Biosynthesis, release, and possible transfer of glucose-derived carbohydrate intermediates and amino acids from mammalian glial cells to photoreceptor-neurons

Thesis

Reference

Biosynthesis, release, and possible transfer of glucose-derived carbohydrate intermediates and amino acids from mammalian glial

cells to photoreceptor-neurons

POITRY-YAMATE, Carole

Abstract

Ce travail explore la possibilité d'un transfert d'hydrates de carbone et d'acides aminés dérivés du glucose des cellules gliales vers les neurones, dans le système nerveux central du mammifère. Nous avons établi, par autoradiographie du ³H-2-désoxyglucose et par HPLC, que les cellules gliales de Müller dans la rétine intacte du cobaye, puis fraîchement isolées, sont un site prépondérant de phosphorylation du glucose. De même, les résultats quantitatifs obtenus sur les cellules de Müller encore attachées aux photorécepteurs plaident en faveur d'un transfert de lactate, de glutamine, et du glutamate neurotransmetteur entre les cellules de Müller et les photorécepteurs car la concentration et l'activité spécifique de marquage radioactif de ces substances sont modulées par l'illumination. En aval du glucose-6-phosphate, (le substrat ³H-2-désoxyglucose étant remplacé par ¹⁴C(U)glucose), les cellules gliales synthétisent et relâchent de fortes quantités de ¹⁴C-lactate ainsi que de nombreux ¹⁴C-métabolites dépendant d'une activité anaplérotique.

POITRY-YAMATE, Carole. Biosynthesis, release, and possible transfer of

glucose-derived carbohydrate intermediates and amino acids from mammalian glial cells to photoreceptor-neurons. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 1994, no. Sc. 2661

DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:104644

Available at:

http://archive-ouverte.unige.ch/unige:104644

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UNIVERSITE ^{DE GENEVE}

Département

de

Physique Théorique Département de Biochimie

Département

^d'

Oto-Neuro-Ophtalmologie

FACULTE DES SCIENCES Professeur C. ^Enz

Professeur J.

Deshusses

FACULTE ^DE MEDECINE Professeur M.

TsacoPoulos

BIOSYNTHESIS, RELEASE, AND ^POSSIBLE TRANSFER OF GLUCOSE.DERIVED

CARBOHYDRATE INTERMEDIATES AND AMINO ACIDSFROMMAMMALIANGLIALCELLSTo

PH OTORECEPTOR-N ^EURONS

THESE

présentée

à

la Facultê

des Sciences

de l'université ^de

^Genève

pour obtenir

^le

^grade

de docteur

^{ès Sciences,}

^mention interdisciplinaire

par

Carole POITRY-YAMATE de Coppet (VD)

Thèse No

²⁶⁶¹

GENEVE

Editions Mêdecine et

^HYgiène

r994

UNIVERSITE ^{DE GENEVE} FACULTE ^{DES SCIENCES} Professeur C. Enz

Professeur J.

^Deshusses

Département de Physique Théorique

Département

de

Biochimie

FACULTE DE MEDECINE Département d'Oto-Neuro-Ophtalmologie Professeur M. Tsacopoulos

BIOSYNTHESIS, RELEASE, AND ^POSSIBLE TRANSFER OF GLUCOSE.DERIVED

CARBOHYDRATE INTERMEDIATES AND AMINO ACIDS FROM MAMMALIAN GLIAL CELLS TO

PHOTORECEPTOR-NEURONS

THESE

présentée

à

la Faculté

des Sciences de

I'Université de

Genève

pour obtenir

^le

^grade

de docteur

ès Sciences,

mention interdisciplinaire

par

Carole POITRY-YAMATE de Coppet (VD)

Thèse

No

2661

GENEVE

Editions Médecine et Hygiène

1994

UNIVERSITE DB ^GENÈVE

FACULTE DES ^SCXENCES

Doctorat ès sciences ment

ⁱ

on

ⁱ

n'ferdi sc ipl

ⁱ

naire

Thèse de lrladame Carol Lynn ^{pOl'TRY YA4YIAT€.}

intitulée

^:

'' BIOSYNTHESIS, RELEASE AND POSSIBLE TRANSFER

OF GLUCOSE.DERIVED CARBOHYDRATE.INTERMEDIATES AND AMINO ACIDS FROI\I MAMMALIAN GLIAL CBLLS

TO PHOTORECEPTOR-NEURONES.''

La Faculté des Sciences, sur le ^préavis de Messieurs M. TSACOPOULOS, professeur titulaire et ^directeur de thèse (Faculté de Médecine, Département

d'oto-neuro-opthalmologie), J. DESHUSSES, professeur ordinaire ^et codirecteur de thèse (Département de biochimie), C.P. ENZ, ^professeur ordinaire et ^répondant devant la ^Faculté des Sciences (Département

de

physique théorique) et P. MAGISTRETTI, professeur (Université de Lausanne

- Faculté de Médecine, Institut de physiologie), autorise I'impression de ^la présente thèse, sans exprimer d'opinion sur les propositions qui y sont énoncées.

Genève,

le 2l ^février

¹⁹⁹⁴

Thèse 2661.

Le Doyen, Pierre

MOESCHLER N.B.

- La thèse doit ^porter la

déclaration rrécédente

et remplir les

conditions énumérées

dans

les

"lnformations relatives

à la

présentation

des

^thèses

de

doctorat

à

I'Université de Genève".

REMERCIEMENTS

Je

remercie tout particulièrement:

Marco

Tsacopoulos,

pour m'avoir formé

comme

scientifique

indépendante avec beaucoup d'enthousiasme et encouragement,

ainsi

^que

pour I'amitié qu'il m'a

témoignée

tout

au

long

des ces années;

Professeur

C. Enz, pour

sa patience,

disponibilité,

et

extrême

gentillesse

tout

au

long

de ce

travaii;

Professeur

J.

Deshusses,

pour

son enthousiasme à me

faire

partager Ses

connaissances en

biochimie;

Professeur

P. Magistretti, pour notre intérêt mutuel

^{au sujet des cellules}

gliales

et

pour avdir suivi

pendant ces dernières années mon

travail

de recherche;

Madame Gertrude

Champendal,

pour

sa présence et gentillesse

qui

nous décharge de nombre tâches

administratives

ingrates;

Serge, mon mari, pour

son aide précieuse, ses

critiques et

^ses encouragements;

ainsi

que tous les amis

qui, par

leurs encouragements,

m'ont

accompagné

jusqu'ici.

RESUME

Ce travail ^explore la possibilité d'un transfert d'hydrates

^de

carbone et d'acides aminés dérivés du ^{glucose des} cellules gliales ^vers les neurones, dans le système nerveux cenral du mammifère. ^Nous avons établi par autoradiographie du 3U-Z-detoxyglucose et par HPLC, que les cellules gliales de Mûller dans la rétine intacte du cobaye, ^puis fraîchement isolées, sont un site prépondérant de phosphorylation du

glucose. En aval du glucose-6-phosphate, (le _substrat ^3U-Z'

désoxyglucose étant remplacé par 1aC(U)gtucose) les cellules ^gliales synthétisenr et relâchent de fortes quantités d. 14c-luctate ainsi que

de

nombreux 74c-^êtubolites _dépendant d'une activité anaplérotique. ^De même, les résultats quantitatifs obtenus sur les cellules de Mûller encore aftachées aux photorécepteurs plaident en faveur d'un transfert

^de

lactate, de glutamine, et du glutamate.neurotransmetteur entre

^les

cellules de Mûller et ^les photorécepteurs car la concentration et

I'activité spécifique de marquage radioactif de ces substances sont

modulés par I'illumination.

SUMMARY

This study explores the possible transfer of glucose-derived carbohydrate intermediates and amino acids from glial cells to neurones

in mammalian central nervous sysrem. We established by ^3U-Z-

Deoxyglucose and HPLC that Mûller glial cells in situ and after

acute

isolation from guinea pig retina are a predominant cellular site of glucose phosphorylation. Downstream to glucose-6-phosphate

^(the

substrate 3H-2-D.oxyglucose being replaced by 1ac{u)gtucose) glial cells synthesize and release large quantities of L4c-luctate in addition to anaplerotic activity-dependent 14C--.rubolites.

Quantitative ^results

following the same experimental protocol using Mûller cells still

aftached to photoreceptors argue in favor of lactate, glutamine

and

neurotransmifter glutamate transfer between glia to photoreceptors since

the pool concentrations and specific activity of these substances were

modulated in a light/dark-sensitive manner.

TABLE DES MATIERES

I. ^RESUME

II. INTRODUCTION

III. Gtial (Mûller ) ^cells take up and phosphorylate [3Hl2-deoxy-D-glucose in a mammalian retina

IV. ^Glucose metabolism in freshly isolated

Mtiller glial cells from a mammalian retina

V. Studies of metabolic interactions betryeen

glial cells and neurones using acutely isolated cells from mammalian retina

VI. ^CONCLUSION VII. BIBLIOGRAPHIE

VIII. APPENDICE I

I

I

t4

18

70 28

73

87

RRSUME

I-e

^système

nerveux central est

constitué

de deux types cellulaires,

les neurones

et les cellules gliales, qui sont

étroitement mêlés

et

occupent chacun

environ

^50Vo

du volume tissulaire. Alors que les

neurones

sont

électriquement excitables et ont pour fonction reconnue de transmettre des signaux électriques, les cellules gliales ne

le

sont pas

et

leurs fonctions ne sont pas encore complètement élucidées.

Dans

la

rétine de mammifère comme dans le cerveau en général, I'histologie montre

qu'il n'y

a pas de contact direct entre la paroi des vaisseaux sanguins et les neurones,

mais que des cellules gliales

s'interposent

toujours. Cene

situation particulière des cellules gliales par rapport

à la

circulation sanguine est à

l'origine de I'idée

émise

par Golgi, il y a

près

d'un

siècle, selon laquelle des substances pourraient être transférées des cellules gliales vers les neurones (notons que Golgi

faisait

référence

au transfert de

substances sans

toutefois se prononcer sur

^la possibilitê d'une transformation de ces substances par les cellules gliales). Cette idée

était

séduisante,

mais son exploration

expérimentale rigoureuse

s'est

longtemps heurtee

à

une

difficulté

majeure,

à savoir I'extrême

complexité

de

structure des tissus nerveux. Ce n'est en

fait

que récemment

qu'un

pas important a pu être

fait

dans ce sens grâce au développement de microtechniques de mesures biochimiques notamment, mais surtout grâce au

choix d'un

modèle de tissu dont

la

structure est remarquablement simple, la rétine du faux bourdon (le mâle de I'abeille).

La simplicité

de cette rétine d'insecte

tient

dans

le fait qu'elle

ne contient qu'un type de neurone, les photorécepteurs, et que sa structure est quasi-cristalline:

les photorécepteurs sont assemblés par groupe de

six qui

sont entourés de cellules gliales

et

forment

un

rêseau de faisceaux alignés

à

intervalles réguliers.

De

plus,

cellules gliales et

photorécepteurs

montrent une

compartimentation métabolique

extrême: la

quasi-totalité

des

mitochondries

se trouve

dans

les

photorécepteurs, alors que les réserves de substrat métabolique sous forme de glycogène se trouvent dans les cellules gliales.

Notre

groupe a

tiré

avantage

de

ce tissu modèle

pour

étudier les relations métaboliques

entre

cellules

gliales et

neurones-photorécepteurs. Ces

travaux

ont montré que, dans une tranche de rétine de faux bourdon isolée, les photorécepteurs continuent

de

consommer

de

I'oxygène pendant plusieurs heures

en

I'absence de

tout

substrat exogène.

Pour

ce

faire,

les photorécepteurs consomment

un

substrat dérivé

du

glycogène des cellules gliales. Par ailleurs, lorsque

le

tissu est maintenu en présence de glucose exogène, ce glucose est phosphorylé en glucose-6-phosphate dans les cellules gliales exclusivement ^(dans

la

mesure, en

tout

cas, où la détection par autoradiographie permet de se prononcer).

Le

glucose-6-phosphate formé dans

les cellules gliales à partir de

glucose exogène

ou de

glycogène

est

ensuite transformé par la voie glycolytique en pyruvate (mais non en lactate)

qui

est ensuite transaminé en alanine à

partir

de glutamate. Cette transamination permet, dans les

cellules gliales, et si elle est

accompagnée

de la

resynthèse

de

glutamate, de

maintenir le potentiel redox, et donc le flux glycolytique dont la

^production

d'alanine dépend. L'alanine ainsi formée dans les cellules gliales est relâchée dans I'espace extracellulaire

et

pénètre dans

les

photorécepteurs

par un

^{mécanisme de} transport dépendant

du Na*.

Dans les photorécepteurs, I'alanine est retransformée

en

^pyruvate

par

une transamination inverse

de celle qui a lieu

dans

les

cellules

gliales, et ce

pyruvate sert de substrat

pour le cycle de

Krebs mitochondrial. La

proline

exogène,

un

acide aminé

qui

n'est pas synthétisé

à partir

de ^glucose, peut également servir de substrat au cycle de Krebs: elle est tout d'abord transformée en

glutamate, lequel est ensuite désaminé

en

a-cêlo-glutarate dans les mitochondries.

Cette double source de substrat, en plus de garantir

un

apport adéquat de substrat aux mitochondries, est peut-être nécessaire au maintien de

la

production d'alanine

par les cellules gliales: en effet, la

resynthèse

de

glutamate dans

ces

cellules consomme

de I'ammoniac, alors que la

désamination

du

glutamate

dans

les mitochondries des photorécepteurs en produit.

Ainsi,

les résultats obtenus sur

la

rétine de faux bourdon montrent ^{que des} cellules gliales peuvent

jouer un rôle

métabolique essentiel au fonctionnement de neurones.

Il

^nous a donc paru important de tester la généralité de cene découverte

en étudiant le

mêtabolisme

du

glucose dans des

cellules gliales de

mammifère.

Notre

choix

de modèle cellulaire s'est porté sur les cellules de

Mûller, qui

sont les cellules gliales de la rétine de vertébrê. Les raisons de ce choix sont principalement que ces cellules sont de

taille

importante (environ _{150 ,um} de longueur) et que leur

forme

caractéristique

permet de les identifier

aisément

sous microscope.

Par ailleurs, si

le

métabolisme du glucose a déjà étê étudié dans la rétine de mammifère complète,

ce

métabolisme

n'a

pas encore

été

étudié

au

niveau des

divers

types

cellulaires (cinq

types

de

neurones

et un type principal de cellule gliale) qui

la composent.

Pour

cette étude,

nous

avons

choisi

comme modèle expérimental la

rétine de

cobaye

juvénile, non

seulement parce

qu'il s'agit là d'un animal

de laboratoire facilement disponible, mais aussi parce que

le

volume de ses cellules de

Mùller

est particulièrement remarquable pour un mammifère.

Ce

travail

de thèse comporte essentiellement

trois

volets.

Tout

d'abord,

j'ai

démontré

sur la rétine

entière

que les

cellules

de Mùller

contiennent

de

^grandes quantités

de

glycogène

et

phosphorylent rapidement

le

^glucose

en

glucose-6- phosphate

(premier article). Ensuite, j'ai

développé

une méthode

perrnettant

I'isolation et la purification d'une

population de cellules de

Mûller,

et

j'ai

montré

que ces cellules

isolêes contiennent

du

glycogène

et sont

encore capables de

phosphoryler

le

glucose ^(deuxième

article).

Finalement,

j'ai

êtudié

le

devenir du glucose métabolisé dans une population

de

cellules

de Mûller purifiée, ainsi

^que

dans une population mixte comportant des photorécepteurs attachés aux cellules de

Mûller

(manuscrit _proposé).

I-es

expériences présentées

dans le premier article m'ont permis

_non seulement

de montrer que,

dans

la rétine entière, les cellules de Mûller

sont probablement

le type cellulaire dans lequel le

glucose

est le plus

intensément phosphorylé, mais aussi de confirmer notre impression première,

à

savoir que les études effectuées dans ces conditions sont rapidement limitées

par la

complexité structurelle du tissu.

' Pour

ces expériences,

j'ai tout d'abord repris

une méthode histochimique pennettant de révéler la .présence de glycogène sur des coupes histologiques et

I'ai

adaptée à nos conditions (coupes semi-fines,

et

non pas ultra-fines comme dans la méthode

originale).

[æs résultats obtenus

ont fait

apparaître

que les

cellules de

Mùller

étaient colorées

de

manière relativement intense

par

cette méthode'et _que leur coloration était particulièrement _prononcée du côté vitréen. En

fait,

ce type de

coloration s'est révélé excellent

pour

marquer les cellules de

Mùller et

pour faire

ressortir les fines ramifications qu'elles projettent de part et d'autre du

colps cellulaire.

En plus de montrer que les cellules de

Mtjller

contiennent

la

majeure partie des stocks

de

glycogène

de la rétine,

ces résultats qualitatifs suggéraient que ces cellules

ont

un métabolisme du glucose important. Pour

voir si

tel était bien le cas, nous avons employé

la

méthode d'autoradiographie par 2-déoxy-glucose

tritié

^(3H-

2DG).

Cette méthode repose sur le

fait

que te

3u-zoc

_{est un analogue}

du glucose

qui

penètre dans les cellules

et

est phosphorylé comme

le

glucose, mais

qui

_n,est

pas métabolisé au delà du

2-dêoxy-glucose-6-phosphate

(3U_ZnC_Op);

_en conséquence,

Ie ^3g-zoc-op s'accumule dans les cellules (en _l,absence

_de

transporteur

spêcifique, les produits

phosphorylés

ne peuvent pas franchir

les membranes cellulaires) et peut ainsi impressionner _une émulsion photographique _ou être détecté dans un compteur de radiations B.

Pour _ces expériences,

la

rétine isolée était panagée en quatre quadrants, et chaque quadrant

était incubé

séparément

à 37oC,

pendant

une heure et

dans

I'obscurité,

dans une solution

de

Ringer oxygénée contenant

3 pM _{ae 3H-zoG.}

,dprès

incubation, les

quadrants

de rétine

étaient

rincés

pendant

au moins

une

minute

_{avec une}

solution de Ringer

normale ^(sans

3H-2DG) et ils

étaient alors preparés pour I'analyse biochimique ou pour I'autoradiographie (congélation _rapide

et

séchage sous

vide).

L'analyse biochimique

par HPLC ("high

_{pressure liquid} chromatography") _{des quadrants}

de rétine, m'a tout d'abord

permis

d'établir

que plus de 95Vo de la radioactivité encore présente dans le tissu après rinçage provenait

de 3H-znG-6P.

_Ensuite

de quoi, j'ai

examiné

par

autoradiographie des coupes semi-fines faites sur ces quadrants de rétine. Après 2 à 3 semaines d,exposition,

j,ai pu

visualiser au niveau cellulaire

la

distribution de grains révélant

la

présence de

matériel radioactif (c'est-à-dire, ici,

Oe

3U-2OG-6P). [æ

marquage observé se

trouvait préférentiellement _{dans les} cellules de

Mùller,

en parriculier _{au niveau de la} rétine

interne; par contre, le

marquage dans des neurones identifiés

de la

rétine interne

était très faible voire

absent.

Un point

essentiel

de la

technique que

j,ai

utilisée pour I'autoradiographie était que, de la

fixation

du tissu jusqu'à I'apposition des coupes semi-fines contre le

film

d'émulsion photographique, le tissu n'était plus en contact avec

de I'eau.

Cette manière

de faire, qui a

été mise au

point par

E.

Bûchner, de Wûrzburg, permet

d'éviter

que le

tritium du

3g-ZOG-6p soit échangé avec

un ^1H

p.ouanant

de l'eau, et

des tests préliminaires nous

ont

amplement convaincu de son bien-fondé.

'

Ces résultats indiquaient que les cellules

de Mùller

peuvent

jouer un

rôle

majeur dans le

métabolisme

du glucose dans la rétine.

Cependant,

ils

^ne

permettaient _{pas de} savoir si les cellules de

Mûller

transforment le glucose pour un transfert éventuel aux neurones.

Un

problème majeur avec I'autoradiographie par 3H-ZDC _est

qu'elle

ne perïnet pas de distinguer les voies métaboliques en aval du glucose-6-phosphate dans différents types cellulaires. De plus, Ies cellules de Mi.iller in

sin

enveloppent de manière extrême tous les types de neurones de la rétine. pour ces raisons, nous avons décidé de développer une méthode d'isolation de cellules de

Mûller

qui nous perrnette d'explorer le devenir du glucose dans ces cellules seules et dans des conditions expérimentales bien contrôlées.

Le

développement

de cette

méthode constitue

le

deuxième

volet de

ce

travail. La

méthode

d'isolation

que

j'ai

finalement mise _au point consiste à exposer la rétine successivement et pendant de courres durées (5 minutes pour chaque étape) à différents

milieux.

Tout d'abord, la rétine isolêe est exposée à la collagénase dans

le but

de digérer les restes de

vitré qui

adhèrent encore au tissu et diminuent _ainsi

l'efficacité

des changements de solutions opêrés;

la

rétine _est ensuite rincée dans la

solution

physiologique standard,

puis

exposée

à une solution

physiologique ne contenant

ni

calcium

ni

magnésium; ceci a

pour effet

de défaire très lentement les

jonctions entre cellules;

ces

jonctions sont

ensuite rompues

par

exposition

à

^la

papaine

en milieu acide; finalement, la rétine est rincée

plusieurs

fois

dans un

milieu

physiologique standard contenant

du BSA

(dans

le but de créer un film

protecteur autour des cellules) et de la DNAase (pour digêrer les débris cellulaires).

Toutes ces étapes sont contrôlées visuellement sous microscope

et, normalement,

la

rétine reste complète pendant toute cette

panie de la

procédure.

Elle est alors triturée mécaniquement par étapes de sorte

qu'elle

se défait en certains de ses constituants cellulaires, puis en d'autres. Les premières cellules libérées par

la trituration

sont

les

photorécepteurs. Ensuite apparaissent les cellules

de Mûller

attachées

à des

photorécepteurs

ainsi que

certains

types de

neurones,

puis

des cellules de

Mûller

seules et d'autres neurones, et finalement quelques débris de tissu insuffisamment _digéré.

Pour

I'isolation d'une

population quasiment pure de cellules de

Mùller,

les aliquots

de

suspensions contenant ces cellules sont ensuite passés

sur un

gradient

différentiel de Percoll. Ce

gradient,

qui

est obtenu

par

centrifugation, permet _la séparation des différents types de cellules présents en

fonction

de

leur taille et

de

leur densité, chaque type formant finalement une bande bien distincte dans le tube contenant le Percoll.

[,es cellules de

Mûller

sont ainsi obtenues en grand nombre

(environ

_2xr05 cellules pour deux rétines) et leurs caractéristiques morphologiques sont semblables à celles observées

in

situ sur des coupes semi-fines colorées.

L'identification

de ces

cellules est d'ordinaire

basée

sur des critères

molphologiques. Cependant,

j,ai

confirmé

I'identité

de ces cellules en montrant qu'elles ont une immunoréaction _{à Ia} vimentine (une protéine présente uniquement dans les cellules de

Mùller,

dans la rétine) et qu'elles contiennent du glycogène. Pour révéler la présence de glycogène,

la

technique

que j'ai utilisée était dans son principe similaire à celle

utilisée auparavant

sur le tissu entier, avec

quelques aménagements

toutefois afin

de s'adapter au marquage de cellules isolées.

Le

résultat de ce marquage a montré la présence de glycogène

tout le

long de la

cellule, et le

marquage disparaissait _après digestion du glycogène par I'amylase.

Ayant ainsi confirmé I'identité de ces cellules de

Mûller, j'ai

vérifié que leur capacité à phosphoryler le glucose subsistait après

I'isolation.

^pour _{cela, les cellules} ont été incubées dans une solution physiologique _contenant du

3H-2DG.

_{par analyse} chimique

sur

des cellules ainsi incubées,

j'ai pu établir

que

plus

des ^g1Vo de cet

analogue étaient phosphorylés en 3H-zoc-op. La distribution de

^cette

phosphorylation

a

été examinée par autoradiographie,

et la distribution

des grains recouvrait la forme des cellules.

Ces

expériences

ont

ensuite

été

répétées

en

^présence d'iodoacétate, _un inhibiteur de

la

glycolyse, et

le

contenu en

ATP

et en glycogène _des cellules a été mesuré enzymatiquement de manière à montrer qu'elles ont encore un métabolisme

normal

aprè1

isolation'

_{Ces mesures}

ont fait

apparaître

une forte

_baisse

d'ATp

(85Vo) et de 3H-2DG-6P _{(90Vo), et}

cene baisse érait accompagnée d,une diminution importante du nombre de grains sur les autoradiographies, _de sorte que I'image des

cellules

ne

se

distinguait plus du bruit de fond. Par contre,

ces différences ne s'accompagnaient

pas de

différences significatives dans

Ia

quantité

de

^3H-2OG

restant, _ce qui semblait exclure la possibilité _que I'entrée ae

3H-zoG

_{dans Ia cellule}

soit affectée par I'iodoacétate. Nous avons

également

mesuré le contenu

de glycogène _{dans ces} conditions (en absence de glucose externe) et nous avons trouvé que

le

contenu

en

glycogène des cellules

diminuait en fonction du temps.

Cette

diminution était

ralentie

de

36Vo

en

présence d'iodoacétate,

ce qui indiquait

que dans les conditions de contrôle le^glycogène était métabolisé

et

permettait ainsi le maintien _de la phosphorylation _Oe 3U-ZOG.

Ces résultats _nous ont permis d'envisager l'étude du devenir métabolique _du glucose en hydrates de carbone

et

en _acides aminés sur une population

purifiée

de cellules

de Mûller' En outre,

nous avons

pu

commencer

d'explorer la

possibilité d'interactions métaboliques entre cellules de

Mùller

_et photorécepteurs en profitant du

fait

qu'à

la

suite de la dissociation enzymatique de

la

rétine,

il

est possible _avec

quelques

modifications et un peu de doiglé d'obtenir de

beaux photorécepteurs encore _attachés aux cellules de

Mùller.

Ce troisième

volet

de mon

travail

a fourni

des

résultats biochimiques quantitatifs

qui montrent que les

cellules

de Mûller

synthétisent

et

relâchent

du

lactate et des acides aminés tels que

le

glutamate

ou

la

glutamine. La

présence

des

photorécepteurs

modifie les

quantités totales

et

la

radioactivité des

métabolites extracellulaires,

notammeni le lactate, et ceci

en

fonction de

I'illumination.

Pour ces expériences, les cellules étaient incubées dans I'obscurité

ou à

la lumière pendant

30

minutes

à 37"C

dans

un

Ringer standard contenant environ 5

mM de

1aC{u)-gtucose comme substrat

unique. Après 30

minutes,

elles

étaient rapidement refroidies, séparées du bain par centrifugation, puis _rincées et congelées.

Le bain

était

tout

de suite congelé puis évaporé _sous

vide.

Après préparation, _les échantillons étaient analysés

par HPLC

de manière à permettre

la

séparation

et

la mesure

soit des

hydrates

de

carbone,

soit des

acides

aminés. La

radioactivité incorporée dans les métabolites était mesurée par

un

compteur B

sur

les fractions collectées

à la sortie de la colonne HPLC. _Quant aux

quantités

totales

des métabolites

en

question,

elles

étaient mesurées grâce

à un

détecteur

d'indice

de réfraction (pour les hydrates de carbone), ou par un détecteur mesurant I'absorbance ultraviolette de

l'éluat

après dérivatisation (pour les acides aminés).

Dans

les

cellules

de Mûller,

Ies résultats obtenus

pour

_les concentrations intracellulaires

d'acides

aminés s'accordent

bien avec celles

mesurées dans des

cellules gliales

du

cerveau. En ce

qui

concerne les hydrates de carbone formés à

partir de l4c-glu.or., le 14c-tu.tut" était le principal (environ

_50Vo

de

la radioactivité totale intracellulaire); en

outre,

Ia majeure panie

du

14c-lactate

était trouvée _dans

le

bain (près de 50

fois

plus que dans les cellules) où elle contribuait

pour plus de

80Vo

de la

radioactivité

totale.

Læ lactate extracellulaire

avait

un pourcentage

de

radioactivité nettement plus élevé que

le

lactate intracellulaire, ce

qui fait

^p€nser que

le

lactate sortant des cellules

était formé

préférentiellement _à

partir d,

14c-glucose fourni.

En

présence

des

photorécepteurs

et sous lumière, le l4c-glr"ore

_était

incolporé en quantité similaire dans les cellules, mais sa répartition était différente:

près de la moitié était incorporée alors en 14c-acides

aminés. En ce qui concerne le lactate,

il

représentait encore une pan importante bien que légèrement plus faible de la radioactivité totale intracellulaire, _mais par contre sa radioactivité baissa

it

de Z0%o

dans

le

bain. De plus, lorsque cellules de

Miiller

et photorécepteurs étaient incubés

dans I'obscurité, les valeurs de

14C-lactate

intracellulaire et

extracellulaire ne représentaient plus respectivement qu'environ 60Vo

et

70Vo des valeurs mesurées à

la lumière. A ce propos, il faut rappeler que le

métabolisme

oxydatif

des photorécepteurs est activé dans l'obscurité du

fait

que les canaux ioniques sont alors ouverts:

14c-lu"tut*

_{dans ces est}

qu'il

conditions, est

utilisé

_une comme substrat explication possible des

du

métabolisme variations

oxydatif

_observées dans sur lesle photorécepteurs.

Iinalement,

la valeur sur laquelle

I'illumination

_avait le plus

d'effet

est celle

de la l4C-glutu-ine

intracellulaire: elle était environ 80 fois plus

grande dans I'obscurité

qu'à

la

lumière.

Cette observation _est particulièrement intéressante

si

on

la

rapproche

du fait que

certains auteurs

ont

proposé I'existence

d'une

navette glutamate-glutamine entre neurones et cellules gliales

(voir

_{schéma) et que, comme}

on le sait, les

photorécepteurs relâchent

du

glutamate comme neurotransmetteur dans I'obscurité.

En

conclusion,

j'aimerais

simplement remarquer

que,

même

s'ils ne

nous permettent pas de nous prononcer tout de suite quant _à un transfert de substrat entre

cellules de Mùller et

photorécepteurs,

ces résultats, par leur

richesse

et

leur complexité, me paraissent extrêmement prometteurs pour la suite de nos recherches.

g

t

luc

-6p

p|,u"o,"

g lucose

K rebs cyc le

og lutorole

I

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lJro,"note'

I

lJrqmine

.glulomole g

g

!

g lu'c o re

INTRODUCTION

This project aims

to

explore

in

a mammalian preparation

of

central nervous system tissue the

nutritive

role

of glial cells (e.g. Kuffler & Nicholls

1966, 1976;

Lasansky 1965; 7971). The specific question being addressed is whether

glial

_cells transform blood-borne glucose, other than

for

storage

in

the

form of

glycogen, and transfer

a different

substrate

of

energy metabolism

which

neurones need

but

may

not

synthesize themselves.

The test of this working

hypothesis

is original

in vertebrate

studies; it should be

acknowledged

that it ^{has been}

developed and continually shaped by quantitative experimental results obtained

in

a "simple'L model

of brain

tissue--the retina

of

the honeybee drone (Tsacopoulos

et

al.

,

^{1988; 1992;}

1994)-- and

for

which this project is a direct test

of

the generality

of

those findings.

Central nervous system (CNS) _tissue is basically composed

of

neurones and

glial cells which

together operate as metabolically and

functionally

coupled units

(e.g. Varon &

^Somj

en

1979).

Glial cells

are as numerous as

the

neurones they surround (Palay

&

Chan-Palay 1977), and are "electrically nonexcitable', cells in the brain

for which

a

growing

number

of

roles have been proposed

in

vertebrates ^(see Barres

for

review 1991), but rvhose precise function(s) have

yet to

be

critically

put

to

rigorous experimental testing

(c.f. Hubel

1979; Bradford 1986).

Within

the past 20 years, 3 proposed functions

of glial

cells have received wide attention: a function

in K+

homeostasis (Coles

&

Tsacopoulos 1979; Coles 19g9; Gardner-Medwin et

al.,

1981; Karwoski

et al.,

1989); a function

in

synaptic transmission (Hertz

et

al., 1983; Brew

& Affwell

1987; Szatkowski et

al.,

1990;

Barbouret al.,

1991; Bouvier et

al.,

1992) and a function

in

nourishing neurones (Tsacopoulos et

al.,

1988, 1993, t994).

A

fundamental question

in

neuroscience has been whether glycogenolysis in

glial

_{cells serves}

to

nourish neurones (Varron

&

Somjen _1979;

Kuffler &

Nicholls 1966;

Wolfe

and Nicholls 1967). This notion

of

"storage and release" is conceptually

different from that formulated in

1904

by Golgi ^(cited in Kuffler and

Nicholls 1966),

who

had proposed,

on the

basis

of

the

glial

enshearhing

of blood

vessels, that

glia

were inert channels

for

the shuttling

of

nutrients

from

blood

to

neurones.

It

is known that stored glycogen is labile _and that

it

can be mobilized

during

ischemia

(towry et

at.

,

^19641,

^however it was not

possible

to

determine

whether

this carbohydrate

is

consumed

by the glial cells

themselves

or is

made available to neurones. One

of the first

indications that

glial

glycogen

is'available to

neurones comes

from

studies

in

this laboratory

in

the honeybee drone retina (Tsacopoulos et

al., L987,1988). However,

glycogen

per se is not

transferred

from

one

cell

to another, and nowhere

prior to

the

work in

drone retina was

it

demonstrated that a

product of glycogen metabolism is transferred from glia to

neurones. This corresponds

to

the notion

of

"storage, transformation and release" (Tsacopoulos et

al.,1994).

The objectivês and rationale

of

the present project have been therefore a

logical extension

of

the

work

carried out

in

insect retina.

The mammalian retina is an appropriate CNS preparation

in

which to test the

nutritive function of glia

_because

(1)

glycolysis,

which

has been explored

at

great lengths

in

this tissue (Cohen

& Noell

1960; Catanzaro er

al.,

1962; Graymore 1969;

Starr 1975; Mojaria & Voaden

7979;

Winkler lg82), is

essential

to

maintaining normal retinal

function;

and (2) and the

Mùller glial

cells contain the predominant stores

of

glycogen (Kuwabara and Cogan 1961). Glucose metabolism has

not

yet been explored at the cellular and molecular level

in this

tissue, so the specific role

of

glucose metabolism

in individual

retinal

cell

types

is

unknown. The solution to this question is significant, however, towards determining how glucose _metabolism

in

each

cell

type contributes

to

the functioning

of

the retina as a

whole. This is

a

considerable challenge technically, owing

to

the extreme cellular heterogeneity _and

functional complexity of this

tissue

(Figure 1). This is confirmed by the

work presented in the

first

article.

The

work

presented

in

this thesis may be divided into three logical

phases/parts, coresponding to

2

articles and 1 manuscript.

Briefly,

we began this study using freshly dissected retina from the juvenile _guinea

pig in

an

effort

to

identify

which cells intensively metabolise glucose. This part corresponds to phase 1

or

"the identification

of

cellular sites

of

retinal glucose phosphorylation.

"

The results

of

that paper raised the question as to whether

Mùller

cells transform glucose

for

storage principally in the

form of

glycogen

for

their cellular functions, or to transform glucose

for

transfer to other retinal cells, or both. The major drawback

of

retinal studies

of

this kind using

light

microscopic autoradiography _{was the}

impossibility to differentiate metabolic pathrvays occurring

in

any one particular cell

Tpe. In

particular, the resolution provided by the histochemical techniques used were impaired by the differences

in

size between

Miller

cells and notably photoreceptors. Moreover;

Mûller

cells in sîtu interdigitate _befween

all

retinal neurones

from

the inner to outer retina.

A

method, therefore,

for

the acute isolation

of

a purified population

of Mùller

cells from _{the same} preparation was developed and the metabolism of these cells tested. This corresponds to phase

z or

^,,the development _and metabolic test

of

acutely isorated

Mûller

cells.

"

Lastly, the

metabolic fate

of l4c-glu.ore

_was determined in this cell model and the

biosynthesis and release

of

glucose-derived carbohydrate intermediates and amino acids quantified.

A

possible metabolic transfer of these metabolites was tested in a

second cell model comprising

Mûller

cells

still

attached to photoreceptors. This is the subject

of

the last phase corresponding

to

"the application

of

models to study metabolic interactions between glia and neurones

Legend

for Figure 1.

Micrograph

of

semi-thin section of juvenile _guinea pig retina showing major cell types.

Mû: Mûller glial

cells; G

=

^{ganglion cells; AC}

=

^amacine

cells;

BC

= bipolar cells;

HC

=

horizontal

ceils;

^pH

-

photoreceptors; IS

=

^inner

segments

of

photoreceptors;

OS=

outer segments

of

photoreceptors;

RpE=

retinal

pigment epithelium. Light

penetrates

the retina at its inner limiting

membrane

(ILM)

_{and traverses} the entire thickness

of

the retina

to

photoreceptors where the

light

_{signal is} transformed

into

an electrical signal. The

two

layers where neurones make synapses are indicated

by

asteriks.

Mùller glial

cells extend

from

the

ILM

to past the outer

limiting

membrane

(OLM),

_{envelop synapses}

in thç

inner _{and outer} retina, and

in

this preparation are particularly large. The thickness

of

the retina is approximately ₇₂₀ microns.

.\euroscience Letters, 122 (1991) 241-244 Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd.

NSL 07509

The pioneering histochemical studies undertaken by Kuwabara and Cogan _[8, 9] revealed the importance of Mûller cells. the principal glia in the retina, as nutritional supporting cells

in

the mammalian retina. As Mûller cells extend radially across the neural retina, from the inner limiting membrane

(ILM) to

at leasr the outer limiting membrane (OLM), and possess an active glyco- gen metabolism [8], it is reasonable to suggest that they may also play a key role in the metabolism of glucose in the mammalian retina.

Glial cells of the central nervous system (CNS) are u'ell situated to perform the transformation and transfer of substances to neurones as they intervene between the neurones and the blood vessels (hypothesis formulated by Golgi. cited in ref. 7). The inner retina is no exception [5]. While this morphological evidence is undeniable, the role of glia in supporting neurones by transforming glu- cose and transferring to neurones a glycolytic substrate, as previously shown in the honeybee drone retina _[15J, lacks direct experimental support

in

the mammalian CNS (but _{see refs.} 6, l0 for contrasting views). For these reasons we initiated a study to identify the cellular site(s)

of ^glucose phosphorylation in the retina of the juvenile guinea pi_e. Although this retina is pseudoangiotic Il l],

the retinal glial cells are large and easily identified in his- tological sections and in autoradiographs it was possible to assess their capacity to phosphorylate glucose.

As glucose is the principal metabolic substrate for the Correspondence. C. Poitry-yamate, Experimental Ophthalmology Laboratorv. 22 rue Alcide-Jentzer, l2l I Ceneva 4, Switzerland.

24t

retina in mammals [4] our strategy was to load isolated retinas in vitro with the radiolabeled glucose analogue, [3H]2-deoxy-o-glucose (PH]2DG), and

to

follow its metabolic fate by light microscopic autoradiography.

If

retinal glial (Mûller) cells phosphorylare glucose rhen

2DG will be phosphorylated by a hexokinase to 2DG-6- phosphate (2DG-6P), a metabolic end-producr rhat ac- cumulates in the cell _[2j.

The experimental procedures we used have been pre- viously described [2,

3, l5].

Briefly, under dim white light, eyes from juvenile (postnatal days

!6)

^{guinea pigs}

(Cavia coba.r-a porcelus), not previously dark-adapted, were enucleated alter decapitation and the retina dis- sected free in substrate-free oxygcnated Ringer solution.

For each eye, the retina was cut into quarters. and each quarter incubated alone but in parallel (in 4 identical 200

pl

chambers)

for

60 min

in

the dark

in

oxygenated Ringer solution (in mM: NaCl 124, KCI 5, CaCll 2, KH2PO4 1.25, NaHCO3 20, MgSOa 2, pH 7.4 ar 37"C) carrying 3

tM

[3H]2DG ^(spec. âcr.

:

42 Ci/mmol).

Thereafter, the 4 retinal quarters were washed

(l

or 45

min) in substrate-free oxygenated Ringer solution in or- der to

(l)

remove nonphosphorylated fHl2DG ^{and (2)}

assess, indirectly, glucose-6-phosphatase activity _[15].

For any one given retina

(n=8),2 of

the

4

retinal quarters were subsequently frozen in liquid nitrogen for HPLC analysis of [3H]2DG-6p and [3H]2DG ro ^derer- mine the identity

of

silver grains

in

autoradiographs (ARG$ (e.g. ref. l5). The 2 remaining quarrers were fro- zen in isopentane cooled in liquid nitrogen for autora- diography. At all stages from fixation to autoradiogra-

Glial (Mûller) cells take up and phosphorylate 13U12-Aeoxy-D-glucose in

a mammalian retina

Carol Poitry-Yamate and Marcos Tsacopoulos

Experimental ophthalmology Laboratory. lJn.iversitv of Geneva. Geneva ⁽ s*.ir:erlandl (Received 8 June 1990; Revised version received l9 October 1990; Accepted 26 October 1990)

Ke.t u'ords; Mûller (glial) _cells; Glycolysis; [3H]2-Deoxy-o-glucose; Autoradiography; [rH]2-Deoxy_o-glucose-6-pOrl Mammalian retina; Neuroglia [rH]2-Deoxy-o'glucose-6-POa (PHI2DG-6P) _was visualised at the level ol single cells in freeze-dried guinea pig retinal sections by in vitro lighr rnicroscopic autoradiography after incubation with IrH]2-deoxy-o-glucose ([]H]2DG). In the dark, autoradiographs revealed heterogeneous labeling tçithin individual retinal layers. Labeling, representing PHI2DG-6P, ^was prelerentially located over Mùller (glial) cells. Labelling over identified neurones in the inner nuclear layer, in contrast. was scatce and over ganglion cells was exceptional. Our observations indicate that Mûller cells in the mammalian retina phosphorylate []HJ2DG to []Hl2DG-6p, ^{the first step} in glycolysis.

0304-3940 9l S 03.50 e ^{l99l Elsevier} Scientific publishers Ireland Ltd.

242

phy

aqueous phases were avoided: freeze-drying, osmium vapour fixation and epon.embedding ^{were per-} formed under vacuum [2, 3]. Sections,

34

^{pm thick. cut}

on dry giass knives at high cutting speeds, were mounted on microscopic slides and then ^apposed to L4 nuclear emulsion (ILFORD) coated slides in order to ^prevent

exposing ^the retinas to water and therefore loss and dis- placement

of

[3H]2DG-6P. Autoradiographic'sand- wiches' were exposed for 2-3 ^weeks in the dark at 4"C.

Coated slides were developed in Kodak

Dl9

and sec-

tions were stained with Toluidine blue/borax. ^Sections and ARGs ^were photographed separately using phase

contrast and lightidark field illumination at the same magnification under oil immersion ⁽ x 40 objective) using a Zeiss Axiophot light microscope.

HPLC analysis, scintillation counting of retinal ho-

mogenates ^(see ref. l5), and integration of _[3H]2DG-6P and [3H]2DG ^peaks in chromatograms revealed at least

30 times more [3H]2DG-6P than _[3H]2DG

(n:16,

8 eyes), indicating that pUIZOC-ee ^would represent more than 90% of the silver grains in ARGs. Not only was the quanriry of [3H]2DG-6P (cpm/mg dry weight tissue) suf- ficient for their detection as silver grains in a typical mi- crograph of a section of guinea pig retina, but

if

only localized to Mûller cells (Mùller cell surface area was 20- 25% of total tissue surface area from weight measure-

ments

of

paper cut-outs), would 'blacken' more than 50% of the cell surface (ref. l5 for penetration capability of 3H and conversion of disintegration of [lH] ^{to silver} grains), As differences in ^washing time

(l

vs 45 min) did

not appreciably alter, and

in

no case diminish, the amount of PHI2DG-6P detected we concluded that ^glu-

{

'i

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I

Fig. l. Guinea pig retina. a: topogaphic Epon+mbedded section cut and processed for ARG in the absencc of water for high retentiod and localiza- tion of []Hl2DG-6p. ^Vitreous ir

"i ^ttt. top in this and all other frgures. Arrows outline 2 Mùller cells. Toluidine blueiborax, ^phase contrast' b: accom- pan5,ing autoradiograph of retina shown in a, after exposure to _[3H]2DG for 60 min in the dark. Silver grains due to radioactivity appear as white spots and are mainly concentrated over Mûller cells. Neurone cell bodies are sparsely labeled. Scale = ^{50 pm. c: detail ol a. Mûller cell endfeet}

(lar_se (*). delimited by two small arrows, and smaller (*)) and cell body (large arrows). Four neurone cell bodies in INL indicated by (t) are flanked b1 Mûller cells, d: detail of b. Note intense labeling of Mùller cell endfeet and cell body and absence of labeling over neurone cell bodies at the Ievel ollNL. At upper right labeling ol 2 Mûller cell endfeet (left one is delimited by small arrows). Symbols are those from c. Top vertical black

bar at right indicates IPL. Lower bar indicates OPL. Scale

:

20 pm'

213

Lr(

ILM

IPL

v.

- INL

1

ONL

Fig. 2. Guinea pig retina showing. a: 5 ganglion cell bodies (arrows) at top. b: ARG of a. Absence of labcl over ganglion cell bodies. Neighboring packets of silver grains. representing [rH]2DG-6P, ^overlie Mùller cell endfeet. Scale = ⁵⁰ tm.

Fig. 3. Guinea pig retina demonstrating. a: Epon-embedded section following incubation in periodic acid-thiosemicarbazide silver proteinate solu- tions [14], indicating sites of ^glycogen in Mûller cells. Note lamination ol their lateral ramifications in IPL and extent of staining of I Mûller cell from the ILM to INL (r); inset, different section showing glycogen staining in Mùller cells at the level of INL, OPL and ONL. Digestion of glycogen

with r-amylase in control sections removed the staining in Mùller cells (not shown). Scale: 20 gm.

,

cose-6-phosphatase activity was negligible in catalyzing the dephosphorylation of 2DG-6P in this retina (Nelson et al., quoted in l5).

The structural preservation of the guinea pig retina following freeze-drying was satisfactory for the identifi- cation of all retinal layers and cells in light micrographs.

Mùller cells (Fig. la,c) could be traced from their irregu- lar polygonally-shaped cell body located in the inner nu- clear layer (INL), to their long vertical process given off lrom the cell body in the inner plexiform layer (IPL) to their endfeet at the inner limiting membrane (ILM). The corresponding [3H]2DG ARG (Fig. lb,d) revealed a

nonuniform distribution

of

silver grains, representing fHl2DG-6P, in the inner retina of ^{the juvenile guinea} pig and no spreading of label around the edges of the section, Silver grains were localized over regions corre- sponding to Mùller cells, particularly at the level of the endfoot. cell body, and vertical process. The intense la- beling over Mûller cells rapidly fell offat the boundaries of the cell body. Outside this boundary weak/no label-

ling over neighboring

INL

neurone cell bodies was observed. Of the 35 ARGs examined (from 5 eyes) 3

showed singular cases of labelling ovcr nonglial cells in addition to labeled Mùller cells:

I

horizontal cell and ² tentatively identified amacrine cells bordering the IPL and ganglion cell layer (GCL). We cannot presently offer an explanation

for

this occurrence. Grains were also heterogeneously distributed

in

the innermost retina. ⁵ large ganglion cells in Fig. 2a showed no labeling beyond background levels within the boundaries of the cell body (Fig. 2b). In sharp contrast, the Mùller cell cytoplasm surrounding ganglion cells was intensely labeled (Fig.

2b).

At the level of the IPL the lateral processes of Mûller cells and neurone processes are too small for identifica- tion in Toluidine blueiborax-stained semi-thin secrions by light microscopy. However, in semi-thin sections his- tochemically treated to reveal glycogen [14j, the organi- zation .of fine lateial processes of Mùller cells, which stained positively for glycogen (Fig. 3), were reminiscent

f ;

t

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