BIOLOGIE MOLECULAIRE
1
èreANNEE PHARMACIE 2012
2012
1
2012 2012
Pr. Alami – Ouahabi Naïma
PLAN DU COURS Chapitre.1
Structure des acides nucléiques & relations structure / fonction.
Chapitre. 2
Expression génétique & systèmes de régulation.
Expression génétique & systèmes de régulation.
•Transcription & traduction
•Cycle cellulaire & réplication de l’ADN
Chapitre. 3
Systèmes de mutation & de réparation de l’ADN in
vivo.
Chapitre. 4
Biologie moléculaire du cancer
(Proto-oncogènes, oncogènes, apoptose & agents anti-cancer).
Chapitre. 5
Biologie moléculaire des virus, viroïdes & prions Biologie moléculaire des virus, viroïdes & prions
(Analyse moléculaire & moyens génétique de diagnostique & de traitement).
Chapitre. 6
Outils, techniques & applications de biologie
moléculaire .
OBJECTIFS DU COURS : Partie Biologie Moléculaire
Transmettre à l’étudiant :
1. Les bases essentielles de la Biologie Moléculaire.
2. Une compréhension spécifique des mécanismes
moléculaires clef & communs à différent organismes.
3. La capacité d’analyser ces différents processus
moléculaires.
4. La capacité de distinguer les processus
moléculaires ciblés à des fins thérapeutiques.
5. La capacité de sélectionner les outils moléculaires nécessaires à ce ciblage thérapeutique.
thérapeutique.
6. Une compréhension globale de l’importance des techniques de Biologie moléculaire dans
la pharmacologie, le diagnostique ainsi que la
thérapie présente & future.
Chapitre. 1.
Structure des acides nucléiques
& relations structure / fonction.
Objectifs:
Objectifs:
1. Connaître la structure des acides nucléiques;
2. Savoir reconnaître les molécules simples dont ils sont constitués;
3. Connaître leurs fonctions dans l’expression génétique.
I. Structure des acides nucléiques
Les acides nucléiques ont été isolés initialement des noyaux des cellules. On peut en distinguer deux grands types:
•les acides désoxyribonucléiques (ADN): essentiellement localisés dans le noyau des cellules
•les acides ribonucléiques (ARN): essentiellement
•les acides ribonucléiques (ARN): essentiellement localisés dans le cytoplasme cellulaire.
•Ces molécules biologiques (les acides nucléiques) contiennent l’information génétique.
•Les acides nucléiques (ADN et ARN) sont des macromolécules composés de molécules simples et comportent des sous-unités appelées nucléotides.
•Un nucléotide comporte trois composants:
un ose, une base & de l’acide phosphorique.
1. 1. Ribose, désoxyribose
Bases puriques
Bases pyrimidiques
Nucléosides
Nucléotide AMP
Nucléotide GMP
Nucléotide CMP
Nucléotide UMP
Les Acides Nucléiques
Acide ribonucléique
Hybridation A - T
Hybridation G - C
Les polymères de nucléotides:
La molécule d’ADN est constituée en règle de deux chaînes (ou brins) de nucléotides.
Les molécules d’ ARN sont le plus souvent sous forme d’un seul brin
forme d’un seul brin
Structure de l’ARN en forme d’ Epingle à cheveux (hair-pin loops)
Les nucléotides des acides ribonucléiques peuvent quelquefois
s’autohybrider en formant des structures secondaires
Acide désoxyribonucléique
La double hélice
Dans l’espace les deux brin d’ADN antiparallèles &
complémentaire présentent une configuration hélicoïdale.
Elles s’enroulent autour d’un axe imaginaire pour constituer une double hélice à rotation droite
(dans les formes A et B de l’ADN)
Sens de lecture d’un acide nucléique.
Par convention,
•on lit toujours un acide nucléique
de l’extrémité 5’ (groupement phosphate) vers l’extrémité 3’ (OH libre).
•on indique seulement La séquence des bases d’un ADN
(A, T, G ou C), en précisant les extrémités 5’ et 3’.
•Les 4 nucléotides de l’ADN avec les 4 bases (A, T, G ou C),
•Les 4 nucléotides de l’ADN avec les 4 bases (A, T, G ou C),
se combinent en une infinité de séquences de la même
manière que les 7 notes de musique composent une infinité
de symphonies.
La forme B de l’ADN
•La forme biologique la plus importante de l’ADN;
•10 paires de bases par tour de spire;
•Le pas de l’hélice 3,4 nm;
•Le diamètre de l’hélice est de 2,4 nm;
•Les bases puriques et pyrimidiques sont à l’intérieur de l’hélice
l’intérieur de l’hélice
•Les groupements phosphates et les désoxyriboses sont à l’extérieur;
•Deux types de sillons appelés :
sillon majeur (1,2 nm de large) et sillon mineur
(0,6 nm de large).
La forme Z de l’ADN
•Double hélice à rotation gauche;
•12 paires de bases par tour d’hélice;
•Le pas d’hélice est 4,6 nm;
•Diamètre de l’hélice est plus petit 1,8 nm;
•Les bases sont enchaînées avec une alternance de
•Les bases sont enchaînées avec une alternance de conformation;
•Le Z-ADN a été décelé dans des chromosomes de mammifères;
•Fonction précise mal connue, (régulation structurale de
l’expression génétique).
Propriétés physico-chimiques de l’ADN.
• A la température T
m(de fusion), l’ADN est dénaturé;
• La dénaturation est réversible dans certaines conditions;
• Elle entraîne des modifications physico-chimiques:
Augmentation de l’absorption dans l’ultra-violet, diminution de la viscosité, augmentation de la densité.
• T
mvarie selon le pourcentage de bases (G+C) de l’ADN étudié;
• La présence des bases puriques et pyrimidiques permet aux acides nucléiques (ADN et ARN)
d’absorber dans l’ultra-violet (UV) à 260 nm.
Les topoisomères sont deux molécules d’ADN qui ont la même séquence & diffèrent uniquement par le nombre d’enlacements ( superenroulement ou le nombre de tours que fait l’un des brins autour de l’autre brin). Il existe Différents états des topoisomères.
I LA CONFORMATION DES ADN LES TOPOISOMÈRES.
L’ADN peut exister:
à l’état relâché avec une contrainte minimale dans la molécule. C’est la forme la plus stable de la molécule.
Cependant, l’axe de la double hélice d’ADN peut
s’enrouler sur lui-même en formant un super
enroulement.
Deux formes de superenroulement sont alors possibles:
-Un superenroulement qui correspond à:
une augmentation du nombre d’enroulements dans la même direction que la rotation de l’hélice B (rotation droite).
On parle de superenroulement positif.
-Un superenroulement de l’ADN autour de son axe dans la direction opposée au sens des aiguilles d’une montre.
Il y a donc au niveau de l’ADN relâchement de la pression de Il y a donc au niveau de l’ADN relâchement de la pression de torsion. On parle de superenroulement négatif.
Le superenroulement de l’ADN a des conséquences importantes:
- Il permet de le rendre plus compact et diminuer ainsi le volume occupé dans la cellule.
- Ces modifications du degré d’enroulement de la double hélice
d’ADN influencent les interactions de l’ADN avec d’autres molécules (protéines qui régulent l’expression génétique).
LES TOPOISOMÉRASES
Les topoisomérases sont des enzymes qui modifient le nombre d’enlacements. Elles augmentent ou diminuent le nombre de supertours dans les molécules d’ADN double brin.
Les topoisomérases de type I: Coupent transitoirement et ressoudent un seul brin d’ADN double brin. Ils peuvent ressoudent un seul brin d’ADN double brin. Ils peuvent agir sur de l’ADN superenroulé positif ou négatif.
Les topoisomérases II : coupent de manière transitoire les deux brins de l’ADN, puis les ressoudent et agissent uniquement sur l’ADN superenroulé négatif (exemple:
gyrase bactérienne).
Les topoisomérases I & II permettent de désenrouler
(relacher) l’ADN.
Les deux types de topoisomérases ont une importance capitale dans la réplication , la transcription et la recombinaison de l’ADN. chez les procaryotes et les eucaryotes.
Ces enzymes sont également la cible d’agents
Rôle des topoisomérases
Ces enzymes sont également la cible d’agents médicamenteux, soit par exemple :
•les agents anti-bactériens de la classe des quinolones qui inhibent les gyrases bactériennes
•ou les agents anti-cancéreux, (le taxol )qui agissent en tant que anti topo isomérases I.
Exemple de poison anti topoisomérase I : ts HMG
STRUCTURE DE LA CHROMATINE
Condensation de la chromatine dans les cellules somatiques
la molécule d’ADN nucléaire est fortement associée à des protéines pour constituer la chromatin e.
protéines pour constituer la chromatin e.
Les complexes protéines-ADN sont appelés nucléosome s.
Le nucléosome contient de l’ADN enroulé autour d’un
« core » constitué de 8 protéines appelées histone s
2x (H2A H2B, H3 et H4).
Les histones sont des protéines de petit poids moléculaire (11-14 k Da);
Les histones sont riches en acides aminés basiques (+);
L’histone H1 n’appartient pas au nucléosome, mais permet le contact entre deux nucléosomes.
L’ enroulements successif de 6 nucléosomes forme des structures de type solénoïde.
de type solénoïde.
Les solénoïdes forment des domaines (boucles de solénoïdes) de 60 kb (60. 000 pb).
Les boucles de solénoïdes s’enroulent ou s’empilent afin de former une mini bande chromosomale
Les mini bandes s’empilent pour former un chromosome
Chez l’homme :
•3 10
9pb,
•100.000 gènes,
•46 chromosomes (2 x 23)
Le projet du Génome Humain
le séquençage complet des 3 10
9pb en juin 2001
Condensation de la chromatine dans les spermatides
•la spermiogenèse (maturation de la spermatide en spermatozoïde);
•Changements morphologiques et physiologiques de la spermatide;
•s’accompagnent de changements drastiques au niveau nucléaire;
•Les histones somatiques sont remplacées par des protéines tsHMG et des protamines;
•Changement de la structure de la chromatine;
•Augmentation de la condensation de l’ADN spermatique;
•Inhibition de l’expression génétique transcription & traduction;
•Autre model de la structure de la chromatine;
•Assure transport sans danger du patrimoine génétique vers l’ovule.
Les travaux de recherche in vitro effectués sur la protéine tsHMG par N. Alami-Ouahabi & al, ont montré que cette nouvelle protéine nucléaire est impliquée dans:
•La condensation et superenroulement de l’ADN;
•L’inhibition de la transcription donc de l’expression génétique & de l’activité de division cellulaire;
génétique & de l’activité de division cellulaire;
•Ces travaux ont également montrés que tsHMG agit comme agent anti topoisomerase I;
•Pourrait être un potentiel agent anticancer pour les
traitements par Thérapie Génique.
LES TÉLOMÈRES.
Les télomères constituent les extrémités des chromosomes eucaryotes.
Ils sont formés par des séquences répétitives d’ADN.
A l’extrémité 3’ des chromosomes, on retrouve des copies répétées de séquences de type TTGGGG (retrouvées chez un protozoaire cilié: Tétrahymena) ou TTAGGG (retrouvées chez l’Homme).
cilié: Tétrahymena) ou TTAGGG (retrouvées chez l’Homme).
A l’extrémité 5’, on a les séquences complémentaires riches en cytosine.
Le problème majeur lors de la réplication de l’ADN est l’élimination potentielle de l’amorce d’ARN la plus externe ce qui pourrait
entraîner un raccourcissement de l’ADN à chaque cycle de réplication.
La protection des extrémités des chromosomes des eucaryotes est assurée par une enzyme spécifique: la télomérase.
TÉLOMÈRASE
La réplication de l’ADN à l’extrémité des chromosomes eucaryotes fait donc intervenir une enzyme particulière appelée téloméras e.
Cette enzyme ajoute des séquences spécifiques en 3’ d’un brin d’ADN.
La télomérase va se positionner à l’extrémité 3’ du brin d’ADN.
La télomérase possède une matrice qui lui est propre et qui est une matrice d’AR N, elle va se fixer à l’extrémité 3’:
(3’ brin parental + télomérase)
Une répétition de motifs: TTGGGG est synthétisée.
Elle constitue le télomèr e.
Pour synthétiser le brin télomère complémentaire riche en C,
une primase interviend avec synthèse d’une amorce d’ARN par copie de l’extrémité 3’.
Puis l’ADN polymérase allonge la chaîne à partir de l’amorce d’ARN.
Finalement, une ligase assure la soudure finale.
L’activité des télomérases est très réduite ou nulle dans les cellules normales en culture. Après plusieurs réplications, les chromosomes normales en culture. Après plusieurs réplications, les chromosomes perdent leurs télomères et deviennent instables.
Par contre dans les cellules cancéreuses, l’activité des télomérases est augmentée.
Les télomères ainsi que les gènes & les activités des télomérases ont un intérêt primordial dans la recherche des phénomènes moléculaires de vieillissement, de longévité & d’immortalité cellulaire.
TERMES CLE EN BIOLOGIE
MOLECULAIRE
I.6. PSEUDOGENES
Certains gènes apparus par duplication au cours de l’évolution ont subi des mutations génétiques
(substitutions, insertions, délétions, etc...) qui empêchent la transcription ou la traduction;
Exemple: (codon Stop prématuré)
Il en résulte que même si la transcription conduit à un ARN messager, celui-ci ne peut être traduit
Ce codon stop prématuré à transformé le gène fonctionnel en pseudo gène non traduit.
Au cours de l’évolution des espèces, le génome s’agrandit continuellement par suite de
duplications
de gènes et detranspositions
.Les duplications:
se produisent en tandem, une séquence se trouvant répétée deux fois dans le génome à la suite de la duplication.
Cette duplication permet à chacune des copies de la séquence d’évoluer pour son propre compte ce qui augmente les chances de d’évoluer pour son propre compte ce qui augmente les chances de produire des caractères nouveaux.
Les transpositions:
résultent de l’incorporation d’acides nucléiques synthétisés hors du génome :
• soit par incorporation du DNA d’un virus,
• soit par transcription reverse d’un RNA de la cellule ou d’un virus, au moyen d’une reverse-transcriptase qui produit un DNA complémentaire (cDNA) et d’une transposase qui l’incorpore au génome de la cellule.
Conversion de gène:
• Les séquences de gènes peuvent être transformées par échange d’exons complets
(par une transposition à partir d’un autre gène).
• La transposition d’un exon peut ajouter un
• La transposition d’un exon peut ajouter un
domaine nouveau dans la structure d’une protéine
ou restaurer un domaine devenu non fonctionnel
au cours de l’évolution.
Les phénomènes de transformation de gènes en Pseudo gènes, de transpositions & de coversions de gènes
Jouent un rôle primordial dans l’évolution, l’adaptation
& la diversité génétique.
effet positif sur l’expression génétique.
Peuvent avoir un effet néfaste sur la régulation de Peuvent avoir un effet néfaste sur la régulation de l’expression génétique.
En effet un transposon peut lors de son mouvement
interrompre un gène codant pour un facteur important
de la régulation du cycle cellulaire ou un facteur
biochimique vital & peut ainsi causer des métastases
ou des pathologies.
LES ACIDES RIBONUCLÉIQUES (OU ARN) CARACTÉRISTIQUES GÉNÉRALES
Les ARN sont caractérisés par:
-L’ose= ribose:
remplace le 2’-désoxyribose présent dans les ADN.
-Les bases pyrimidiques et puriques rencontrées sont:
A, C, G et U (cette dernière est remplacée par T dans les ADN).
•Une seule chaîne nucléotidique (au lieu de deux dans les ADN).
Cette unique chaîne est plus courte que les chaînes d’ADN.
Cette unique chaîne est plus courte que les chaînes d’ADN.
Les règles d’appariement entre les bases complémentaires peuvent s’observer dans les ARN.
•Dans certains cas: une même chaîne d’ARN peut s’auto hybrider où les portions bi caténaire ont un appariement suivant la règle:
A apparié avec U (deux liaisons hydrogène) et C apparié avec G (trois liaisons hydrogène).
Ainsi les régions appariées donnent des tiges & les régions non appariées donnent des boucles (structure en cruciforme) .
LES DIFFÉRENTS TYPES D’ARN.
Les cellules contiennent essentiellement quatre types d’ARN:
- Les ARN ribosomiques (ou rARN).
- Les ARN de transfert (ou tARN).
- Les ARN messagers (ou mARN).
- Les ARN nucléaires de petite taille (ou snRNA)(ou - Les ARN nucléaires de petite taille (ou snRNA)(ou small nuclear RNA)(snRNA)
Dans la cellule, les rARN sont les plus abondants (au
moins 80% de l’ensemble des ARN de la cellule) et les
snRNA les moins abondants.
LES ARN RIBOSOMIQUES.
Ils constituent les ribosomes;
Les ribosomes sont des organites intra-cellulaires situés dans le cytoplasme (également dans les mitochondries) et qui sont l’usine de fabrication des protéines de la cellule.
On peut distinguer les rARN des procaryotes (E. coli) et les rARN des eucaryotes.
Les rARN des procaryotes (E. coli): constituent les ribosomes dits 70 S (S = unité de sédimentation ou Svedberg) qui sont dits 70 S (S = unité de sédimentation ou Svedberg) qui sont formés de deux sous-unités, une grande sous-unité (50 S) et une petite sous-unité (30 S).
Chaque sous-unité comporte des protéines dites protéines ribosomales (ou r-protéines) et des rARN.
Les rARN des eucaryotes.
Chez les eucaryotes, les ribosomes sont plus gros (80 S) avec également une structure à deux sous-unités (40 S et 60 S).
La sous-unité 60 S contient trois rARN différents (5 S, 5,8 S et 28 S), et la petite sous-unité 40 S ne contient qu’un seul rARN 18 S).
Le nombre de protéines ribosomales à l’intérieur de chaque sous-unité est plus important que chez les procaryotes.
sous-unité est plus important que chez les procaryotes.
.
LES ARN DE TRANSFERT (tARN).
•Les tARN sont les vecteurs qui vont transférer les acides aminés jusqu’à l’usine ribosome où s’effectue la synthèse protéique.
•Structure des tARN.
Les tARN présentent bien entendu la structure générale des ARN.
Mais ils possèdent en plus quelques particularités propres.
•Des bases inhabituelles.Tout d’abord, ils contiennent des nucléotides inhabituels par les bases qu’ils renferment. Ainsi, l’hypoxanthine, dont le nucléotide correspondant est l’IMP (I = l’hypoxanthine, dont le nucléotide correspondant est l’IMP (I = inosine monophosphate), mais aussi la thymine ou des bases méthylées.
•La structure spatiale des tARN. Les chaînes de tARN sont constituées d’une centaine environ de nucléotides. Surtout, il existe des zones d’appariement selon la règle de complémentarité et des zones appelées boucles sans appariement où sont présentes les bases inhabituelles.
•La forme générale est celle d’un L. En structure spatiale, on
présente souvent les tARN sous forme de trèfle ou un cruciforme.
Les sites importants dans les tARN.
Plusieurs sites sont importants dans les tARN. Tout d’abord:
•leur extrémité 3’-OH. Il existe trois nucléotides caractéristiques -C- C-A-3’-OH. C’est par cette extrémité que sera fixé l’acide
aminé qui sera véhiculé par le tARN.
•Puis, l’anticodon qui correspond à un groupe de trois nucléotides
•Puis, l’anticodon qui correspond à un groupe de trois nucléotides (ou triplet) situé sur une boucle du tARN. Ce triplet présente un rôle très important puisqu’il doit s’apparier avec le codon correspondant présent sur l’ARN messager.
Cet appariement entre l’anti-codon et le codon se fait par des liaisons hydrogène et suivant les règles de complémentarité.
Le codon et l’anti-codon sont disposés de manière antiparalllèle.
LES ARN MESSAGERS (mARN).
Les ARN messagers (ou mARN) constituent le support essentiel de l’information génétique entre l’ADN et le ribosome où s’effectuera la synthèse protéique.
Leur durée de vie est très courte à la différence des tARN par exemple. Chez les bactéries, la durée de vie d’un mARN est de quelques minutes environ.
quelques minutes environ.
Les mARN sont très rapidement synthétisés et dégradés.
Ils sont formés d’une seule chaîne de nucléotides avec les bases communes aux ARN: A, U, C et G.
Cette chaîne comporte une succession de triplets nucléotidiques.
Chaque triplet nucléotidique constitue un codon spécifique d’un acide aminé donné.
Il existe naturellement une vingtaine d’acides aminés et on dénombre 61 codons différents !
Ceci signifie qu’un acide aminé pourra être véhiculé par plusieurs tARN spécifiques (différent par leur anticodon).
Enfin, l’extrémité 5’ des tARN comporte un groupement phosphate.
Les tARN jouent un rôle capital dans la biosynthèse
protéique.
LES PETITS ARN NUCLEAIRES.
Les petits ARN nucléaires (ou snRNA) sont
présents dans le noyau des cellules et sont
impliqués dans certaines étapes de la régulation
post transcriptionnelle (épissage alternatif).
II. Relation entre les structures des acides nucléiques et leurs fonctions lord de l’expression génétique
•Les différentes structures des acides nucléiques & des protéines
associées à la chromatine ont une grande influence sur la régulation de l’expression génétique.
•En effet: La structure de la double hélice d’ADN, sa forme A, B ou Z, sa charge négative et son degré de superenroulement jouent un rôle Déterminant dans l’accessibilité des gènes au facteurs d’initiation, Déterminant dans l’accessibilité des gènes au facteurs d’initiation, D’activation ou d’inhibition de la transcription.
•Donc la structure de l’ADN est déjà en soi un facteur régulateur de l’expression génétique.
•Les interactions ADN—ADN , ADN—ARN, ADN—Protéines &
Protéines----Protéines sont également des éléments clef de La régulation de l’expression des gènes.
INFORMATION GENETIQUE Expression Génétique :
Transcription &Traduction
Réplication & Cycle Cellulaire
Expression Génétique Définitions :
La double hélice
L’acide désoxyribonucléique (ADN ou DNA), constitué de deux chaînes de nucléotides monophosphates, liés chacun par une liaison ester entre son carbone 3’ et le carbone 5’ du nucléotide suivant.
Ces deux chaînes de nucléotides sont unies entre elles par des liaisons hydrogènes pour former un hybride en forme de double hélice dont les deux brins sont : antiparallèles & complémentaires.
Chaque adénine (A) d’un des deux brins est liée par deux liaisons hydrogène avec une thymine (T) de l’autre brin, et chaque guanine (G) d’un brin est liée par trois liaisons hydrogène avec une cytosine (G) d’un brin est liée par trois liaisons hydrogène avec une cytosine (C) de l’autre brin.
De sorte que si on désigne les nucléotides par les lettres A, C, G et T en fonction des bases azotées qu’ils contiennent, on peut lire sur cette figure le texte suivant :
AGAGTCGTCTCGAGTCA...
...TCTCAGCAGAGCTCAGT
• Écrire à la suite les lettres A, C, G et T dans l’ordre où on rencontre les nucléotides sur l’un des brins de l’ADN de l’extrémité 5’ à l’extrémité 3’
aboutit à un texte.
• Le texte ainsi transcrit contient toute l’information nécessaire pour la synthèse d’une protéine). C’est pourquoi on appelle ce brin d’ADN le brin « sens ». L’autre brin est le brin complémentaire ou brin « antisens ».
• L’ensemble de l’information génétique transmise par chacun des parents à un enfant (génome haploïde) est contenue ainsi en 3 x 109 nucléotides.
•Ces 3 x 109 nucléotides d’information génétique constituent
des gènes = séquences codantes = exons = cadres ouvert de lecture (Open Reading Frames = ORF).
•Ces gènes sont copiés dans le noyau en tRNA ou rRNA ou mRNA =
Transcription.
•Seuls les mRNA sont traduit dans le cytoplasme en protéines = Traduction.
Gène
•Pour permettre la biosynthèse d’une protéine, il doit y avoir dans la structure de l’ADN, une séquence de nucléotides qui constitue le gène de cette protéine.
•Il existe des séquences régulatrices = éléments régulateurs ou promoteur:
généralement proximal en amont du gène
Le promoteur peut être en aval ou distal du gène et ne devient proximal que lors de la transcription et ceci via des remaniements structuraux de la chromatine).
Le promoteur est une séquence non-transcrite et non-traduite.
Le promoteur est une séquence non-transcrite et non-traduite.
•Une région génique ou locus peut contenir une suite variable d’exons (ORFs transcrites et traduites) et d’introns ( sequences
non-codantes)
• L’ensemble des mécanismes qui à partir de la séquence du gène (ADN) conduisent à la production d’un acide ribonucléique (ARN) est désigné sous le terme de Transcription
ARNm proteine == traduction
Transcription & traduction == expression génétique.
Brin sens & Brin antisens
•Tout le DNA n’est pas transcrit seuls les gènes = exons = ORFs Sont transcrits.
•En plus même si l’ADN est double brin seul un brin est transcrit ou copié en mRNA.
•Le mRNA est complémentaire & antiparallèle au brin d’ADN transcrit (nommé: Brin antisens)
•Le mRNA est identique à l’autre brin non transcrit (nommé: Brin sens).
5’….AGCTTAACGCGTA…. 3’ Brin DNA sens=
non transcrit=informatif.
3’….TCGAATTGCGCAT…. 5’ Brin de DNA Transcription
antisens=transcrit.
5’….AGCUUAACGCGUA…. 3’ mRNA
1.A. La transcription
• Les nucléotides qui précèdent l’exon contiennent de nombreuses séquences reconnues par des protéines nucléaires qui permettent le début (initiation) & la régulation de la transcription. C’est le promoteur
• On distingue en particulier :
— vers -20 -30 (20 à 30 nucléotides en amont de l’exon 1 en direction de l’extrémité 5’ du brin sens) une séquence TATATA appelée « boîte TATA », qui est spécifiquement reconnue par la protéine TFIID, cofacteur de la RNA-polymérase II ;
— vers -80 une séquence GGCCCATCCAT à la fois « boîte CAT ou CAAT » et « boîte GC », sur laquelle viennent se fixer d’autres protéines de la transcription (CTF et Sp-1) ;
— de nombreuses autres séquences sont des sites de fixation des protéines régulatrices de la transcription. Par exemple, une séquence TRE (TGACTCA) au début de la troisième ligne de la sequence, sur laquelle vont se fixer des protéines de la famille AP-1 pour activer la transcription.
Cis- et trans-régulateurs
• Les séquences de nucléotides du promoteur=(facteurs cis- régulateurs), sont reconnues par une classe de protéines spécifiques=(facteurs trans-régulateurs) dont la structure permet une liaison avec l’ADN (DNA binding proteins).
• La structure secondaire et tertiaire des DNA binding proteins comprend des domaines spécifiques permettant la reconnaissance des séquences régulatrices du gène : - domaines en doigts de zinc/ –structures riches en leucine en forme de « fermeture Eclair » (Leu zipper)/ – homéodomaines, bHLH = région fermeture Eclair » (Leu zipper)/ – homéodomaines, bHLH = région basique, hélice a, boucle, hélice a/ - domaines riches en glutamine/
– domaines riches en proline/ - hélices a acides (Asp, Glu).
• Les séquences qui reconnaissent les DNA binding proteins (facteurs cis-régulateurs=promoteur) ont des effets sur la vitesse de la transcription: activateurs = (séquences enhancer) ou inhibiteurs = (sé-quences silencer). Leur liaison avec les protéines dépend le plus souvent de circonstances physiologiques qui induisent ou répriment l’expression du gène.
La RNA polymérase II est l’enzyme de la transcription des gènes exprimés sous forme de protéines.
• Elle est présente dans tous les noyaux cellulaires. Sa masse moléculaire est de 500 kilo daltons pour 10 sous-unités.
• La transcription qu’elle catalyse nécessite des ribonucléosides triphosphates comme substrats (ATP, CTP, GTP et UTP), plusieurs cofacteurs protéiniques (transcription factors)
Initiation de la transcription
L’énergie de la réaction est fournie par l’hydrolyse des liaisons riches en énergie des nucléosides triphosphates (42 kJ/mol).
•
L’initiation de la transcription sur un promoteur humain implique plusieurs facteurs de transcription, connus sous les noms de TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH et TFIIJ en plus de la RNA polymérase II elle-même.• Au centre de ce mécanisme initial, il y a l’association de TBP, la sous-unité reconnaissant l’ADN du facteur TFIID, avec la boîte TATA
Initiation de la transcription
sous-unité reconnaissant l’ADN du facteur TFIID, avec la boîte TATA du promoteur. L’adjonction successive de TFIIB et de RAP30, petite sous-unité de TFIIF , sont ensuite nécessaires pour la fixation de la polymérase et déterminent à la fois le brin transcrit et le sens de la transcription. A ce complexe ADN-TFIID-TFIIB-RAP30-polymérase II, s’ajoutent encore successivement la grande sous-unité de TFIIF (RAP74), TFIIE et TFIIH.
Alors la transcription peut commencer si les ribonucléotides substrats sont présents.
Le complexe d’initiation de la transcription recouvre une séquence d’environ 100 nucléotides (100pb avant Nt: +1) du brin antisens de l’ADN, en provoquant l’ouverture et le déroulement partiel de la double hélice à cet endroit.
• La transcription commence à environ 22 nucléotides de la boîte TATA en direction opposée à celle des éléments GC-CAAT et se poursuit en remontant le brin antisens GC-CAAT et se poursuit en remontant le brin antisens
=(transcrit), en direction de son extrémité 5’.
• La formation de ce complexe est activée ou inhibée par
les facteurs trans-régulateurs liés aux séquences cis-
régulatrices du même promoteur.
Elongation de la transcription
•Chaque nucléoside triphosphate est choisi spécifiquement pour être complémentaire de la base du brin antisens qui va lui faire face. La liaison riche en énergie entre le premier phosphate estérifiant le carbone 5’ du ribose et les deux autres phosphates est hydrolysée, libérant un pyrophosphate qui sera hydrolysé ensuite par une pyrophosphatase.
Le phosphate restant est lié par une liaison ester au carbone Le phosphate restant est lié par une liaison ester au carbone 3’ OH libre du dernier nucléotide du transcrit en cours de synthèse.
• La RNA polymérase construit un ARN hybridé avec le
brin antisens de l’ADN, dont la séquence primaire est la
copie du brin sens mais composée de ribonucléotides au lieu
des désoxyribonucléotides et d’uracile à la place des
thymines.
Exon
• Les exons sont des fragments de séquence primaire d’un gène qui seront recopiés dans la structure
primaire de l’ARN messager, après l’épissage.
• Un exon code le plus souvent pour un domaine fonctionnel de la protéine ou une partie d’un tel domaine.
• Au cours de l’évolution le gène peut être modifié par la
substitution, l’insertion ou la délétion d’un exon entier
(conversion de gènes) ce qui modifie, apporte ou retire
à la protéine un domaine fonctionnel en entier.
Exon 1
• Après la fixation de la RNA-polymérase sur la boîte TATA par l’intermédiaire du facteur TFIID, la transcription va commencer 23 nucléotides au delà de cette boîte.
• A ce point, la séquence du brin sens est 5’AGGCACAGA...3’, celle du brin antisens est donc 3’TCCGTGTCT...5’ (complémentaire et antiparallèle).
• En choisissant comme substrats les ribonucléotides complémentaires de ce brin antisens, la RNA-polymérase va composer 5’AGGCACAGA...3’ qui sera le début de la séquence de composer 5’AGGCACAGA...3’ qui sera le début de la séquence de l’ARN transcrit. Lorsque la polymérase rencontre un A sur le brin antisens, elle incorpore un nucléotide à Uracile dans le mRNA :
5’ UGGCUCUGU...3’.
• La séquence de l’ARN transcrit recopie donc celle du brin sens de l’ADN.
• La transcription se poursuit alors tout au long du brin antisens en incorporant les nucléotides dans l’ARN transcrit.
Fin de la transcription
• Vers la fin du gène la RNA-polymérase rencontre une séquence 3’-TTATTT-5’ qu’elle reconnaît comme un signal de fin d’activité. La transcription s’arrête en effet peu après ce signal qui est transcrit en AAUAAA.
• La RNA-polymérase quitte l’ADN et libère le transcrit
d’ARN qui contient l’information génétique recopiée
pour permettre l’expression du gène sous forme de
protéine.
Modifications du transcrit
•
Chapeau = Capping: une enzyme ajoute un nucléotide à Guanine sur les phosphates du Carbone 5’ du premier nucléotide du transcrit et transfère des radicaux méthyles sur les premiers nucléotides. Ces modifications font un début commun à tous les transcrits primaires, précurseurs des RNA messagers.• Queue poly-A : une enzyme coupe le transcrit environ 10 à 20 nucléotides au delà de la séquence AAUAAA et synthétise sur le Carbone 3’ libre du dernier nucléotide du transcrit restant une longue chaîne de 500 à 2000 nucléotides à Adénine polymérisés.
chaîne de 500 à 2000 nucléotides à Adénine polymérisés.
• Édition : Des enzymes peuvent « éditer » (au sens anglais du terme) la structure primaire du transcrit en modifiant certaines bases (exemple : C en U par une cytosine désaminase spécifique
• Excision - épissage : les parties non codantes de la structure primaire du transcrit sont coupées et les parties codantes ré assemblées
Les ARN messagers sont détruits par des ribonucléases dans le cytoplasme. Leur hydrolyse libère des nucléotides qui seront réemployés à la synthèse de nouveaux acides nucléiques.
• Pour protéger les ARN messagers de ce catabolisme, une structure particulière dissimule l’extrémité 5’ terminale de ces ARN aux exonucléases spécifiques de cette partie de l’ARN.
Cette structure est appelée chapeau du messager (cap).
• Au minimum, il y a fixation d’un GMP sur le deuxième phosphate du nucléoside triphosphate qui se trouve à l’extrémité 5’ du transcrit. Ce GMP est méthylé sur son azote n°7.
• Si le nucléotide initial comprend une adénine celle-ci peut être méthylée sur l’azote n°6. Les riboses des nucléotides initiaux sont quelquefois méthylés sur l’oxygène de la fonction alcool en 2’.
• Le transcrit primaire contient des nucléotides.
• Il a reçu un chapeau (ca p), GMP méthylé qui se fixe sur le phosphate b de l’ATP en 5’ du transcrit primaire.
• Il reçoit une queue poly-A synthétisée en 3’ après la fin du transcrit.
• les introns excisés seront reconnus par :
• les introns excisés seront reconnus par :
— un site donneur GU en 5’ de chaque intron,
— un site receveur AG en 3’ de chaque intron.
• Après cette maturation le transcrit primaire devenu ARN
messager sera transporté vers le cytoplasme pour la
traduction.
Excision - épissage
• Les introns, parties non codantes des gènes des eucaryotes, sont coupés (excision) de la structure primaire des ARN au cours de la maturation des messagers.
• Les exons, parties codantes, sont ensuite liés entre eux bout à bout (épissage), pour établir la séquence primaire de l’ARN messager.
• L’excision et l’épissage représentent donc l’action
• L’excision et l’épissage représentent donc l’action d’enzymes et de ribozymes qui catalysent la coupure de l’ARN (endoribonucléase) et la fermeture de la brèche (ARN ligase).
• L’épissage peut être alternatif, c’est à dire peut conduire à
plusieurs structures d’ARNm : les ARNm alternatifs ont
chacun en propre certains exons ainsi que des exons en
commun.
Formation du lasso
• L’excision des introns et l’épissage des exons est l’étape la plus importante de la maturation du transcrit dans le noyau cellulaire.
• Elle fait appel à des facteurs spécifiques : ribonucléoprotéines contenant des petits ARN (snR-NP), ribozymes (ARN ayant des propriétés catalytiques), protéines codées par les introns eux-mêmes (maturases)...
• La structure secondaire du transcrit met en contact trois séquences de l’intron : la séquence du début de l’intron (extrémité 5’ ou site donneur), la séquence de la fin de l’intron (extrémité 3’ ou site accepteur) et une séquence riche en pyrimidines (C ou U) contenant un nucléotide à adénine (A du riche en pyrimidines (C ou U) contenant un nucléotide à adénine (A du branchement).
• Le site donneur commence habituellement par un nucléotide à guanine dont le phosphate est détaché de l’exon précédent pour être transféré sur le carbone 2’ de l’A du branchement. Le dernier nucléotide du site accepteur, aussi une guanine, est détaché de l’exon suivant, dont le premier nucléotide est lié par son phosphate 5’ au carbone 3’ du dernier nucléotide de l’exon
précédent.
• L’intron, libéré sous forme de lasso, est détruit par des nucléases. Le transcrit perd successivement tous ses introns et les exons épissés constituent la séquence codante du messager.
RNA Messager
•
L’ARN messager comprend plusieurs séquences :— une séquence 5’ non-codante, qui ne sera pas traduite, qui correspond à l’exon 1 et à une partie de l’exon 2 dans le gène de l’apoA-II ;
— un codon AUG qui fixe le tARN de la méthionine initiale ;
— des séquences de codons pour incorporer les acides aminés du signal-peptide et du propeptide;
— la séquence des codons dont les acides aminés formeront la séquence primaire de la protéine ;
primaire de la protéine ;
— le codon de terminaison (ici, UGA) ;
— une séquence 3’ non-traduite qui s’achève par la queue poly-A.
• Sur la séquence 5’ non-traduite, va se construire le complexe d’initiation de la traduction où les ribosomes vont s’assembler successivement pour commencer la traduction.
La traduction
•Lors de la traduction:
la structure transcrite sur l’ARNm, s’exprime par la synthèse de protéines dont la séquence traduit en acides aminés l’information portée par la structure primaire de l’ADN.
La traduction est faite dans le cytoplasme des cellules :
• soit pour libérer des protéines cytoplasmiques,
• soit pour conduire ces protéines dans les membranes
• soit pour conduire ces protéines dans les membranes ou les organites de la cellule (reticulum
endoplasmique, appareil de Golgi, membrane
plasmique, lysosomes, mitochondries, noyau, etc...),
• soit pour excréter ces protéines à travers les
membranes vers l’extérieur de la cellule.
Codon
•
La liaison de l’ARN de transfert (ARNt) avec l’ARN messager (ARNm) porteur de l’information, se fait par complémentarité entre 3 nucléotides de chacun de ces deux ARN.Les 3 nucléotides de l’ARNm constituent un codon et les 3 nucléotides de l’ARNt un anticodon.
Au cours de la traduction l’anticodon et le codon se lient de manière antiparallèle, et l’acide aminé porté par l’ARNt est incorporé à la protéine en cours de synthèse.
incorporé à la protéine en cours de synthèse.
• La séquence primaire de l’ARNm est donc traduite par groupes de 3 nucléotides (codons). Un nucléotide de l’ARNm au cours de la traduction peut se trouver en position 1, 2 ou 3 dans un codon si le nombre de nucléotides qui le séparent du codon d’initiation AUG est ou n’est pas un multiple de 3. Cette position porte le nom de cadre de lecture.
Code génétique
• La séquence codante est une suite de codons dont chacun permet d’incorporer spécifiquement un acide aminé dans la synthèse d’une protéine.
• Le code génétique est le même pour tous les êtres vivants de la biosphère (universel). Il existe quelques variations (codons propres à la biosynthèse des protéines dans les mitochondries).
dans les mitochondries).
• Le code génétique comporte 61 codons pour signifier les 20 acides aminés qui participent à la synthèse des protéines :
chaque acide aminé peut être codé par plusieurs codons
(de un à six) qui diffèrent en général par leur troisième
nucléotide. On dit que le code est dégénéré.
Ribosome eucaryote
• Les acides ribonucléiques ribosomiaux et les protéines ont des sites de fixation pour la séquence du messager,
• Les ARN de transfert portent l’acide aminé à
incorporer (site A) et le peptide en cours de synthèse
(site P), un site catalytique pour former les liaisons
peptidiques, des sites de fixation pour les cofacteurs
peptidiques, des sites de fixation pour les cofacteurs
protéiques de l’initiation (eIF2, eIF3), de l’élongation et
de la terminaison et des sites de régulation (protéine
S6).
Polyribosomes
•
L’initiation est un phénomène permanent à l’extrémité 5’
d’un ARN messager et les ribosomes se succèdent sur le même messager à raison d’un tous les 100 nucléotides environ, formant un polyribosome.
• Les polyribosomes présentent un aspect différent selon la régulation des différentes étapes de la traduction. Plus l’initiation est active plus les ribosomes traduction. Plus l’initiation est active plus les ribosomes sont nombreux sur le messager. Si l’élongation est lente, les ribosomes vont mettre plus de temps à lire la séquence codante. Une activation de la terminaison dissocie tous les ribosomes du messager.
De nombreux antibiotiques sont capables d’interférer
avec chacune des étapes de la synthèse des protéines
(streptomycine, cycloheximide, puromycine).
ARN de transfert
•
Les ARN de transfert constituent le lien chimique nécessaire entre la structure du codon, reconnu par l’anticodon, et l’acide aminé spécifique porté par l’ARNt. C’est en quelque sorte le dictionnaire de la traduction.• L’anticodon est une séquence de trois nucléotides située à l’extrémité de la boucle inférieure de l’ARNt, complémentaire et antiparallèle de la séquence du codon de l’acide aminé corres- pondant.
• Chaque acide aminé est lié spécifiquement (code génétique) par une aminoacyl-tRNA-synthétase à l’extrémité 3’ de l’ARNt dont l’anticodon lui correspond (ARNt chargé).
• Les ribosomes lient les ARNt chargés sur le site A de l’élongation si leur anticodon s’apparie avec le codon du messager à cet endroit. L’élongation transfère alors le peptide sur l’acide aminé nouveau, lui-même porté par l’ARN de transfert.
Sérine tRNA synthétase
Cystéine tRNA synthétase
•
Les aminoacide-tRNA-synthétases sont les enzymes qui chargent les acides aminés libres du cytoplasme sur les ARN de transfert correspondants. Le coenzyme ATP est hydrolysé en AMP et en pyrophosphate pour fournir l’énergie nécessaire. La liaison ester constituée entre l’acide aminé et son ARNt est riche en énergie et sera hydrolysée au cours de l’étape d’élongation de la traduction.• Les aminoacide-tRNA-synthétases ont une double spécificité très étroite pour les deux substrats : l’acide aminé reconnu (ici, la cystéine) et les ARNt dont les anticodons sont complémentaires des codons correspondant à cet acide aminé dans le code des codons correspondant à cet acide aminé dans le code génétique. L’exactitude de la traduction repose entièrement sur cette double spécificité.
• La reconnaissance de l’ARNt se fait par l’anticodon dans certains cas (l’enzyme ne tenant pas toujours compte de la première base de l’anticodon, ce qui explique la dégénérescence du code génétique) ou bien encore par d’autres séquences de l’ARNt communes aux ARNt synonymes. Certaines aminoacide-tRNA- synthétases sont régulées par phosphorylation.
Initiation de la traduction
L’initiation de la traduction est l’étape limitante de la traduction.
• Les sous-unités des ribosomes sont dissociées dans le cytoplasme. Une cascade d’évènements vont former un complexe d’initiation.
• Le facteur eIF2 (eucaryotic initiation factor 2) est porteur d’un GDP, coenzyme qu’il vient d’hydrolyser à l’étape précédente. En présence du facteur eIF2B, un nouveau GTP est substitué à ce GDP. Le facteur eIF2 ainsi activé, peut alors lier l’ARNt chargé d’une méthionine dont peut alors lier l’ARNt chargé d’une méthionine dont l’anticodon est complémentaire du codon d’initiation (AUG) du messager.
En présence du cofacteur eIF4C, la petite sous-unité va
fixer le facteur eIF3 et le facteur eIF2 activé qui porte
l’ARNt chargé de la méthionine initiale. L’énergie de la
formation de ce complexe a été fournie par l’hydrolyse de
la liaison riche en énergie du GTP porté par le facteur eIF2.
La séquence 5’ non traduite de l’ARN messager est reconnue par les cofacteurs eIF4A, eIF4B et eIF4F qui s’y fixent. Grâce à l’hydrolyse d’un ATP pour fournir l’énergie, le messager est alors transféré sur la petite sous-unité, en regard du site P, de façon à hybrider les nucléotides du codon d’initiation avec ceux de l’anticodon de l’ARNt de la méthionine initiale.
• En présence du dernier cofacteur eIF5, le complexe va se lier à une grande sous-unité pour constituer un ribosome fonctionnel. Les cofacteurs d’initiation sont libérés et la traduction commence.
Le cofacteur eIF2 toujours porteur de son GDP, se libère
pour recommencer un nouveau complexe.
Cadre de lecture
• Le positionnement du messager par rapport à l’ARN de transfert de la Méthionine initiale détermine le cadre de lecture de la traduction du messager.
• L’ARN de transfert de la méthionine occupe un des deux sites de fixation des tRNA sur le ribosome : site P (ou peptidique, car il contiendra le peptide en cours de synthèse). Le codon AUG du messager, en s’hybridant synthèse). Le codon AUG du messager, en s’hybridant dans le site P avec l’anticodon CAU de l’ARN de transfert de la méthionine, place le messager de telle sorte que le codon suivant (N1N2N3) apparaisse dans l’autre site de fixation : site A (ou acide aminé, car il servira à la fixation des nouveaux acides aminés incorporés).
• Le nucléotide N1 sera toujours le premier de chaque
codon.
Facteurs d’initiation
La formation du complexe d’initiation fait appel a de nombreux facteurs qui participent à la structure, à l’activation ou à la régulation de ce complexe.
• Parmi ces facteurs on reconnaît les deux sous-unités des ribosomes (Unité L ou 60S et unité S ou 40S), le Met-tARN initiateur, l’ARN messager et les coenzymes donneurs d’énergie ATP et GTP.
• Les cofacteurs protéiniques de cette étape sont classifiés sur ce Tableau. Certains participent à l’activation du Met-tARN initiateur Tableau. Certains participent à l’activation du Met-tARN initiateur ou à sa liaison avec la sous-unité S, d’autres à la reconnaissance de l’extrémité 5’ de l’ARN messager ou à sa liaison avec le complexe d’initiation, d’autres enfin à la liaison finale avec la sous- unité L.
• Certains de ces facteurs protéiniques et une au moins des chaînes protéiniques de la petite sous-unité sont régulées par phosphorylation ou déphosphorylation sur des Ser ou des Thr.
Elongation
Incorporation d’un acide aminé
• Un ARNt chargé vient se fixer sur le site A libre. Le codon du messager au fond du site A va se lier complémentairement avec l’anticodon de l’ARNt du nouvel acide aminé ce qui va permettre l’incorporation de cet acide aminé dans le peptide en cours de synthèse.
Transfert du peptide
Le ribosome catalyse alors le transfert du peptide situé sur l’ARNt du site P sur la fonction amine de l’acide aminé de l’ARNt du site A. Il utilise pour cela, l’énergie de l’hydrolyse de la liaison ester riche en énergie entre le peptide et l’ARNt du site P.
• L’ARNt libre du site peptidique quitte le ribosome.
• Le messager, l’ARNt restant et le peptide en cours de synthèse sont alors déplacés (translocation) du site A vers le site P, sans qu’il y ait fusion de l’hybride entre le codon et l’anticodon
Translocation des codons
Terminaison de la traduction
• Lorsque le site A se trouve en regard d’un codon non- sens annonçant la fin de la traduction, le complexe va
se dissocier du messager en présence d’un dernier cofacteur eRF.
cofacteur eRF.
• Les deux sous-unités du ribosome se dissocient, la protéine synthétisée est libérée, ainsi que le dernier
ARNt.
• L’élongation ou la terminaison de la protéine naissante font appel a de nombreux facteurs qui participent aux étapes successives de la traduction.
• Parmi ces facteurs on reconnaît les ribosomes, les aminoacyl- tARN activés, l’ARN messager et le coenzyme donneur d’énergie GTP.
Facteurs d’élongation ou de terminaison
GTP.
• Les cofacteurs protéiniques de ces étapes sont classifiés sur Tableau. Certains participent à l’activation des aminoacyl-tARN ou à leur liaison au site A du ribosome, d’autres à la trans- location du tARN porteur du peptide naissant du site A vers le site P. Le dernier facteur en-gendre la dissociation du ribosome et la libération de la protéine synthétisée.
