Le virus de la leucémie à cellules T de l ¶ homme (HTLV-1, human T-cell leukaemia

INTRODUCTION

I. Le virus HTLV-1 1) Description générale

Le virus de la leucémie à cellules T de l ¶ homme (HTLV-1, human T-cell leukaemia

virus) est un rétrovirus complexe de la famille des deltaretrovirus. C ¶ est le premier rétrovirus

humain isolé séparément en 1980 et 1981 par des équipes américaine et japonaise. Ce virus

est l ¶ agent étiologique de la leucémie à cellules T de l ¶ homme (ATL), une leucémie des

cellules T CD4

matures, hôtes du virus. L¶infection par HTLV-1 induit également des

manifestations inflammatoires incluant un désordre neurodégénératif appelé myélopathie

associée à HTLV-1 (HAM) ou paraparésie spastique tropicale (TSP). Aujourd ¶ hui, 10 à 20

millions d ¶ individus au monde sont infectés par HTLV-1. Ce virus est endémique au Japon,

en Afrique centrale, dans les Caraïbes et en Amérique du Sud. La leucémie à cellules T de

l ¶ homme ne se développe que chez des individus infectés par HTLV-1 et toutes les cellules

leucémiques issues de ces individus contiennent un provirus intégré, impliquant ce virus

comme agent causal de la leucogénèse. Néanmoins, seul 5 à 10% des individus infectés

développent une leucémie à cellules T de l ¶ homme et ce après une période asymptomatique

de plusieurs décennies. Cette leucémie est aigue et une fois déclarée, le temps de survie

moyen des patients est de moins d ¶ une année. Aucun traitement efficace n ¶ est actuellement

disponible. La transmission du virus se fait principalement par l ¶ allaitement maternel, les

rapports sexuels et les transfusions sanguines. Deux autres virus apparentés ont été mis en

évidence : HTLV-2 et HTLV-3. Le premier a été isolé dans un cas de leucémie à cellules

chevelues mais n ¶ a jamais été clairement associé au développement de désordres

lymphoprolifératifs. Le deuxième a été récemment isolé et la séquence nucléotidique de son

génome indique qu ¶ il est plus proche d ¶ HTLV-1 que d ¶ HTLV-2. Néanmoins, peu

d ¶ informations sont actuellement disponibles sur les pathologies associées à ce virus

.

2) Cycle de vie d ¶ un rétrovirus

La particule virale (Figure 1) est enveloppée et sphérique avec un diamètre de 110 à 140 nm. L ¶ enveloppe virale est issue, lors du bourgeonnement du virus, de la membrane plasmique de la cellule hôte dans laquelle sont insérées les glycoprotéines de surface et transmembranaire. Le centre du virion est constitué d ¶ une nucléocapside icosaédrique (polyèdre régulier à 20 faces triangulaires et 12 sommets) qui contient le génome viral constitué de deux molécules d¶ARN simple brin de polarité positive d¶environ 9 kb, la transcriptase inverse, l ¶ integrase et la protéase.

Figure 1 : Structure d¶une particule virale du virus HTLV-1 (adapté de Maniez-Montreuil, 1989)

La première étape du cycle de vie du rétrovirus inclut l ¶ entrée du virus dans la cellule, la

rétrotranscription de l ¶ ARN génomique en ADN complémentaire double brin, la migration de

cet ADN dans le noyau et enfin, l ¶ intégration de cet ADN dans le génome de la cellule pour

former un provirus stable. L ¶ intégration virale se fait préférentiellement dans des gènes, des

sites de début de transcription et dans des ilots CpG

. La seconde étape du cycle viral

utilise les machineries cellulaires de transcription et de traduction pour permettre l ¶ expression des gènes viraux. Ces processus sont régulés par les protéines Tax et Rex codées par le virus.

Enfin, les protéines de structure du virus et son génome sont assemblés à la membrane plasmique pour le bourgeonnement des nouvelles particules virales

.

La transmission de HTLV-1 se fait par contact de cellules à cellules. Lorsqu ¶ une cellule infectée entre en contact avec une cellule non infectée, le centre d ¶ organisation des microtubules (MTOC) est polarisé à la jonction cellulaire et une synapse virale se forme à l ¶ interface entre les cellules. Ensuite, les protéines de structure et l ¶ ARN génomique viral s ¶ accumulent au niveau de cette synapse et passent dans la cellule non infectée. La molécule d ¶ adhésion intercellulaire (ICAM-1) et l ¶ antigène associé à la fonction des lymphocytes (LFA-1) sont importants pour la formation de cette synapse et donc l¶infection par HTLV-1.

Comme LFA-1 est exprimée dans les lymphocytes T, ce mécanisme est en accord avec une infection de ces lymphocytes par HTLV-1 in vivo. D¶autre part, la protéine de transport du glucose (GLUT-1) et le protéoglycan à chaîne héparane sulfate (HSPG) ont été impliqués dans le transfert de cellules à cellules du virus HTLV-1 ainsi que pour la liaison avec la protéine d ¶ enveloppe virale, permettant l ¶ entrée du virion. Néanmoins, les mécanismes impliqués dans la fonction de ces récepteurs ne sont pas encore connus

.

3) Le génome d ¶ HTLV-1

La forme intégrée du génome du virus HTLV-1 ou provirus (Figure 2) contient les

gènes gag, pol, pro et env qui codent pour les protéines virales enzymatiques et de structure,

communes aux rétrovirus. Il est flanqué aux extrémités par les longues répétitions terminales

ou LTR qui sont créées lors de la rétrotranscription du génome d ¶ ARN en ADN

complémentaire. Le LTR 5 ¶ contient le promoteur viral tandis que le LTR 3 ¶ contient le site

de terminaison de la transcription ainsi qu ¶ un promoteur permettant l ¶ expression d ¶ un gène

récemment identifié (HBZ) sur la fibre anti-sens. La région pX, localisée entre le gène env et

le LTR 3 ¶ , code pour plusieurs protéines régulatrices virales (Tax, Rex, p21, p12, p13 et p30).

Figure 2 : Représentation schématique de la structure du génome de HTLV-1 et des ARN messagers correspondants. (Adapté de Matsuoka, 2007) Carte du génome du provirus HTLV-1 ainsi que des ARN messagers correspondants avec les sites d¶épissage.

Le gène gag code pour un précurseur qui est clivé par la protéase virale pour former les protéines de structure du virus : la matrice (MA, p19), la capside (CA, p24) et la nucléocapside (NC, p15). Le gène env code pour un précurseur glycosylé qui, après clivage, génère les glycoprotéines de surface et transmembranaire. Le gène pol code pour les protéines enzymatiques du virus, la transcriptase inverse, l ¶ intégrase et la protéase. Ces différentes protéines sont traduites à partir d ¶ ARN messagers viraux non épissés (gag, pol) ou simplement épissés (env).

La région pX contient 4 cadres ouverts de lectures (ORF I à IV) qui codent pour 6

protéines régulatrices grâce à un système d ¶ épissage alternatif des transcrits primaires et de

multiples sites d ¶ initiation de la traduction. Parmi ces protéines régulatrices, la protéine Tax

est un facteur de transcription pléiotrope qui joue un rôle majeur dans la régulation de

l ¶ expression des gènes viraux et dans l ¶ induction de la transformation lors de l ¶ infection par

HTLV-1. Ce point sera développé dans le paragraphe II. La protéine Rex est une

phosphoprotéine de 27 kDa qui est localisée dans le nucléole et le nucléoplasme. Elle est

impliquée dans l ¶ export sélectif des ARN messagers viraux non épissés ou incomplètement

épissés du noyau vers le cytoplasme, permettant ainsi l ¶ expression des protéines virales

enzymatiques et de structure. Elle joue donc un rôle essentiel de régulateur post- transcriptionnel. La fonction de Rex est contrôlée par un domaine de liaison à l ¶ ARN riche en arginine dans sa partie amino-terminale, qui se superpose à un signal de localisation nucléaire et un domaine d ¶ activation riche en leucine qui comporte un signal d ¶ export nucléaire. Rex interagit par son domaine amino-terminal avec l ¶ élément de réponse à Rex localisé à l ¶ extrémité 3 ¶ des ARN messagers viraux et via son domaine d ¶ activation avec le facteur cellulaire d¶export nucléaire CRM-1

.

Les protéines p30

, p12

, p13

contribuent également à l ¶ établissement de l ¶ infection persistante in vivo. La protéine p12 est présente dans le réticulum endoplasmique et le Golgi et elle interagit avec la calreticuline et la calnexine. Elle augmente la quantité de calcium cytoplasmique conduisant à l¶activation des facteurs de transcription de la famille NFAT, influençant ainsi la prolifération et la différentiation des lymphocytes T

. Les fonctions de la protéine p13, qui est localisée dans la mitochondrie, ne sont pas claires à présent. Enfin, la protéine p30

est présente dans le nucléole. Cette protéine a été impliquée dans l ¶ inhibition de l ¶ expression des ARN messagers codant pour Tax et Rex. Deux mécanismes ont été proposés pour cette inhibition : l ¶ un implique l ¶ interaction de p30

avec la jonction d ¶ épissage de l ¶ ARN messager codant pour les protéines Tax et Rex, induisant sa rétention dans le noyau et l ¶ autre implique l ¶ interaction de p30

avec les complexes formés par Rex et CRM-1, induisant leur rétention dans le nucléole

.

Récemment, un cadre ouvert de lecture a été mis en évidence sur le brin anti-sens du génome d ¶ HTLV-1. Ce cadre ouvert de lecture est transcrit en ARN messager grâce à un promoteur fonctionnel présent dans le LTR 3 ¶ du génome d ¶ HTLV-1 et code pour la protéine HBZ (facteur bZIP d ¶ HTLV-1) qui contient un domaine d ¶ activation de la transcription dans sa partie amino-terminale et un domaine leucine zipper dans sa partie carboxy-terminale.

Cette protéine compète avec Tax pour l ¶ interaction avec CREB et induit ainsi une inhibition

de l ¶ expression des gènes viraux. D ¶ autre part, il semblerait que l ¶ ARN messager de HBZ

puisse stimuler l ¶ expression du facteur E2F1, contribuant à la prolifération cellulaire, mais les

données à ce sujet sont encore fort controversées

.

II. La protéine Tax

Tax est un facteur de transcription pléiotrope qui active l ¶ expression des gènes viraux à partir du LTR 5 ¶ ainsi qu ¶ un ensemble de gènes cellulaires impliqués dans la prolifération et la différentiation des lymphocytes T. Cette activité transcriptionnelle résulte de la capacité de Tax d ¶ activer diverses voies d ¶ activation cellulaires incluant la voie des facteurs de transcription ATF/CREB (activating transcription factor/cAMP response element binding protein), NF-κB (Nuclear factor κB) et SRF (serum response factor). Outre les voies d¶activation transcriptionnelle, la protéine Tax affecte de multiples processus biologiques contrôlant la progression du cycle cellulaire, l ¶ activité de suppresseurs de tumeurs et l ¶ efficacité des systèmes de réparations de l ¶ ADN.

L ¶ hypothèse que Tax joue un rôle primordial dans les premières étapes qui mènent à la

transformation des lymphocytes T et au développement de la leucémie à cellules T de

l ¶ homme lors de l ¶ infection par HTLV-1 résulte des observations suivantes. L ¶ expression

dans des lymphocytes T humains primaires de la région pX du génome de HTLV-1, qui code

pour l ¶ ensemble des protéines régulatrices virales parmi lesquelles Tax, détermine

l ¶ immortalisation de ces lymphocytes

. L ¶ immortalisation des lymphocytes T primaires est

également obtenue suite à la transfection d ¶ un provirus HTLV-1 cloné. Cependant, des

provirus fonctionnels présentant des gènes tax mutés incapables d ¶ activer l ¶ expression de

gènes cellulaires par la voie des facteurs NF-κB sont défectifs pour l¶immortalisation des

lymphocytes T

. Tax coopère également avec le proto-oncogène Ras pour transformer des

fibroblastes de rat

. L ¶ ensemble de ces travaux indique que l ¶ activation par Tax de

l¶expression de gènes cellulaires par la voie NF-κB est une des fonctions critiques de Tax

pour permettre la transformation cellulaire

. Enfin, l¶expression de la protéine Tax

détermine le développement de tumeurs dans des souris transgéniques

. En particulier, des

souris transgéniques exprimant le gène tax sous le contrôle du promoteur du granzyme B

permettant son expression dans les cellules NK développent un type particulier de leucémie

(LGL : large granulocytic leukemia)

.

Le processus oncogénique induit par le virus HTLV-1 (Figure 3) s ¶ effectue en plusieurs étapes.

Figure 3 : Schéma des différentes étapes conduisant au développement de l¶ATL. (Adapté de Mesnard, 2006). La transmission du virus se fait de cellules à cellules et l¶accroissement du nombre de cellules infectées est dû une prolifération clonale de ces cellules infectées. Les cellules exprimant de haut taux de la protéine Tax sont la cible d¶une réponse immune intense, conduisant à la sélection de cellules exprimant peu de Tax. Celles-ci subissent des altérations génétiques et épigénétiques conduisant finalement à l¶ATL.

Chez les patients infectés, la prolifération clonale des cellules infectées assure

l ¶ accroissement du nombre de cellules infectées plutôt que la propagation du virus de cellule à

cellule. Au cours de la longue période asymptomatique qui suit l ¶ infection, les capacités de

Tax d ¶ activer la prolifération des cellules T, d ¶ interférer avec la réparation de l ¶ ADN et

d ¶ empêcher l ¶ arrêt du cycle cellulaire (Figure 4) induisent des altérations génétiques et

épigénétiques menant à une réplication cellulaire incontrôlée. Il faut cependant noter que la

présence d¶ARN messager exprimant Tax n¶est détectée que dans 40% des cas d¶ATL,

indiquant que Tax n ¶ est pas nécessaire pour le maintien du phénotype transformé. L ¶ analyse

des provirus et des transcripts de Tax dans les cellules ATL indique que la perte de

l ¶ expression de Tax résulte de l ¶ accumulation de mutations non-sens dans le gène tax, de

délétions du LTR 5 ¶ ou encore de l ¶ hyperméthylation du provirus. Il faut aussi noter que les

cellules exprimant Tax sont les cibles d ¶ une réponse immunitaire intense menant à la sélection

des cellules exprimant peu ou pas la protéine Tax.

Figure 3 : Schéma des différentes fonctions de Tax dans la transformation.

Tax semble donc nécessaire pour l ¶ initiation de la transformation mais pas pour le maintien du phénotype transformé. Dans le processus de transformation, on distingue deux stades, l ¶ immortalisation qui mène à la prolifération dépendante de l ¶ interleukine-2 (IL-2) des lymphocytes T infectés et la transformation où la prolifération des cellules devient indépendante de l ¶ IL-2.

1) Rôle de Tax dans l¶activation de l¶expression des gènes du virus HTLV-1

La protéine Tax active l'expression de l ¶ ensemble des gènes du virus HTLV-1 en

recrutant des facteurs de transcription cellulaires appartenant à la famille ATF/CREB au

niveau du promoteur viral dans le LTR 5 ¶ (Figure 5). Le promoteur viral contient trois

répétitions imparfaites de 21 pb dans la région U3 du LTR, appelées éléments de réponse à

Tax (TRE). Ce sont des éléments enhancer agissant en cis requis pour l ¶ activation par Tax de

ce promoteur. Chacune de ces répétitions contient un domaine central présentant des

homologies de séquence avec l ¶ élément de réponse à l ¶ AMP cyclique (CRE) flanqué de

courtes séquences riches en guanine et cytosine. Des analyses de gel retard indiquent que Tax interagit avec les facteurs de la famille ATF/CREB pour augmenter leur affinité de liaison aux éléments enhancer TRE. Dans ce complexe, Tax interagit par son extrémité N-terminale avec le domaine leucine zipper commun aux facteurs ATF/CREB et contacte le sillon mineur de l ¶ ADN au niveau des séquences riches en guanine et cytosine permettant la stabilisation du complexe formé

. La formation du complexe Tax/CREB sur le promoteur sert alors de site de haute affinité pour le recrutement des co-activateurs transcriptionnels CBP, p300 et P/CAF.

Le recrutement de p300 et CBP par le complexe Tax/CREB nécessite la phosphorylation de CREB sur la sérine 133

et l ¶ interaction de Tax avec 3 domaines distincts des co- activateurs CBP/p300 : le domaine CH-1, KIX et SRC-1

. Différents domaines de Tax ont également été caractérisés pour leur interaction avec les co-activateurs CBP et p300.

Ainsi, un domaine amino-terminal de Tax, caractérisé par la mutation K88A, médie l¶interaction avec CBP

tandis que la région carboxy-terminale de Tax, caractérisée par la mutation M47 (L319A, L320S) a été montré nécessaire pour la liaison à P/CAF

. Cette région a également été impliquée dans l ¶ interaction avec CBP. De plus, la région centrale caractérisée par la mutation M148 (G148V) a été impliquée dans l ¶ interaction avec p300

.

Figure 4 : Schéma du complexe présent sur le promoteur viral. (Adapté de Kashanchi, 2005). La protéine Tax interagit avec le domaine bZIP des facteurs de la famille ATF/CREB au niveau de l¶élément de réponse à Tax (TRE) présent dans le promoteur viral. Ce complexe permet le recrutement des co-facteurs CBP et p300, qui acétylent les histones et se lient aux facteurs généraux de la transcription, conduisant à l¶activation de

l¶expression des gènes viraux.

D ¶ autre part, l ¶ activité du promoteur HTLV-1 intégré dans la chromatine est fortement

stimulée par la surexpression de p300 ou de CBP mais pas de P/CAF. Les activités

acétyltransférases des co-activateurs p300 et CBP, mais pas celle de P/CAF, sont donc

requises pour l ¶ activation de l ¶ expression des gènes viraux par Tax

. Plusieurs études utilisant un modèle de chromatine reconstituée ont permis de montrer que les activités acétyltransférases de p300 et CBP facilitent la transcription à partir du promoteur viral en présence de Tax et CREB. La protéine p300 acétyle les histones des nucléosomes localisés dans le promoteur et cette acétylation est accompagnée d ¶ une augmentation de la liaison du facteur de transcription TFIID et de l ¶ ARN polymérase II

. De plus, des expériences d ¶ immunoprécipitation de la chromatine (ChiP) sur des cellules transformées par HTLV-1 ont permis de montrer que les protéines p300 et CBP, ainsi que des facteurs de transcription de la famille ATF/CREB et le composant TAF

250 du complexe TFIID, sont associés au LTR d ¶ HTLV-1 in vivo

. Il est intéressant de noter que les co-activateurs CBP et p300 sont également capables d ¶ acétyler des facteurs de transcription mais ce rôle n ¶ a encore jamais été décrit dans l ¶ activation de la transcription à partir du promoteur viral par Tax.

Les composants du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF semblent également importants pour l ¶ activation de la transcription des gènes viraux par Tax. Tax interagit avec différents composants de ce complexe et l ¶ activation du promoteur viral est inhibée en présence de petits ARN interférants (siRNA) empêchant l ¶ expression de la sous- unité BRG-1 de ce complexe dans des cellules transformées par HTLV-1

. Une étude plus récente montre que les sous-unités BRG1 et Brm du complexe SWI/SNF sont présentes sur le promoteur viral en l ¶ absence de la protéine Tax. Lorsque Tax est exprimé, ces deux sous- unités sont déplacées avec le nucléosome associé au promoteur. Tax induit alors un fort recrutement de l ¶ ARN polymérase II au niveau du promoteur

. Enfin, les promoteurs viraux silencieux sont associés à l ¶ histone déacétylase 1 (HDAC1). Une étape préalable dans l ¶ activation du promoteur viral requererait l ¶ interaction directe de Tax avec HDAC1

.

2) Rôle de Tax dans la transformation cellulaire

a) Tax active de manière constitutive la voie des facteurs NF-κB

La voie des facteurs de transcription de la famille NF-κB est impliquée dans la réponse inflammatoire, dans diverses réponses au stress et elle participe à l ¶ activation antigénique des lymphocytes B et T. Les 5 membres de la famille NF-κB chez les mammifères, p65 ou RelA, RelB, p50/p105 (NF-κB1) et p52/p100 existent sous forme d ¶ homo- ou d ¶ hétérodimères.

Dans les cellules de mammifères, le complexe le plus ubiquitaire est l ¶ hétérodimère

RelA/p50. Ces protéines sont caractérisées par un domaine d ¶ homologie Rel conservé dans leur partie amino-terminale qui est responsable de la dimérisation et de la liaison à l ¶ ADN.

Dans les cellules au repos, ces protéines sont liées aux protéines inhibitrices de κB (IκB).

Cette interaction masque le signal de localisation nucléaire des facteurs NF-κB et est responsable de leur séquestration dans le cytoplasme. L ¶ activation de cette voie par de nombreux stimuli requiert l ¶ activation du complexe des kinases de IκB ou IKK. Ce complexe est constitué de deux sous-unités catalytiques IKKα et IKKβ et d ¶ une sous-unité régulatrice IKKγ, aussi appelée NEMO

.

L ¶ activation de ce complexe (Figure 6) implique la polyubiquitination de la sous-unité IKKγ avec branchement sur la lysine K63 de l ¶ ubiquitine (branchement en K63). La modification des protéines par ubiquitination est détaillée au paragraphe III. Cette modification constitue un site de liaison pour d ¶ autres molécules requises pour l ¶ activation des kinases IKKα et IKKβ. Plusieurs ubiquitine E3 ligases peuvent ubiquitiner différentes lysines de IKKγ en fonction de la voie d ¶ activation impliquée. Par exemple, l ¶ activation du récepteur de cellules T (TCR) résulte en la polyubiquitination de IKKγ sur la lysine 399 par le facteur 6 associé au récepteur TNF (TRAF-6). Ce facteur ainsi que les facteurs de la même famille, TRAF-2 et TRAF-5, induisent la polyubiquitination de IKKγ en réponse au facteur nécrosant des tumeurs (TNFα) et à la voie de signalisation liée au récepteur de l ¶ IL-1. Lors de cette activation, les facteurs TRAF-2 et TRAF-6 s ¶ auto-polyubiquitinent et induisent la polyubiquitination de la kinase RIP-1 (receptor interacting protein 1) avec branchement en K63. Ces polyubiquitinations permettent l ¶ oligomérisation des facteurs du complexe IKK et le recrutement de diverses kinases capables d ¶ activer ce complexe. La kinase activée par le TGF-β (TAK-1), impliquée dans l¶activation de la voie NF-κB en réponse à la liaison des récepteurs du TNF, de l ¶ IL-1, de cellules T (TCR) ou de Toll (TLR), est la mieux caractérisée.

Cette kinase est associée aux protéines adaptatrices TAB2 et TAB3 qui lient les chaînes

polyubiquitines branchées en K63. TAK-1 est dès lors recruté grâce à TAB2 et TAB3 dans les

complexes IKK suite à la polyubiquitination de IKKγ par TRAF2 et peut activer la kinase

IKKβ par phosphorylation sur les sérines activatrice en position 177 et 181. Le complexe IKK

actif est alors compétent pour la phosphorylation de IκB et l ¶ induction de la voie NF-κB.

Figure 5 : Schéma des événements cytoplasmiques conduisant à la translocation du facteur NF-κB dans le noyau. (Adapté de Haglund, 2005). Lors de l¶activation cellulaire par différents stimuli, une cascade

d¶ubiquitination et de phosphorylation conduisent à l¶activation du complexe de kinases IKK. La kinase IKKβ phosphoryle l¶inhibiteur IκB conduisant à son ubiquitination et sa dégradation par le protéasome, libérant ainsi les facteurs NF-κB qui migrent dans le noyau.

La kinase IKKβ phosphoryle l ¶ inhibiteur IκBα sur les sérines 32 et 36, créant un

domaine de liaison au complexe ubiquitine E3 ligase SCF-βTrCP. Ce complexe

polyubiquitine alors IκBα sur les lysines 21 et 22 avec branchement sur la lysine K48 de

l ¶ ubiquitine. Cette polyubiquitination conduit à la dégradation de IκBα par le protéasome,

permettant la translocation de p50/RelA dans le noyau. En réponse au TNF, l ¶ association de

IKKβ avec IKKγ et sa phosphorylation sur les sérines activatrices 177 et 181 est suivie de sa

monoubiquitination. Cette modification est importante pour l ¶ activation de IKKβ

.

L ¶ activation de l ¶ expression de gènes cellulaires spécifiques suite à l ¶ activation de la voie NF-

κB en réponse à de multiples signaux d ¶ activation requiert non seulement des événements

cytoplasmiques menant à la migration de la sous-unité RelA du facteur NF-κB vers le noyau

mais elle requiert aussi de multiples modifications post-traductionnelles de la sous-unité RelA

elle-même. Ainsi, la phosphorylation de RelA par IKKβ sur la sérine 276 augmente son

affinité pour les co-activateurs CBP/p300. Cette interaction permet l ¶ acétylation de RelA sur les lysines 218, 221 et 310 et l ¶ accroissement de son affinité pour l ¶ ADN.

Dans les cellules non transformées, l ¶ activation de la voie NF-κB est un processus transitoire. Plusieurs systèmes de contrôle régulent la terminaison de cette activation (Figure 7). Tout d¶abord, l¶expression de l¶inhibiteur IκBα est contrôlée par un promoteur présentant un élément enhancer d¶interaction avec le complexe p50/RelA, permettant l¶expression de IκBα lorsque la voie NF-κB est activée. D ¶ autre part, IκBα peut être sumoylé sur les lysines 21 et 22, et cette modification entre en compétition avec l ¶ ubiquitination de ces mêmes résidus lysine (pour plus de détails sur la modification des protéines par sumoylation, cf.

paragraphe III). Cette sumoylation est inhibée par la phosphorylation sur les sérines 32 et 36, contrairement à l ¶ ubiquitination qui est favorisée par celle-ci. La sumoylation de IκBα participe à la terminaison de la réponse en permettant à IκBα de migrer vers le noyau où il interagit avec les complexes NF-κB

. Cette succession d ¶ événements rétablit le pool des complexes p50/RelA séquestrés par IκBα dans le cytoplasme.

Figure 6 : Evénements conduisant à la terminaison de l¶activation de voie NF-κB. L¶activation de la voie

NF-κB est un processus transitoire qui est régulé par différents mécanismes. L¶inhibiteur IκBα est sumoylé et

interagit avec les complexes RelA/p50 présents sur les promoteurs pour induire leur relocalisation et leur

séquestration dans le cytoplasme. D¶autre part, les protéines TRAF-2, TRAF-6 et IKKγ sont désubuquitinées par

l¶enzyme CYLD tandis que la protéine RIP-1 est désubiquitinée par l¶enzyme A20 et ubiquitiné avec des

branchements en K48 par Itch. L¶activité des enzymes A20 et Itch est régulé par leur association avec la

protéine Tax-BP1.

En plus de ce contrôle lié à l ¶ expression et à la sumoylation de IκBα, deux enzymes de déubiquitination A20 et CYLD bloquent l ¶ activation de la voie NF-κB en hydrolysant les chaînes d ¶ ubiquitine branchée en K63 des protéines contrôlant l ¶ activation de la voie NF- κB

. L ¶ expression de ces deux enzymes est contrôlée, tout comme celle de IκBα, par des séquences enhancer κB présentes dans leur promoteur. A20 cible les chaînes de polyubiquitine de RIP-1 et CYLD, celles de TRAF-2, TRAF-6 et IKKγ. De plus, le complexe cytoplasmique contenant l ¶ enzyme A20 inclut une E3-ubiquitine ligase, Itch, qui polyubiquitine RIP-1 avec des branchements sur la lysine K48 induisant sa dégradation par le protéasome

. Il est intéressant de constater que A20 et Itch sont ciblés sur RIP-1 par une protéine adaptatrice TAX1BP1 (Tax-1 binding protein 1), une protéine initialement identifiée comme un partenaire de la protéine Tax du virus HTLV-1

.

Dans les cellules transformées par HTLV-1, la voie NF-κB est activée de manière

constitutive comme c ¶ est le cas dans de nombreuses cellules transformées. La protéine Tax

joue un rôle critique dans cette activation constitutive en agissant à deux niveaux : la

stimulation de la dégradation de l ¶ inhibiteur IκBα et le blocage des mécanismes de

terminaison (Figure 8). Tax interagit directement avec IKKγ via son domaine central et cette

interaction permet le recrutement des sous-unités catalytiques IKKα et IKKβ

, la

phosphorylation et l¶ubiquitination consécutive de IκBα, sa dégradation par le protéasome et

la présence de la sous-unité RelA active dans le noyau de toutes les cellules infectées par

HTLV-1 ou exprimant seulement la protéine Tax

. L ¶ activation de la voie NF-κB par Tax

nécessite la kinase TAK-1 et la protéine adaptatrice TAB2. Tax augmente l ¶ activité de la

kinase TAK-1 et sert d ¶ adaptateur entre TAK-1 et IKKγ

. Mais, cette activation ne nécessite

pas les protéines RIP-1, TRAF-2 et TRAF-6

. La protéine Tax induit la polyubiquitination

de IKKγ avec branchement en K63 mais cette modification ne semble pas intervenir dans

l ¶ activation de la voie NF-κB par Tax

. Tax induit également la monoubiquitination de la

sous-unité IKKβ

.

Figure 7 : Effets de Tax conduisant à l¶activation constitutive de la voie NF-κB. La protéine Tax induit l¶activation de la voie NF-κB en interagissant avec la sous-unité IKKγ du complexe IKK et avec la kinase TAK- 1. De plus, Tax inhibe le complexe Itch/A20/Tax-BP-1.

L ¶ activation constitutive de la voie NF-κB dans les cellules exprimant la protéine Tax

ne peut être uniquement expliquée par l ¶ activation des kinases IKK, la dégradation de IκBα et

la translocation de RelA dans le noyau. En effet, la conséquence directe de ces deux

événements est l ¶ activation de l ¶ expression des protéines responsables de la terminaison de

l ¶ activation de cette voie. En effet, la protéine Tax est également capable d ¶ inhiber la fonction

de ces protéines. Par exemple, la protéine Tax empêche la formation des complexes formés

par A20-Itch et TAX1BP1, inhibant ainsi l ¶ effet de régulateur négatif de ce complexe

.

b) Perturbations de la progression du cycle cellulaire par Tax

Le déclenchement, le contrôle et la succession harmonieuse des différentes phases du cycle cellulaire sont régulés par la formation et l ¶ activation séquentielle de complexes protéiques constitués chacun d ¶ une kinase de la famille des CDK (cyclin dependent kinase) et d ¶ une sous-unité régulatrice appartenant à la famille des cyclines (Figure 9). Des complexes CDK/cyclines spécifiques régulent chaque phase du cycle cellulaire.

Figure 8 : Complexes CDK/cyclines et CDKI impliqués dans la régulation du cycle cellulaire.

(Adapté de Meijer, 2003). La progression du cycle cellulaire est régulée par la formation de complexes CDK (cyclin-dependant kinase) et cycline spécifiques à chaque phase du cycle, ainsi que par les inhibiteurs de la famille INK4 ou p21 et p27.

Les CDK sont exprimées de manière constitutive tandis que les cyclines sont exprimées de manière périodique au cours du cycle cellulaire. L ¶ activation des CDK dépend de leur liaison à une cycline ainsi que d ¶ une phosphorylation activatrice sur des résidus thréonine.

Ainsi, les cyclines D et E interviennent lors du passage de la phase G

à la phase S ; la cycline A s¶accumule et est active pendant la phase S et les cyclines B sont actives pendant la mitose.

A certaines étapes critiques du cycle (G

/S, G

/M et M), des inhibiteurs des CDK (CDKI)

peuvent bloquer le cycle cellulaire. Le cycle cellulaire est donc régulé par plusieurs

processus : la formation des complexes CDK/cycline, la séquestration des CDK par les CDKI,

la phosphorylation et la déphosphorylation des CDK et la stabilité des complexes

CDK/cycline.

La protéine Tax accélère la progression de la phase G

à la phase S en intervenant dans plusieurs mécanismes (Figure 10).

Figure 9 : Effets de Tax sur la progression des phases G

et S. (Adapté de Meijer, 2003). La protéine Tax interagit et active le complexe CDK4/Cycline D et empêche l¶action des inhibiteurs de la famille INK4 et de p21. Ces effets conduisent à l¶accélération de la progression de la phase G

et du passage à la phase S.

Premièrement, Tax interagit directement via son domaine N-terminal avec CDK4 et

CDK6. Tax stabilise et active les complexes CDK4/Cycline D

. De plus, Tax induit la

phosphorylation de la cycline D3

. Deuxièmement, Tax active l ¶ expression de la protéine

p21

impliquée dans le transport des complexes CDK4/cycline D vers le noyau et dans leur

stabilisation. De plus, l ¶ effet inhibiteur de la protéine p21

sur les complexes CDK4/cycline

D est contrecarré par la présence de Tax dans ces complexes. Troisièmement, la protéine Tax

interagit directement via son extrémité C-terminale avec la protéine Rb hypophosphorylée et

par son extrémité N-terminale avec le protéasome. Cette double interaction permet la

dégradation directe de la protéine Rb. L ¶ interaction de Tax avec CDK4 ou le protéasome

s ¶ effectue à différents moments du cycle cellulaire : Tax est principalement associé au

protéasome en début de phase G

et est associé à CDK4 du milieu de la phase G

au milieu de

la phase S

. Ces effets conjugués conduisent à la phosphorylation et la dégradation de la

protéine Rb, libérant ainsi les facteurs de transcription de la famille E2F et permettant

l ¶ activation des gènes impliqués dans la réplication de l ¶ ADN. Quatrièmement, Tax interagit

directement avec les motifs ankyrines des protéines inhibitrices de CDK, p16INK4A et

p15INK4B, empêchant ainsi leurs effets inhibiteurs sur CDK4. En outre, Tax réprime l ¶ expression de p18INK4C via un élément E-box présent dans le promoteur de ce gène

.

Au niveau de la phase S, les complexes CDK2/cycline A limitent la réplication de l ¶ ADN à un seul cycle par la phosphorylation de composants du complexe de pré-réplication.

Tax réprime l ¶ expression de la cycline A, ce qui contribue à l ¶ aneuploïdie observée dans les cellules infectées par HTLV-1

.

La phase de mitose (M) est divisée en 5 étapes successives conduisant à la séparation effective du matériel génétique répliqué entre les cellules filles. La protéine Tax induit un blocage de la progression et de l ¶ accomplissement de la mitose ou de la cytokinèse. Les étapes de la transition entre la métaphase et l ¶ anaphase sont décrites dans la figure 11.

Figure 10 : Description du rôle de Mad2 et du complexe APC/C lors du passage à l¶anaphase.

(Adapté de Meijer, 2003). La protéine Mad2 séquestre la sous-unité régulatrice Cdc20 du complexe promouvant l¶anaphase APC/C tant que les kinétochores ne sont pas correctement attachés au fuseau. Cette séquestration inhibe l¶activité ubiquitine-ligase du complexe APC/C.

Au stade de la métaphase, les chromatides restent associées grâce à des complexes

protéiques appelés cohésines. Une caspase, la séparase, qui est maintenue sous une forme

inactive par association avec la sécurine, détruit les cohésines lorsqu ¶ elle est activée et permet

ainsi la séparation des chromatides et l ¶ accomplissement de l ¶ anaphase. L ¶ activation de la

séparase implique l ¶ ubiquitination de la sécurine par le complexe de stimulation de

l ¶ anaphase/cyclosome (APC/C : anaphase promoting complex/cyclosome) et sa dégradation par le protéasome. APC/C est un complexe de protéines possédant une activité ubiquitine E3 ligase qui nécessite la sous-unité adaptatrice Cdc20. Cette activité est contrôlée par séquestration de la sous-unité Cdc20 par la protéine Mad2, associée, en complexe avec Mad1, au système de contrôle de l ¶ assemblage du fuseau. Cette séquestration prend fin lorsque tous les kinétochores sont attachés aux microtubules du fuseau. Lors de cette étape, le complexe APC/C induit également l ¶ ubiquitination dégradative de la cycline B. L ¶ inactivation consécutive de CDK1 détermine la formation d ¶ une nouvelle enveloppe nucléaire, la disparition du fuseau, le déclenchement de la cytokinèse et la transition vers la phase G

. L ¶ association de APC/C à la sous-unité régulatrice Cdh1, au lieu de Cdc20, cible l ¶ activité ubiquitine E3 ligase de APC/C sur Skp2, une sous-unité d ¶ une autre complexes ubiquitine E3 ligase impliqué dans la dégradation des inhibiteurs de CDK, p21

et p27

.

Tax perturbe les mécanismes qui contrôlent la division cellulaire et ces effets déterminent la formation de cellules géantes multi-nucléées et l ¶ apparition de micro-noyaux formés par la condensation de fragments de chromosomes ou de chromosomes entiers. Cette dernière propriété nécessite l ¶ extrémité C-terminale de Tax. L ¶ apparition de cellules multi- nucléées suite à l ¶ expression de novo de la protéine Tax a été étudiée dans plusieurs systèmes cellulaires différents y compris dans des lymphocytes T

. De plus, lors de l ¶ infection de lymphocytes T CD4

ou CD8

par co-culture avec des cellules infectées par HTLV-1 issues de patients atteints de TSP/HAM, la formation de cellules multi-nucléées est significativement plus importante dans les lymphocytes T CD4

, ceux-là mêmes qui sont la cible de la transformation

. L ¶ apparition de ces cellules multi-nucléées peut être attribuée à un blocage dans la progression et l ¶ accomplissement de la mitose ou à une inhibition de la cytokinèse. L¶expression de la protéine Tax induit une activation prématurée du complexe APC/C lors de la phase S (Figure 12) conduisant à la dégradation prématurée de la sécurine, de la cycline B1 et de la cycline A. La protéine Tax se lie directement aux sous-unités régulatrices Cdc20 et Cdh1 du complexe APC/C

. Cette dégradation de la cycline B1 conduit à l ¶ inactivation de CDK1 et donc à la formation d ¶ une nouvelle enveloppe nucléaire.

Par contre, le déroulement de la cytokinèse nécessite d ¶ autres protéines comme les kinases AuroraB et Plk1 (Polo like kinase) en plus de l¶inactivation de Cdk1 et aucunes données sur les effets de Tax sur ces protéines ne sont actuellement disponibles.

Un autre effet de Tax sur le déroulement de la mitose est l ¶ inhibition de la protéine

Mad1 par sa translocation dans le cytoplasme. Cette inhibition permet le passage de la

métaphase à l ¶ anaphase sans le contrôle d ¶ un attachement correct des kinétochores, induisant l ¶ aneuploïdie observée dans les cellules exprimant Tax. En effet, les cellules transformées par HTLV-1 sont résistantes à l ¶ arrêt en métaphase induit par le nocodazole, une drogue qui déstabilise les microtubules

.

Figure 11 : Effets de Tax sur la transition métaphase-anaphase. (Adapté de Meijer, 2003). La protéine Tax induit la relocalisation cytoplasmique de Mad2 et active le complexe APC/C de manière prématurée lors de la phase S.

On peut remarquer que cette inhibition de Mad1 pourrait également conduire à l ¶ activation du complexe APC/C

puisqu ¶ elle ne pourrait plus séquestrer la sous-unité Cdc20 de ce complexe. Actuellement, aucune étude montrant une activation indirecte d ¶ APC/C par l ¶ inhibition de Mad1 lors de l ¶ expression de Tax n ¶ est disponible.

Tax active également le complexe APC/C

, déterminant une dégradation prématurée

de Skp2 et une stabilisation des inhibiteurs p21

et p27

. Normalement, la dégradation de

p21

et p27

se déroule durant la phase S et est régulée par le complexe ubiquitine E3

ligase SCF (Skp/Cullin/F-box) associée à sa sous-unité Skp2, qui permet la reconnaissance

spécifique du substrat. Cet effet induit l ¶ arrêt des cellules exprimant Tax en phase G

après un

seul cycle cellulaire. Il faut remarquer que les cellules transformées par HTLV-1 expriment de

haut taux de p21

, mais peu de la protéine p27

et de l ¶ ARN messager correspondant. Il semble donc que l ¶ absence de p27

soit nécessaire pour permettre aux cellules exprimant Tax de lever l ¶ arrêt du cycle en phase G

. La perte de l ¶ expression de p27

pourrait être une des étapes importantes dans la transformation cellulaire par HTLV-1.

Parallèlement aux dérégulations induites dans la progression du cycle cellulaire, la protéine Tax induit la multiplication anormale des centrosomes. Tax est localisée dans ces structures durant la mitose et interagit avec la protéine Ran-BP1. Cette protéine fait partie d ¶ un complexe protéique qui régule la stabilité des centrosomes durant la mitose, la nucléation des microtubules et la formation du fuseau. L ¶ interaction de Tax avec RanBP1 est nécessaire pour sa localisation dans les centrosomes et l ¶ induction de centrosomes surnuméraires. Ce mécanisme est en partie à l¶origine de l¶aneuploïdie observée dans les cellules ATL

.

c) Tax inactive le suppresseur de tumeur p53

Le suppresseur de tumeur p53 joue un rôle important dans la régulation du cycle cellulaire et induit l ¶ apoptose suite à des stress génotoxiques et à des signaux oncogènes. Le gène de p53 est muté dans environ 50% des cas de cancers. Cependant, ce gène est intact et p53 est exprimé et stabilisé dans les lymphocytes T transformés issus de patients ATL. Tax maintient p53 dans un état inactif et cette inhibition fonctionnelle s¶effectue par deux voies distinctes. Premièrement, l ¶ activation par Tax de la kinase IKKβ détermine la phosphorylation de la sous-unité RelA sur la sérine 536 (RelA S536P) et la formation d ¶ hétérodimères RelA S536P/p53 sur les promoteurs contrôlés par p53 inhibe l ¶ activité transcriptionnelle de p53.

Cette voie d ¶ inactivation de p53 ne nécessite pas l ¶ activation de l ¶ expression des gènes par la voie NF-κB mais uniquement la translocation de RelA phosphorylé dans le noyau

. Deuxièmement, l ¶ activité transcriptionnelle de p53 requiert son acétylation par les co- activateurs transcriptionnels CBP/p300. Tax interagit avec ces co-activateurs limitant leur disponibilité au niveau d ¶ autres promoteurs parmi lesquels ceux contrôlés par p53

.

d) La région carboxy-terminale de Tax est importante pour la transformation.

Un domaine de liaison aux protéines à domaine PDZ a été identifié à l ¶ extrémité

carboxy-terminale de la protéine Tax (PBM : PDZ binding motif

ETEV

). La protéine

Tax interagit par son domaine PBM avec plusieurs protéines à domaine PDZ parmi lesquelles

la protéine DLG (Discs Large Tumor Suppressor)

. Cette protéine est un membre de la famille de protéines MAGUK (membrane-associated guanylate kinase homologous) caractérisée par des domaines SH3, PDZ et une région homologue à la guanylate kinase (GuK). Les domaines PDZ sont des modules de reconnaissance permettant l ¶ assemblage de complexes multiprotéiques de signalisation à des sites spécialisés dans la membrane plasmique. Dans les cellules épithéliales, DLG co-localise avec la cadhérine E aux sites d ¶ interactions entre cellules. Ces complexes pourraient être impliqués dans une connexion entre l ¶ organisation épithéliale et le contrôle de la croissance cellulaire. La protéine DLG interagit via son domaine PDZ à l ¶ extrémité carboxy-terminale de la protéine APC (adenomatous polyposis coli) dont le gène est muté dans de nombreuses tumeurs colorectales.

APC est associé à des composants du signal de transduction Wnt/Wingless, la β-caténine, l ¶ axin et la conductine/axil. La surexpression de la protéine APC bloque le cycle cellulaire à la transition G

/S via l ¶ inhibition de l ¶ activité kinase de CDK2. Cette inhibition du cycle cellulaire par APC nécessite la formation de complexes APC/DLG

.

En interagissant avec le domaine PDZ de DLG, Tax empêcherait la formation des complexes APC/DLG par compétition et lèverait ainsi l ¶ inhibition du cycle cellulaire en G

/S, événement favorable à l ¶ induction de la transformation cellulaire

. Les arguments qui suggèrent que l ¶ interaction du domaine PBM de Tax avec le domaine PDZ de DLG pourrait participer à la transformation cellulaire par HTLV-1 sont les suivants. La protéine Tax du virus HTLV-2 (Tax-2), quoiqu ¶ elle possède plus de 70 % d ¶ homologie avec la protéine Tax du virus HTLV-1 (Tax-1), ne présente pas de motif PBM. Des expériences utilisant l ¶ infection de lapins avec des clones moléculaires de HTLV-1 ou de HTLV-2 reconstitués avec le gène Tax-1 délété de son domaine PBM ou le gène Tax-2 fusionné au domaine PBM de Tax-1 ont permis de montrer que la présence du domaine PBM augmente la prolifération des cellules T infectées et qu¶il est nécessaire pour permettre la persistance de l¶infection in vivo

. Il est intéressant de noter que le mécanisme d ¶ interaction impliquant un domaine PBM et le domaine PDZ de DLG est également utilisé par d¶autres protéines virales oncogènes. Ainsi, la protéine E6 du papillomavirus interagit avec DLG mais, à la différence de Tax, cette interaction conduit à la dégradation par le protéasome de DLG

.

D ¶ autre part, l ¶ extrémité carboxy-terminale de Tax a été impliquée dans la formation de

micro-noyaux. La comparaison de l ¶ extrémité carboxy-terminale des protéines Tax1 et Tax2

indique que la protéine Tax1 possède 13 acides aminés de plus que Tax2. Cette différence a

été impliquée dans la capacité de Tax1 de former des micro-noyaux. De plus, lorsque la

protéine Tax1 est délétée des 16 acides aminés carboxy-terminaux, elle perd la capacité de former des micro-noyaux

. Cette même région a été impliquée dans l ¶ inhibition de l ¶ hématopoïèse suite à l ¶ activation de l ¶ expression des inhibiteurs p21

et p27

. Cette inhibition est observée lorsque la protéine Tax1 est transfectée dans des cellules hématopoïétiques primaires CD34

, mais pas lorsque la protéine Tax2 est transfectée.

Lorsqu ¶ un mutant chimérique contenant les 300 premiers acides aminés de Tax2 et les 53 acides aminés carboxy-terminaux de Tax1, ce mutant récupère les propriétés de la protéine Tax1

.

e) Tax perturbe la réparation de l ¶ ADN et induit une instabilité génomique

Les cellules transformées par HTLV-1 présentent une grande gamme d ¶ anomalies chromosomiques. La protéine Tax ne semble pas capable d¶induire directement des dommages à l ¶ ADN mais inhibe plutôt les mécanismes de réparation de l ¶ ADN suite à des dommages introduits par des sources externes. La protéine Tax réprime l ¶ expression de l ¶ ADN polymérase β qui est impliquée dans la réparation des dommages à l ¶ ADN par excision de bases (BER : base excision repair), par excision de nucléotides (NER : nucleotide excision repair) et par réparation des bases non appariées (MMR : mismatch repair) et diminue l ¶ efficacité de ces mécanismes de réparation de l ¶ ADN dans les cellules infectées par HTLV-1. De plus, au cours des étapes précoces du processus de transformation par HTLV-1, Tax réduit l ¶ expression de la télomérase (hTERT) et l ¶ addition de répétitions télomériques à l ¶ extrémité des chromosomes. Tax supprime aussi l ¶ effet protecteur du facteur KU80 sur les cassures double-brin de l ¶ ADN (DSB). Ces effets peuvent mener à des anomalies chromosomiques par fusion de chromosomes

.

Une autre source d ¶ anomalies chromosomiques est due à l ¶ inhibition par Tax de points

de contrôle qui sont sensibles à l ¶ intégrité de l ¶ ADN lors du cycle cellulaire. Comme nous

l¶avons décrit plus haut, Tax inhibe p53 dont une des fonctions est de bloquer le cycle

cellulaire en cas de dommages à l ¶ ADN. Un autre mécanisme de contrôle de l ¶ intégrité de

l ¶ ADN requiert l ¶ activation de la kinase Chk2, induisant un blocage en G

/M. La protéine

Tax est capable de séquestrer cette kinase dans les corps à Tax (qui seront détaillés dans le

paragraphe 3) et de permettre le passage de la phase G

à la mitose malgré des défauts dans

l¶ADN

.

3) Localisation intracellulaire de Tax et domaines fonctionnels de Tax

La protéine Tax est présente à la fois dans le noyau et le cytoplasme et possède un signal de localisation nucléaire (NLS) dans son extrémité amino-terminale et un signal d¶export nucléaire (NES) dans son domaine central (Figure 13). Les 60 acides aminés N- terminaux de Tax sont importants pour sa localisation nucléaire, mais il n ¶ existe aucune similitude entre cette séquence et celle d ¶ autres NLS connus. Le transport des protéines dans le noyau passe par les complexes des pores nucléaires (NPC) et implique dans la plupart des cas un signal de localisation nucléaire (NLS) présent dans la protéine transportée. La majorité des transporteurs appartiennent à la famille des importines et ce transport nécessite de l ¶ énergie qui est fournie par la petite GTPase Ran. Une étude récente montre que le transport de Tax du cytoplasme vers le noyau ne nécessite pas d¶énergie et se fait par interaction directe avec la protéine p62 des complexes des pores nucléaires. Des mutants de Tax dont le NLS est muté (C29A et C36A) perdent la capacité d ¶ interagir avec p62 et de transloquer dans le noyau

. L ¶ export de Tax du noyau vers le cytoplasme n ¶ est pas facilité par le transporteur CRM-1

sauf dans des situations de stress

.

Dans le noyau, Tax présente une distribution ponctuée sous forme de corps nucléaires

ou corps à Tax. Des expériences d'immunofluorescence ont montré que Tax colocalise dans

ces structures nucléaires avec des facteurs de transcription cellulaires directement impliqués

dans l ¶ activation de l ¶ expression des gènes par Tax, les sous-unités du facteur NF-κB, p50 et

RelA, un membre de la famille ATF/CREB, ATF-1, et les co-activateurs transcriptionnels

CBP et p300. Ces corps nucléaires contiennent également des sous-unités de l'holoenzyme

ARN polymérase II incluant la grande sous-unité de l'ARN polymérase II et une kinase

dépendant d¶une cycline CDK8, ainsi que des facteurs d¶épissage tels que SC-35, un facteur

intervenant dans l ¶ assemblage des complexes d ¶ épissage, et un ensemble de facteurs

d ¶ épissage présentant un épitope commun (Sm) composant les snRNP. Enfin, ces corps

nucléaires comprennent également de l'ARN messager nouvellement synthétisé et plus

précisément l'ARN messager correspondant à un gène activé spécifiquement par Tax. La

microscopie électronique (Figure 13) a mis en évidence que ces corps nucléaires à Tax sont

formés de fibres et de granules présentant une structure semblable aux granules présents dans

les amas de granules interchromatiniens (IGC : interchromatin granule clusters). De plus ces

corps sont en contact direct avec diverses structures : les IGC impliqués dans le stockage des

facteurs d ¶ épissage et leur redistribution aux sites de transcription, les corps à PML et la chromatine décondensée qui établit des contacts à la surface de ces corps

. La formation de ces corps nucléaires semble jouer un rôle important pour l ¶ activation de l ¶ expression des gènes induite par Tax

.

Figure 12 : Image d¶un corps à Tax par microscopie électronique. CN : corps nucléaire à Tax ; IGC : amas de grains interchromatiniens ; CH : chromatine ; NU : Noyau ; CY : Cytoplasme; PML : corps à PML

Les différentes propriétés des corps nucléaires assemblés par Tax sont en accord avec la

structure et l ¶ organisation de domaines de transcription où l ¶ ensemble des facteurs généraux

de transcription, les facteurs de maturation des transcrits ainsi qu ¶ un assortiment spécifique de

facteurs de transcription sont concentrés et fixés à la matrice nucléaire dans une distribution

discrète. Les gènes à transcrire sont localisés dans des boucles d ¶ ADN en contact avec la

surface de ces domaines de transcription

.

Des travaux antérieurs du laboratoire ont montré que la protéine Tax était phosphorylée sur les sérines 300 et/ou 301. Cette propriété a été mise en évidence grâce à deux mutants : le mutant F2 où les deux sérines en position 300 et 301 sont substituées respectivement par une leucine et une alanine. Ce mutant est déficient pour la phosphorylation, ne forme pas les corps nucléaires et est incapable d ¶ activer l ¶ expression des gènes par les deux voies ATF/CREB et NF-κB. La substitution des résidus sérines critiques pour la phosphorylation par des acides aspartiques, résidus qui miment les sérines phosphorylées, dans le mutant F9 restaure partiellement la capacité de ce mutant d ¶ activer l ¶ expression des gènes par les deux voies d¶activation. La phosphorylation de Tax sur les résidus sérines 300/301 est donc critique pour les activités transcriptionnelles de Tax

.

L ¶ analyse de phénotypes d ¶ un ensemble de mutants de Tax a permis de définir plusieurs domaines fonctionnels. Ceux-ci sont schématisés dans la figure 14.

Figure 13 : Représentation schématique des domaines fonctionnels de Tax et localisation des principaux mutants. (Adapté de Wu, 2004). Les mutants K88A et M47 sont défectifs pour l¶activation de la voie ATF/CREB tandis que les mutants M22 et M148 sont défectifs pour l¶activation de la voie NF-κB.

La protéine Tax contient dans sa partie centrale un domaine de dimérisation qui est important pour ses activités transcriptionnelles

. L ¶ incapacité du mutant M22 d ¶ interagir avec IKKγ met en évidence l ¶ importance la région centrale de Tax dans cette interaction.

L ¶ extrémité amino-terminale de Tax est impliquée dans son interaction avec les facteurs de

transcription de la famille ATF/CREB, tandis que son extrémité carboxy-terminale contient

un domaine de transactivation impliqué dans l ¶ activation de l ¶ expression des gènes viraux,

caractérisé par la mutation M47. Ce mutant est capable d ¶ interagir avec p300 mais pas avec CBP. Il est défectif pour l ¶ activation de l ¶ expression des gènes par la voie ATF/CREB mais pas pour l ¶ activation de l ¶ expression des gènes par la voie NF-κB. Il existe un autre mutant, le mutant M148, qui lui est capable d ¶ interagir avec CBP mais pas p300. Ce mutant M148 est défectif pour la voie NF-κB mais pas pour la voie ATF/CREB

. Le mutant M47 est également défectif pour l ¶ interaction avec P/CAF

. La région comprise entre les acides aminés 81 et 95 a également été montrée comme nécessaire pour l ¶ interaction avec CBP, la mutation K88A étant suffisante pour empêcher cette interaction

. Ces différents mutants sont repris dans la figure 14. Le domaine de localisation nucléaire se situe dans la partie N- terminale de Tax tandis que le signal d¶export nucléaire se situe dans le centre de la protéine.

Enfin, le domaine de liaison aux protéines à PDZ, aussi appelé PBM, est localisé à l ¶ extrémité

carboxy-terminale de Tax.

III. Les modifications post-traductionnelles des protéines

La plupart des protéines eucaryotiques sont modifiées après leur traduction de manière covalente et transitoire et ces modifications jouent un rôle important dans la régulation des fonctions de ces protéines. Ces modifications contrôlent l ¶ activité intrinsèque de ces protéines, leur localisation intracellulaire, leur interaction avec d ¶ autres protéines ou l ¶ ADN ou encore leur stabilité. Les modifications post-traductionnelles des protéines sont nombreuses et impliquent différents résidus. De plus, certaines protéines sont modifiées sur plusieurs acides aminés différents. La multiplicité des sites de modifications sur une protéine corrèle avec son importance biologique et la complexité de l ¶ organisme dont elle est issue (ex : le suppresseur de tumeur p53, la sous-unité RelA du facteur NF-κB, l ¶ ARN polymérase II, les histones).

Outre la multiplicité des sites de modifications dans une protéine, certaines modifications peuvent cibler le même acide aminé. Le cas du résidu lysine est particulièrement complexe puisque cet acide aminé peut être la cible d ¶ une acétylation, d ¶ une ubiquitination, d ¶ une sumoylation, d¶une méthylation, d¶une neddylation, d¶une biotinylation ou encore d¶une hydroxylation

. Nous n ¶ exposerons dans ce travail que les modifications par acétylation, ubiquitination et sumoylation.

1) L ¶ acétylation

L ¶ acétylation consiste en l ¶ addition d ¶ un groupement acétyle sur le groupement ε-

amine d ¶ une lysine ou sur le groupement amino-terminal de la protéine. Cette réaction est

catalysée par les acétyltransférases. Les histones ont été les premières protéines reconnues

comme cibles d ¶ acétylation. L ¶ acétylation sur les queues amino-terminales des histones

diminue leur affinité pour l¶ADN et permet l¶ouverture de la chromatine et l¶expression des

gènes. Depuis, de nombreuses autres protéines parmi lesquelles de nombreux facteurs de

transcription ont été montrées comme étant acétylées. Les conséquences de l ¶ acétylation sur

ces facteurs de transcription sont aussi diverses qu ¶ opposées. En effet, cette modification peut

augmenter l ¶ affinité pour l ¶ ADN et augmenter les activités transcriptionnelles (RelA, lysines

221 et 310) ou au contraire diminuer l ¶ affinité pour l ¶ ADN et inhiber les activités

transcriptionnelles (RelA, lysines 122 et 123). L¶acétylation peut également favoriser ou

empêcher les interactions entre protéines. Le bromodomaine est un domaine de

reconnaissance spécifique pour les lysines acétylées. Enfin, l ¶ acétylation peut altérer la

stabilité des protéines. Elle permet la stabilisation des protéines en compétant pour une lysine

cible d ¶ une ubiquitination, une modification post-traductionnelle déterminant la dégradation de la protéine par le protéasome (voir ci-dessous).

Il existe plusieurs familles d ¶ acétyltransférases dont certaines sont conservées de la levure aux cellules humaines

. Nous décrivons ici plus spécifiquement les acétyltransférases CBP et p300, vu leur l ¶ importance dans les fonctions de la protéine Tax de HTLV-1. Ces acétyltransférases interagissent à la fois avec les facteurs de transcription associés aux séquences enhancer dans les promoteurs d¶une part et les facteurs de transcription basale (TBP et TFIIB, qui s ¶ associent avec la TATA box et l ¶ ARN polymérase II) d ¶ autre part. Elles fonctionnent comme des ponts qui stabilisent le complexe de transcription et permettent l ¶ acétylation des histones (activité HAT : histone acetyltransferase) et le remodelage de la chromatine, des étapes importantes pour l¶initiation de la transcription. Enfin, ces acétyltransférases acétylent aussi des facteurs de transcription (activité FAT : factor acetyltransferase).

CBP et p300 présentent un haut degré d ¶ homologie et sont interchangeables comme co- activateurs pour au moins 40 facteurs de transcription différents. Cependant, de nombreux travaux indiquent que ces deux enzymes ne sont pas complètement redondantes mais ont aussi des rôles uniques in vivo. Ces différences fonctionnelles semblent dues à leur association différentielle avec d¶autres protéines ou des différences dans la spécificité de substrats de ces deux enzymes

. Ainsi, des souris knockout pour le gène p300 ou CBP ne présentent pas le même phénotype. En outre, les activités acétyltransférases de ces protéines sont activées par phosphorylation par des kinases distinctes. La protéine p300 est phosphorylée par les kinases AKT ou par HIPK2

. Par contre, CBP, mais pas p300, est phosphorylé par IKKα et cette phosphorylation augmente son affinité pour le complexe p50/RelA au détriment de l ¶ affinité pour le suppresseur de tumeur p53

.

L ¶ acétylation est réversible et est enlevée par les déacétylases. Ces déacétylases

appartiennent à quatre classes selon leur degré d ¶ homologie avec leurs équivalents chez la

levure. La classe I est composée de la déacétylase RPD3 et des histones déacétylases HDAC

1, 2, 3 et 8 ; la classe IIa est composée des histones déacétylases HDAC 4, 5, 7, 9 ; la classe

IIb est composée des histones déacétylases HDAC 6 et 10 ; la classe III est composée par les

sirtuins (SIRT 1-7) et la classe IV est composée de l¶histone déacétylase HDAC 11. Les

déacétylases des classes I et II sont inhibées par la trichostatine A tandis que celles de la

classe III sont inhibées par la nicotinamide.

2) L ¶ ubiquitination

L¶ubiquitine est un polypeptide de 76 acides aminés qui est lié de manière covalente au

groupement ε-aminé d¶une lysine de la protéine cible. Les premiers travaux concernant

l ¶ ubiquitination ont mis en évidence que cette modification ciblait les protéines pour la

dégradation par le protéasome. Cependant, des travaux plus récents indiquent que

l ¶ ubiquitination a aussi un rôle dans la régulation de la fonction de certaines protéines. La

conjugaison de l ¶ ubiquitine à une protéine implique plusieurs étapes enzymatiques (Figure

15). L ¶ ubiquitine est synthétisée en tant que précurseur et doit être clivée à son

extrémité carboxy-terminale par une hydrolase spécifique pour produire un motif

diglycine d ¶ attachement à la protéine cible. Lors de la première étape, l ¶ enzyme activatrice

E1 utilise de l ¶ ATP pour former un lien ubiquitine-adénylate via la glycine carboxy-terminale

de l ¶ ubiquitine avant de former un lien thioester de haute énergie entre la même glycine de

l ¶ ubiquitine et une cystéine interne de l ¶ enzyme E1. L ¶ ubiquitine est alors transférée par une

réaction de transestérification pour former un lien thioester entre l ¶ ubiquitine et l ¶ enzyme de

conjugaison E2. Lors de la troisième étape, l ¶ ubiquitine est transférée de l ¶ enzyme de

conjugaison E2 sur le groupement ε-amine d ¶ une lysine spécifique de la protéine cible. Cette

réaction est catalysée par une des multiples enzymes de ligation E3 qui déterminent la

spécificité du substrat. Les enzymes E3 appartiennent à deux familles selon qu ¶ elles possèdent

un domaine HECT (Homologous to E6-associated protein C-Terminus) ou un domaine RING

(Really Interesting New Gene). Enfin, les enzymes E4 facilitent la multimérisation des

chaînes d ¶ ubiquitine

.

Figure 14 : Cascade enzymatique impliquée dans l¶ubiquitination des protéines. E1 : enzyme activatrice, E2 : enzyme de conjugaison, E3 : enzyme de ligation.

L ¶ ubiquitine possède 7 lysines (K6, K11, K27, K29, K33, K48 et K63) qui sont elle-

même la cible d ¶ ubiquitination formant ainsi des chaînes de polyubiquitine

. Le branchement

de molécules d ¶ ubiquitine sur la lysine 48 conduit à la reconnaissance de la protéine

polyubiquitinée par le protéasome et à sa dégradation. Ce type d¶ubiquitination joue un rôle

majeur dans l ¶ activation de certaines voies de signalisation (dégradation de l ¶ inhibiteur

IκBα lors de l ¶ activation de la voie NF-κB) et dans la régulation du cycle cellulaire

(dégradation des cyclines et de la sécurine). Le branchement de molécules d¶ubiquitine sur la

lysine 63 est impliqué dans l ¶ activation de kinases (la polyubiquitination de la sous-unité

régulatrice IKKγ permet le recrutement de TAK-1 et la phosphorylation activatrice de IKKβ),

l ¶ activation de l ¶ endocytose et la réparation de l ¶ ADN

. Cette modification est réversible et

est enlevée par les déubiquitinases, et la désubiquitination joue un rôle important dans la

terminaison de l ¶ activation de la voie NF-κB (désubiquitination de RIP-1 et TRAF-6 par A20

et CYLD).