Bases moléculaires de l'exocytose

PHYSIQUE CELLULAIRE

FUSION MEMBRANAIRE (6) BASES MOLÉCULAIRES DE

L’EXOCYTOSE

Jean-Pierre HENRY

12 Mars 2009

L’exocytose: rappels

C’est la fusion d’une vésicule de

sécrétion avec la membrane plasmique

La sécrétion est un processus multi étapes

bourgeonnement remplissage

migration

arrimage maturation exocytoseexocytose endocytose

migration fusion

Ca²⁺

Ca²⁺

Ca²⁺

membrane

extérieur de la cellule

vésicule

catécholamine (adrénaline) endosome

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bourgeonnement remplissage

migration

arrimage maturation exocytoseexocytose endocytose

migration fusion

Ca²⁺

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membrane

extérieur de la cellule

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catécholamine (adrénaline) endosome

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L’exocytose est la dernière étape

L’exocytose est déclenchée par les ions

Ca

Problématique

• Quelles protéines sont responsables du phénomène d’exocytose?

• Ces protéines interviennent-elles dans

l’hémifusion et dans la formation du pore de fusion?

• Le même système protéique est-il impliqué

dans l’exocytose stimulée et dans toutes les

fusions du trafic membranaire?

Présentation historique:

Reconstitution in vitro du trafic cis-Golgi vers Golgi médian

• On utilise des extraits de foie

• On détermine les facteurs nécessaires pour avoir un bourgeonnement à partir du cis-Golgi

• Puis, une fusion des vésicules navettes avec le Golgi médian

• C’est une approche purement biochimiste de J Rothman

Reconstitution in vitro du trafic cis-Golgi vers Golgi médian (2)

• La réaction de fusion requiert de l’ATP et une protéine soluble, NSF

• L’ATPase NSF a un (des) partenaire(s)

solubles α ( β,γ ) SNAP

• Ces deux protéines, NSF et SNAP, étant

solubles, on recherche des récepteurs sur les

deux membranes, donneuse et acceptrice

Identification des récepteurs des SNAP:

les SNARE (1)

• On effectue une chromatographie d’affinité: on immobilise NSF, en présence d’un excès de SNAP et en absence d’ATP

• On ajoute des membranes (cerveau de rat) solubilisées en étergents

• Après lavage en l’absence d’ATP (ou ATP non hydrolysable), on élue en présence d’ATP

(Sollner et al (1993) Nature,362, 318)

Identification des récepteurs des SNAP:

les SNARE (2)

• Les protéines membranaires (SNARE) pêchées sont des protéines connues (mais non impliquées dans l’exocytose

• Les syntaxines (A et B) intrinsèques de la membrane neuronale

• SNAP-25, une protéine fixée sur la membrane par palmitoylation

• VAMP (ou synaptobrévine-2) intrinsèque de la membrane vésiculaire

Importance de cette découverte

• L’expérience a été faite avec SNAP et NSF de Golgi et elle a conduit à l’isolement de SNARE sur les membranes plasmique et vésiculaire

• Système unique pour tous les trafics membranaires?

• SNARE directement impliqués dans le

mécanisme de l’exocytose

Premier type de mécanisme

• Il y aurait assemblage d’un complexe ternaire des 3 SNARE

• Puis fixation de SNAP et NSF

• L’addition d’ATP

permettrait la fusion des membranes

Ce modèle a été refusé par les neurobiologistes car l’exocytose est induite par les ions Ca²⁺ et non par l’ATP

Deuxième type de modèle

• Les protéines NSF et SNAP ne sont pas impliquées dans la fusion

• Leur rôle est de dissocier les

protéines SNARE après la fusion;

NSF est un « chaperon »

• La fusion implique le complexe des protéines SNARE et le Ca²⁺

• Ni le complexe, ni les SNARE n’ont d’affinité pour le Ca²⁺

• Il existe des protéines régulatrices

(Dessin B Poulain)

Première preuve:

les neurotoxines clostridiales coupent sélectivement les protéines SNARE

• Le genre Clostridium contient des bactéries anaérobies pathogènes responsables du tétanos et du botulisme

• Les toxines sont des protéines de type métalloprotéases à Zn, avec une très grande spécificité

• Elles ne coupent qu’un substrat, une SNARE, produisant un arrêt de la transmission synaptique

TeTX, VAMP

BotTXA et E, SNAP-25 BotTXC, Syntaxine BotTXB,D,F, VAMP

(Schiavo et al (1992) Nature,359, 832)

Caractéristiques moléculaires du complexe SNARE (1)

• Analyse de la structure secondaire des domaines

solubles par dichroïsme circulaire

• Seule la syntaxine (t-SNARE) a un contenu (faible) en hélice α

• Après mélange, très forte structuration par rapport au

spectre somme des composants

• Les protéines SNARE sont très peu structurées, le complexe est très structuré

Caractéristiques moléculaires du complexe SNARE (2)

• Observation par DC de la stabilité des SNARE et du complexe

• Seule la Syntaxine a une

structure et elle se dénature à partir de 40°C

• Le complexe est stable jusqu’à 80°C

• Même dans le SDS, le complexe a une stabilité

Structure atomique du complexe (1)

• Cristallisation du domaine structuré et analyse par radiocristallographie

• 4 hélices: VAMP (v-

SNARE),Syntaxine et deux domaines de SNAP-25 (t- SNARE)

• Hélices parallèles

• Stabilisation par 15 plateaux carrés, correspondant à des interactions hydrophobes

• Au centre, plateau hydrophile

(Sutton et al(1998) Nature,395, 347)

Structure atomique du complexe (2)

• Vue du plateau central hydrophile

• Ce système tend à séparer le complexe en deux parties

Structure atomique du complexe (3)

• Dans tous les trafics

membranaires, on trouve le même type de complexe (4 hélices parallèles et 15

plateaux hydrophobes)

• Il y a des différences de

séquence et les SNARE ne sont pas interchangeables

• Le point commun est la répétition de résidus

hydrophobes (Leu) en position 1, 4 et 7 (leucine zipper)

(Fassbauer et al (1998) Proc Natl Acad US, 95, 15781)

Mécanisme hypothétique de la fusion par les SNARE

• Les hélices du complexe

étant parallèles, sa formation rapproche nécessairement les membranes

• La fusion serait une conséquence d’un

mécanisme de fermeture éclair formant le complexe, depuis l’extrémité N-

terminale vers l’extrémité C- terminale, proche de la

membrane

L’analogie avec les virus

Le complexe (à droite) SNARE agirait comme la protéine HA de l’influenza (à gauche)

(Couverture Cell, 1998)

Mécanisme hypothétique de l’exocytose

• a- la formation du complexe SNARE est nécessaire et suffisante pour la fusion

• b- après formation du complexe, une autre étape induit la fusion

• c- dans l’hypothèse a, un frein, levé par Ca²⁺, empêche la formation

complète du complexe

• d- le senseur de Ca²⁺ n’est pas un frein, mais un activateur

• e- dans l’hypothèse b, la protéine de fusion est activée par le Ca²⁺

Deuxième preuve:

fusion de cellules par SNARE inversés

• On prépare 2 séries de cellules COS

• Exprimant v-SNARE inversé et avec une protéine rouge cytosolique

• Exprimant t-SNARE inversé avec protéine bleue dans le noyau

• Après mélange, on observe des fusions: cytoplasme rouge avec plusieurs noyaux bleus

(Chuan et al (2003) Science,300, 1745)

Troisième preuve: fusion liposome/liposome induite par les SNARE (1)

• Les t-SNARE (syntaxin et SNAP-25) sont reconstitués dans une vésicule contenant NBD-PE et Rho-PE

quenchés

• Le v-SNARE (VAMP) est dans une vésicule non fluorescente

• Après mélange, une fusion diluera le NBD et augmentera sa fluorescence

• La concentration de v-SNARE est 10 fois celle de t-SNARE et il y a 10 fois plus de t-vésicules, permettant des fusions répétées.

(Parlati et al (1999) ProcNatlAcadUS,96, 12565)

Fusion liposome/liposome induite par les SNARE (2)

• L’augmentation de fluorescence indique des fusions

• Après calibration, on a en moyenne 2 fusions/vésicule

• La cinétique est très lente!

• Une préincubation (une nuit à 4°C) augmente la vitesse de fusion

Evènements uniques de fusion de liposomes vus par TIRFM

• On prépare une

bicouche suspendue

contenant des t-SNARE

• Et des liposomes Rho- PE/NBD-PE contenant le v-SNARE

• On observe par TIRFM

• Une faible proportion des vésicules dockées fusionnent, (C)

(Fix et al (2004) Proc Natl Acad Sc US, 101, 7311)

Résultats obtenus en systèmes reconstitués

• De nombreuses approches ont été utilisées:

– Liposomes/liposomes, en solution – Liposomes/liposomes immobilisés – Liposomes/vésicules synaptiques – Liposomes/vésicules géantes (GUV) – Liposomes/bicouche plane

• De nombreux artefacts ont été observés

• Des résultats semblent établis:

– Mise en évidence de l’hémifusion – Inhibition par la LysoPC

– Importance de la courbure: fusion LUV/GUV difficile – Rôle de protéines annexes: ex. la synaptotagmine

Rôle de la synaptotagmine

• La synaptotagmine est une protéine de la membrane vésiculaire

• Elle possède des domaines

extramembranaires, C2AC2B (bleu et rouge), qui interagissent avec le

complexe SNARE (horizontal)

• En présence de Ca²⁺, ces domaines pénètrent dans la monocouche de la membrane plasmique

• Cette déformation induit une

courbure, déclenche l’hémifusion et accélère la fusion

(Martens et al (2007) Science,316, 1205)

Rôle de la synaptotagmine (2)

• Les domaines C2A et C2B s’insèrent dans

une monocouche acide, en présence de Ca²⁺

• La protéine se lie plus à des petits liposomes à courbure forte

• A haute concentration, la protéine induit la

formation de tubules à partir de liposomes

Energétique de la formation du complexe SNARE (1)

• On utilise le montage SFA (surface forces apparatus)

• Les t- et v-SNARE sont greffés sur des lipides de bicouches (pas de fusion possible)

(Li et al(2007) Nature Struct Mol Biol,14, 890)

Energétique de la formation du complexe SNARE (2)

• L’étape 2 correspond à l’interaction v- et t-

SNARE

• En 3, on peut

rapprocher sans force:

formation du complexe

• En 4, on comprime le complexe formé

Energétique de la formation du complexe SNARE (3)

• Quand on éloigne les

couches, on a d’abord une réversibilité de la contraction

• Puis, on ne retrouve pas le plateau et il faut une force pour séparer les bicouches (à 8 nm)

• Cette force de séparation donne accès à l’énergie du complexe

Energétique de la formation du complexe SNARE (4)

• Pour passer l’énergie macroscopique à l’énergie du complexe, il faut connaître la densité surfacique des SNARE

• Ceci est fait en considérant que la phase de répulsion est due à des SNARE en « champignon »

• L’énergie du complexe est évaluée à 35 ± 7 k_BT, proche des 40-50 k_BT nécessaires à la formation du pédoncule

• La distance de séparation (8-9 nm) suggère que des résidus proches de la membrane ne participent pas au complexe

CONCLUSIONS

• Le complexe SNARE est central dans le mécanisme de l’exocytose

• Chacune des étapes de fusion du trafic

membranaire possède ses SNARE (plusieurs dizaines de protéines)

• Le complexe SNARE participe au schéma général: hémifusion, pore de fusion

• L ’exocytose implique plusieurs couches de

protéines de régulation, positives et négatives