NOTE
Détermination de la patuline dans les jus de fruits commercialisés en Côte d’Ivoire
Michèle AKE*, Brice EBA, Anglade K. MALAN, Eugène ATINDEHOU
SUMMARY Liquid chromatographic determination of patulin in fruit juices sold in Côte d’Ivoire
A high performance liquid chromatography method was developed for the determination of patulin in fruit juices sold in Côte d’Ivoire. Patulin is conside- red as a natural contaminant of fruit juices. The method involved extraction with organic solvent. Patulin was resolved with a C18 reversed phase-phase column followed by UV detection. Results of validation tests were satisfactory.
Application of the method to the analysis of three manufactured types of fruits juices showed that few samples contained patulin (18 %). However, patulin was found at a higher level than the admitted norm of 50 µg·L–1in one traditio- nally manufactured sample. These results show that contamination due to the fruit used or resulting from bad conservation conditions is possible.
Key-words: mycotoxins, patulin, HPLC, fruit juices.
RÉSUMÉ
Pour évaluer la présence de la patuline, contaminant naturel des jus de fruits, une méthode d’analyse a été proposée pour le contrôle en routine des jus de fruits commercialisés en Côte d’Ivoire. Elle comprend une première étape d’ex- traction par partage liquide-liquide à l’aide de solvant organique suivie de l’analyse par chromatographie liquide haute performance (CLHP) sur colonne en phase inversée. La détection s’est faite dans l’ultraviolet. La technique a été validée et appliquée à des échantillons de jus de fruits de trois origines diffé- rentes. Sur les 44 échantillons de jus analysés, la patuline a pu être mise en évidence sur 8 échantillons (18 %). Cependant, un seul échantillon de jus de fabrication artisanale a présenté une teneur en patuline au-dessus de la norme admise de 50 µg·L–1, traduisant une contamination due aux fruits utilisés ou aux mauvaises conditions de conservation.
Mots clés : mycotoxines, patuline, CLHP, jus de fruits.
Laboratoire de chimie analytique, UFR des Sciences pharmaceutiques et biologiques, BP V 34 Abidjan 01, Côte d’Ivoire.
* Correspondance.
1 - INTRODUCTION
La patuline est un métabolite toxique secondaire, produit par de nom- breuses espèces des genres Penicillium et Aspergillus. Elle est considérée comme un contaminant alimentaire naturel, présent dans les fruits avariés en particulier la pomme et leurs dérivés. Plusieurs auteurs rapportent que cette présence dans les jus de fruits constitue une indication de la qualité des fruits utilisés lors de la production (STRAY, 1978 ; FRAYSSINET, 1984 ; BURDA, 1992).
La nécessité de la recherche et du dosage de la patuline dans les jus de fruits de grande consommation en Côte d’Ivoire est apparue principalement en raison de sa toxicité probable : toxicité embryonnaire et propriétés immunosup- pressives (HOPKINS, 1993 ; FAO, 1992), et de son rôle comme marqueur de qua- lité des jus de fruits.
Parmi les méthodes chromatographiques recensées dans la littérature, les techniques de chromatographie sur couche mince (CCM) ont été les premières utilisées (ABRAMSONet al., 1989). Des méthodes de chromatographie en phase gazeuse avec ou sans étape préliminaire de dérivation ont ensuite été dévelop- pées (TARTERet SCOTT, 1991 ; LLOVERAet al., 1999). La chromatographie liquide haute performance (CLHP) couplée à une détection dans l’ultraviolet reste encore l’une des méthodes les plus utilisées en raison de la diminution considé- rable des temps d’analyse et de l’amélioration de la résolution notamment par rapport à un autre contaminant : le 5 hydroxyméthylfurfural (HMF) (WARE et al.,1974 ; WEIGERT et al., 1997 ). Une étape préalable d’extraction est néces- saire, effectuée soit par partage liquide-liquide (MÖLLER et JOSEFSSON, 1980 ; BARTOLOMEB., 1994 ; HERRYet LEMETAYER, 1996 ; BRAUSEet al., 1996) soit sur phase solide (ROVIRAet al., 1993) L’usage de techniques d’extraction par sys- tème de dialyse diphasique suivie d’une purification sur colonne a également été rapportée dans la littérature (PRIETAet al., 1993 ).
Pour notre étude, la détermination de la teneur en patuline est faite par extraction par l’acétate d’éthyle suivie de la purification par partage avec une solution de carbonate de sodium. Le dosage est ensuite réalisé par CLHP sur colonne en phase inverse avec une détection dans l’ultraviolet à 276 nm.
2 - MATÉRIEL ET METHODE
2.1 Matériel
– Filtre sans cendre n° 1 (WHATMAN) ; – Balance de précision (SARTORIUS) ; – Évaporateur rotatif (BUCHI) ;
– Dispositif de filtration sur membrane (MILLIPORE) ;
– Chromatographe liquide haute performance équipé d’une pompe 200 LC (PERKIN ELMER), d’une vanne d’injection Rhéodyne 7010 avec boucle de
20 µL, d’une colonne Spherisorb (MERCK) RP 18 (250 mm ×4,6 mm) dont la taille des particules est de 5 µm, d’un détecteur UV visible (APPLIED BIO- SYSTEMS modèle 785) et d’un intégrateur (HEWLETT PACKARD modèle 3395).
2.2 Réactifs et solvants
Tous les réactifs utilisés sont de qualité analytique : – eau bidistillée ;
– solution aqueuse de carbonate de sodium à 1,5 % (m/v) (RIEDEL-DE HAËN) ; – sulfate de sodium anhydre (RIEDEL-DE HAËN) ;
– acide acétique (PROLABO), ajusté à pH 4 ; – acétate d’éthyle (PROLABO) ;
– acétonitrile pour chromatographie liquide haute performance (PROLABO).
L’étalon utilisé est la patuline cristallisée (SIGMA). Une solution mère à 0,4 g·L–1 dans l’acétate d’éthyle est préparée et stockée à l’obscurité et à +4 °C. Les solutions étalons de travail de 5 à 100 µg·L–1de patuline sont prépa- rées par dilution extemporanée de la solution mère dans l’acétate d’éthyle.
2.3 Traitement de l’échantillon et extraction
Quarante quatre échantillons de jus de fruits commercialisés en Côte d’Ivoire ont été étudiés : jus de pomme, d’ananas, de fruit de la passion et de gingembre.
Prélever exactement 5 mL de jus et les transférer dans une ampoule à décantation de 50 mL. Ajouter 10 mL d’acétate d’éthyle. Agiter manuellement pendant une minute puis laisser les phases se séparer. Procéder à une seconde extraction dans les mêmes conditions avec 10 mL d’acétate d’éthyle puis ras- sembler les phases organiques. Ajouter 2 mL de solution de carbonate de sodium à 1,5 % m/v. Extraire à nouveau avec 5 mL d’acétate d’éthyle. Filtrer la phase organique à travers un filtre sans cendre contenant 1 g de sulfate de sodium anhydre. Concentrer puis évaporer à sec le filtrat à l’aide d’un évapora- teur rotatif à 40 °C sous vide. Le résidu obtenu est repris par 0,5 mL d’acide acétique. La solution ainsi obtenue est ensuite analysée par chromatographie liquide haute performance sur phase inversée.
2.4 Analyse chromatographique
Les conditions retenues sont les suivantes : – phase stationnaire octadécylsilanisée ; – phase mobile : eau : acétonitrile (90 : 10, v/v) ; – débit de la phase mobile : 0,5 ml/min ; – détection UV : 276 nm.
La patuline est éluée entre 15 et 16 min. Le chromatogramme d’un extrait de jus d’ananas est représenté sur la figure 1.
3 - RÉSULTATS ET DISCUSSION
Avant d’appliquer la méthode, elle a été soumise aux principaux tests de validation. La linéarité de la concentration en fonction de la surface de pic a été établie pour des concentrations comprises entre 5 µg·L–1et 100 µg·L–1. Le coef- ficient de détermination r2 est égal à 0,9998. L’ordonnée à l’origine n’est pas significativement différente de zéro (p = 0,05). Une analyse de variance (ANOVA) a confirmé ces résultats Fcal= 2192.36 (p < 0,0001).
La spécificité de la méthode a été vérifiée en étudiant l’absence d’interfé- rence d’autres composés, dont le 5-hydroxyméthylfufural (HMF), produit résul- tant de la dégradation des sucres. Selon les conditions chromatographiques retenues, la patuline et la 5-HMF sont résolus séparément (figure 2).
La répétabilité de l’analyse chromatographique a été vérifiée à partir de six injections d’une solution de référence de patuline à deux niveaux de concentra- tion, d’une part, et d’un extrait de jus d’ananas naturellement contaminé, d’autre part. La répétabilité de l’ensemble de la procédure a été déterminée à partir de six extractions différentes d’un échantillon de jus d’ananas naturelle- ment contaminé. Chaque extrait obtenu est ensuite injecté à deux reprises dans le chromatographe. Les coefficients de variation obtenus sont rapportés dans le tableau 1.
Figure 1
Chromatogramme d’un extrait de jus d’ananas Pic : 1 : patuline
Chromatogram of an extract from pineapple juice.
Peak 1: patulin
Tableau 1 Répétabilité de la méthode Repeatability of the method
Répétabilité de l’analyse chromatographique Moyenne Écart-type CV
(n = 6) (µg·L–1) (µg·L–1) (%)
Solution de référence de patuline
20 µg·L–1 1,31
100 µg·L–1 1,35
Jus d’ananas 12,84 0,24 1,86
Répétabilité de l’ensemble de la procédure (n = 6)
Jus d’ananas 41,75 3,86 9,25
L’absence d’effet de matrice de la procédure d’analyse a été vérifiée en ajoutant des quantités de patuline à trois niveaux de concentration à des
Figure 2
Chromatogramme d’une solution mixte de référence de 5-hydroxyméthylfurfural (2 mg·L–1) et de patuline (50 µg·L–1)
Pic 1 : 5 hydroxyméthylfurfural ; Pic 2 : patuline
Chromatogram of a reference solution containing 2 mg·L–1 of 5 hydroxymethylfurfural and 50 µg·L–1of patulin Peak 1: 5 HMF; peak 2: patulin
échantillons jus d’ananas. La détermination de la teneur en patuline avec ou sans ajouts a été réalisée. Le recouvrement variait entre 90 % et 107 % avec un recouvrement moyen de 96,20 %.
Pour évaluer la sensibilité de la méthode, les limites de détection et de quan- tification ont été évaluées par référence à un rapport signal sur bruit (S/N) res- pectivement égal à 3 et 10. La limite de détection obtenue est de 1,5 µg·L–1et la limite de quantification de 5 µg·L–1.
L’analyse des résultats des tests de validation a permis de définir un domaine de linéarité. Les coefficients de variation calculés, inférieurs à 10 % sont proches de ceux rapportés par BRAUSEet al. (1996) et indiquent une répé- tabilité acceptable de la méthode. Les taux de recouvrement obtenus lors de l’analyse de l’exactitude sont proches et même supérieurs à ceux rapportés par la littérature (STRAY, 1978, MOLLERet JOSEFSSON, 1980 et BRAUSEet al., 1996).
Les limites de détection et de quantification sont également proches de celles obtenues aussi bien par les techniques de chromatographie en phase gazeuse (4 µg·L–1) (LLOVERAet al., 1999) que par celles en phase liquide (5 µg·L–1)(BAR- TOLOME et al., 1994 ; BRAUSE et al., 1996). Ces résultats globalement satisfai- sants nous ont permis de retenir cette méthode pour le contrôle en routine des jus de fruits.
Tableau 2
Teneur en patuline (exprimée en µg·L–1) dans les échantillons de jus de fruits Patulin content (expressed in µg.L-1) in samples of fruit juices
Origine N° Nature Teneur en patuline
(µg·L–1)
A3 Pomme 13,71
A (importé) A15 Pomme 16,75
A16 Pomme 9,29
B (fabrication industrielle) B10 Ananas 14,42
C2 Fruit de la passion 16,60
C (fabrication artisanale) C3 Gingembre 15,00
C5 Fruit de la passion 59,96
C8 Ananas 13,70
La méthode a été appliquée à l’analyse de 44 échantillons de jus de fruits d’origine différente (A : importé ; B : fabrication locale industrielle et C : fabrica- tion locale traditionnelle) commercialisés en Côte d’Ivoire. Les résultats ont indi- qué que la patuline a été retrouvée uniquement dans trois échantillons de jus A, un échantillon de jus B et quatre échantillons de jus C (tableau 2). Elle a pu être mise en évidence non seulement dans des échantillons de jus de pomme mais également dans des échantillons de jus d’ananas, de fruit de la passion et de gingembre, ce qui indique bien que la pomme n’est pas le seul substrat dans lequel la patuline pourrait être présente. Sur ces huit échantillons, des teneurs inférieures à la teneur maximale admise qui s’étend de 20 à 50 µg·L–1 (FAO, 1995 ; FAO, 1996) ont été retrouvées à l’exception d’un échantillon. La pré- sence de patuline au-dessus de ce seuil indiquerait la présence d’une contami-
nation due aux fruits utilisés (pomme, fruit de la passion, ananas et gingembre).
Elle pourrait être également due aux mauvaises conditions de conservation des fruits en particulier pour les jus fabriqués traditionnellement et vendus sur les marchés ouverts et dans les restaurants (PASTERet al., 1995).
4 - CONCLUSION
La méthode proposée permet une résolution rapide et efficace de la patuline dans les jus de fruits. Les tests de validation appliquées ont indiqué que la méthode est précise, spécifique et exacte et peut être retenue pour le contrôle de routine de la qualité des jus de fruits. Le contrôle de différents types de jus de fruits commercialisés en Côte d’Ivoire a mis en évidence que seul un échan- tillon de jus a présenté une teneur en patuline au-dessus du seuil admis de 50 µg·L–1. Ces résultats semblent donner une indication de la qualité des jus, en particulier de ceux fabriqués traditionnellement et pourraient justifier la mise en place d’un contrôle en routine systématique des jus de fruits commercialisés en Côte d’Ivoire.
Reçu le 25 mars 2000, révisé le 26 février 2001, accepté le 8 mars 2001.
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