes cinq (5) techniciens répartis comme suit : un responsable du laboratoire du nom de monsieurLézin ZOKPE, trois techniciens et d’un agent d’entretien. Dans le laboratoire nous avons des sections telles que : sections de l’hématologie, de la parasitologie-bactériologie, de la biochimie, de l’entretien et stérilisation de la verrerie. En outre des analyses hématologiques, biochimiques et bactériologiques y ont réalisées.

1.2.2.3. Laboratoire central

Le laboratoire central du CHD / ZOU-COLLINES est situé derrière la caisse ou le service d’entrée et est diamétralement opposé à la pharmacie dudit centre.

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Le laboratoire répond aux normes nationales et aux normes de l’OMS relatives à un laboratoire d’analyse biomédicale dans un Hôpital de zone sanitaire. Le plateau technique du laboratoire est dirigé par monsieur Blaise TCHEKPO qui, sen sa qualité de responsable de laboratoire coordonne la bonne marche des activités en collaboration avec monsieurFructueux ASSOGBA, le surveillant et leurs collègues bio-technologistes. Ce laboratoire se charge d’analyser les produits biologiques tels que sang, urines, selles, spermes, LCR et autres liquides biologiques etc. L’effectif de son personnel est de seize(16) agents dont dix (10) techniciens, un(01) agent d’entretien et cinq (05) aides-soignants. Le bloc du service du laboratoire abrite trois (03) sections qui sont la biochimie, l’hémato-parasitologie et la microbiologie auxquelles s’ajoutent le bureau du surveillant, le bureau du responsable, une salle de prélèvement dans laquelle se trouvent la salle de garde et une toilette, une salle de stérilisation, un réfectoire, un magasin et une salle contenant des douches et toilettes.

Notre stage s’est déroulé sur une période allant du 20 Juin au 23 Septembre repartie comme suit : Du 20 Juin au 08 Juillet au SDTS et du 11 Juillet au 23 Septembre au laboratoire central du CHD / ZOU-COLLINES.

L’échantillonnage a débuté le 02 Août. Les examens réalisés dans les différentes sections sont :

 Section de la bactériologie On réalise les examens tels que :

 ECBU : Examen Cytobactériologique des Urines

 ECB du LCR : Examen Cytobactériologique du Liquide Céphalo- rachidien

 Antibiogramme ; la Coproculture ; Spermogramme ; le Prélèvement vaginal.

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 Section de la Biochimie et de la Sérologie Dans cette section, sont réalisés :

La glycémie ; La protidémie ; L’albuminémie ; La CRP ; La sérologie HIV ; La SDW ; L’ALSO ; L’AgHbs ; La calcémie ; L’uricémie ; L’urémie ; les transaminases ; La cholestérolémie total et HDL ; La magnésémie ; La créatininémie ; Les triglycérides ; Les phosphatases acides et alcalines ; L’électrophorèse de l’hémoglobine ; L’ionogramme sanguin ; La bilirubinémie ; La phosphoremie ; La protidémie ; La Gama glutamyl Transférase (Gama GT).

 Section d’Hémato-Parasitologie

Dans cette section s’effectue les examens suivant :

NFS : Numération Formule Sanguine ; Taux d’hémoglobine ; NGB : Numération des Globules Blancs ; Numération des réticulocytes ; GE+DP : Goutte Epaisse + Densité Parasitaire ; AKOP : Amibes Kystes Œufs Parasites et parfois une méthode de concentration ; La Numération des Réticulocytes (NR) ; La vitesse de sédimentation (VR) ; Le temps de saignement (TS) et le temps de coagulation (TC). Les prélèvements dans cette section sont uniquement réalisés sur tube EDTA.

1.2.3. Présentation du laboratoire de l’U.R.M.A.Pha

L’unité de Recherche en Microbiologie Appliquée et Pharmacologie des Substances Naturelles (U.R.M.A.Pha) a été créée en 2017 en tant qu’Unité de recherche trans-facultative. Elle est au sein du Laboratoire de Recherche en Biologie Appliquée(L.A.R.B.A) de l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi.

Physiquement et administrativement située eu sein du campus de l’Université d’Abomey-Calavi, elle est constituée d’un accueil, du bureau du Directeur, d’un laboratoire et d’une salle de travail.

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Le laboratoire est composé de deux paillasses de manipulation.

Les analyses biochimiques, hématologiques et bactériologiques y sont réalisées. Il dispose d’un Poste de Sécurité en Microbiologie, d’un microscope et d’un microscope à camera, d’un autoclave, d’un agitateur magnétique, d’un agitateur vortex, d’un spectrophotomètre et d’un automate d’hématologie.

La vision du laboratoire est d’être une unité nationale d’excellence ou les scientifiques travaillent ensemble pour trouver des solutions aux problèmes sanitaires et environnementaux d’importance majeure au Benin et en Afrique.

2. MATERIEL

2.1. Souches bactériennes

Dans le cadre de cette étude, 5 souches de Shigella spp acquises à l’U.R.M.A.Pha ont été utilisées. Ces souches étaient conservées en cryotubes dans du lait écrémé à -30°C au surgélateur.

2.2. Milieux de culture

Les milieux de culture utilisés sont :

 Gélose Muller Hinton

 Bouillon – Sélénite -Cystine

 Gélose Xylose – Lysine – Désoxycholate

 Gélose Salmonelle-Shigelle

 Galerie Api 20E

2.3. Colorants

 Colorants pour la coloration de GramHucker

2.4. Appareils

 Réfrigérateur

(30)

 Microscope

 Etuve à 37°C

 Bec Bunsen et bouteille de gaz

 Lame porte-objet

 Lamelle couvre-objet

 Pipette pasteur

 Ensemenceur Gants à usage unique

 Marqueur permanent

 Compresse

 Gants

2.5. Autres materiel

 Anse calibrée

 Bande de contrôle de stérilité

 Bec bunsen

 Boîtes de Pétri

 Eprouvette graduée

 Gants

 Lames

 Papier aluminium

 Pipette Pasteur

 Seringues stériles plus aiguille

 Standard de turbidité de Mac Farland

 Tubes à hémolyses

(31)

3. METHODES

3.1. Contrôle des souches 3.1.1. Repiquage des souches

 Toutes les souches bactériennes ont été repiquées sur la gélose Xylose– Lysine – Désoxycholate etla gélose Salmonelle- Shigelle.

 Technique - Sortir les aliquotes du congélateur ;

- gratter la surface du cryotube avec une anse de platine ; - ensemencer par stries la gélose XLD et SS ;

- incuber à l’étuve pendant 24 h.

3.1.2. Examen microscopique.

Etat frais

Une préparation entre lame et lamelle a été réalisée à partir de colonies obtenues. L’observation a été faite au microscope à l’objectif X40.

Etat coloré

A partir des colonies observées, un frottis a été réalisé et coloré par la méthode de coloration Hücker. L’observation a été faite au microscope à l’objectif à immersion.

3.2. Réalisation de quelques tests biochimiques 3.2.1. Recherche de la catalase

Elle a été recherchée sur toutes les souches deShigella spp.

(32)

 Technique

- Déposer une goutte d’eau oxygénée sur une lame propre à l’aide d’une pipette stérile;

- prélever avec une anse de platine stérile une colonie de germes et l’émulsionner dans l’eau oxygénée.

 Lecture

La présence d’effervescence signale une réaction positive à la catalase 3.2.2. Recherche de l’oxydase

Elle a été recherchée sur toutes les souches deShigella spp.

 Technique

- placer un disque non imprégné sur une lame à l’aide d’une pince flambée

- déposer une goutte du réactif sur le disque non imprégné,

- avec une pipette pasteur prélever une colonie sur milieu solide et la déposer doucement sur le disque.

 Lecture

Absence de coloration violette traduisant une oxydase négative.

3.3. Isolement

Lecture de la boite ensemencée après 24h en faisant le Gram contrôle.

3.3.1. Réalisationdu pré-enrichissement

- Prélever une colonie du milieu XLD grâce à l’anse de platine

- Emulsionner dans un tube contenant de l’eau peptonnée,

- Incuber pendant 18h à 37°C à l’étuve.

3.3.2. Enrichissement

- Prélever 100 µl du mélange préalablement pré-enrichis.

(33)

ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE 21 - Emulsionner dans 10ml du Bouillon – Sélénite - Cystine,

- Incuber pendant 24h à 37°C à l’étuve.

3.3.3. Mise en culture sur la gélose Xylose-Lysine-Désoxycholateet la gélose Salmonelle-Shigelle

- Prélever 100 µl du mélange préalablement enrichidans le Bouillon-Sélénite-Cystine,

- Ensemencer sur le milieu Xylose-Lysine-Désoxycholate et Salmonelle-Shigelle,

- Incuber pendant 16-18h à 37°C à l’étuve.

3.3.4. Identification

Les caractères biochimiques ont été lus avec la galerie API 20E pour l’identification des souches deShigella spp.

3.3.5. Incorporation et remise en culture

- Incorporation de Shigellaspp dans 5 g de tomate.

- Réalisation du pré-enrichissement en émulsionnant 5g de tomate dans 45 ml d’eau peptonée et incuber pendant 18h à 37°C à l’étuve.

- Ensemencer 100 ul du mélange de la veille dans 10 ml de

Bouillon-Sélénite-Cystine pour l’enrichissement et incuber pendant 18h à 37°C à l’étuve.

- Mise en culture deShigella spp sur gélose Xylose-Lysine-Désoxycholate et

Salmonelle-Shigelle, incubation 24 h.

- Repiquage d’une colonie isolée caractéristique sur la gélose Muller Hinton pour l’obtention d’une culture pure, incubation 24 h.

(34)

- Identification de la souche avec la galerie API 20E et sérotypage.

3.4. Galerie API 20E

Galerie de 20 microtubes prêts à l’emploi permettant de réaliser 20 tests biochimiques afin d’identifier des bacilles Gram négatif appartenant à la famille des ENTEROBACTERIACEAE.

Technique

- Ensemencer la galerie avec une pipette Pasteur stérile ouverte chargée en suspension, pointe posée sur un côté de la cupule, en laissant couler doucement la suspension dans la cupule. Tenir la boîte légèrement inclinée pour éviter la formation de bulles.

- Pour les caractères encadrés (CIT, VP, GEL) : remplir entièrement la cupule (tube et mise en aérobioseorifice)

- Pour les caractères soulignés (ADH, LDC, ODC, H2S, URE) : remplir l’orifice de la mise en anaérobiosecupule avec de l’huile de vaseline stérile et pour les autres caractères, ne remplir que le tube.

- Refermer la boîte et mettre à l’étuve à 37°C pendant 18 à 24 heures.

3.5. Sérotypage 3.5.1. Test d’agglutination sur lame

Technique

- Déposer 2 gouttes séparées de sérum physiologique sur une lame de verre, -Emulsionner les parties de la culture à tester avec une anse, dans chaque

goutte de sérum physiologique pour donner une suspension homogène et assez dense.

(35)

- Dans l’une des suspensions utilisées, ajouter 1 goutte de sérum physiologique comme témoin et homogénéiser. Dans l’autre suspension, ajouter 1 goutte d’antisérum non dilué et homogénéiser.

- Faire osciller la lame pendant 1 minute et observer s’il se produit une agglutination, plus facilement visible sur un fond sombre éclairé par une lumière indirecte,

- Eliminer la lame utilisée selon les règles de désinfection et d’élimination appropriées.

Résultat

L’agglutination doit être forte et nettement visible au bout d’une minute.Il ne doit se produire aucune agglutination visible dans la suspension de contrôle.

(36)

ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE 24 PARTIE 3 : RESULTATS ET COMMENTAIRE

PARTIE 3

RESULTATS ET COMMENTAIRE

(37)

1. RESULTATS

1.1. Examen microscopique 1.1.1. Etat frais

Des résultats issus de l’état frais montrent la présence de bactéries immobiles et à la coloration de Gram, les bacilles à Gram négatif ont été observés. (Figure 1, 2)

Figure 1:Images des états frais de Shigella spp au microcope à camera (objectif X40)

Prise de vue : ADJAKOTAN, Octobre 2017

(38)

1.1.2. Etat coloré

Sur la figure 2, des bacilles Gram négatifs sont observés (Figure 2).

Figure 2: Images des états colorés de Shigella spp au microscope à camera (objectif X100)

Prise de vue : ADJAKOTAN, Octobre 2017

A la poursuite des examens bactériologiques, le Bouillon Sélénite Cystine ensemencé pour l’enrichissement a viré du blanc à l’orange. Ce qui confirme la présence d’une souche bactérienne.

(39)

Figure 3:Bouillon Sélénite Cystine (témoin négatif)

Figure 4:Bouillon Sélénite Cystine (réaction)

Prise de vue:ADJAKOTAN, Octobre 2017

1.2. Isolement et identification 1.2.1. Isolement

Des colonies roses ou rouges ont été observées sur la gélose XLD.

(40)

Figure 5:Aspect des colonies de Shigella sppsur XLD Prise de vue : ADJAKOTAN, Octobre 2017

1.2.2. Identification

La galerie API 20E est un système standardisé pour l’identification des Enterobacteriaceae et autres bacilles à Gram négatif non fastidieux, comprenant 21 tests biochimiques miniaturisés. Ainsi pour confirmer la nature de la souche Shigelle utilisée on a réalisé une identification par la galerie API 20E.

Pour ce faire un témoin négatif a été fait (figure 6) suivi de la réaction elle- même qui prouve que la souche est vraiment Shigella spp(figure 7).

(41)

Figure 6 : Imagede la galerie API 20E (Témoin négatif) Prise de vue : ADJAKOTAN, Octobre 2017

Figure 7:Image de la galerie API 20 E de la souche bactérienne Prise de vue : ADJAKOTAN, Octobre 2017

2. COMMENTAIRE

Le présent travail a eu pour objectif général de contribuer à la meilleure connaissance des souches pathogènes de Shigella spp.

L’examination de l’état frais des colonies montre la présence de nombreuses bactéries immobiles. Des bacilles Gram négatif ont été observés à l’état coloré sur des colonies des souches de Shigella spp acquises. Les shigelles sont des entérobactéries responsables de la dysenterie bacillaire. Elles sont des bacilles Gram négatif immobiles, asporulées et se développent en présence ou en absence d’oxygène. (Batoul, 2001).

Les colonies de Shigella spp sont rouges sur la gélose XLD. La couleur de ses colonies est la même que celle des salmonelles sur ce milieu mais, avec une présence de centre noir due au Sulfure d’Hydrogène (H2S) présent au sein des

(42)

salmonelles mais absent chez les shigelles.Ces colonies apparaissent rouge due à la fermentation de xylose (Hadjer,2016).Sur la gélose SS, les colonies de Shigella spp sont incolores tandis que sur Hektoen, les colonies sont vertes. Ces colonies sont de taille 02 à 04 mm de diamètre à bords réguliers, lisses. (Batoul, 2001 ; Fiche technique, 2010). Selon Hadjer, sur le milieu SS, on observe des colonies incolores ce qui indique qu’elles ne fermentent pas le lactose tout comme les souches de salmonelles. Sur ces différents milieux, la couleur des colonies est la même à la différence du centre noir présent aux niveaux des souches de salmonelles mais absent chez les shigelles.

De cette étude, les souches de Shigella spp identifiées ont été positives à la catalase et négative à l’oxydase. Ces caractères appartiennent aux caractères généraux et obligatoires des entérobactéries dont fait partir les shigelles.

(DCEM1, 2003)Lescaractères biochimiques de Shigella spp issus de la galerie API 20E ont révélé que les souches sont négatives à la plupart des tests biochimiquessauf pour le glucose et le mannitol. Ces résultatsconcordent avec ceux de Badoul, qui montre à travers son étude que les shigelles ont des caractères biochimiques négatifs pour le lactose, le Tryptophane désaminase (TDA), la Lysine décarboxylase (LDC), le Sulfure d’hydrogène (H2S) et positifs pour le glucose. Quand au mannitol, son résultat varie selon la souche bactérienne identifiée. Le mannitol est positif pour les souches S. flexneri S.

boydii S. sonnei et négatif pour S. dysenteriae.(Batoul, 2001).

(43)

ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE 31 CONCLUSION

CONCLUSION

(44)

Shigella spp sont des micro-organismes pathogènes d’origine alimentaire qui préoccupent particulièrement les humains. Elles sont des bactéries à Gram négatif, immobiles et asporulées.

Au cours de cette étude, des souches de shigelle sont été isolées et caractérisées. Cette caractérisation a été réalisée par des méthodes bactériologiques et biochimiques. L’identification de la souche à la galerie API 20E a montré une concordance entre les caractères des souches de Shigella spp obtenues et ceux des souches isolées de la matrice. Il convient de dire que la matrice utilisée a favorisé la croissance des shigelles sans affecter leurs caractères biochimiques et bactériologiques.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

(45)

REFERENCES

BIBLIOGRAPHIQUES

(46)

1. A.Hadjer, 2016.Isolement et identification des Salmonelles à partir de poulets de chair et des eaux usées, Faculté des sciences, Département de Biologie de l’université Hassiba BEN-BOUAU-Chlef, Mémoire de master en microbiologie. P : 61.

2. Batoul M.2001 Shigelle. Faculté de Médecine de Sétif, service de microbiologie p : 3

3. BennishML.,Wojtyniak BJ. Mortality due to shigellosis : Community and hospital data. Rev. Infect. Dis. 1991; 13 (Suppl):S245-S251.

4. Bingen E., Groupe de travail de l’Agence française de sécurité sanitaire des produits de santé (Afssaps) Traitement antibiotique des gastro- entérites à Shigellasonnei. Revue française des laboratoires, 2004, N°364, 25-31.

5. Bosmans, E; Engelen , A., Van ourti c., Vandepitte, J.&Ghysels,G.(1977): Les shigelles et salmonelles à Kigali ( Rwanda), Ann. Soc. Belge Med.trop.,57.29-38.

6. DCEM1.2003 Bactériologie Université PARIS VI Pierre et Marie Curie.

Faculté de MédecinePitié-Salpêtrière. Mise à jour 24 Mars 2003.

7. Ericsson CD, Pickering LK, Sullivan P, DuPont HL.The role of location of food consumption in the prevention of travelers’ diarrhoea in Mexico.

Gastroenterology 1980;79:812-916.

8. Ewing WH. 1986. The genus Shigella, p. 135-172. In Edwards and Ewing’s identification of Enterobacteriaceae, 4th ed., Elsevier Publishing Co., New York.

9. Fiche technique 2010.Gélose Salmonelles Shigelle (SS), production Indicia version 02.2010.

10. Guérin PJ., Brasher C., Baron E., Mic D., Grimont F., Ryan M.

Aavitsland P., Legros D. Case management of a multidrug-resistant Shigelladysenteriaeserotype 1 outbreak in a crisis context in Sierra

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Leone, 1999-2000. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 2004; 98:635-643

11. Kotloff KL, Winickoff JP, Ivanoff B, Clemens JD, Swerdlow DL, Sansonetti , Adak GK and Levine MM. (1999), Global burden of Shigella infections : implication for vaccine development and implementation of control strategies. BullWord Health Organ., 77, pp.

651-656.

12. Taneja N, LyngdohV, Vermani A, Mohan B, Rao P, Singh M, Dogra A, Singh MP and Sherma M. (2005), Re-emergence of multi-drug esistantShigelladysenteriaewith added resistence to ciprofloxacin in north India and plasmid profiles. Indian J Med Res., 122, pp. 348-354.

13. Umoh VJ, Odoba MB. Safety and quality evaluation of street foods sold in Zaria, Nigeria. Food Control 1999; 10:9-10.

(48)

ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE 36 TABLE DES MATIERES

LISTE DES ENSEIGNANTS DU DEPARTEMENT DE GBH... Erreur ! Signet non défini.

DEDICACE... iv

REMERCIEMENTS ... v

HOMMAGES ... vi

LISTE DES ABREVIATIONS ... vii

LISTE DES FIGURES ... viii

SOMMAIRE ... ix

RESUME ... x

ABSTRACT ... xi

INTRODUCTION ... 1

PARTIE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ... 4

1. CARACTERES GENERAUX DES ENTEOBACTERIES ... 5

1.1. Définition des entérobactéries ... 5

1.2. Répartition en genres ... 5

1.3. Caractérisation des espèces ... 6

1.3.1. Antigène O ... 6

1.3.2. Antigène H ... 7

1.3.3. Antigène K ... 7

2. SHIGELLES ... 7

2.1. Habitat ... 8

2.2. Pouvoir pathogène ... 8

2.2.1. Physiopathologie ... 8

2.3 Clinique ... 8

2.4 Diagnostic bactériologique ... 8

2.5 Diagnostic biochimique ... 9

PARTIE 2 : MATERIEL ET METHODES ... 11

1. CADRE D’ETUDE ... 12

1.1. Présentation du cadre institutionnel : EPAC ... 12

1.2. Cadre de recherche ... 12

1.2.1. Situation géographique et présentation du CHD / ZOU-COLLINES ... 12

TABLE DES MATIERES

(49)

1.2.2. Présentation et fonctionnement des laboratoires d’analyses biomédicales du

CHD/ZOU-COLLINES. ... 14

1.2.3. Présentation du laboratoire de l’U.R.M.A.Pha ... 16

2. MATERIEL ... 17

2.1. Souches bactériennes ... 17

2.2. Milieux de culture ... 17

2.3. Colorants ... 17

2.4. Appareils ... 17

2.5. Autres materiel ... 18

3. METHODES ... 19

3.1. Contrôle des souches ... 19

3.1.1. Repiquage des souches ... 19

3.1.2. Examen microscopique. ... 19

3.2. Réalisation de quelques tests biochimiques ... 19

3.2.1. Recherche de la catalase ... 19

3.2.2. Recherche de l’oxydase ... 20

3.3. Isolement ... 20

3.3.1. Réalisation du pré-enrichissement ... 20

3.3.2. Enrichissement ... 20

3.3.3. Mise en culture sur la gélose Xylose-Lysine-Désoxycholate et la gélose Salmonelle- Shigelle ………..21

3.3.4. Identification ... 21

3.3.5. Incorporation et remise en culture ... 21

3.4. Galerie API 20E ... 22

3.5. Sérotypage ... 22

3.5.1. Test d’agglutination sur lame ... 22

PARTIE 3 : RESULTATS ET COMMENTAIRE ... 24

1. RESULTATS ... 25

1.1. Examen microscopique ... 25

1.1.1. Etat frais... 25

1.1.2. Etat coloré ... 26

1.2. Isolement et identification ... 27

1.2.1. Isolement ... 27

1.2.2. Identification ... 28

2. COMMENTAIRE ... 29

(50)

ESSAI D’ISOLEMENT DE QUELQUES SOUCHES DE SHIGELLES DANS UNE MATRICE EXPERIMENTALE 38 CONCLUSION ... 31 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 32 TABLE DES MATIERES ... 36