Analyse du rôle de la clustérine dans l'ischémie cérébrale chez la souris

Thesis

Reference

Analyse du rôle de la clustérine dans l'ischémie cérébrale chez la souris

IMHOF, Anouk

Abstract

Dans ce travail, nous nous intéressons dans un premier temps à faire un état des lieux des connaissances concernant l'ischémie cérébrale, dans ses dimensions épidémiologiques, d'impact économique, de santé publique, mais aussi étiologiques, physiopathologiques, et thérapeutiques. Nous parcourons également quelques facteurs neuroprotecteurs et leurs mécanismes d'action. Dans un deuxième temps, nous présentons la clustérine et décrivons sa structure, son expression, ses fonctions biologiques et l'état des connaissances de son rôle dans diverses pathologies (maladies autoimmunes, cancers, et maladies neurologiques comme la maladie d'Alzheimer et l'ischémie cérébrale). Ainsi, nous introduisons deux articles, auxquels nous avons contribués, qui concernent l'analyse du rôle de la clustérine dans des modèles d'ischémie cérébrale in vivo et in vitro chez la souris. Nous concluons en mettant en lumière la complexité des interventions neuroprotectrices dans l'ischémie cérébrale et considérons les perspectives concernant l'étude de la clustérine dans le domaine de l'ischémie cérébrale.

IMHOF, Anouk. Analyse du rôle de la clustérine dans l'ischémie cérébrale chez la souris. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2011, no. Méd. 10645

URN : urn:nbn:ch:unige-161594

DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:16159

Available at:

http://archive-ouverte.unige.ch/unige:16159

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Section de médecine Clinique Département de Psychiatrie Service de Psychiatrie Gériatrique

Thèse préparée sous la direction du Professeur Panteleimon Giannakopoulos

" Analyse du rô le de la clust é rine dans l ’ isch é mie

c é r é brale chez la souris

Thèse

présentée à la Faculté de Médecine de l'Université de Genève

pour obtenir le grade de Docteur en médecine par

Anouk IM HOF de

Ifwill, BE

Thèse n° 10645 Genève

2011

Table des matières

RESUME... 4  

1.   ISCHEMIE  CEREBRALE ... 5  

1.1   DETERMINANTS  CHEZ  L’HOMME... 5  

1.1.1   EPIDEMIOLOGIE...5  

1.1.2     IMPACT  ECONOMIQUE...5  

1.1.3     ETIOLOGIES...5  

1.1.4     GENETIQUE...6  

1.1.5     DE  LA  FORME  AUX  PROCESSUS  :  MORPHOLOGIE  ET  PHYSIOPATHOLOGIE...6  

1.1.5.1     Morphologie...7  

1.1.5.2     Biologie  moléculaire ...8  

1.1.5.2.1     Calcium  et  excitotoxicité  :  déterminants  initiaux  de  la  mort  cellulaire ...8  

1.1.5.2.2     NO  (oxyde  nitrique),  stress  oxydant  et  ischémie  cérébrale...8  

1.1.5.2.3     Inflammation  post-­‐ischémique...9  

1.1.5.2.4     Apoptose...9  

1.1.6     STRATEGIES  THERAPEUTIQUES...11  

1.1.6.1     Prévention ...11  

1.1.6.2   Traitements  d’aujourd’hui,  traitements  de  demain ... 12  

1.1.6.2.1     Interventions  ciblées  sur  le  moment  de  survenue  de  l’ischémie  cérébrale... 13  

1.1.6.2.2     Interventions  ciblées  sur  la  phase  de  décours  de  l’ischémie  cérébrale...16  

1.2   MODÈLE  ANIMAL...17  

1.3   QUELQUES  FACTEURS  NEUROPROTECTEURS  POTENTIELS  ÉTUDIÉS  DANS  LE  CADRE  DE  L’ISCHÉMIE   CÉRÉBRALE...17  

1.3.1     LES  INHIBITEURS  DES  CANAUX  CALCIQUES... 18  

1.3.2     LES  ANTAGONISTES  DU  GLUTAMATE... 18  

1.3.3     LES  AGONISTES  GABA ... 18  

1.3.4   LE  MAGNESIUM...18  

1.3.5   LES  ANTIOXYDANTS... 18  

1.3.6   L’HYPOTHERMIE  THERAPEUTIQUE... 18  

2.   LA  CLUSTERINE ...19  

2.1     HISTORIQUE...20  

2.2     STRUCTURE...20  

2.3     ONTOGENESE...21  

2.4     FONCTIONS  PHYSIOLOGIQUES...22  

2.4.1   AGREGATION  CELLULAIRE  IN  VITRO... 22  

2.4.2   PROTEINE  CHAPERONE  EXTRACELLULAIRE,  INDEPENDANTE  DE  L’ATP... 23  

2.4.3   REGULATRICE  DU  COMPLEMENT...24  

2.4.4   LIPOPROTEINE...25  

2.4.4   FONCTION  DANS  LA  REPRODUCTION... 25  

2.4.5   FONCTION  DANS  LA  SECRETION  ENDOCRINE... 25  

2.4.6   APOPTOSE...25  

2.5   PHYSIOPATHOLOGIE...26  

2.5.1   LES  MALADIES  AUTO-­‐IMMMUNES...26  

2.5.2   UN  EXEMPLE  DE  L’EFFET  DE  LA  CLUSTERINE  DANS  LE  CANCER:  LA  CANCER  DE  LA  PROSTATE... 27  

2.5.3    LA  CLUSTERINE  ET  LES  MALADIES  NEUROLOGIQUES...27  

2.5.3.1.     La  Clustérine  et  la  maladie  d’Alzheimer...27  

2.5.3.2.     La  Clustérine  et  l’ischémie  cérébrale... 28  

3.   ETUDES ...32  

3.1     SUSTAINED  ASTROCYTIC  CLUSTERIN  EXPRESSION  IMPROVES  REMODELING  AFTER  BRAIN  ISCHEMIA   32   3.2   CLUSTERIN  INCREASES  POST-­ISCHEMIC  DAMAGES  IN  ORGANOTYPIC  HIPPOCAMPAL  SLICE  CULTURES   43   4.   CONCLUSION,  PERSPECTIVES ...57  

4.1     DANS  DE  LA  PREVENTION  PRIMAIRE  : ...57  

4.2   DANS  LA  PREVENTION  SECONDAIRE  ET  TERTIAIRE...57  

4.3   DANS  LE  TRAITEMENT  DE  L’ISCHEMIE  CEREBRALE...57  

4.4   INTERETS  EVENTUELS  DES  TRAITEMENTS  BASES  SUR  L’ADMINISTRATION  DE  CLUSTERINE   RECOMBINANTE  HUMANISEE  OU  LA  STIMULATION  DE  SON  EXPRESSION  VIA  SON  PROMOTEUR...58  

5.   BIBLIOGRAPHIE ...60  

Résumé  

Dans ce travail, nous nous intéressons dans un premier temps à faire un état des lieux des connaissances concernant l’ischémie cérébrale, dans ses dimensions épidémiologiques, d’impact économique, de santé publique, mais aussi étiologiques, physiopathologiques, et thérapeutiques. Nous parcourons également quelques facteurs neuroprotecteurs et leurs mécanismes d’action.

Dans un deuxième temps, nous présentons la clustérine et décrivons sa structure, son expression, ses fonctions biologiques et l’état des connaissances de son rôle dans diverses pathologies (maladies autoimmunes, cancers, et maladies neurologiques comme la maladie d’Alzheimer et l’ischémie cérébrale).

Ainsi, nous introduisons deux articles, auxquels nous avons contribués, qui concernent l’analyse du rôle de la clustérine dans des modèles d’ischémie cérébrale in vivo et in vitro chez la souris.

Nous concluons en mettant en lumière la complexité des interventions neuroprotectrices dans l’ischémie cérébrale et considérons les perspectives concernant l’étude de la clustérine dans le domaine de l’ischémie cérébrale.

1.   Ischémie  cérébrale  

1.1   Déterminants  chez  l’homme  

L’accident vasculaire cérébral (AVC) se définit comme un trouble focal aigu du système nerveux central d’origine vasculaire. Chez l’humain, environ 85% des AVC sont d’origine ischémique et 15% d’origine hémorragique. Si les symptômes durent moins de 24 heures, on parle d’une attaque ischémique transitoire (AIT), s’ils persistent plus de 24 heures d’un accident vasculaire cérébral ou d’une apoplexie.

1.1.1   Epidémiologie  

L’accident vasculaire cérébral représente la troisième cause de décès après les maladies cardiovasculaires et les cancers dans les pays industrialisés. L’incidence s’élève à environ 150 cas pour 100’000 habitants par an. La mortalité varie de pays en pays avec une marge de 20 à 250 décès pour 100’000 habitants par an. En Suisse, la mortalité pour tous les groupes d’âge était, en 1985, de 20/100’000 en ce qui concerne la population féminine, et, respectivement de 37/100’000 en ce qui concerne la population masculine.

Ce taux de mortalité représente ainsi le plus bas taux mondial.

En outre, l’accident vasculaire cérébral représente la cause la plus fréquente de handicaps acquis à l’âge adulte. Pour ces raisons, le traitement et la prévention sont d’une importance primordiale.

Après la première manifestation de symptômes focaux d’ischémie cérébrale, la probabilité de réapparition de symptômes à 5 ans est de 30%, le risque étant, avec 12%, le plus élevé pendant la première année (1,2).

1.1.2     Impact  économique  

L’impact économique de cette pathologie est très important : aux Etats-Unis, le coût total annuel, pour l’année 1993, était de 30 billion d’US dollars pour les accidents vasculaires ischémiques. Une méta-analyse d’études effectuées sur trois continents (Amérique du Nord, Europe et Nouvelle Zélande) a mis en évidence que les coûts par patient souffrant d’accident vasculaire cérébral sont en augmentation au cours du temps. Ainsi, ils sont estimés à 7'975 US dollars pour l’année 1988 et 54'546 US dollars pour l’année 1993. Dans cette méta-analyse, le calcul de ces coûts est basé sur la prévalence annuelle de cette maladie. Ces coûts comprennent les coûts directs et indirects (baisse de productivité) (3).

Dans le monde entier, les AVC sont responsables de 2 à 4% du total des coûts de la santé et dans les pays industrialisées, plus de 4% (4).

1.1.3     Etiologies  

Une recherche considérable a été effectuée pour comprendre les origines des AVC ischémiques et hémorragiques, afin d’obtenir un outil prédictif et préventif. En 1948 l’étude « Framingham Heart study » recrute sa première cohorte de citoyens (5’209 personnes) avec pour objectif d’étudier longitudinalement les facteurs de risque de développer des maladies cardiovasculaires et des AVC. Depuis lors, plusieurs nouvelles cohortes ont été recrutées et une littérature considérable en est issue. Dans les années 90, Wolf et coll. ont mis en évidence un profil de risque basé sur les résultats des

études Framingham. Les facteurs associés à une augmentation du risque de développer un AVC sont donc l’âge, la pression artérielle systolique, l’utilisation de traitement antihypertenseur, le diabète, le tabagisme, les antécédents de maladies cardiovasculaires (maladie coronarienne, insuffisance cardiaque, ou claudication intermittente), la fibrillation auriculaire et l’hypertrophie du ventricule gauche à l’électrocardiogramme (5).

Outre les facteurs prédictifs et préventifs, de nombreux efforts ont été effectués pour établir un pronostic, sur la base de la localisation de la lésion cérébrale et de sa taille. Plus récemment, des recherches pour permettre de classifier les AVC ischémiques selon leurs étiologies ont été effectuées, avec pour objectif de permettre le développement de stratégies thérapeutiques adaptées à la cause de l’AVC. En 1993, une étude nommée TOAST (Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment), menée par Adams et coll. a mis en évidence cinq sous-types d’AVC ischémiques consécutifs 1) à l’athérosclérose de grosses artères, 2) à un embole d’origine cardiaque, 3) à une occlusion d’un petit vaisseau, 4) à une autre étiologie déterminée (ex : artérite infectieuse ou auto-immune), ou 5) d’origine indéterminée (6).

1.1.4     Génétique  

Des études génétiques sur des jumeaux ont mis en évidence un taux concordant d’AVC dans 17.7% des jumeaux monozygotes et 3.6% des jumeaux dizygotes.

La présence d’une histoire familiale d’AVC augmente le risque de développer cette pathologie de 2 à 3 fois.

De nombreuses maladies monogéniques ont été identifiées, comme l’artériopathie autosomale dominante avec infarcts subcorticaux et leucoencéphalopathie (CADASIL) qui est liée à des mutations dans le gène Notch 3 situé dans le bras court du chromosome 19, la maladie de Fabry (maladie lysosomale génétique, liée au chromosome X, résultant d'un déficit enzymatique de l'α-galactosidase lysosomale),... La majorité d’entre elles sont responsables d’AVC à travers une vasculopathie ou une coagulopathie.

Des études d’associations sur tout le génome à l’aide de SNPs (single nucleotide polymorphism), ont permis de mettre en évidence des associations entre la survenue d’AVC et plusieurs régions, dont les loci associés à la fibrillation auriculaire (4q25 et 6q22), au diabète (loci dans et autour des gènes de l’inhibiteur 2A et 2B de la kinase cyclindépendante dans la région 9q21), et à l’hypertension (serine thréonine kinase 39).

Au total, le génome semble intervenir dans la survenue d’AVC à travers une prédisposition (histoire familiale positive d’AVC en augmente le risque, les facteurs de risques environnementaux (diabète, hypertension, fibrillation auriculaire) ou les vasculopathies ou coagulopathies) (7).

1.1.5     De  la  forme  aux  processus  :  Morphologie  et  physiopathologie  

La physiopathologie de l’AVC ischémique est liée à la réduction d’apport d’oxygène au tissu cérébral soit généré par la pathologie athéromateuse soit par l’obstruction consécutive au comblement de la lumen d’un vaisseau par des thrombi d’origine cardiaque ou par des phénomènes thrombotiques locaux.

Pour rappel et de manière succincte, sachant qu’une description exhaustive dépasse le cadre du sujet de cette thèse, l’athérome résulte du développement d’une plaque épaisse, lipidique, composée de cholestérol et d’esters de cholestérol transportés par

des lipoprotéines de basse densité (LDL). Une fois oxydées, ces molécules activent les macrophages tissulaires, stimulent la production de cytokines inflammatoires et les processus cellulaires générant l’inflammation (8) à l’intérieur de l’intima (endothélium et fine couche de tissu conjonctif sous endothélial, séparée de la média par la lamina élastique interne) de la paroi d’un vaisseau. L’accumulation de plaques d’athérome peut soit en elle-même provoquer l’occlusion de petits vaisseaux, soit dans les vaisseaux plus larges, affaiblir la paroi des vaisseaux, engendrant des anévrysmes, des ruptures de la paroi ou des agrégations plaquettaires.

1.1.5.1    Morphologie  

L’analyse morphologique d’un infarctus ischémique se modifie au cours du temps. Durant les premières 6h d’une lésion irréversible chez l’homme, macroscopiquement, la lésion est peu visible. A 48h, le tissu devient pâle, mou, et œdémateux. De 2 à 10 jours, le cerveau devient gélatineux et friable, et la limite peu définie auparavant entre la zone infarcie et la zone saine, devient plus distincte, comme l’œdème péri-lésionnel se résorbe. De 10 jours à trois semaines, le tissu infarci se liquéfie et est finalement enlevé laissant la place à une cavité remplie de liquide, entourée d’un tissu gris foncé.

Microscopiquement, après les premières 12 heures, on relève un changement morphologique des neurones ischémiés, dont le noyau devient plus dense, et l’œdème prédomine. Les cellules endothéliales, la glie (principalement les astrocytes) se gonflent et les fibres myélinisées commencent à se désintégrer. Jusqu’à 48h après l’ischémie irréversible, une émigration neutrophilique croît progressivement, puis décroît. A 48h, la présence de cellules phagocytaires comme les monocytes circulants, les histiocytes de l’adventice (différenciation tissulaire des monocytes, qui dès qu’un processus de phagocytose sera actif deviendront des macrophages) et de la glie activée est évidente et elle devient prédominante entre la deuxième et la troisième semaine post-infarctus.

Les macrophages se remplissent des produits de la myéline et du sang et peuvent rester présents dans la lésion pour des mois voire des années. Durant l’avancement du processus de liquéfaction et de phagocytose, les astrocytes du bord de la lésion s’agrandissent se divisent et développent un important réseau d’extensions protoplasmiques. Les astrocytes activés peuvent déjà être présent une semaine après la lésion (9).

Parallèlement, une néovascularisation commence à se développer. La lésion ischémique évolue en une cicatrice qui commence 8 jours après l’infarct chez la souris et atteint son stade final 30 jours après la survenue de la lésion (10).

La région qui entoure la zone où les cellules nerveuses meurent par manque d’oxygène (zone infarcie) est appelée la pénombre. Elle consiste en un tissu ayant subi des dommages réversibles. Néanmoins son devenir dépend de la possibilité de restaurer un flux sanguin suffisant. De nombreuses études chez l’animal ont mis en évidence que cette zone peut disparaître dans les heures qui suivent l’AVC au profit soit d’une extension de la zone infarcie soit d’un recouvrement des caractéristiques physiologiques du tissu sain. Dans ce dernier cas, la taille de la lésion peut ainsi être limitée et son impact fonctionnel amoindri.

D’un point de vue hémodynamique, la diminution de la pression de perfusion cérébrale (pression artérielle moyenne – pression intracrânienne) génère une vasodilatation compensatrice dans les régions affectées par l’ischémie. Ce mécanisme permet dans un premier temps de préserver le débit cérébral normal. La stratégie compensatoire suivante est marquée par une augmentation l’extraction d’oxygène fournie par l’apport sanguin disponible. Cette stratégie permet de maintenir temporairement un taux d’oxygène cérébral suffisant. Ainsi la fonction du tissu cérébral est maintenue durant ces phases compensatoires, jusqu’à que la perfusion sanguine poursuive sa diminution. La synthèse de protéine est d’abord diminuée, puis un métabolisme anaérobique se met en place, suivi d’un relâchement de neurotransmetteur, avec une perturbation du métabolisme énergétique et finalement une dépolarisation cellulaire (11).

1.1.5.2    Biologie  moléculaire  

Le cœur de l’ischémie est le siège d’une nécrose, souvent rapide et secondaire à des processus de mort cellulaire d’origine cytoplasmique où la libération massive de calcium joue un rôle important. En revanche, la zone de pénombre, où persiste une certaine perfusion, est le siège de l’apoptose, un processus de mort cellulaire programmé au niveau nucléaire. Relevons que cette distinction entre nécrose et apoptose a été contestée par des analyses récentes, qui proposent que les voies aboutissant à une mort cellulaire par apoptose ou par nécrose peuvent se mettre en œuvre de manière concurrentielle dans les cellules ischémiques, selon la sévérité de la lésion ischémique cellulaire (12).

L’évolution des lésions ischémiques est marquée par la mise en œuvre d’une succession de processus délétères débutant immédiatement au décours de l’ischémie, tels que l’excitotoxicité ou le stress oxydant, et se prolongeant parfois plusieurs jours, comme l’inflammation post ischémique (13).

1.1.5.2.1     Calcium  et  excitotoxicité  :  déterminants  initiaux  de  la  mort  cellulaire    

L’une des conséquences principale et la plus rapide de l’ischémie au sein du tissu cérébral est l’augmentation de la concentration intracellulaire de calcium, conduisant rapidement à la nécrose. Cette destruction cellulaire s’effectue par l’intermédiaire de la mise en jeu de plusieurs systèmes enzymatiques (protéines kinases, protéases, NO-synthétase [NOS]) responsables d’une inhibition de la synthèse protéique, de la production de radicaux libres ou encore de l’altération des protéines du cytosquelette. Si l’invasion calcique est déclenchée par la déplétion énergétique cellulaire et par l’anoxie, responsables par ailleurs d’une dépolarisation anormale des cellules, elle est entretenue par la libération massive d’acides aminés excitateurs, en particulier du glutamate. Ces événements successifs vont rapidement être complétés par la mise en jeu d’autres mécanismes délétères, mais aussi protecteurs, en rapport avec la synthèse de NO (13).

1.1.5.2.2     NO  (oxyde  nitrique),  stress  oxydant  et  ischémie  cérébrale    

De nombreux travaux réalisés ces dernières années ont permis de mettre en évidence l’implication importante du NO au cours de l’ischémie cérébrale. Les effets délétères, mais aussi parfois bénéfiques de celui-ci, au cours du processus ischémique, sont dépendants de la mise en jeu des différentes isoformes de la NOS. L’activation, sous l’effet de l’élévation de la concentration en calcium intracellulaire, de la NOS neuronale (NOS de type I) dans les 10 minutes suivant l’ischémie va constituer l’une des premières

étapes de la toxicité du NO. Dans les 12 heures suivantes, l’augmentation de l’activité de la NOS inductible (NOS de type II), exprimée par les cellules astrocytaires et gliales, l’endothélium vasculaire et les macrophages, va conduire là encore à la majoration des lésions ischémiques. La synthèse de NO par les NOS de types I et II va contribuer au stress oxydatif par la formation de radicaux libres, en particulier de peroxynitrites qui, au niveau des cellules neuronales mais aussi endothéliales, seront responsables de la peroxydation des lipides membranaires et de l’oxydation des protéines, contribuant ainsi à la mort cellulaire. Il a aussi été démontré que le NO produit par les NOS de types I et II pouvait avoir une action délétère plus directe du fait de:

– la majoration de l’excitotoxicité induite par le glutamate ;

– l’aggravation du déficit énergétique cellulaire par activation de la poly-(ADP-ribose) synthétase (PARS) ;

– l’induction de lésions de l’ADN par inhibition de la ribonucléoside-réductase.

En contrepartie, le NO produit par la NOS endothéliale (NOS de type III), dès la première heure de l’ischémie, aurait quant à lui un rôle protecteur. Il serait en effet capable de diminuer l’adhésion leuco-plaquettaire, de contrôler le tonus vasculaire et d’améliorer ainsi le débit sanguin cérébral, de même qu’il pourrait favoriser les processus antithrombotiques et fibrinolytiques à la surface de l’endothélium vasculaire (13).

1.1.5.2.3     Inflammation  post-­‐ischémique    

Les concentrations intracellulaires élevées en calcium, la production de NO et de radicaux libres ainsi que l’hypoxie vont contribuer à l’activation de nombreux facteurs de transcription nucléaire, en particulier du facteur NF-κB. L’activation de ce facteur de transcription a de nombreux effets délétères :

– augmentation de la synthèse de NO via la NOS de type II, renforçant ainsi les effets délétères de celle-ci ;

– expression de la cyclo-oxygénase de type2 (COX-2), enzyme impliquée dans la synthèse de prostanoïdes toxiques et oxydatifs ;

– expression de nombreuses cytokines telles que le tumor necrosis factor α (TNFα) et l’interleukine 1ß (IL-1ß), cytokines impliquées dans l’activation des cellules gliales et des macrophages (synthèse de NOS de type II et de COX-2) ainsi que dans les processus favorisant l’adhésion des polynucléaires et des monocytes à l’endothélium vasculaire (activation des protéines d’adhésion ICAM-1, sélectine P, sélectine E, etc.) et leur migration au sein du parenchyme cérébral, contribuant de cette manière à l’augmentation de l’importance des lésions ischémiques (13).

1.1.5.2.4     Apoptose    

Parallèlement aux phénomènes de nécrose cellulaire qui surviennent précocement, en particulier au cœur de l’ischémie, l’augmentation de la concentration cellulaire en calcium, la production de NO et de radicaux libres ainsi que les médiateurs de l’inflammation vont être susceptibles de mettre en œuvre un processus de mort cellulaire programmé, l’apoptose. Ce processus est, par définition, différé dans le temps.

Il prédomine au sein de la zone de pénombre, lorsque l’intensité des lésions cellulaires n’engendre pas la suprématie des phénomènes nécrotiques, et fait intervenir des processus biologiques complexes. L’augmentation de la concentration en calcium,

particulièrement lorsqu’elle est secondaire à l’activation de récepteurs glutamate non- NMDA (non-NMDA signifie ionotropiques : AMPA, Kaïnate, ou métabotropique : mGluR ; les récepteurs AMPA sont les plus impliquées dans l’apoptose par Ca ++), va constituer l’un des signaux activateurs principaux de l’apoptose par l’intermédiaire de l’expression de gènes de réponse immédiate (IEG) permettant la transformation, par l’activation d’autres gènes, d’un signal extracellulaire en modifications à plus long terme. Ainsi, l’expression de la Trp53 va provoquer un déséquilibre entre des facteurs pro- apoptotiques et anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 en faveur de l’apoptose.

La famille Bcl-2 peut être subdivisée en membres pro-apoptotiques (Bax, Bad, Bid) et anti-apoptotiques (sous-famille Bcl-2). La surexpression de Bcl-2, protéine anti- apoptotique, dans des souris transgéniques amène une protection contre l'ischémie.

L'expression de Bcl-2 est aussi modulée par l'ischémie, avec une importante diminution d'expression six heures après une ischémie sévère. Les protéines de cette famille sont impliquées dans le contrôle d'événements mitochondriaux de l'apoptose tels que le relâchement de cytochrome C. Le cytochrome C est relâché après une ischémie et contribue à l'activation de la caspase 3.

Les caspases sont une famille de protéases jouant un rôle primordial dans l'apoptose, ainsi nommées en raison de la cystéine contenue dans leur site actif, et en raison de leur spécificité de clivage, qui survient après un résidu aspartate (cystéine, aspartate, protéase). Douze caspases sont actuellement connues chez les mammifères. Elles sont activées en cascade. Elles sont synthétisées sous forme de pro-enzyme, puis clivées protéolytiquement pour être activées. La caspase 3 est considérée comme la caspase exécutrice principale. On lui connaît un grand nombre de substrats, notamment la DNAse, la poly ADP-ribose polymérase (PARP), l'actine ou encore la huntingtine.

Ainsi, l’activation de nombreuses caspases peut engendrer des altérations de l’ADN cellulaire, une désorganisation du cytosquelette et un délabrement de la membrane cytoplasmique.

La caspase 3 est exprimée dans le cerveau du rongeur. Elle est activée après ischémie cérébrale et peut être détectée dans des cellules neuronales. En effet, elle colocalise avec un marquage TUNEL ("Terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling"), qui marque les brins d’ADN coupés lors du processus apoptotique, confirmant ainsi un lien avec l'induction d'une mort cellulaire de type apoptotique.

Un argument important en faveur du rôle des caspases dans l'ischémie cérébrale est que les inhibiteurs de caspases protègent contre l'ischémie en réduisant la taille de la lésion et en améliorant les déficits fonctionnels. Une telle protection a été obtenue avec des inhibiteurs peptidiques de caspases, administrés directement à l’intérieur des ventricules cérébraux dans différents modèles d'ischémie cérébrale. Chez la souris, lors d'ischémie cérébrale focale sévère par occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne pendant deux heures, l'administration, jusqu'à une heure après la reperfusion, de l'inhibiteur sélectif de la caspase 3 zDEVD.fmk ou de l'inhibiteur de caspase non spécifique zVAD.fmk permet d'obtenir une réduction de l'importance des dommages.

Lors d'ischémie moins sévère, par occlusion de l'artère cérébrale moyenne de trente minutes, les mêmes inhibiteurs, administrés jusqu'à neuf heures après la reperfusion, permettent d'obtenir également une protection, le degré de protection étant meilleur lors d'ischémie légère que lors d'ischémie sévère (14, 15, 16, 17, 18, 19, 20).

Le blocage de certaines de ces caspases ou encore l’induction préférentielle de protéines anti-apoptotiques constituent donc de nouvelles voies de recherche dans le traitement de l’ischémie cérébrale.

1.1.6     Stratégies  thérapeutiques  

Une meilleure connaissance de la physiopathologie des AVC ischémiques a permis le développement de programme de prévention et d’outils thérapeutiques spécifiques.

1.1.6.1    Prévention  

La prévention primaire (destinée à diminuer l'incidence d'une maladie, donc à réduire l'apparition des nouveaux cas) des AVC ischémiques passe par l’évaluation des facteurs de risques (cf. supra) et leurs corrections. La diminution actuelle de la mortalité liée aux AVC est largement attribuable à l’amélioration du contrôle des facteurs de risque et notamment de l’hypertension artérielle, grâce aux agents antihypertenseurs.

La prévention secondaire (destinée à diminuer la prévalence d'une maladie, donc à réduire sa durée d'évolution) est l’une des avancées majeure de ces quarante dernières années, notamment l’introduction d’antiagrégants plaquettaires comme l’aspirine, d’anticoagulants pour les patients souffrant de fibrillation auriculaire, l’endartérectomie pour les sténoses carotidiennes symptomatiques, les antihypertenseurs et les hypolipémiants (4).

Les statines semblent également prometteuses tant dans la prévention primaire, que dans la prévention secondaire. Dans la prévention primaire, une large étude (JUPITER) mettait en évidence une diminution de 48% du risque d’AVC ischémique chez les patients avec une augmentation des facteurs de risques classiques (genre masculin, âgés, et fumeurs) chez les patients traités par la rosuvastatine versus ceux traités par placebo (21).

Relevons qu’à titre expérimental, le pré-conditionnement, qui consiste à induire un phénotype protecteur avant que le stress ischémique ne survienne, semble prometteur.

Il s’agirait donc d’activer les voies moléculaires qui confèrent des mécanismes de défenses endogènes vis-à-vis de l’agression ischémique et de prévenir, par la répression de l’activité des gènes correspondants impliqués, l’activation des voies moléculaires qui jouent, au cours de l’ischémie, un rôle essentiel dans l’induction de la mort neuronale nécrotique ou apoptotique. On peut distinguer deux types d’effecteurs : (1) ceux qui résultent d’une programmation génomique des fonctions de survie : protéines anti- apoptotiques (Bcl-2, UCP-2, IAP inhibitors of apoptosis proteins), enzymes de réparation de l’ADN, gènes de survie, enzymes anti-oxydantes, facteurs neurotrophiques et de croissance, érythropoïétine, protéines chaperones (HSP pour heat shock protein etc.) ; (2) ceux qui résultent d’une programmation génomique de l’inhibition des phénomènes de mort cellulaire : protéines pro-apoptotiques (Bax, cytochrome c et AIF), facteurs de transcription pro-inflammatoires (NFκB), enzymes de production de radicaux libres, endonucléases, p53, c-jun, etc. Si, longtemps, le préconditionnement a été considéré comme un mécanisme essentiellement neuronal, il est maintenant reconnu comme un phénomène de protection global des trois compartiments de l’unité neurovasculaire (l’endothélium, les astrocytes et les neurones).

Les mécanismes précédemment cités ont été souvent décrits à l’échelon neuronal et le préconditionnement induit également une augmentation de la neurogenèse. Mais il est

également capable de préserver la fonction endothéliale avec pour conséquence un maintien du débit sanguin cérébral et des capacités d’angiogenèse. Les astrocytes et les cellules microgliales sont également transitoirement activés par le préconditionnement (22).

Dans la continuité des travaux sur le préconditionnement, l’effet neuroprotecteur préventif de classes médicamenteuses utilisées dans la prévention primaire ou secondaire des accidents ischémiques cérébraux a été testé. Une série de travaux a permis de montrer que l’administration préventive de différentes statines était associée à une diminution de la taille des infarctus dans des modèles expérimentaux, à une augmentation de l’expression de la NOS endothéliale et à un effet antioxydant. Les antagonistes des récepteurs AT1 de l’angiotensine 2 ont également des effets similaires, par leur modulation des voies impliquées dans le phénomène de préconditionnement cérébral. Un effet identique a été également décrit avec la classe des fibrates. Hormis les médicaments, l’exercice physique ou la prise d’oméga-3 induisent expérimentalement un effet neuroprotecteur préventif. Des résultats expérimentaux complémentaires ont démontré que l’effet de ces différentes classes, en particulier celle des statines, ne persistait pas au-delà de quelques jours après l’arrêt de l’administration de la molécule, avant la réalisation de l’ischémie, suggérant que l’effet neuroprotecteur préventif n’est pas lié à un mécanisme de préconditionnement mais plus à la présence du médicament dans l’organisme au moment de la survenue de l’accident ischémique cérébral. Il n’en demeure pas moins que, quel que soit le mécanisme en jeu, la neuroprotection préventive reste cliniquement pertinente puisque plusieurs études cliniques ont permis de montrer que les patients traités par des agents hypolipémiants ou pratiquant un exercice physique régulier avant la survenue d’un accident ischémique cérébral ont une sévérité moindre des symptômes cliniques (23).

1.1.6.2   Traitements  d’aujourd’hui,  traitements  de  demain  

Le décours temporel de l’ischémie cérébrale aiguë nécessite d’adapter la réponse thérapeutique à l’évolution de la lésion.

Tiré de Régis Bordet, Ischémie cérébrale : les pistes thérapeutiques de demain, Médecine/Science | Octobre 2009 | Volume 25 | n° 10

1.1.6.2.1     Interventions  ciblées  sur  le  moment  de  survenue  de  l’ischémie  cérébrale  

Un des objectifs principaux du traitement de l’accident ischémique aigu est la restauration du flux sanguin et l’amélioration de la perfusion de la région affectée. La pierre angulaire de ce traitement est la recanalisation rapide d’un vaisseau parent via l’exérèse ou la dissolution du thrombus obstructif et la prévention de la propagation des thrombi en aval (11).

Le seul traitement dont l’utilisation est validée est la thrombolyse, notamment par administration intraveineuse d’activateurs recombinants du plasminogène tissulaire, applicable dans les quatre heures trente qui suivent le début de l’accident ischémique.

Elle assure une reperfusion rapide du tissu ischémié permettant d’accroître le nombre de patients vivants et autonome. Sa limite réside dans cette fenêtre thérapeutique étroite, car au-delà du délai recommandé de 4h30, le risque hémorragique est élevé. La proportion de patients susceptibles de bénéficier d’une thrombolyse est de ce fait inférieure à 10 %. Cette approche nécessite le développement de nouveaux agents fibrinolytiques ou le recours à des traitements adjuvants permettant de limiter le risque hémorragique d’une fibrinolyse administrée au-delà du délai recommandé.

Les techniques de thromboembolectomies mécaniques sont utilisées pour les patients présentant des contre-indications à la thérapie thrombolytique ou un échec de recanalisation après thrombolyse.

Outre ces stratégies thérapeutiques visant à rétablir aussi vite que possible le flux sanguin, de plus en plus d’études s’intéressent au développement de facteurs neuroprotecteurs, notamment ciblés sur la zone de pénombre.

Même si le concept de neuroprotection vis-à-vis des lésions ischémiques est né au cours des années 1980 avec les premières recherches sur la physiopathologie de l’ischémie cérébrale, ce n’est que dix ans plus tard que la recherche sur la neuroprotection a vraiment émergé, comme l’atteste l’afflux de publications référencées. Au cours des six dernières années, environ 1 000 articles expérimentaux et 400 articles cliniques ont été publiés dans ce domaine.

La neuroprotection peut être définie comme une stratégie ou une combinaison de stratégies qui peuvent inhiber, interrompre ou ralentir les événements moléculaires et cellulaires conduisant à des lésions ischémiques irréversibles ; elle exclue les thérapeutiques visant à agir directement sur l’obstruction artérielle elle-même (24).

Or, le développement de traitements neuroprotecteurs pour l’accident vasculaire cérébral ischémique est empêché par la présence de la barrière hémato-encéphalique et par la diminution de l’apport sanguin aux zones cérébrales ischémiées. Si, dans la zone nécrotique (le core de l’infarct), le métabolisme diminue au point d’atteindre rapidement une disparition complète de l’ATP et une mort cellulaire, dans la pénombre, l’ATP diminue dans une proportion moindre, influençant le devenir des cellules de cette zone. Cette connaissance a généré une intense recherche sur les moyens de générer une suppression métabolique pour diminuer la demande énergétique de cette zone. Plusieurs moyens ont été identifiés, comme l’hypothermie et l’utilisation d’anesthésiques ou de sédatifs.

Outre la suppression métabolique des études expérimentales chez le rat ont cherché à amener de l’ATP dans la zone de pénombre, avec notamment l’utilisation d’ATP lysosomal.

Par ailleurs, l’ischémie cérébrale génère un changement du métabolisme en faveur de la glycolyse anaérobique, engendrant une baisse du pH dans la zone ischémiée. Cette observation a engendré des recherches pour créer des nanotransporteurs utilisant les propriétés acido-basiques pour relâcher leur cargaison (25).

S’appuyant sur des modèles expérimentaux reproduisant la pathologie vasculaire cérébrale et sur les nombreux mécanismes physiopathologiques mis en évidence (excitotoxicité, dépolarisation péri-infarctus, stress oxydant, inflammation, activation des caspases…), de nombreux agents neuroprotecteurs ont été évalués dans des modèles précliniques mais aussi en clinique. Les échecs répétés de ces essais ont conduit à remettre en question la pertinence de la stratégie, des modèles précliniques ou de l’évaluation clinique. Bien que cette stratégie de neuroprotection se soit heurtée à de nombreuses déconvenues, un certain nombre de pistes pharmacologiques restent exploitées ; elles proposent des approches innovantes pour cibler les principales voies physiopathologiques, en particulier celles qui interviennent de manière différée par rapport au début de l’ischémie (23).

Régis Bordet, en 2009, dans son article sur les pistes thérapeutiques de demain pour l’ischémie cérébrale, propose plusieurs cibles pour le développement de stratégies thérapeutiques:

Stratégies thérapeutiques de neuroprotection :

- antagonisation de l’excitotoxicité liée à la libération massive de glutamate, responsable de lésions sévères et rapides,

- antagonisation de la dépolarisation neuronale via les canaux sodiques ou calciques voltage-dépendants

- inhibition de l’apoptose de la pénombre péri-infarctus.

Stratégies thérapeutiques concernant l’unité neurovasculaire :

La plupart des recherches thérapeutiques dans les AVC se sont concentrées initialement sur le compartiment neuronal, alors que l’ischémie cérébrale touche l’intégralité de l’unité neurovasculaire qui intègre l’endothélium, les astrocytes, et les neurones (Figure ci-dessous). Chacun de ces acteurs de l’unité neurovasculaire est affecté par l’activation des différentes voies physiopathologiques déclenchées par l’ischémie cérébrale ; les interactions cellulaires qui existent au sein de l’unité neurovasculaire expliquent

pourquoi les altérations post-ischémiques de l’un des compartiments cellulaires ont des répercussions sur les autres compartiments.

Schéma des interactions au sein de l’unité neurovasculaire

de Régis Bordet, Ischémie cérébrale : les pistes thérapeutiques de demain, Médecine/Science | Octobre 2009 | Volume 25 | n° 10

Stratégies thérapeutiques concernant les cellules gliales et microgliales :

Les astrocytes sont des déterminants critiques dans la physiopathologie de l’ischémie cérébrale puisqu’ils assurent le couplage entre les neurones et les vaisseaux. Ils peuvent assurer une protection à court terme en libérant des facteurs de croissance ou à plus long terme par la libération d’autres molécules qui facilitent la neurogenèse et la régénération. Cependant la sévérité de l’ischémie peut compromettre les fonctions astrocytaires et la survie neuronale post-ischémique, en raison d’une diminution de l’apport d’énergie aux neurones et d’une contribution à la propagation de la dépolarisation péri-infarctus. Les cellules microgliales sont également activées au cours du processus d’ischémie cérébrale et exercent des effets contrastés voire contradictoires : (1) un effet délétère a été décrit, par le biais d’une libération de substances toxiques pour les neurones (cytokines, radicaux libres, médiateurs

inflammatoires…), expliquant l’effet neuroprotecteur de la minocycline ou de l’édaravone qui inhibent l’activation microgliale ; (2) des données plus récentes suggèrent que les cellules microgliales pourraient exercer un effet neuroprotecteur (26).

Stratégies thérapeutiques concernant le compartiment vasculaire :

Le compartiment vasculaire a été longtemps négligé alors que la réponse des neurones et des microvaisseaux adjacents au processus d’ischémie est probablement simultanée et coordonnée compte tenu des liens physiques étroits qui existent au sein de l’unité neurovasculaire. Très rapidement au décours du processus d’ischémie-reperfusion, les vaisseaux cérébraux répondent de façon dynamique par une ouverture de la barrière hémato-encéphalique, l’expression de marqueurs d’adhésion des leucocytes, l’effondrement de l’unité fonctionnelle neuro-glio-vasculaire, une diminution de la réactivité endothélium-dépendante et la dégradation de la matrice extracellulaire.

Toutes ces altérations influencent la viabilité des cellules avoisinantes et l’intégrité fonctionnelle des relations entre les apports vasculaires et l’activité neuronale et gliale.

1.1.6.2.2     Interventions  ciblées  sur  la  phase  de  décours  de  l’ischémie  cérébrale  

Contrairement à une idée reçue, dans la pathologie ischémique cérébrale, tout n’est pas joué dans les premières heures, même si la rapidité de l’intervention est indispensable pour préserver le maximum de tissu cérébral. L’observation clinique suggère que dans les jours et semaines qui suivent la survenue d’un accident vasculaire cérébral, une récupération fonctionnelle est encore possible, par exemple sous l’effet de la physiothérapie. Cette capacité de récupération est probablement liée à la plasticité cérébrale, favorisée par la mise en jeu spontanée de mécanismes endogènes, dont celle des facteurs neurotrophiques comme le BDNF (brain-derived neurotrophic factor) qui améliore la récupération fonctionnelle. Compte tenu des difficultés d’utilisation thérapeutique des facteurs neurotrophiques (passage de la barrière hémato- encéphalique, risques inhérents à une administration prolongée de facteurs de croissance), les recherches se sont portées sur l’évaluation de médicaments agissant directement ou indirectement sur ces facteurs neurotrophiques. Au décours d’une ischémie cérébrale, une mobilisation spontanée de cellules souches d’origine neurale ou issues de la moelle osseuse a été décrite, qui permet une réparation partielle du tissu cérébral lésé, puisque ces cellules souches sont capables de migrer dans le foyer ischémique et de s’y différencier en neurones, astrocytes ou cellules endothéliales. On pourrait donc imaginer amplifier cette réparation spontanée qui est insuffisante pour assurer une récupération significative. Deux approches ont été proposées : l’une utilise la thérapie cellulaire par administration de cellules souches par voie systémique. Des travaux précliniques ont été concluants et des études cliniques sont en cours qui visent à mieux définir les procédures (type de cellule, stade de différenciation, quantité, voie d’administration,…) et à en évaluer l’efficacité. L’autre approche est pharmacologique et son objectif est de mobiliser les cellules souches endogènes vers le foyer ischémique dans une perspective de réparation du tissu cérébral. Cette approche en est encore au stade de la recherche fondamentale, essayant de comprendre les mécanismes en jeu dans les phénomènes spontanés. Certains agents pharmacologiques ayant des effets protecteurs cérébraux (G-CSF, statines,…) agissent sur les cellules souches, ce qui pourrait en partie expliquer leurs effets bénéfiques (23, 24).

1.2   Modèle  animal      

La recherche sur l’ischémie cérébrale passe inévitablement par des modèles animaux. Or aucun modèle animal ne reproduit toute la complexité des variables connues dans l’AVC ischémique humain. La forme la plus commune d’AVC ischémique humain est l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne. Cependant les résultats physiologiques d’une occlusion dépendent aussi bien de l’intensité de l’occlusion, du type de phénomènes qui la produisent que de la localisation du thrombus, de l’anatomie des artères cérébrales et notamment du cercle de Willis, mais également de la présence des facteurs systémiques que sont l’hypertension, la présence de diabète, l’obésité, le tabagisme,…

Ainsi le choix de l’animal dépend à la fois de contraintes économiques, éthiques et physiologiques. Ces dernières prennent en compte le type de variations dans l’anatomie vasculaire, notamment dans l’artère cérébrale moyenne et le rapport substance grise/substance blanche le plus proche possible de l’humain, ce qui est le cas chez les animaux plus grands, mais avec comme corollaire une augmentation de la taille des craniotomies avec risque de dommages collatéraux faussant les données sur l’ischémie.

Chez la plupart des mammifères, l’obstruction de l’artère cérébrale moyenne résulte en un infarct qui touche le cortex moteur et somato-sensoriel, la substance blanche sous- jacente et les ganglions de la base (caudé-putamen et thalamus). Ces structures reçoivent cependant un apport sanguin de petites artères perforantes ou de segments adjacents du cercle de Willis.

La gerbille est considérée comme un modèle très favorable pour étudier les AVC ischémiques car elle n’a pas d’artères communicantes postérieures et, dans 20% des cas, pas d’artères communicantes antérieures, ce qui génère une homogénéité de la taille des infarcts et l’absence de phénomènes de reperfusion (27).

Le choix du modèle animal dépend également de la possibilité d’apporter des modifications génétiques comme la suppression de l’expression d’une protéine d’intérêt par l’exérèse du gène correspondant (knockout ou KO) ou sa surexpression par apport d’un transgène. A l’heure actuelle, les souris sont les mammifères qui permettent le plus aisément de procéder à des transformations génétiques, même si quelques mutations induites obtenues chez le rat peuvent s’avérer d’intérêt dans le domaine de l’ischémie.

1.3   Quelques   facteurs   neuroprotecteurs   potentiels   étudiés   dans   le   cadre   de   l’ischémie  cérébrale  

La physiopathologie complexe de l’AVC ischémique a généré une intense recherche de facteurs neuroprotecteurs depuis le début des années 90 et un nombre considérable de publications. Une revue exhaustive de toutes ces publications dépasse le cadre de cette thèse.

Globalement, on peut relever que les différentes phases des processus activés par l’ischémie ont chacune été la cible de recherches.

Dans une revue de 2007 sur la neuroprotection dans les AVC ischémiques, Ginsberg (24) relève que sur environ 160 études cliniques, le plus grand nombre (16) concerne les bloqueurs des canaux calciques sur les 48 neuroprotecteurs potentiels décrits.

Nous parcourrons quelques facteurs que cet auteur a particulièrement développés :

1.3.1     Les  inhibiteurs  des  canaux  calciques  

Le calcium joue un rôle central dans la physiopathologie de l’ischémie cérébrale. Le blocage des canaux calciques à activation lente diminue l’entrée de calcium dans les neurones, les protégeant ainsi de la nécrose (cf. p.8).  

1.3.2     Les  antagonistes  du  glutamate

Le glutamate, neurotransmetteur excitateur d’importance majeure dans le système nerveux central, peut induire des lésions neuronales consécutives à l’excitotoxicité lors de la survenue de l’ischémie cérébrale. Le glutamate et les acides aminés excitateurs correspondants interagissent avec plusieurs classes de récepteurs qui interviennent dans la neuroprotection, comme le NMDA (N-methyl-D-aspartate) et l’AMPA (acide proprionic 3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole). L’inhibition de ces récepteurs semble générer une neuroprotection en cas d’ischémie focale dans des études précliniques, moyennant une administration très précoce.  

1.3.3     Les  agonistes  GABA  

Le récepteur GABA est un inhibiteur du système nerveux central bien connu en médecine, notamment puisqu’il est le récepteur des benzodiazépines. Ainsi plusieurs benzodiazépines ont été administrées à des patients souffrant d’AVC ischémiques, avec des résultats cliniques peu satisfaisant probablement liés à latence entre l’événement ischémique et l’administration du traitement.  

1.3.4   Le  magnésium  

Le magnésium peut être considéré comme un antagoniste endogène du calcium qui peut exercer un effet neuroprotecteur à travers plusieurs mécanismes, dont le blocage du récepteur NMDA, l’inhibition du relâchement de neurotransmetteurs excitateurs, le blocage des canaux calciques et la relaxation de la musculature lisse vasculaire. Les études précliniques semblent cependant ne mettre en évidence qu’un faible potentiel neuroprotecteur.

1.3.5   Les  antioxydants  

En limitant les effets dévastateurs des radicaux libres, les antioxydants seraient théoriquement utiles comme facteur de neuroprotection. Néanmoins, les études cliniques restent peu prometteuses (24).

1.3.6   L’hypothermie  thérapeutique  

L’hypothermie thérapeutique modérée est l’une des stratégies neuroprotectrices les plus solides disponible actuellement en cas de traumatisme crânien aigu chez l’homme et dans des modèles expérimentaux d’ischémie cérébrale focale chez l’animal, alors que la fièvre, même modérée aggrave le devenir des AVC ischémiques (28).

Au total, aucun de ces facteurs neuroprotecteurs ne se révèle être la panacée pour le traitement de l’AVC ischémique chez l’homme. Leur toxicité, leur difficulté à pénétrer la barrière hémato-encéphalique, ou encore la marge temporelle extrêmement réduite entre l’événement ischémique et leur efficacité potentielle en limitent les performances. Un effort considérable est cependant poursuivi pour effectuer des études neurobiologiques, précliniques et cliniques pour développer un traitement des AVC ischémiques alternatif à la thrombolyse.

2.   La  Clustérine    

La clustérine (CLU) est une glycoprotéine dont la complexité fonctionnelle a généré une importante quantité de recherches avec des résultats parfois contradictoires. Ses noms ont été multiples, selon le lieu où elle était découverte comme en témoigne le tableau suivant, issu de M. Rosenberg, S. Silkensen, 1995 (29).

(sulphated glycoprotein 2 (SGP-2), initialement désignée comme dimeric acidic glycoprotein (DAG); SP-40,40 : protéine sérique composée de deux sous unités d’un poids moléculaire 40’000 chacunes ; CLI : cytolysis inhibitory protein ; TRPM-2 : testosterone-repressed prostatic messenger-2; apo J et NAI/NA2 : protéine impliquée dans le transfert de cholestérol entre les particules de lipoprotéines ou qui se lie à la lipoprotéine A; gp III : glycoprotein III, faisant partie des protéines composants les granules chromaffines sécrétés; et d’autres dénominations comme T-64, gp 80, pADHC,…)

Depuis quelques années, « clustérine » a été défini comme le nom officiel de cette protéine, en référence aux auteurs qui l’ont découverte.

Depuis une dizaine d’année, deux formes de clustérine ont été mises en évidence, une forme sécrétée qui se trouve de manière quasi ubiquitaire dans les tissus (testicules, épididyme, ovaires, foie, estomac, prostate, reins, surrénales, cerveau, rétines, cœur (oreillettes),…), et les fluides biologiques (plasma, LCR, lait, urine, sperme), et une forme nucléaire. Dans le cerveau, la clustérine est exprimée dans les neurones et les astrocytes. Sa localisation est étendue: neurones corticaux (couches IV et VI), hippocampe (neurones pyramidaux de CA2-3), dans la substance noire, dans le locus coeruleus, dans les neurones du tegmentum mésencéphalique, les bulbes olfactifs, les plexus choroïdes (30).

Nous avons effectué une mesure de l’expression tissulaire de la clustérine chez la souris par RT-PCR (reverse transcriptase polymerisation chain reaction : amplification de l’ARN en ADN qui permet de quantifier l’expression d’un gène dans un tissu):

La clustérine semble impliquée dans de nombreux processus biologiques, dont la maturation du sperme, la différenciation tissulaire, le recyclage membranaire, le transport de liquides, les interactions entre cellules ou entre une cellule et un substrat, la prolifération tissulaire, la survie ou la mort cellulaire. Elle a donc été étudiée dans de nombreuses conditions physiopathologiques, comme l’ischémie, la neurodégénérescence, le vieillissement et les cancers. Un ouvrage sur la clustérine a d’ailleurs été publié en 2009 (31).

2.1     Historique  

La clustérine a été isolée pour la première fois en 1983, dans le rete testis de béliers par l’équipe de Fritz et coll. (32). Cette découverte est liée à la recherche des facteurs expliquant l’agrégation des cellules de Sertoli et des globules rouges en suspension, lorsqu’ils sont mise en présence de liquide issu du rete testis des béliers. Cette agrégation intercellulaire est responsable du nom de la clustérine (celle qui génère des clusters ou des agrégats).

2.2     Structure  

La clustérine est une glycoprotéine de poids moléculaire de 75-80 kDa dont 30% de la masse est due à sa glycosylation. Elle comprend 449 acides aminés. La structure de la protéine est un hétérodimère avec deux chaînes (α et β) liées par 5 ponts disulfure. Elle possède trois hélices α amphiphiliques (bleu clair sur le schéma ci-dessous) et deux hélices α (bleu foncé) torsadées et enroulées sur elles-mêmes (« coiled-coil » en anglais, qui signifie que la structure tridimensionnelle de cette zone est marquée par des torsades enroulées sur elles-mêmes en raison de la répétition de motifs de 7 acides aminés hydrophobes et chargés). Cette structure torsadée peut être responsable de la polymérisation de la protéine, dépendante du pH. Lorsque le pH baisse, la clustérine a tendance à se trouver sous forme de monomère. La protéine est caractérisée par un point isoélectrique de 3.6.

La clustérine est codée par un seul gène sur le chromosome 8 (8p21-p12) chez l’homme (9 exons, 16’580 bp). La présence de sites promoteur alternatifs pour l’initiation de la

0 0.0001 0.0002 0.0003 0.0004 0.0005 0.0006 0.0007 0.0008 0.0009

Nb de copies/18S

Expression tissulaire de la clustérine chez la souris (RT-PCR)

transcription générerait, selon les tissus, deux isoformes d’ARNm, pour revue, voir Rizzi et coll (33). Plusieurs facteurs de croissance (TGFβ, NGF, EGF), cytokines et facteurs pro-apoptotiques (TNFα,…) moduleraient l’expression des protéines correspondantes de manière différentielle selon les tissus et lignées cellulaires. Il existe une forme soluble de clustérine, fortement glycolsylée, présente dans le cytoplasme et sécrétée dans le milieu extracellulaire (sCLU). Une forme préférentiellement localisée dans le noyau (nCLU), correspondant à une séquence tronquée (début Met 34, cf. schéma représentant le précurseur CLU ci-dessous) a été mise en évidence par immunohistochimie dans diverses lignées cellulaires sans toutefois bénéficier pour le moment d’une identification formelle. D’autres isoformes de clustérine ont été rapportées dans certaines lignées de cellules tumorales. Leur présence dans le système nerveux ou encore dans les fluides biologiques reste toutefois à établir.

La clustérine est assez stable à travers les espèces, puisqu’elle partage 70-80%

d’homologie de séquence chez les mammifères.

Tiré de Jones SE, Jomary C, 2002 (34).

2.3     Ontogenèse  

French et coll. ont analysé la distribution cellulaire de la clustérine durant l’embryogenèse murine. A partir de 12.5 jours de développement, le gène de la clustérine est largement exprimé dans les épithélia en développement, comme la peau, les dents, le duodénum. De plus, une expression transitoire et localisée du gène de la clustérine a été détectée dans certains épithélia morphogénétiquement actifs. Dans les poumons, le transcrit du gène de la clustérine semble présent dans les cellules épithéliales cuboïdales des boutons bronchiques terminaux durant la morphogenèse et dans le rein, la présence de l’expression du gène coïncide avec le processus de polarisation. Ainsi, la clustérine semble avoir un rôle à jouer dans la différenciation et la morphogenèse de certains épithélia chez la souris (35).

Dans le système nerveux central, la clustérine montre une localisation préférentielle dans des sous-populations astrocytaires (hippocampe, néocortex) et neuronales (nerf facial, hypoglosse, noyau moteur dorsal du nerf vague et corne antérieure de la moelle épinière). La clustérine est aussi fortement exprimée dans les protoneurones des ganglions spinaux. Cette expression déjà présente au cours de la période néonatale, persiste chez l’adulte et semble indépendante de tout stress. Nous noterons aussi une très faible expression de la clustérine dans l’ensemble des neurones du cerveau, expression non détectée chez la souris KO pour ce gène. Etonnamment, l’absence de clustérine (souris invalidée pour le gène de la clustérine) ne semble pas causer d’altération sévère de la morphologie cérébrale, de la myélinisation ou de la synaptogenèse, mais pourrait être associée avec une perte de motoneurones, notamment du nerf facial, de manière postnatale. Les conséquences physiologiques de cette découverte ne sont pas encore clairement établies. Par ailleurs, une large population d’astrocytes expriment la clustérine à travers le néocortex et l’hippocampe du jour embryonnaire E18 au jour postnatal P15. La plupart de ces astrocytes semblent activés (GFAP positifs et critères morphologiques) (36).

2.4     Fonctions  physiologiques  

Comme déjà mentionné, les fonctions de la clustérine sont longtemps restées énigmatiques. Nous allons passer en revue les principales fonctions étudiées, sachant que ces sous-chapitres sont arbitraires puisque plusieurs fonctions de la clustérine se regroupent.

2.4.1   Agrégation  cellulaire  in  vitro  

La clustérine induit l’agrégation cellulaire de plusieurs types cellulaires in vitro, comme les globules rouges et blancs, les spermatides, les cellules de Sertoli et les cellules épithéliales rénales. Il s’agit d’une agrégation homotypique, les cellules ne se liant qu’aux cellules de la même nature. Cette agrégation est réversible en présence de carnitine (37, 38).

0.0E+00 5.0E-05 1.0E-04 1.5E-04 2.0E-04 2.5E-04 3.0E-04 3.5E-04 4.0E-04 4.5E-04 5.0E-04

nb copies CLUMO pour 1 copie 18S

Ontogenèse de la clusterine cérébrale mesurée par RT-PCR

14jours gestation 16jours gestation 18jours gestation Naissance 1 semaine 2 semaines 4 semaines 6 semaines 8 semaines

2.4.2   Protéine  chaperone  extracellulaire,  indépendante  de  l’ATP  

Une protéine chaperone est une protéine dont la fonction est d'assister d'autres protéines dans la maturation de leur conformation, assurant un repliement tridimensionnel adéquat, afin d’éviter que celles-ci ne se dénaturent, ne précipitent ou ne s’agrègent. La clustérine peut inhiber la précipitation de protéines, induite par des stress tissulaires (variation de température, de pH,…) et a donc cette caractéristique de chaperone.

Beaucoup de protéines chaperones sont des protéines de choc thermique (Heat shock proteins: Hsp), c'est-à-dire des protéines exprimées en réponse à des variations de température, ou d'autres types de stress cellulaire, notamment le changement de pH.

Une région du promoteur de la clustérine, très conservée phylogénétiquement chez les vertébrés, est spécifiquement reconnue par le facteur de transcription HSF1 (heat shock factor 1), qui peut ainsi induire sa transcription en cas de choc thermique. Le rôle des protéines chaperones est de prévenir les dommages potentiellement causés par la perte de fonction protéique due à un mauvais repliement tridimensionnel.

C’est grâce à ses hélices α amphiphiliques et torsadées que la clustérine exerce une action de détergent biologique ou d’adaptateur moléculaire qui favorise la recapture cellulaire et la dégradation de macromolécules indésirables dans le sang circulant. La structure de la clustérine est plus sensible au pH ambiant qu’à la chaleur (39).

Dans la liste des ligands de la clustérine étudiés, on relève de nombreuses molécules qui peuvent laisser présager des différentes fonctions biologiques de cette protéine : -L’apolipoprotéine A-1,

-les lipides (la clustérine est une lipoprotéine responsable du transport des lipides, mais qui se lie également à certains récepteurs du cholestérol),

-le peptide β-amyloïde (source de nombreuses recherches sur le rôle de la clustérine dans la maladie d’Alzheimer),

-les composants du complément (cf. infra),

-la glutathion-S-transférase (les glutathion S-transférases (GSTs) sont une superfamille d'enzymes responsables de la détoxification de composés toxiques d’origine exogène et endogène. Les GSTs peuvent avoir des activités péroxidase, isomérase ou thiol transférase et également d’exprimer fonctions non-catalytiques, comme l’interaction avec différents ligands ou la modulation de la signalisation cellulaire),

-la glycoprotéine 330 (la glycoprotéine 330 est un membre d'une famille de récepteurs endocytosiques liés à la mégaline, récepteur des LDL (lipoprotéine de basse densité)), -l’héparine,

-les immunoglobulines (notamment l’IgG, l’IgA et IgM),

-la paraoxonase (enzyme impliquée dans l’hydrolyse des organophosphates, qui agit comme antioxydant et contributrice majeure des effets bénéfiques des HDL (lipoprotéine de haute densité) cholestérol),

-le peptide prion, responsable de la maladie de maladie de Creutzfeldt-Jakob,

-le récepteur du TGF-β (le facteur de croissance transformant bêta contrôle la prolifération, la différenciation cellulaire, et d'autres fonctions dans la plupart des cellules. Il joue un rôle dans l'immunité et le cancer. Il se lie à un récepteur de type II qui engendre une cascade de réactions (Smad), forme un complexe qui entre alors dans