Thesis
Reference
Mécanismes de relocalisation de la Glucose-regulated protein 78 à la surface des cellules du cancer de l'ovaire
MEYNIER, Sonia
Abstract
Afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans le développement du cancer de l'ovaire, nous nous sommes intéressés à la protéine GRP78. Dans les cellules cancéreuses, la GRP78 du RE est relocalisée à la surface cellulaire et participe au développement tumoral. Afin d'apporter des informations sur les mécanismes de transport de la GRP78 du RE à la membrane plasmique, nous avons investigué le rôle d'un potentiel partenaire : la protéine Par-4. Nous confirmons l'implication de Par-4 dans, 1) le transport de la GRP78 à la membrane plasmique et, 2) le développement tumoral et la réponse au taxol dans le cancer de l'ovaire. Nous avons également investigué l'implication des différents domaines de la GRP78 dans son transport à la membrane plasmique et montrons que le SBD joue un rôle important. Enfin, nous suggérons que la forme transmembranaire au niveau du RE ne serait pas l'« origine » de la forme transmembranaire à la surface cellulaire.
MEYNIER, Sonia. Mécanismes de relocalisation de la Glucose-regulated protein 78 à la surface des cellules du cancer de l'ovaire. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2016, no.
Sc. 5039
URN : urn:nbn:ch:unige-929969
DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:92996
Available at:
THESE
Présentée à la Faculté des Sciences de l’Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences mention biologie
par
Sonia Meynier de
Saint-Yrieix-La-Perche (France)
Thèse n°5039
Genève
2017 UNIVERSITE DE GENEVE
Département de biologie cellulaire FACULTE DES SCIENCES Professeur Didier Picard
Departement de gynécologie et obstétrique FACULTE DE MEDECINE Professeur Marie Cohen
HOPITAUX UNIVERSITAIRE DE GENEVE
Departement de gynécologie et Professeur Patrick Petignat obstétrique
Mécanismes de relocalisation
de la Glucose-regulated protein 78
à la surface des cellules du cancer de l'ovaire
Remerciements
En préambule de ce mémoire, je souhaite remercier la ligue genevoise contre le cancer, l’Université de Genève, l’hôpital universitaire de Genève et le groupe Novartis pour leurs soutiens financiers, et également, l’ensemble des personnes qui ont participé à la réalisation de ce projet.
En tout premier lieu, j’aimerais remercier le Pr. Patrick Petignat et le Pr. Marie Cohen sans qui je n’aurai pu réaliser ce projet de quatre années. Je remercie particulièrement le Pr. Marie Cohen pour sa confiance, son temps, ses conseils, et également pour la liberté qu’elle m’a accordée dans la réalisation de ma thèse. J’aimerais également remercier le Dr. Florence Delie pour son temps et ses conseils rédactionnels. De plus, je remercie mes stagiaires et collègues, Danka Stojanovic, Karim Hammad, Su Choi, Anita Shanker, Marianne Kramer et Daniel Bastida, pour leurs participations au projet et leurs dynamismes et gaietés apportés durant cette thèse.
Ensuite, je tiens à remercier le Pr. Dominique Belin, le Pr. Michelangelo Foti, le Dr. Ariane De Agostini, le Dr. Jean-Christophe Tille, le Dr. Jean Philippe Didier, le Dr. Adrien Decorsière, le Dr. François Prodon et Mr. Olivier Brun pour leurs précieux conseils et leurs aides techniques.
De plus, je souhaite également remercier le Dr. Palma Rocchi et le Pr. Didier Picard pour avoir accepté d’être membre de mon jury de thèse, et aussi pour leurs commentaires rédactionnels.
Un grand MERCI à mes collègues qui sont devenues mes amies : Sandra Pierredon, Mathilde Dromard, Tess Marchetti, Christine Wuillemin et Pascale Ribaux, sur qui j’ai pu compter tout
au long de ces quatre années et qui ont été d’un grand soutien, car il faut l’avouer, une thèse est une source de questionnement et de remise en question professionnelles mais aussi et surtout personnelles. Dans cette même pensée, je souhaite remercier Emmanuel et Catherine Fabrègue pour leurs encouragements et Fredéric Fabrègue pour son appui, sa patience et son soutien moral.
Enfin, malgré la distance, je souhaite remercier mes parents, Roger et Viviane, et ma sœur, Cindy, qui ont été présents chaque jour et chaque minute de ces quatre années pour m’encourager, me soutenir et aussi me rappeler les choses essentielles. Alors MERCI mille fois d’avoir réanimé ces pensées pendant ces quatre années. Pour terminer, merci à toi, Armando pour ton réconfort, ton soutien et tes attentions.
Mécanismes de relocalisation de la Glucose-regulated protein 78
à la surface des cellules du cancer de l’ovaire
Sommaire
Résumé ... i
Liste des abréviations ... iv
Liste des Tableaux ... ix
Liste des Figures ... ix
1- Introduction ... 1
1.1. Le cancer de l’ovaire ... 1
1.1.1. Epidémiologie du cancer de l’ovaire ... 2
1.1.2. Etiologie du cancer de l’ovaire ... 3
1.1.2.1. Facteurs de risques ... 3
1.1.2.2. Facteurs préventifs... 4
1.1.3. Classification des tumeurs ovariennes ... 5
1.1.4. Les cancers épithéliaux de l’ovaire ... 6
1.1.4.1. La classification de la Fédération Internationale de Gynécologie-Obstétrique (FIGO) ... 6
1.1.4.2. Les types histologiques ... 6
1.1.4.3. Les grades du cancer de l’ovaire ... 9
1.1.4.4. Classification moléculaire ... 9
1.1.4.5. L’origine du cancer épithélial de l’ovaire : les hypothèses ... 9
1.1.5. Les traitements du cancer de l’ovaire ... 12
1.1.5.1. La chirurgie ... 12
1.1.5.2. La chimiothérapie ... 13
1.1.5.3. Les thérapies ciblées ... 14
1.1.5.4. L’immunothérapie active ... 16
1.1.5.5. L’utilisation de nanovecteurs dans le cancer de l’ovaire ... 19
1.2. La Glucose-regulated protein 78 : GRP78 ... 21
1.2.1. Généralités ... 22
1.2.1.1. Sa structure ... 22
1.2.1.2. La localisation cellulaire de la GRP78 ... 23
1.2.1.3. Mécanismes de relocalisation de la GRP78 ... 24
1.2.2. Ses rôles physiopathologiques ... 30
1.2.2.1. Rôles de la GRP78 du RE ... 30
1.2.2.2. Rôles de la GRP78 à la surface cellulaire ... 36
1.2.2.3. Rôles de la GRP78 extracellulaire ... 45
1.2.2.4. Rôles de la GRP78 au sein de la mitochondrie ... 46
1.2.2.5. Rôles de la GRP78 du cytosol ... 46
1.2.3. La GRP78 : une application thérapeutique ? ... 46
1.2.4. La GRP78 : un marqueur ? ... 48
1.2.5. La GRP78 et le cancer de l’ovaire ... 49
1.3. Le Projet ... 51
2. Matériels et Méthodes ... 53
2.1.1 Les lignées cellulaires ... 53
2.1.2. Les anticorps ... 54
2.1.3. Transfection ... 54
2.2. Chapitre 1 : Par-4, partenaire de relocalisation de la GRP78 du RE à la surface cellulaire dans le cancer de l’ovaire? ... 56
2.2.1. Consentement ... 56
2.2.2. Le plasmide d’expression Par-4 ... 56
2.2.3. Purification des cellules d’ascites... 57
2.2.4. Purification des cellules cancéreuses et des cellules saines ovariennes ... 57
2.2.5. L’ELISA cellulaire ... 58
2.2.6. La réaction en chaîne par polymérase en temps réel (qPCR) ... 58
2.2.7. L’immunoprécipitation ... 59
2.2.8. Le fractionnement subcellulaire ... 60
2.2.9. Western blot ... 61
2.2.10. Test d’invasion cellulaire ... 61
2.2.11. Analyse de l’apoptose cellulaire ... 62
2.2.12. Analyse des protéines sécrétées ... 63
2.2.13. Colocalisation et mesure de l’apoptose par immunofluorescence ... 63
2.2.14. Mesure de l’activité des caspase-3 et caspase-7 par luminescence... 64
2.2.15. Etablissement de la lignée stable SKOV-3 Par-4sh ... 64
2.2.16. Modèle de la membrane chorioallantoïdienne de l’embryon de poulet ... 65
2.2.17. L’immunohistochimie ... 66
2.3. Chapitre 2 : Mécanismes de relocalisation de la GRP78 du RE à la surface cellulaire. 67 2.3.1. Les plasmides d’expression de la GRP78 ... 67
2.3.2. Le fractionnement subcellulaire ... 69
2.3.3. Extraction des membranes plasmiques ... 69
2.3.4. Analyse des protéines sécrétées ... 70
2.3.5. Extraction de microsomes ... 70
2.3.6. Western blot ... 71
3. Résultats ... 72
3.1. Chapitre 1 : Par-4, partenaire de relocalisation de la GRP78 du RE à la surface cellulaire dans le cancer de l’ovaire? ... 72
3.1.1. Le rôle de Par- 4 dans le cancer de l’ovaire ... 73
3.1.2. Données supplémentaires ... 90
3.1.2.1. Effet de l’expression de Par-4 sur l’invasion cellulaire ... 90
3.1.2.2. Effet de l’expression de Par-4 et du taxol sur la sécrétion de Par-4 ... 91
3.2. Chapitre 2 : Mécanismes de relocalisation de la GRP78 du RE à la surface cellulaire 94 3.2.1. Implication du SBD de la GRP78 dans sa relocalisation à la membrane plasmique ... 94
3.2.2. Implication du mécanisme de sécrétion de la GRP78 dans sa relocalisation à la surface cellulaire.. ... 100
3.2.3. Existence d’une forme membranaire de la GRP78 au niveau du RE ... 103
4. Discussion ... 106
4.1. Par-4, partenaire de relocalisation de la GRP78 du RE à la surface cellulaire dans le cancer de l’ovaire?... 106
4.2. Chapitre 2 : Mécanismes de relocalisation de la GRP78 du RE à la surface cellulaire
………..111 4.3. Perspectives ... 116
Bibliographie ... 119
RESUME
Le cancer de l’ovaire est une maladie rare, mais cependant, est reconnu comme le cancer gynécologique le plus mortel et représente la huitième cause de décès par cancer chez les femmes dans le monde. Malgré le perfectionnement des traitements proposés, le pourcentage de survie à 5 ans, tous stades confondus, est d’environ 40 %. Il est donc important de mieux comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans le développement du cancer de l’ovaire afin de développer des traitements plus spécifiques et efficients. Dans ce but, nous nous sommes intéressés à la protéine GRP78 qui a la particularité d’être présente à la surface des cellules cancéreuses.
La GRP78 est une protéine chaperonne principalement présente dans le réticulum endoplasmique (RE) et participe à la réponse au stress du RE. Elle est composée de trois principaux domaines: un domaine responsable de l’activité ATPase en position N-terminale (NBD), un domaine de liaison aux peptides en position C-terminale (SBD), et un domaine hélicoïdal en position C-terminale. De plus, elle contient un peptide signal en position N- terminale et une séquence KDEL en position C-terminale. Dans les cellules cancéreuses, la GRP78 du RE est relocalisée à la surface cellulaire et joue un rôle dans l’invasion, la migration et la prolifération cellulaires. Les mécanismes impliqués dans le transport de la GRP78 du RE à la surface cellulaire sont, à l’heure actuelle, peu connus. Néanmoins, quelques hypothèses ont été proposées. La première implique des partenaires protéiques participant au transport de la GRP78 du RE à la surface cellulaire. La deuxième suggère que la forme transmembranaire de la GRP78 présente à la surface cellulaire pourrait provenir de la forme transmembranaire de la GRP78 au niveau du RE et la troisième évoque le masquage du motif KDEL empêchant ainsi le mécanisme de rétention exercé par le RE.
Afin d’apporter de nouvelles informations sur les mécanismes de transport de la GRP78 du RE à la surface des cellules cancéreuses de l’ovaire, nous avons, dans un premier temps, investigué le rôle de la protéine Prostate apoptosis response-4 (Par-4 ; protéine oncosuppressive) dans le cancer de l’ovaire. En effet, Par-4 peut être un partenaire de relocalisation de la GRP78 à la surface des cellules de cancer de la prostate, de l’ostéosarcome et des cellules trophoblastiques. Dans les cellules de cancer de l’ovaire, nous confirmons l’implication de Par-4 dans le transport de la GRP78 à la membrane plasmique.
Par ailleurs, nous montrons que Par-4 module l’invasion des cellules cancéreuses de l’ovaire.
De plus, contrairement aux résultats de Burikanov et al. sur le rôle de Par-4 dans les cellules de cancer de la prostate, la relocalisation du complexe GRP78/Par-4 n’influence pas l’apoptose des cellules cancéreuses de l’ovaire via la forme sécrétée de Par-4, mais uniquement via sa forme intracellulaire, et seulement en présence d’un stimulus. Enfin, in ovo, nous remarquons que l’inhibition de l’expression de Par-4 entraine une augmentation du volume tumoral et une diminution de la réponse au taxol dans le cancer de l’ovaire, suggérant ainsi que Par-4 pourrait être une cible thérapeutique intéressante.
Dans un second temps, nous avons investigué l’implication du domaine SBD de la GRP78 dans son transport à la membrane plasmique. Ensuite, nous avons étudié si la présence d’une séquence FLAG avant le peptide signal de la GRP78 peut entraver la relocalisation de la GRP78 à la membrane plasmique, puis, si la présence de la GRP78 à la surface cellulaire est liée à son mécanisme de sécrétion. Enfin, nous avons regardé si la forme transmembranaire de la GRP78 au niveau du RE peut être à l’origine de sa présence à la surface cellulaire. Nous montrons que lorsque le SBD de la GRP78 est partiellement ou totalement supprimé, le transport de la GRP78 du RE à la membrane plasmique est fortement inhibé soutenant les résultats obtenus, dans le même temps, par Tsai et al., montrant que la mutation du SBD prévient le transport de la GRP78 à la membrane plasmique. De plus, nous montrons que la
GRP78 dépourvue de son SBD est sécrétée, et proposons l’existence de deux mécanismes de transport : un pour la sécrétion de la GRP78 et un pour son transport à la membrane. Ensuite, nous montrons que le masquage du peptide signal de la GRP78 n’entrave pas le transport de la GRP78 à la surface cellulaire suggérant que l’entrée de la GRP78 dans le RE pourrait être dispensable à son transport à la membrane plasmique. Enfin, nous observons que la GRP78 peut être une protéine intégrale de membrane au niveau du RE, mais écartons l’hypothèse, émise par Rao et al. et Reddy et al, que la GRP78 soit une protéine transmembranaire au RE.
De ce fait, nous suggérons que la forme transmembranaire de la GRP78 à la surface cellulaire ne proviendrait pas de la forme transmembranaire au niveau du RE.
Liste des abréviations
5-FU 5-fluorouracile
ADN Acide désoxyribonucléique
ADP Adénosine diphosphate
Akt ou PKB Protéine kinase B
ARID1A AT-rich interactive domain-containing protein 1A
ARN acide ribonucléique
ARNm Acide ribonucléique messager ASK1 Apoptosis Signal-regulating Kinase1
AT Après transfection
ATF4 Activating transcription factor 4 ATF6 Activating transcription factor 6
Atg5 Autophagy protein 5
ATP Adénosine-5′-triphosphate
B7-H4 ou VTCN1 V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1 BAD Bcl-2-associated death promoter
Bag-1 BCL2 associated athanogene 1
BAX BCL2 associated X, apoptosis regulator
Bcl-2 B-cell lymphoma 2
BIK BCL2 interacting killer
BIM Bcl-2-like protein 11
BiP Binding immunoglobulin protein BMTP78 βone metastasis targeting peptide-78
BRAF B-Raf proto-oncogene, serine/threonine kinase
BRCA1 Breast cancer 1
BRCA2 Breast cancer 2
BSA Bovine serum albumin
CAR-T Chimeric Antigen Receptor T-cell therapy
CCL22 C-C motif chemokine 22
CD3 Cluster of differentiation 3 CD44 Cluster of differentiation 44 CD8 Cluster of differentiation 8
CHIP Chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale
CHOP C/EBP homologous protein
COPI Coat protein 1
COPII Coat protein 2
CSF-1R Colony stimulating factor-1 CTLA-4 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4
DAB Diaminobenzidine
DIM Diindolyméthane
DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium
EDD Embryonic development day EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EGFR Epidermal growth factor receptor
EGTA Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid eiF2α Eukaryotic translation initiation factor 2 subunit 1
EiF4 Eukaryotic translation initiation factor 4 EpCAM Epithelial cell adhesion molecule
EPR Enhanced permability and retention effect
ERAD Endoplasmic-reticulum-associated protein degradation ERGIC ER-Golgi intermediate compartment
ERK Extracellular signal-regulated kinases
ERSE Endoplasmic reticulum stress response elements ESO Epithélium de surface ovarien
FADD FAS-associated death domain protein
FAK Focal adhesion kinase
FBS Fetal bovine serum
FDA Food and Drug administration
FIGO Fédération Internationale de Gynécologie-Obstétrique FSH Follicle-stimulating hormone
GADD34 Growth arrest and DNA damage inducible 34 GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GPI Glycosylphosphatidylinositol
GRP78 Glucose-regulated protein 78 GRP94 Glucose-regulated protein 94 GSK3 Glycogen synthase kinase-3
GTP Guanosine-5'-triphosphate
Gαq11 Gq alpha subunit 11
h heure
HBSS Hanks’Balanced Salt Solution
HeLa Henrietta Lacks
HER2 Human epidermal growth factor receptor 2 HGSC High-grade serous carcinoma
HIPEC 65 Human invasive proliferative extravillous cytotrophoblast 65
HRP Horseradish peroxidase
Hsp40 Heat Shock protein 40kDa Hsp70 Heat shock protein 70kDa HSPA5 Heat shock 70kDa protein 5
IDO Indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase IGFBP-3 Insulin-like growth factor binding protein-3
IgG Immunoglobulin G
IL-10 Interleukin 10
IP Intraperitoneal
IRE1 Inositol requiring kinase 1
IV Intravenous
JNK C-Jun N-terminal Kinase
KCl Potassium chloride
KH2PO4 Potassium Dihydrogen Phosphate
KRAF V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog
LC3 Light chain 3
LGSC Low grade serous carcinoma
LH Luteinizing hormone
MAPK Mitogen-activated protein kinases MBOT Mucinous borderline ovarian tumor
MDR1 Multi-Drug Resistance 1
MgCl2 Magnesium chloride
min minutes
MLH1 MutL homolog 1
MMP Matrix metalloproteinases
MMP2 Matrix metalloproteinase-2
MSH2 MutS protein homolog 2
MTJ-1 Murine tumor cell DnaJ-like protein 1 mTOR Mammalian target of rapamycin
MUC16 Mucin 16
NA2HPO4 Sodium phosphate dibasic Na3HPO4 Trisodium Phosphate NA3VO4 Sodium orthovanadate
NaCl Sodium chloride
NaH2PO4 Sodium phosphate monobasic
NANOG Nanog homebox
NBD Nucleotide-binding domain
NCK Non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein
NEF Nucleotide Exchange Factors
NF-kβ Nuclear factor-kappa B
NKG2D Natural-killer group 2, member D OMS Organisation mondiale de la santé
PAK2 P21 Protein (Cdc42/Rac)-Activated Kinase 2 Par-4 Prostate apoptosis response 4
PARP Poly ADP-ribose polymerase
PAX8 Paired box gene 8
PBS Phosphate-buffered saline
PCR Polymerase chain reaction
PD-1 Programmed cell death protein 1 PDI Protein disulfide isomerase
PDK1 3-Phosphoinositide-dependent kinase 1 PD-L1 Programmed death-ligand 1
PEG PolyEthylene Glycol
PERK Protein kinase R-like ER kinase
PI3K Phosphoinositide 3-kinase
PIP2 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate PIP3 Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate
PIPAC Pressurized Intraperitoneally Aerosol Chemotherapy
PKA Protein kinase A
PKCζ Protein kinase C zeta type
PMS1 Postmeiotic segregation protein 1 PMS2 Postmeiotic segregation protein 2 PTEN Phosphatase and tensin homolog Raf-1 Rapidly Accelerated Fibrosarcoma
RE Réticulum endoplasmique
RPMI Roswell Park Memorial Institute medium 1640
s seconde
SAC Selective for apoptosis in cancer cells Sar1 Secretion associated Ras related GTPase 1
SBD Substrate-binding domain
SBOT Serous borderline ovarian tumors
SDS Sodium dodecyl sulfate
SFRP1 Secreted frizzled-related protein 1
SG Survie globale
Sig 1R Sigma-1 receptor
siRNA Small interfering RNA
SKOV-3 Sloan-Kettering ovarian carcinoma cell line Smad2/3 Mothers against decapentaplegic homolog 2/3 Smad4 Mothers against decapentaplegic homolog 4
SP1 Site-1 protease
SP2 Site-2 protease
SPT SREBP
survie sans progression de la tumeur Sterol regulatory element-binding proteins SRP Signal Recognition Particle
STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3
TA Température ambiante
TAMs Tumor-associated macrophages
TBS Tris-buffered saline
TF Tissue factor
TFII-I Transcription factor II-I
TGF-β Transforming growth factor beta THS Traitement hormonal substitutif TIC Tubal intraepithelial carcinoma TILs Tumor infiltrating lymphocytes
TOPO1 Topoisomerase-1
TRAF2 TNF receptor-associated factor 2 Treg Cellules T régulatrices
Tris-HCl Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride
UPR Unfolded protein response
VC Volume de cellule
VEGF Vascular endothelial growth factor
WASF3 Wiskott-Aldrich syndrome protein family member 3
Wnt WgInt
wt Wild type
XBP1 X-Box Binding Protein 1
α2M Alpha2-macroglobulin
Liste des Tableaux
Tableau 1 : Liste des anticorps primaires et secondaires utilisés lors de l’analyse des protéines par Western Blot, immunofluorescence et ELISA cellulaire.
Tableau 2 : Protocoles de transfections de plasmides dans les cellules SKOV-3, HIPEC 65 et A2780.
Tableau 3: Protocoles de transfections de siRNA dans les cellules SKOV-3, HIPEC 65 et A2780.
Tableau 4 : Séquences des oligonucléotides utilisées pour l’analyse d’ADN par qPCR.
Liste des Figures
Figure 1: Incidence mondiale du cancer de l’ovaire tous âges confondus [1].
Figure 2: Répartition géographique du taux de mortalité du cancer de l’ovaire (World Health Rankings).
Figure 3: Coupe histologique des quatre principaux sous types du cancer épithélial de l’ovaire (Coloration à l’hématoxyline/éosine) [2].
Figure 4 : Domaines protéiques de la GRP78.
Figure 5 : Localisation cellulaire de la GRP78 d’après Tsai et al. 2015 [3].
Figure 6 : Topographie de la GRP78 transmembranaire [4].
Figure 7 : Modèle de la recapture de protéines résidentes du RE [5].
Figure 8 : Les voies d’activation de la réponse au stress dans le RE [6].
Figure 9 : Schéma des voies d’activation induites par la formation du complexe α2M/GRP78.
Figure 10 : Schéma des voies d’activation induites par la formation du complexe Cripto/GRP78.
Figure 11 : Schéma de la voie d’activation induite par la formation du complexe GRP78/intégrine β1.
Figure 12 : Schéma de la voie d’activation induite par la formation du complexe GRP78/plasminogène.
Figure 13 : Schéma de la voie d’activation induite par la formation du complexe GRP78/Kringle 5.
Figure 14 : Schéma de la voie d’activation induite par la formation du complexe GRP78 /Par- 4.
Figure 15 : Schéma de la voie d’activation induite par la formation du complexe GRP78 /T- cadhérine.
Figure 16 : Les différentes étapes de développement de la membrane chorioallantoïque de l’embryon de poulet (Adaptation de l’image d’Aybike Ozcetin et al. [7]).
Figure 17 : Carte du plasmide d’expression de la GRP78.
Figure 18 : Séquence protéique des différents mutants de la GRP78.
Figure 19 : Effet de l’expression de Par-4 sur l’invasion cellulaire.
Figure 20 : Effet de l’expression de Par-4 et du taxol sur la sécrétion de Par-4.
Figure 21: Implication du SBD de la GRP78 dans sa relocalisation à la membrane plasmique.
Figure 22 : Effet de la présence d’un motif FLAG avant le peptide signal de la GRP78 sur la relocalisation de la GRP78 à la membrane plasmique.
Figure 23 : Implication du SBD dans la sécrétion de la GRP78 dans le milieu extracellulaire.
Figure 24 : Effet de la présence d’un motif FLAG avant le peptide signal de la GRP78 sur la sécrétion de la GRP78 dans le milieu extracellulaire.
Figure 25 : Existence d’une forme membranaire de la GRP78 au niveau du RE.
1- Introduction
Les ovaires jouent un rôle capital dans la reproduction humaine. Ils possèdent une fonction exocrine via la production d’ovules et une fonction endocrine via la sécrétion d’hormones. A chaque ovulation, les ovaires subissent des dommages et sont le siège de modulations hormonales intenses. Ces facteurs, additionnés à notre environnement, peuvent entraîner des lésions cellulaires aboutissant à des cellules cancéreuses.
Le cancer de l’ovaire est le plus mortel des cancers gynécologiques et la huitième cause de décès par cancer chez les femmes dans le monde selon le projet Globocan 2012 [1, 8]. Le pourcentage de survie à 5 ans, tous stades confondus, est d’environ 40 %. Le cancer de l’ovaire est décrit comme une maladie asymptomatique aux stades précoces. De ce fait, la détection de ce cancer est difficile et, actuellement, aucun test de dépistage ou marqueur spécifique n’a été validé pour le cancer de l’ovaire.
1.1. Le cancer de l’ovaire
Le cancer de l’ovaire est une maladie rare (3,6 % de l’ensemble des cancers diagnostiqués chez la femme) et les causes exactes sont, à l’heure actuelle, inconnues [1]. Cependant, les études sur la fréquence, la répartition, la classification histologique et l’implication de différents facteurs dans le développement de ce cancer permettent une meilleure compréhension de la maladie et une meilleure approche pour la recherche de traitements.
1.1.1. Epidémiologie du cancer de l’ovaire
Selon le projet Globocan 2012, chaque année, environ 238 000 femmes sont diagnostiquées avec un cancer de l’ovaire et 151 000 décès sont prononcés dans le monde [1]. L’Asie est le continent avec le plus grand nombre de cas dénombrés (Figure 1) et également où il est recensé le plus de décès (Figure 2).
Figure 1: Incidence mondiale du cancer de l’ovaire tous âges confondus [1]
Figure 2: Répartition géographique du taux de mortalité du cancer de l’ovaire (World Health
Amérique du Nord: 10%
Amérique Latine et les Caraïbes: 7.5%
Afrique: 7.5%
Océanie: 0.8%
Europe: 27.5%
Asie: 46.7%
1.1.2. Etiologie du cancer de l’ovaire
De nos jours, les causes du cancer de l’ovaire demeurent obscures. Cependant, des facteurs de risque, associés au développement des tumeurs malignes ovariennes, ainsi que des facteurs préventifs ont été mis en évidence.
1.1.2.1.Facteurs de risques
L’âge
L’âge moyen du diagnostic du cancer de l’ovaire se situe entre 60 et 64 ans. Si les jeunes femmes (moins de 45 ans) ne sont néanmoins pas épargnées, l’incidence chez ces patientes a fortement diminué, probablement due à l’augmentation du nombre de jeunes femmes prenant une contraception orale (voir paragraphe Facteurs préventifs) [2].
Les antécédents familiaux
Le risque de cancer de l’ovaire augmente lorsque des parents de premier degré ont développé un cancer de l’ovaire. Cette hérédité peut être due à la présence de mutations génétiques spécifiques comme dans les gènes BRCA1 et BRCA2. D’autres mutations dans des gènes impliqués dans la réparation de l’ADN, telles que les mutations des gènes MSH2, MLH1, PMS1 et PMS2, favoriseraient également l’apparition du cancer de l’ovaire [9].
L’augmentation du nombre d’ovulations
L’ovulation entraine des lésions de l’ovaire propices au développement du cancer de l’ovaire. Ainsi, la puberté précoce, la nulliparité et la ménopause tardive peuvent être des facteurs de risque dus à l’augmentation du nombre d’ovulations. [10].
Le mode de vie
L’alimentation (consommation accrue de viande, de beurre), l’obésité, l’utilisation de talc, la cigarette (uniquement pour le cancer ovarien mucineux) favoriseraient l’apparition de dommages à l’ADN impliquant ainsi l’apparition de cellules cancéreuses [10].
Le traitement hormonal substitutif (THS)
Le THS est prescrit pour minimiser les effets de la ménopause. Cependant depuis quelques années, des études ont établi un lien entre le THS et le cancer de l’ovaire. Une revue de 52 études épidémiologiques a clairement montré une augmentation significative d’environ 50% de risque de développer un cancer de l’ovaire lorsque les femmes reçoivent un traitement hormonal d’une durée de 6 ans. Ils observent également que le risque diminue lorsque la durée du THS diminue [11].
Les maladies gynécologiques associées au cancer de l’ovaire
Des maladies telles que l’endométriose, le syndrome des ovaires polykystiques et les maladies pelviennes inflammatoires ont été pointées comme facteur de risque du cancer de l’ovaire [9, 10].
1.1.2.2.Facteurs préventifs
La diminution du nombre d’ovulations
La contraception orale et la multiparité réduiraient le risque de développer un cancer de l’ovaire grâce à la diminution du nombre d’ovulations. L’effet du contraceptif oral est validé pour une prise de contraception d’une durée minimum de cinq ans. L’effet peut être d’une durée de 10 à 20 ans après l’arrêt de la pilule [2, 9, 12]. Des études ont également montré que l’allaitement diminuerait le risque de cancer de l’ovaire via l’inhibition de sécrétion des gonadotrophines (FSH et LH) aboutissant à
La ligature des trompes et l’hystérectomie
Les femmes qui ont eu une ligature des trompes ou une hystérectomie (ablation de l’utérus) ont un moindre risque de développer un cancer de l’ovaire [10, 13].
1.1.3. Classification des tumeurs ovariennes
Il existe trois principaux groupes de tumeurs ovariennes: les tumeurs des cellules germinales, les tumeurs du cordon sexuel et du stroma et les tumeurs de surface épithéliale [2]. Chacune de ces trois catégories comprend plusieurs sous-catégories en fonction de l’aspect cellulaire et moléculaire [2, 14].
Les cancers des cellules germinales de l’ovaire représentent moins de 5 % des cancers de l’ovaire et débutent dans les cellules germinales. Selon l’organisation mondiale de la santé (OMS), il existe six sous-groupes de tumeurs germinales. Elles sont plutôt diagnostiquées chez les jeunes femmes, se développent rapidement et peuvent devenir très volumineuses. Le traitement de ce type de cancer est la chirurgie complétée par une chimiothérapie [2, 14, 15].
Les tumeurs du stroma et des cordons sexuels représentent 5 à 7 % des cancers de l’ovaire et comportent également six sous-groupes. Elles prennent leur origine à partir des tissus conjonctifs de l’ovaire qui sont impliqués dans la production d’hormones. De ce fait, lors de l’apparition de ces tumeurs, le dérèglement hormonal est souvent présent. Les tumeurs du stroma sont, dans la majorité des cas, détectées à un stade précoce permettant un fort taux de rémission. Les traitements sont identiques aux traitements proposés contre les tumeurs germinales [2, 14, 15].
Les tumeurs épithéliales de l’ovaire représentent environ 85 % des tumeurs ovariennes diagnostiquées et sont donc les plus fréquentes d’où l’intérêt que leur porte ce travail.
1.1.4. Les cancers épithéliaux de l’ovaire
1.1.4.1.La classification de la Fédération Internationale de Gynécologie-Obstétrique (FIGO)
Quatre stades ont été décrits afin d’évaluer la progression de la maladie. Au stade I, la tumeur est restreinte aux ovaires. Si la maladie présente une tumeur sur l’un ou les deux ovaires avec une extension pelvienne ou un cancer primaire du péritoine, le cancer appartient alors au stade II. Le stade III implique une atteinte d’un ou des deux ovaires avec une invasion du péritoine à l’extérieur du pelvis et/ou des métastases sur les ganglions lymphatiques retro péritonéaux. Au stade IV, le cancer s’est propagé vers d’autres organes (poumon, foie) [14]. La définition du stade de la maladie permet au médecin de mettre en place un traitement adapté et également de lui fournir des informations quant à l’avancée de la maladie et à la prise en charge de la patiente.
1.1.4.2.Les types histologiques
Parmi les cancers épithéliaux de l’ovaire, quatre sous-types histologiques sont majoritairement diagnostiqués : les carcinomes séreux (environ 75% des cas), les carcinomes mucineux (environ 3%
des cas), les carcinomes endométrioïdes (environ 10% des cas), et les carcinomes à cellules claires (environ 10% des cas) [16] (Figure 3).
Figure 3: Coupe histologique des quatre principaux sous-types du cancer épithélial de l’ovaire (Coloration à l’hématoxyline/éosine) [2]
Les tumeurs séreuses
Ces tumeurs sont divisées en trois groupes selon leur potentiel évolutif : les tumeurs bénignes (70 %), les tumeurs borderlines (10 %) et les tumeurs malignes (20 %). Les tumeurs borderlines séreuses (SBOT) sont diagnostiquées chez des femmes de 40-50 ans, atteignent dans un tiers des cas les deux ovaires et ont un faible taux de rechute (environ 7 %). Les tumeurs séreuses borderlines sont souvent kystiques. Elles peuvent s’accompagner d’implants non invasifs à la surface péritonéale. Si des implants invasifs sont présents, les tumeurs séreuses borderlines sont qualifiées de tumeurs séreuses de bas grade (LGSC). Les SBOT peuvent également présenter des micro-papilles. Les SBOT micro- papillaires ont un profil génétique qui ressemble fortement au LGSC et ont un taux de rechute plus important que les SBOT classiques. Les tumeurs malignes séreuses sont scindées en deux groupes : les LGSC et les tumeurs séreuses de haut grade (HGSC) qui diffèrent par leur profil génétique. Les HGSC ont un indice mitotique plus important que les LGSC. De plus, les HGSC sont plus souvent résistants à la doxorubicine et à l’étoposide, et les LGSC sont plus résistants au paclitaxel et au carboplatine. Enfin, la survie à 5 ans tous stades confondus est d’environ 50 % pour les patientes souffrant d’un LGSC et d’environ 20 % pour les patientes souffrant d’un HGSC [14, 16, 17].
Les tumeurs mucineuses
Ces tumeurs représentent environ 3 % des tumeurs épithéliales de l’ovaire dont 85 % sont bénignes, 10-15 % borderlines et 10 % malignes. La caractéristique majeure de ces tumeurs est la présence de cellules mucosécrétantes. Les tumeurs mucineuses sont souvent unilatérales, de grandes tailles et lisses en surface. Les tumeurs borderlines mucineuses (MBOT) affectent les femmes de 35 à 45 ans et sont diagnostiquées à un stade précoce offrant ainsi un excellent pronostic de survie (96 % de survie sur 10 ans). Les MBOT peuvent être de type intestinal ou séromucineux. Les tumeurs malignes mucineuses s’observent chez les patientes de 60 ans et plus, et sont également diagnostiquées à un
stade précoce. Les caractéristiques sont les mêmes que celles des MBOT mais les tumeurs malignes mucineuses présentent un caractère infiltrant [14, 16, 18].
Les tumeurs endométrioïdes
Les tumeurs endométrioïdes représentent environ 10 % des tumeurs épithéliales dont 20 % sont bénignes ou borderlines et 80 % sont malignes. La morphologie des cellules de ces tumeurs ressemble fortement à celle des cellules de l’épithélium de l’endomètre. Les tumeurs borderlines endométrioïdes sont souvent des tumeurs solides et peuvent parfois être microinvasives. Le pronostic de ces tumeurs est très bon avec cependant un risque de développer un adénocarcinome de même type au niveau de l’endomètre et dans l’ovaire controlatéral. Les tumeurs endométrioïdes malignes s’observent chez des patientes de 50 à 60 ans et affectent les deux ovaires dans un tiers des cas, et ces tumeurs s’accompagnent d’un cancer malin de l’endomètre dans un quart des cas. Le taux de survie est de 80 % à cinq ans au stade I et diminue drastiquement au fur et à mesure des stades pour atteindre 5 % au stade IV [14, 16, 18].
Les tumeurs à cellules claires
Les tumeurs à cellules claires représentent moins de 10 % des tumeurs épithéliales de l’ovaire dont 10
% sont bénignes ou borderlines et 90 % sont malignes. Elles sont, dans la plupart des cas, unilatérales et affectent des patientes de 50 à 70 ans. Les tumeurs borderlines à cellules claires sont constituées de nids de cellules claires avec absence de caractères invasifs et, le taux de survie est très bon [14, 18].
Elles présentent un caractère invasif et auraient un plus mauvais pronostic que les tumeurs malignes séreuses.
1.1.4.3. Les grades du cancer de l’ovaire
Les grades sont définis en fonction de l’agressivité des cellules cancéreuses, c'est-à-dire de leur capacité à se multiplier, mais également en fonction de leurs similitudes avec une cellule saine. Trois grades ont été définis afin de juger de l’agressivité du cancer. Le grade 1 correspond à des cellules cancéreuses qui se multiplient lentement et qui sont bien différenciées. Les tumeurs de grade 3 ont un pouvoir de division cellulaire important et présentent un risque élevé de se disséminer dans le corps humain. Le grade 2 est un grade intermédiaire avec peu de cellules différenciées et une agressivité modérée.
Pour le cancer épithélial séreux de l’ovaire, le grade 1 représente les cancers de bas grade, et les grades 2 et 3 correspondent aux cancers de haut grade [14].
1.1.4.4. Classification moléculaire
Depuis environ dix ans, les cancers épithéliaux ovariens ont été classés en deux types en fonction de leur profil génétique. Le type 1 regroupe les tumeurs séreuses de bas grade, les tumeurs endométrioïdes, mucineuses et à cellules claires, et est caractérisé par la présence de mutations des gènes BRAF, KRAS et phosphatase and tensin homolog (PTEN). Quant au type 2, il regroupe les cancers séreux de haut grade, et est caractérisé en général par la présence de mutations dans les gènes p53, BRCA1 ou BRCA2 [19].
1.1.4.5. L’origine du cancer épithélial de l’ovaire : les hypothèses
Depuis environ 150 ans, plusieurs hypothèses ont été proposées afin d’expliquer l’origine du cancer épithélial de l’ovaire mais à l’heure actuelle, aucune n’a été validée.
Les cellules de l’épithélium de surface de l’ovaire
En 1872, Sir Spencer Wells suggère que le cancer de l’ovaire prend origine au niveau de l’épithélium de surface ovarien (ESO). Les cellules de l’ESO ressemblent à des cellules mésothéliales et partagent une origine embryologique commune avec l’épithélium Mullérien. Les cellules tumorales ovariennes proviendraient de l’ESO peu différencié qui aurait subi des modifications moléculaires aboutissant à différents types de cellules tumorales ovariennes (séreux, endométrioïdes, cellules claires, mucineux).
Cette hypothèse a été soutenue par Cheng et al. qui ont montré, in vivo et in vitro, que les cellules de l’ESO ont la capacité de se différencier en cellules cancéreuses ovariennes [20, 21].
Inclusion de kystes corticaux au sein de l’ovaire
En 1971, Fathalla et al. proposent que l’excès de cellules mésothéliales, dû à la cicatrisation après l’ovulation, induirait l’inclusion de kystes au sein du stroma (kystes corticaux). Ces kystes subiraient des changements dus à leur exposition à des facteurs de croissance, aboutissant à un épithélium de type Mullérien. Ensuite, ces kystes se transformeraient en tumeurs malignes au sein de l’ovaire [22].
A l’heure actuelle, le processus de transformation est mal documenté et il est donc difficile d’expliquer la progression de ces kystes en tumeurs malignes.
Les cellules souches
Le mécanisme rapide et robuste impliqué lors de la réparation de la surface de l’ovaire suggère la présence de cellules souches. Les cellules souches ont été décrites comme de parfaites candidates pour induire un cancer dans des tissus épithéliaux et ceci pourrait s’appliquer au cancer de l’ovaire [23]. Les cellules de l’ESO exprimeraient différents marqueurs de cellules souches tels que NANOG, CD44 ou encore SFRP1 [2, 23]. Un marquage spécifique des cellules souches a permis de les
dans la cicatrisation de la surface de l’ovaire après l’ovulation [23]. De plus, les tumeurs épithéliales ovariennes expriment des marqueurs de cellules souches [24]. Brenton et al. propose qu’une niche de cellules souches puisse être à l’origine des cancers épithéliaux de l’ovaire chez la souris. Une ou plusieurs mutations au niveau des cellules souches se produiraient et ainsi entraîneraient une transformation néoplasique et une différenciation aboutissant à des tumeurs de différents types [25].
Les théories impliquant les tissus avoisinants
En 1999, l’implication des cellules de l’ESO dans le cancer de l’ovaire est remise en question.
Dubeau propose une origine mullérienne pour le cancer de l’ovaire. L’argument majeur est l’aspect histologique des cellules tumorales ovariennes. En effet, les cellules cancéreuses ovariennes ne ressemblent pas aux tumeurs mésothéliales. Il explique également que les lésions pré-malignes se développent rarement au sein des cellules de l’ESO des kystes d’inclusion, mais plutôt sur des organes adjacents [26].
A la suite de cette étude, différentes hypothèses ont été proposées pour expliquer l’origine des tumeurs séreuses, à cellules claires, mucineuses et endométrioïdes.
o Les carcinomes séreux de haut grade
Les cellules de la trompe de Fallope pourraient s’implanter au sein de l’ovaire via les franges de la trompe de Fallope au moment de l’ovulation. En 2001, Piek et al. analysent des segments de trompes de Fallope provenant de patientes présentant soit une mutation BRCA, soit un historique familial de cancer de l’ovaire. L’histologie de ces segments montre une ressemblance frappante à des cancers séreux de l’ovaire de haut grade [27]. Par la suite, d’autres analyses de fragments de trompes de Fallope de patientes avec une mutation BRCA ont pu démontrer le lien indéniable entre le carcinome des trompes de Fallope et les maladies associées à la mutation BRCA suggérant une origine tubaire du cancer de l’ovaire pour les femmes portant la mutation BRCA [28, 29].
Un autre aspect appuyant l’hypothèse de l’origine tubaire (non héréditaire) du cancer séreux de l’ovaire est la présence de la mutation p53. Les carcinomes intra épithéliaux tubaires (TIC) ainsi que les cancers séreux de l’ovaire de haut grade portent la même mutation p53 et ont une forte ressemblance morphologique [28-31].
L’hypothèse de l’origine tubaire du cancer séreux de l’ovaire est aussi appuyée par l’expression de marqueurs spécifiques. En effet, les tumeurs de haut grade du cancer séreux de l’ovaire expriment PAX 8 qui est un marqueur Mullérien mais pas la calrétinine qui est un marqueur du mésothélium [32].
Cependant, cette origine tubaire nécessite d’autres analyses et n’explique pas l’origine de l’ensemble des cancers épithéliaux de l’ovaire.
o Les carcinomes à cellules claires, mucineux et endométrioïdes
Les tumeurs à cellules claires et les tumeurs endométrioïdes seraient associées à l’endométriose par leur morphologie et leur ressemblance moléculaire. Des mutations sont communes avec l’endométriose, comme les mutations des gènes PI3K, ARID1A [33].
Quant au cancer mucineux, son origine n’est pas très bien définie car son phénotype est très éloigné du phénotype Mullérien. Les tumeurs mucineuses auraient pour lieu d’origine la zone de jonction entre l’épithélium tubaire et le péritoine [30].
1.1.5. Les traitements du cancer de l’ovaire 1.1.5.1. La chirurgie
La chirurgie est le traitement de base proposé en première instance aux patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire de stades I, II jusqu’à IIIB. Pour le stade IV, la chirurgie est discutée en fonction de la taille, de l’évolution de la tumeur et également de l’état de la patiente.
En fonction du stade et de l’étendue de la tumeur, plusieurs options sont possibles. Si la tumeur est à un stade précoce (stade I) impliquant uniquement l’ovaire, l’opération est conduite sous laparoscopie (mini-incisions au niveau de la paroi abdominale). En revanche, si d’autres organes sont atteints, une laparotomie est envisagée (ouverture plus large de l’abdomen).
Lors de l’opération, des échantillons sont prélevés afin d’effectuer une analyse histologique de la tumeur. Par la suite, le chirurgien réalise une annexectomie bilatérale et une hystérectomie totale dépendant du cas. De plus, lors de cette chirurgie, d’autres tissus ou organes avoisinant peuvent être retirés. Pour les stades IIIB et IV, une chimiothérapie néoadjuvante est proposée et sera suivie d’une chirurgie d’intervalle (qui se déroulera entre 2 cures). L’objectif majeur est la résection complète [2, 15, 19].
1.1.5.2.La chimiothérapie
La chimiothérapie est prescrite dans la majorité des cas. La prescription de la chimiothérapie dépend du stade, du type et du grade de la tumeur. Pour les stades I, la chimiothérapie n’est pas proposée sauf pour le stade IC en cas de mauvais pronostic. La chimiothérapie standard, composée de platine (carboplatine) et taxane (paclitaxel), est utilisée dans le traitement des stades précoces à haut risque et des stades avancés du cancer de l’ovaire [2]. Le traitement comporte 6 à 8 cycles espacés de trois semaines [2]. En cas de chimiothérapie néoadjuvante, les cycles sont réduits à 3 ou 4, puis, après la chirurgie, 2 à 3 cycles de chimiothérapie sont ajoutés [2].
La chimiothérapie peut être administrée par voie intraveineuse (IV) ou par voie intrapéritonéale (IP).
L’IP permet un contact direct avec la masse tumorale et serait plus efficace que l’IV [34]. Cependant, en terme de qualité de vie pour la patiente, l’IP augmenterait les effets indésirables [34] et donc l’IV est préférentiellement utilisée.
La chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale (CHIP) est une autre méthode d’administration.
La CHIP combine la chirurgie de réduction tumorale suivie directement de l’application d’une chimiothérapie diluée dans un liquide chauffé à 42°C. L’hyperthermie a son propre effet toxique au niveau des cellules (destruction des lipides membranaires, destruction du cytosquelette, formation de radicaux libres…) et permettrait ainsi une meilleure action de la drogue chimiothérapeutique utilisée.
La CHIP peut être réalisée à ventre ouvert ou à ventre fermé. Quelques études ont montré que les patientes traitées avec la CHIP présentent une meilleure survie globale (SG). Cependant, le nombre d’études cliniques utilisant cette méthode est insuffisant pour prouver le réel bénéfice de cette méthode pour le traitement de patientes souffrant d’un cancer de l’ovaire [2, 35, 36].
Une autre option thérapeutique, en Suisse, est la chimiothérapie intra-péritonéale vaporisée (PIPAC).
Cette méthode permet une distribution homogène de la drogue et une meilleure pénétration tissulaire.
Une étude faite sur des patientes atteintes du cancer de l’ovaire a montré les bénéfices de la PIPAC sur la régression tumorale mais également sur la diminution des effets secondaires. Cependant, d’autres études cliniques seront nécessaires afin d’affirmer le réel bénéfice de ce procédé [37].
1.1.5.3.Les thérapies ciblées
La thérapie ciblée est une approche thérapeutique permettant le blocage spécifique de mécanismes impliqués dans le développement ou le maintien des cellules cancéreuses. De plus, elle peut être complémentaire à la chimiothérapie ou représenter une alternative. Les études sur les thérapies ciblées sont nombreuses, nous nous sommes donc focalisés sur les plus étudiées.
Les antiangiogéniques
L’anticorps monoclonal bevacizumab (Avastin) permet d’inhiber l’angiogenèse en liant le facteur de croissance VEGF, l’empêchant de se fixer aux récepteurs à la surface des cellules endothéliales. Le
utilisation en combinaison avec la chimiothérapie pour des patientes avec un cancer de l’ovaire résistant aux platines. Différentes études cliniques telles que GOG 0218, ICON7, OCEANS, AURELIA ont permis de démontrer l’efficacité de l’Avastin sur la survie sans progression de la tumeur (SPT) [2]. D’autres drogues permettant d’inhiber l’angiogenèse telles que l’aflibercept, le trebanabib, le pazopanib, le cediranib, le nintedanib ont montré une meilleure SPT mais pour le pazopanib, le cediranib, le nintedanib, les effets secondaires sont très importants [2, 38-41].
La famille des anti-epidermal growth factor receptor (EGFR)
Ces récepteurs sont surexprimés dans certaines tumeurs et ont un rôle dans la croissance tumorale en favorisant la prolifération, la migration et l’adhésion des cellules. L’EGFR le plus étudié est EGFR2 ou encore HER2. Celui-ci est plus souvent observé dans les cancers ovariens séreux de haut grade et sa surexpression est souvent associée à un mauvais pronostic [42]. Trois différents agents ont été utilisés afin d’inhiber l’activité de HER2 : deux anticorps (le trastuzumab, connue sous le nom de Herceptin, et le pertuzumab) et un inhibiteur de la tyrosine kinase de HER2 (lapatinib). Cependant, les études, utilisant ces agents pour le traitement du cancer de l’ovaire, montrent peu d’amélioration de la SPT et de la SG [2, 41-44].
Le Catumaxomab
Le Catumaxomab est un anticorps bispécifique trifonctionnel, c'est-à-dire qu’il peut lier les cellules cancéreuses via la molécule d’adhésion cellulaire épithéliale (EpCAM), les lymphocytes T via l’antigène CD3, et les cellules accessoires via le récepteurs Fc. Cette trifonctionnalité va entraîner une dynamique immunitaire aboutissant à la lyse apoptotique via les lymphocytes T et une phagocytose via les cellules accessoires. En 2009, le Catumaxomab a été approuvé par la FDA pour le traitement de l’ascite malin [45].
Les anticorps ciblant les macrophages associés aux tumeurs (TAMs)
Les TAMs vont permettre l’activation des cellules régulatrices T (Treg) via la sécrétion de la cytokine chimiotactique : CCL22. Les Treg inhibent la prolifération des lymphocytes effecteurs diminuant les réponses immunitaires anti-tumorales. L’utilisation d’un anticorps anti-CCL22 a montré une diminution du transport des Treg et de l’effet immunosuppressif des TAMs [46]. Les TAMs expriment un autre récepteur : B7-H4. Dans le cancer de l’ovaire, B7-H4 serait exprimé dans environ 70 % des TAMs isolés de tumeurs ovariennes. B7-H4 inhiberait la prolifération et la production des cytokines des lymphocytes CD4 et des lymphocytes CD8 (lymphocyte cytotoxiques) [47].
L’utilisation d’anticorps anti-B7-H4 permettrait une diminution de la prolifération des cellules ovariennes cancéreuses et induirait également une activation des lymphocytes T [46]. Une autre possibilité serait de cibler spécifiquement les récepteurs du colony stimulating factor-1 (CSF-1R).
Les CSF-1R contrôlent la production, la différenciation et la fonction des TAMs [48]. Chez la souris, une injection d’anti-CSF-1R diminue la production de TAMs et augmente les lymphocytes CD8 [49].
Une étude clinique de phase I combinant un anti-CFS-1R (emactuzumab) au paclitaxel est actuellement en cours [50].
1.1.5.4. L’immunothérapie active
L’immunothérapie a pour but de stimuler le système immunitaire afin de détruire les cellules cancéreuses. Comme il a été décrit précédemment, les anticorps monoclonaux (tels que les anti-HER, catumaxomab) sont considérés comme un traitement d’immunothérapie passif dû à l’absence de mémoire immunologique et donc inefficace contre une possible récidive. L’acquisition d’une mémoire immunologique passe par l’induction d’une réponse des lymphocytes T (immunothérapie active) permettant ainsi de lutter contre les récidives. En 2003, Zhang et al. observent, dans le cancer
des lymphocytes est considérée comme un facteur de pronostic [52]. Ces travaux proposent donc une stratégie d’immunothérapie en stimulant les cellules du système immunitaire.
L’utilisation d’inhibiteurs des points de contrôle du système immunitaire
Les points de contrôle du système immunitaire sont des clefs importantes pour le maintien de la tolérance au soi et également pour la modulation des réponses immunitaires. Les cellules cancéreuses utiliseraient ces points de contrôle afin de résister au système immunitaire. Les trois cibles à l’étude sont : la protéine T4 associée aux lymphocytes T cytotoxiques (CTLA-4), le ligand 1 de la protéine de la mort cellulaire programmée (PD-L1), et l’indoleamine 2,3 –dioxygénase (IDO).
CTLA-4 est un récepteur exprimé à la surface des lymphocytes T auxiliaires. Il joue un rôle dans la régulation de l’activation des lymphocytes T. L’inhibition des CTLA-4 entraîne une activation des lymphocytes T CD4+ et CD8+ favorisant la régression tumorale [53, 54]. Une étude clinique de phase II utilisant l’iplimumab (anti-CTLA-4) en monothérapie sur des patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire est en cours [2, 55].
Le PD-L1, exprimé par différents types cellulaires, forme un complexe avec le récepteur 1 de mort cellulaire programmée (PD-1) qui est exprimé par les lymphocytes T. La formation de ce complexe empêche l’activation des lymphocytes. Cependant, certaines cellules cancéreuses, comme celles de l’ovaire, surexpriment le PD-L1 leur permettant ainsi d’échapper à l’immuno-surveillance. Le PD-L1 et son récepteur sont des cibles possibles pour inhiber l’immunosuppression induite par les tumeurs.
Des études cliniques utilisant des anticorps ciblant le complexe PD-1/PD-L1 montrent des effets intéressants sur la SPT et la SG des patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire [2, 55, 56].
L’IDO est une enzyme qui dégrade le tryptophane en kynurénine. Dans l’environnement tumoral, l’IDO permet aux cellules tumorales d’échapper au système immunitaire. Deux mécanismes sont suggérés : 1) la kynurénine serait toxique pour les lymphocytes T et, 2) l’IDO limite la disponibilité
du tryptophane aux lymphocytes T inhibant leur activation. Dans le cancer de l’ovaire, l’IDO serait prévalent dans environ 53 % des tumeurs. La présence de l’IDO corrèlerait avec une réduction des lymphocytes infiltrés CD8+, une inhibition des cellules NK et une augmentation de l’angiogenèse [46]. Des études sur modèle murin utilisant un inhibiteur de l’IDO (le 1-D-methyl-tryptophan (1-D- MT) ou Indoximob) montrent une augmentation de la survie, une suppression de l’ascite et de la dissémination tumorale [46]. Différentes études cliniques utilisant l’Indoximob, montrent des résultats encourageants et d’autres études sont actuellement en cours [46].
L’immunothérapie cellulaire adoptive : les lymphocytes infiltrant les tumeurs ou Tumor infiltrating lymphocytes (TILs)
Cette méthode consiste à injecter aux patientes des lymphocytes autologues préalablement amplifiés.
En 1991, le traitement, combinant le cisplatine et les TILs, des patientes souffrant d’un cancer de l’ovaire résistant montre une régression de la tumeur. L’efficacité du traitement par les TILs est confirmée en 1995 avec une augmentation significative de la SG des patientes traitées [46, 57]. Plus tard d’autres groupes se sont intéressés à cette méthode de traitement en perfectionnant l’idée. Les cellules T sont modifiées génétiquement afin d’exprimer un récepteur antigénique chimérique (CAR) permettant de cibler les cellules cancéreuses. Le groupe de Sentman a utilisé cette stratégie, avec le récepteur NKG2D, sur modèle murin et montre une augmentation de la survie des souris et également l’acquisition d’une mémoire immunitaire [58]. D’autres ciblages, comme MUC-16, Her2/Neu, induisent des effets sur les cellules cancéreuses sans affecter les cellules saines de l’ovaire [59]. Un autre récepteur cible étudié est le récepteur aux folates. Une étude clinique de phase I utilisant des CAR-T dirigés contre les récepteurs aux folates et un signal de costimulation montre une augmentation de la régression tumorale et une augmentation du nombre de lymphocytes CD3
L’immunothérapie est une avancée révolutionnaire dans le traitement du cancer de l’ovaire. Ces traitements permettent d’activer notre système immunitaire contre les cellules cancéreuses.
En parallèle à l’immunothérapie, d’autres traitements, toujours en vue d’apporter un traitement plus spécifique à la patiente, sont à l’étude, car la chimiothérapie reste un traitement dangereux pour les patientes. Un ciblage des cellules cancéreuses, tout en limitant l’impact sur les cellules saines, reste une des priorités dans l’amélioration des traitements.
1.1.5.5. L’utilisation de nanovecteurs dans le cancer de l’ovaire
L’administration de drogues chimiothérapeutiques affecte les tissus sains et provoque de nombreux effets secondaires. De plus, les drogues rencontrent des barrières physiologiques limitant leurs effets.
Pour remédier à cela, une nouvelle approche est développée grâce aux nanotechnologies. Le principe est d’utiliser un nanovecteur afin de préserver le principe actif des barrières naturelles et de vectoriser le médicament afin de limiter l’impact sur les tissus sains et les effets secondaires. Il existe plusieurs types de nanovecteurs tels que les liposomes, les micelles, les dendrimères, les nanosphères et les nanocapsules.
Les différentes générations de nanovecteurs
On distingue trois générations de nanovecteurs. La première génération correspond à des nanovecteurs « nus », sans aucune modification chimique de leur surface. Lors du traitement, les nanovecteurs de première génération se concentrent au niveau du foie. En effet, ces nanovecteurs vont subir l’opsonisation permettant leur reconnaissance par les macrophages. Les nanovecteurs de première génération ont été utilisés dans le cas de maladies hépatiques afin de libérer le principe actif choisi. Afin d’élargir le traitement par nanovecteurs aux autres organes, une deuxième génération a été créée pour les protéger contre la dégradation par les macrophages. Les nanovecteurs ont été
recouverts d’un manteau de polyéthylène glycol (PEG) (polymère biodégradable) permettant une circulation du principe actif plus longue et une concentration des nanovecteurs plus importante au niveau de la tumeur. Ce phénomène est possible grâce à l’effet EPR (enhanced permability and retention effect). Au niveau des tissus sains, les jonctions de l’endothélium vasculaire sont serrées empêchant les nanovecteurs de pénétrer. En revanche, au niveau des tissus cancéreux, la perméabilité des vaisseaux sanguins est augmentée permettant la diffusion des nanovecteurs vers la tumeur. Une troisième génération a fait son apparition : des nanovecteurs pegylés additionnés d’un ligand permettant de cibler spécifiquement les cellules tumorales limitant ainsi l’impact sur les cellules saines [61].
Les nanovecteurs et le cancer de l’ovaire
Les premiers nanovecteurs utilisés pour le traitement du cancer de l’ovaire étaient des liposomes pegylés contenant de la doxorubicine : Doxil®. L’administration de Doxil® combinée au carboplatine permet une augmentation de la SPT comparé au traitement carboplatine/paclitaxel et également une réduction des effets toxiques du traitement. Par la suite, son utilisation a été approuvé par la FDA pour le traitement du cancer de l’ovaire récidivant [62].
Des liposomes, des micelles et des nanoparticules ont été utilisés pour encapsuler d’autres drogues telles que le paclitaxel, le docétaxel ou la cisplatine et ont été largement étudiés dans le cancer de l’ovaire. Les études montrent un bénéfice sur la régression tumorale comparé à la drogue seule et une augmentation de la concentration des nanovecteurs au niveau de la tumeur [62-69].
Afin de cibler spécifiquement les cellules cancéreuses, un ligand a été additionné à la surface des nanovecteurs. Le traitement avec des nanovecteurs chargés en drogues ciblant les récepteurs de l’acide folique ou les récepteurs du facteur de libération de l’hormone lutéinisante ou les récepteurs
survie des souris plus longue que le traitement avec des nanovecteurs sans ciblage [70-78]. De plus, le ciblage des EGFRs via des nanovecteurs permet une amélioration du traitement avec une régression tumorale in vivo [79-82].
Le ciblage des cellules cancéreuses de l’ovaire est une approche thérapeutique permettant d’augmenter l’efficacité du traitement et de diminuer les effets secondaires provoqués par les drogues chimiothérapeutiques. Cependant, de nos jours, malgré les dernières avancées dans la recherche de traitement, le cancer de l’ovaire reste le cancer gynécologique le plus mortel dans le monde. Il est donc également important d’investiguer les mécanismes qui participent à la croissance des cellules cancéreuses ovariennes pour permettre d’améliorer la spécificité et l’efficacité des traitements.
Dans cette optique, nous nous sommes particulièrement intéressés à une protéine qui a la spécificité d’être présente à la surface des cellules cancéreuses et pas des cellules saines : la Glucose-regulated protein 78 (GRP78).
1.2. La Glucose-regulated protein 78 : GRP78
La GRP78 est une protéine chaperonne principalement présente dans le RE. La GRP78 participe à la réponse au stress du RE. Des études montrent une forte expression de la GRP78 au niveau du cœur, du tube neural (système nerveux primitif de l’embryon), de l’endoderme, des somites (futur système nerveux central) et de l’ectoderme suggérant un rôle de la GRP78 dans le développement embryonnaire [83-85]. De plus, la délétion totale de la GRP78 est létale pour l’embryon [83]. Au-delà de l’impact sur le développement embryonnaire, la GRP78 prend une place importante dans le fonctionnement des organes et des tissus tels que le foie, les intestins, l’œsophage, le système
hématopoïétique, les muscles, le tissu adipeux, les glandes mammaires, la prostate et le cervelet [86, 87].
1.2.1. Généralités 1.2.1.1.Sa structure
La GRP78 a été découverte et nommée ainsi en 1977. La privation de glucose augmentait fortement l’expression de deux protéines, une à 78 kDa et l’autre à 94 kDa. En revanche, lorsque la concentration en glucose était élevée, la synthèse de ces deux protéines était fortement réduite [88].
En conséquence, ces deux protéines ont été nommées GRP78 et glucose-regulated protein 94 (GRP94). En 1986, il est également décrit que la GRP78 est identique à l’immunoglobulin heavy- chain-binding protein (BiP) [89]. De ce fait, la GRP78 peut être connue sous le nom de BiP ou également de heat shock 70kDa protein 5 (HSPA5). En effet, la GRP78 est codée par le gène HSPA5 et partage 60 % de sa séquence avec la Hsp70 [90].
La GRP78 est composée de trois principaux domaines : le NBD, le SBD et un domaine hélicoïdal en position C-terminale qui aurait un rôle lors de la formation du complexe entre la GRP78 et la protéine naissante. La GRP78 possède également un peptide signal en position N-terminale permettant son entrée dans le RE et une séquence KDEL en position C-terminale permettant sa rétention dans le RE (Figure 4) [91].
