Extraction et analyse de principes actifs d'origine végétale: application à l'artémisinine extraite de 'Artemisia annua' L.

Thesis

Reference

Extraction et analyse de principes actifs d'origine végétale:

application à l'artémisinine extraite de 'Artemisia annua' L.

KOHLER, Marcel

Abstract

Ce travail présente l'optimisation et la comparaison de techniques d'extraction et d'analyse de l'artémisinine, une lactone sesquiterpénique à potentiel antimalarique, contenue dans la plante 'Artemisia annua' L. Les techniques étudiées comprennent l'extraction solide-liquide conventionnelle, assistée par ultrasons ou micro-ondes, ainsi que l'ASE ou la SFE. La technique la plus sélective, la SFE, a également été appliquée à l'échelle semi-préparative.

L'artémisinine et ses dérivés ont été dosés dans les extraits par GC, SFC sur colonnes capillaires ou remplies ainsi que par HPLC. Dans ces deux derniers cas, la détection par ELSD a été utilisée afin de palier à l'absence de chromophores. Les séparations SFC et HPLC ont été confirmées par le couplage à la spectrométrie de masse. Finalement, une méthode HPLC-MS a été développée pour le dosage de l'artémisinine et de son métabolite principal, la dihydroartémisinine, dans du sérum.

KOHLER, Marcel. Extraction et analyse de principes actifs d'origine végétale:

application à l'artémisinine extraite de 'Artemisia annua' L.. Thèse de doctorat : Univ.

Genève, 1999, no. Sc. 3129

DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:104546

Available at:

http://archive-ouverte.unige.ch/unige:104546

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1 / 1

UNIVERSITÉ DE GENÈVE

Département de chimie minérale, analytique et appliquée Section de chimie

Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique Section de pharmacie

FACUUTÉ DES SCIENCES

Professeur W. HAERDI

Professeur J.-L. VEUTHEY

Extraction et analyse ^de principes actifs d'origine ^végétale

Application ^à l'artémisinine extraite

de Artemisia annua.L.

THÈSE

présentée à la Faculté des sciences ^de l'lJniversité de Genève

pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention chimique par

Marcel

KOHLER

de

Lauperswil ^(Berne)

Thèse N" 3129

Genève

Atelier de reproduction ^de la Section de physique L999

UNIVERSITÉ DE GENÈVE

Département de chimie minérale, analytique et appliquée Section de chimie

Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique Section de pharmacie

FACUUTÉ DES SCIENCES

Professeur W. HAERDI

Professeur J.-L. VEUTHEY

Extraction et analyse de principes actifs dbrigine ^végétale

Application ^à I'artémisinine extraite de Artemisia annua"L.

THÈSE

présentée à la Faculté des sciences de I'université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention chimique

par

Marcel

KOHLER

de

Lauperswil ^(Berne)

Thèse N" 31,29

Genève

Atelier ^de reproduction de la Section de physique L999

Lo Foculté des sciences, sur le préovis

de

Messieurs W. HAERDI, profeseur _honoroire

et

directeur

de

thèse (Déportement

de

chimie minérole, onolytique

et

oppliquée), J.-1. VEUTHEY, professeur ordinoire

et

codirecteur

de

thèse ^(Section

de

phormocie

-

Loborotoire

de chimie onolytique

phormoceutique),

C.

BlCCHl, ^profeseur

(Università degliStudidiTorino, Diportimento discienzo e Tecnologio del Formoco

-

^ltolio),

M.

DREUX, profeseur (Université d'Orléons, UFR Sciences, Loborotoire

de

chimie bioorgonique et onolytique

-

^{Fronce), L. WUNSCHE, docteur} (Firmenich SA

-

^Genève)

et

P. CHRISTEN, docteur ^(Section

de

^phormocie

-

Loborotoire

de

chimie onolytique phormoceutique), _outorise I'impression

de lo

^présente thèse, sons exprimer d'opinion

sur les propositions qui y sont énoncées.

Genève, le 20 décembre ^'1999

Thèse -

3129 -

[e

Doyen, Jocques WEBER

Cette thèse est

dédiée

à mes parents pour leurs encouragements, leur compréhension et leur soutien sans faille

tout au long

de

mes

études.

Remerciements

Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance au professeur Werner Haerdi pour m'avoir accueilli dans son équipe. J'ai beaucoup apprécié la confiance dont

il

^a fait preuve à mon égard, tout en sachant rester toujours présent, et assurant ainsi une direction aussi ^efficace qu'humaine de ce travail.

Je remercie également le Professeur Jean-Luc Veuthey d'avoir co-dirigé ^cette thèse. Ses nombreux conseils scientifiques, ^sa disponibilité de tous les instants et tous les moyens techniques qu'ila mis à ma disposition ont été essentiels à la réalisation ^de celle-ci.

Mes remerciements vont aussi

au

Docteur Philippe Christen (Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique, Université de Genève) pour sa disponibilité et ^sa patience dans f initiation du chimiste ^que je suis au monde végétal.

Je tiens'à remercier le Docteur Laurent Wùnsche (Firmenich ^{SA, Genève)} pour les essais de SFE semi-préparative d'une part, et d'autre part pour avoir accepté de juger _ce travail.

Merci

aussi au

Professeur Michel

Dreux

(Université d'Orléans, France) de

m'avoir accueilli en stage dans son laboratoire. Je le remercie, ainsi ^que le Pro- fesseur Carlo Bicchi (Université de Turin, Italie) pour leur participation ^au

jury

de thèse.

Merci également au Docteur Nicolas Delabays (Station Fédérale de Recherches Agronomiques, Valais) pour la mise à disposition ^de tout le matériel ^{végétal né-} cessaire à la réalisation de cette étude'

Je remercie le Professeur Achille Benakis (Université de Genève) pour la mise à disposition ^de substances standards et de préparations galéniques

Ainsi que le Docteur Nancy Acton, du Walter Reed Army Institute of Research (Washington, USA) pour m'avoir fourni ^les substances de référence.

J'adresse mes vifs remerciements ^à Monsieur Rupert Haering (Université de Ge- nève) pour son efficace et inventive assistance technique tout ^{au long de ces} an- nées.

Toute ma reconnaissance va au Docteur Michel Pelletier (Université de Genève)

pour ses nombreux conseils et au Docteur Rossanna Martini (Université de Ge- nève) pour la réalisation ^{des photos de} microscopie électronique ^{à balayage,} ain- si qu'au Docteur Francine Dreier (Université de ^Genève) et à Monsieur Cédric Noir (Université de Genève) pour leur assistance dans ^des recherches bibliogra- phiques parfois ardues...

J'ajouterai encore Monsieur Cédric Schelling, Madame Catherine Michel et Monsieur Jacques Metzger (Université de Genève) pour leur aide précieuse.

Qu'il ^{me soit encore permis de remercier} ici tous mes collègues, stagiaires, diplô- mants ayant participé à l'élaboration de ce travail.

J'adresse aussi mes remerciements au Docteur Claude Corvi ainsi qu'à tous mes collègues du Service du Chimiste Cantonal pour leurs patience et compré- hension.

Merci aussi à tous mes amis pour leur présence au cours de ces années.

Merci Béatrice pour ta présence efficace et attentive ainsi que ta patience durant toute la rédaction de cette thèse.

Je ne saurais terminer sans remercier toute ma famille pour leurs compréhen- sion et soutien constants.

Publications ^et Présentations

Articles

scientifiques

r _[{.

Kohler, J.-L. Veuthey, ^W. Haerdi, Analysis by ^SFC (Capillary and Packed) of Artemisinin and Artemisinic ^Acid in Artemisia annuaL., Proceedings of the Eighteenth International Symposium on Capillary Chromatography,. Riua del

Garda, Italg, 1996, _PP 1776-1782.

r

l![. Kohler, W. Haerdi, P. Christen, J.-L. Veuthey, Determination

of

Artemisi- nin and Artemisinic Acid by Capillary and ^Packed Supercritical

Fluid

Chro- matography, J. High Resol. Chromatogr., 1997, vol. 20, pp 62-66.

r

\d. Kohler, W. Haerdi , ^P. Christen, J.-L- Veuthey, Extraction of artemisinin and artemisinic acid from Artemisia annua

L.

using supercritical ^carbon dioxide, J. Chromatogr.A, L997, vol. 785, pp 353-360.

o

_{l\d. Kohler,} W.Haerdi, P. Christen, J.-L. Veuthey, ^SFE and SFC of Artemisinin

and

Artemisinic Acid: An Improved Method for the Analysis ^of Artemisia an- nuaL. Samples, Phgtochem. Anal., L997, vol. 8, pp 223-227.

r

l\{. Kohler, W.Haerdi, ^P. Christen, J.-L. Veuthey, Evaporative light scattering detection: ^some applications in pharmaceutical analysis, TRAC, L997, vol 16,

pp 475-484.

o _[{.

Kohler, lV.Haerdi, ^P. Christen and J.-L. Veuthey, Detemination of artemi- sinin in Artemisia annua L. by off-line supercritical

fluid

extraction and su- percritical

fluid

chromatography coupled

to

an evaporative

light

scattering detector in Supercritical fluids methods and protocols, A.A. Clifford, J. Wil- liams, The Humana Press, in _Press.

Posters

r

t\1t. Kohler, J.-L. Veuthey, ^W. Haerdi, SFC and Extraction of Artemisinin and

Artemisinic

^Acid

in

Artemisia annua L., The 3rd European Symposium ^on Analytical SFC and SFE

&

^{The 6th} International Symposium on SFC and SFE, 1995, Uppsala, ^Sweden.

r

Iv[. Kohler, P. Christen, J.-L. Veuthey, Application of Supercritical Fluids ^to the Extraction and Chromatography ^of Artemisinin and Artemisinic Acid in Artemisiaannua

L.,44thAnnual

Congress of the Society for Medicinal Plant Research, L996, Praha, Czech Republic.

r

l![. Kohler, J.-L. Veuthey, W. Haerdi, Analysis by SFC (Capillary and Packed)

of Artemisinin and Artemisinic Acid in Artemisia annua L., Eighteen Interna- tional Symposium on Capillary ChromatograPhY, 20-24 May 1996, Riva del Garda, Italy.

r

l!t. Kohler, B. Kaufmann, F. Besse, W. Haerdi,J.-L. Veuthey, Influencingfac- tors for SFE of plant material z Artemi.sia

annual.

^leaves, a case study, 19th International S5rmposium on Capillary Chromatography, 25-29 May 1998, Riva del Garda, Italy.

Conférences

.

J.-L. Veuthey, M. Kohler, C. Staub, P. Edder, Evaluation of SFE for the Reco- very of Drugs of Abuse and Active Principles

in

Biological Matrices, The 3rd European SSrmposium on Analytical SFC and SFE & The 6th International Symposium on SFC and SFE, 1995, Uppsala, Sweden.

r

_{[\d. Kohler,} J.-L. Veuthey, W. Haerdi, Evaporative Light Scattering Detector Coupled

with

HPLC and Packed SFC: Application to the Analysis of an Anti- malarial Agent, Euroanalysis IX, L996, Bologna, Italy

I

TABLE ^DES MATIERES

PARTIE THEORIQUE

1. LEs pRrNcrpEs AcrrFs

vÉcÉtaux.. ^..

^.

1.1

Définition ^et origine.

1.2

^Formes d'utilisation des plantes médicinales

1.2.1

^{Les extraits}

L2.2

^Les principes actifs

I.3

^{La recherche} phytochimique- -

1.4

^La production des principes actifs végétaux. -

1.5

^{Le rôle de} lachimie analytique

2. LAMALARIA

2.1.

Historique et épidémiologie

2.2

^{Mode de} transmission...

2.3

^{Aspects cliniques.}

2.4

Aspects thérapeutiques. ... ^..

3. L'ARTÉMISININE

3.1

Découverte et origine ^{. .. .} ...

3.2

Artemisia annua L.. ^{. . ..}

3.2.1

Aspects botaniques

3.2.2

Culture / agronomie

3.2.3

Localisation de I'artémisinine dans Artemisia annua L.

3.2.4

Biosynthèse de I'artëmisinine et autres constituants de laplante

3.3

Caractéristiques chimiques ^{. .. . ..}

3.3.1

ldentffication

3.3.2

^Stabilité

3.4

^Production

3.4.1

^{La synthèse}

3.4.2

^La production in vitro

3.4.3

L'extraction àpartir de Artemisia annua L.

3.5

Mode d'action ^et métabolisme

4. METHODES D'EXTRACTION ET D'ANALYSE DE I,:ARTÉPTTSTUTNN

4.I

Traitement du matériel végétal

4.2

Méthodesd'extraction

4.3

Méthodes d'analyse

.9

9 10

1t

11 1

I

2 2 3 3 5 6

2t

23 23 23 25 13 13 13 13

t4 t6 I7

18

t8

19 20 20 20 21

ll 4.3.1

4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.3.6

Chromatographie en phase gazeuse (GC) Chromatographie en phase liquide (HPLC) Chromatographie en phase supercritique (SFC) Chromatographie sur couche mince gLC)

Immunoessais

Electrophorèse capillaire (CE)

25

5.

TECHNIQUES D'EXTRACTION

5.1

Introduction

5.2

L'extraction en phase supercritique (SFE) ... ..

5.2.1

Introduction

5.2.2

Brefrappelsurlesfluides supercritiques

5.2.3

Lesfluides supercritiques en extraction

5.2.4

^Les mécanismes d'extraction

5.2.5

^Les variables en SFE

6.2

La chromatographie en phase supercritique (SFC)

6.2.1

Introduction

6.2.2

^{SFC sur colonne} capillaire

6.2.3

^{SFC sur} colonnes remplies

6.2.4

Applications aux produits naturels

6.2.5

^Conclusion

6.3

^{Le détecteur} évaporatifàdiffrrsion de la lumière (ELSD)

6.3.1

Introduction

6.3.2

Description du ELSD

6.3.3

^La dffision ^de la lumière

6.3.4

La réponse du ELSD

6.3.5

^Exemples d'applicationduELSD dans Ie domainepharmaceutique

6.3.6

^Conclusion

6.4

^Le spectromètre de masse (MS)

6.4.1

Introduction

6.4.2

^{Le couplage} HPLC-MS

6.4.3

^{Principe de} l'intedace electrospray

6.4.4

^{Le phénomène} d'ionisation

6.4.5

Caractéristiques deI'interface électrospray

26 30 30 30

3I

33 33 34 34 34 35 36 37

5.3

Quelques techniques d'extraction solideJiquide en relation avec le travail présenté ^. 42

5.3.1

L'extraction accélérée par solvants

(ASE) .

⁴²

5.3.2

L'extraction assistée par

ultrasons

⁴³

5.3.3

L'extraction assistée par

micro-ondes

⁴⁴

6. TECHNTQUES ANALYTIQUES

6.1

Introduction

49 49 49 49 49 50 51 51

5l

51 52 55 56 57 57 57 57 s8 58 60 60

lll

PARTIE EXPERIMENTALE

7. INTRODUCTION

8. LA PRÉPARATION DE L'ÉCHANTILLON

8.1

^{Origine des plantes.}

8.2

Traitement du matériel végétal

8.3

Conservation du matériel végétal.

8.4

L'homogénéité ^de l'échantillon. ^.

9. L'EXTRACTION SOLTDE-LTQUTDE (SLE)

9.1.

Introduction

9.2

L'agitation mécanique et les ultrasons-. ^{. ..}

9.2.1

L'agitationmécanique

9.2.2

L'agitation par ultrasons

9.2.3

Comparaison des résultats obtenus selonles deux techniques

9.3

L'extraction ^{assistée par} micro-ondes. ^.

9.3.1

Introduction

9.3.2

Protocoleexpérimental

9.3.3

^{Résultats et} discussion ^-

9.4

L'extraction ^accélérêe par solvants (ASE)

9.4.1

Introduction

9.4.2

Protocole expérimental

9.4.3

Extraction ^{avec de} l'eau

9.4.4

Extraction ^{avec de} l'éthanol

9.4.5

^{Effet des} extractions surlamatricevégétale

9.4.6

^Discussion

I0.L'EXTRACTTON EN PHASE SUPERCRITIQUE (SFE)

10.1 Introduction

I0.2

L'optimisation ^des paramètres d'extraction ^.. -. ^.

10.2.1

Le choix du modificateur polaire

10.2.2

^{La pression}

10.2.3

La température

10.2.4

^{Le débit}

10.3 L'optimisation ^de la récupération

10.3.1 Le choix de la récupération par barbotage

10.3.2

Choix du solvant ^de

récupération

^.

1 0. 3

.3

^{Choix de Ia} température de récupération ^.

10.4 L'optimisation de lapreparation de l'échantillon ^. I 0.4.

I

^{Le degré de séchage de la plante}

10.4.2 La granulométrie de I'échantillon

65

67 67 67 68 68

69 69 70 70 71

7l

72 72 72 73 74 74 74 75 76 77 78

81 81 81 8T 85 86 89 89 89 90 91 91 92 87

lv

10.4.3

Conditions optimales

10.5 Effet de I'extraction sur la matrice végétale

10.5.1 Introduction

10.5.2 ^La plante après SFE

10.6 SFE Semi-préparative d'artémisinine àpartir d'Artemisia annua L.

10.6.1 Introduction

10.6.2

Conditions

10.6.3 Résultats

10.7 Discussion.

11.L4 CHROMATOGRAPHTE EN PHASE GAZEUSE (cC)..

11 .

1

Principe de la méthode. ^.

.

^.

LL.2 La dégradation thermique de I'artémisinine

11.3 Obtention des spectres de masse des composés d'intérêt. ^{. .}

11.4 Mise au point de la séparation. ^{. . .}

11.5 Validation de la méthode ^. ..

11.6 Discussion.

tz.LL CHROMATOGRAPHTE EN PHASE SUPERCRITIQUE SUR COLONNE CAPILLAIRE (SFC)

I2.I

^{Raison du choix de} la SFC capillaire..

12.2 Appareillage ...

I2.3

Mise au point de la séparation. ^{. . .}

12.3.1 Démarche adoptée

12.3.2

Choix de la colonne

12.3.3 Influence de la température

12.3.4 Etude des paramètres d'injection

12.3.5

Conditions choisies

1,2.4 Mise au point de la méthode quantitative . . . .

12.4.1 Paramètres devalidation

12.4.2 Analyses parallèles entre la SFC-FID et Ia GC-FID L2.5 Discussion.

13.LA CHROMATOGRAPHTE EN PHASE SUPERCRITIQUE SUR COLONNE REMPLTE COUPLÉE AU ELSD

(SF'C-ELSD) .i.

....

13.1 Introduction

13.2 Appareillage ...

13.2.1 Description générale

13.2.2 Larestriction . . ^.

13.3 Mise au point de la séparation en mode isocratique

13.3.1

Stratégie

13"3.2 Colonne de silice vierge

13.3.3

Colonne de silice _Sreffée octadécyle

13.3.4 Colonne de silice _Sreffee arninopropyle

I3.3.5

Influence dumodificateur polaire sur laréponse du ELSD

13.3.6 Optimisation des paramètres ELSD

93 93 93 94 95 95 95 96 97

.99 .99 99 101 104 r07

108

109 109 109 110 110 1j/1 TT4 116 116 l17

TT7 119

t20

123

t23

123 123 125 r27 127 127 r31 131 132 r33

V

L3.4 Mise au point de la séparation avec gradient de méthanol

13.4.1 Stratégie

13.4.2

^{Choix des} conditions chromatographiques

13.4.3 Etude du couplage SFC-ELSD

13.4.4 Discussion

13.5 Conclusion

l4.I,:HPLC COUPLÉE AU DÉTECTEUR ÉVI.PON,IUF À DIFF'USION DE LA LUMrÈRE (HPLC-ELSD) ^.

14.l

Introduction

14.2 Mise au point de la séparation. ^.

I4.3

La détection ELSD

I4.4

Aspects quantitatifs de la méthode. ^{. . .}

14.4.1

Détection ELSD

I4.5

Dosage de I'artémisinine et de ses dérivés dans des preparations galéniques . , .

14.5.1

Introduction

14.5.2

Conditions expérimentales

14.5.3

Validation de la méthode

14.5.4 Application à l'analyse de comprimés

14.6 Comparaison à la détection UV.

I4.7

^{Exemples de} chromatogrammes d'exhaits d' Artemisia annaaL, 14.8 Discussion.

15.L'HPLC COUPLÉE AU SPECTROMÈTRE DE MASSE (HPLC-MS) 15.1 Introduction

15.2 ^{Etude de} I'influence des paramètres ESI-MS ^{. .}

.

^{. .} 15.2.1 Méthodologie

I5.2.2

^{Le type de phase mobile}

15.2.3 Le dëbit de phase mobile

1

5.2.4

^{La pression de gaz de} nébulisation

15.2.5 Le potentiel du capillaire

15.2.6 ^Le débit de gaz de séchage

15.2.7 La température du gaz de séchage

15.2.8 Le potentiel de fragmentation

15.3 Confirmation de la méthode HPLC-ELSD...

15.3.1 Méthodologie adoptëe

15.3.2 Appareillage utilisé

15.3.3 Choixdes conditions chromatographiques et de détection

15.3.4 ^{Résultats et discussion} 15.3.5 Conclusion

L5.4 Utilisation de I'HPLC-MS pour le dosage de traces

15.4.I

Introduction

15.4.2 Mise aupointdelaméthode

15.4.3 Aspects quantitatifs

15.4.4 Application à des extraits de sérum dopés

15.4.5 Discussion

r39 139 r39 140 146 r46

147 147 r47

151

r52

152

r54 154 155 155 158 159 161

r63 165 165 1,66

166 167 169 171 I7T 173 173 175 179 179 180 180 181 187 188 188 189 191 194 196

vl

l6.ANNEXES

16.1 Structures de I'artémisinine et de ses dérivés . . . .

16.2 Chimiothérapie de la malaria.

16.2.1

Principe

16.2.2 Mode d'action des antimalariques

16.2.3 Les mëdicaments utilisés actuellement dans le traitement de la malaria

16.2.4 Le vaccin

16.3 Voie de biosynthèse de I'artémisinine ^.

L6.4 Mode d'action et métabolisme de I'artémisinine ^{. . . .}

16.4.1 Les peroxydes cotnme antimalariques

16.4.2

Pourquoi synthétiser des dérivés

16.4.3

_Quelques exemples de dérivés

16.4.4 Mode d'action de l'artémisinine et dérivés

16.4.5 Métabolisme

16.4.6

Elimination

16.4.7 Etudestoxicologiques

16.5 Applications de la SFC aux produits naturels. . . . .

16.5.1 Les alcaloïdes

16.5.2 Les stéroides

16.5.3

Les terpènes

16.5.4

Les acides gras et lipides

16"5.5 Les mycotoxines

16.5.6

Divers

16.6 Exemples d'application du ELSD dans le domaine pharmaceutique.

16.6.1

Les hydrates de carbone

16.6.2 Les acides aminés

16.6.3

^Les ginkgolides

16.6.4

Lesphospholipides

16.6.5

^Les polyéthers

16.6.6

Les stéroides

16.6.7

Les acides biliaires

16.6.8

Les mycotoxines

16.6.9

Divers 16.7 Méthode GC-FID

16.8

Méthode GC-MS

16.9 Méthode de SFC capillaire 16.10 Méthode SFC remplie

16. I 1 Méthode HPLC-UV-ELSD.

I7.RÉFÉRENCES..

201 20r

203 203 203 204 205 207 209 209 209 209 210 21r 212 212 215 215 215 216 216 217 217 219 219 219 219 220 220 220 221 221 221 223 225 227 231 233 235

v1l

Note concernant ^les abréviations

Dans le but d'alléger le texte, des abréviations sont parfois utilisées. Afin de faci- liter la lecture, les abréviations anglaises, plus répandues, ont été utilisées. La liste suivante indique la signification de ces abréviations.

AAR Acide artésunique

ACA Acide artémisinique

AEN Artémisitène

APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization

ARB Artéanuine B

ART Artémisinine

ASE Accelerated Solvent Extraction

CL Chemiluminescence

DHA Dihydroartémisinine

DOA Déoxyartémisinine

DSC Differential Scanning Calorimetry

EC Electrochemical

ELSD Evaporative Light Scattering Detector

ESI ElectroSpray Ionization

GC Gas Chromatography

HPLC High Performance Liquid Chromatography Infrared

IR

International Union of Pure and Applied Chemistry IUPAC

LOD Limit Of Detection

LOQ Limit Of Quantitation

MS Mass Spectrometry

NMR Nuclear Magnetic Resonance

SFC Supercritical Fluid Chromatography

SFE Supercritical Fluid Extraction

SPE Solide Phase Extraction

TG Thermogravimetry

tx

Avant-propos

De tout temps et dans toutes les civilisations, l'Homme a su utiliser les plantes à des fins alimentaires, religieuses et médicinales.

De

nombreux médicaments actuellement encore largement

utilisés

sont d'origine végétale,

on

citera comme exemples I'acide acétylsalicylique ^(Aspi- rine@) qui est issu de l'écorce de saule (Salix

albaL.l,l'atropine,

qui se trouve dans les feuilles de belladone (Atropa belladona L.) et la morphine que I'on ex-

trait

du pavot _{Papauer somniferumL.l.

A notre époque encore, la recherche de nouvelles substances pharmaologique- ment actives se tourne largement vers les plantes. La découverte récente de I'agent anticancéreux taxol extrait de l'écorce de I'if du Pacifique (Taxus breuifu- Iia Nutt.i en est un exemple.

Entre

la

découverte d'une activité thérapeutique

et la

commercialisation du médicament, de nombreuses études sont nécessaires. Dans un premier temps, les substances actives doivent être isolées et caractérisées, avant de procéder à leur évaluation pharmacologique, toxicologique et clinique.

A chaque étape de cette procédure, des méthodes anal5rtiques performantes sont indispensables.

Le dosage de principes actifs dans des matrices végétales ^pose de nombreuses exigences. Les techniques utilisées doivent

tenir

compte de

la

complexité du

milieu

ainsi que de

la

fragilité des substances. De plus,

on

est souvent en présence de groupes de composés de structure homologue nécessitant une sé-

paration spécifique.

Un dosage comprend l'échantillonnage et

la

préparation du matériel végétal, une procédure d'extraction suivie ou non d'une étape de purification de I'extrait;

I'analyse quantitative étant

généralement effectuée

par une

technique chromatographique.

Chacune

de ces

étapes

doit être

optimisée

en fonction de

I'information recherchée.

S'agit-il de doser un

^{composé déterminé}

ou d'obtenir

une

information qualitative sur les

substances présentes

dans

l'échantillon (screening)?

Il

^est primordial de considérer que I'extrait obtenu dépendra fortement des

conditions opératoires choisies et ne reflétera que partiellement la composition réelle de la plante.

Le nombre de techniques de préparation d'échantillons proposées ne cesse de

croître.

En

effet,

la

classique extraction solide-liquide de type Soxhlet

a

été complétée par des techniques censées permettre une extraction plus douce et

plus

rapide avec

une

meilleure sélectivité.

A titre

d'exemple,

on peut

citer

x I'extraction par les fluides supercritiques, I'extraction solide-liquide assistée par ultra-sons ou micro-ondes ou, plus récemment, I'extraction par des solvants chauffés sous pression (ASE).

L'introduction de chacune de ces techniques a été suivie d'un enthousiasme qui a,

plus

ou moins rapidement, cédé

la

place

au

constat

plus

réaliste que la méthode d'extraction universelle n'existe pas.

Après I'obtention de I'extrait se pose le choix de la technique analytique. A ce stade, de longues étapes de purification ou de dérivation pourraient souvent être évitées

par le

choix d'une méthode de séparation mieux adaptée

ou

d'une détection plus sélective.

I1 reste

au

chimiste analyste le rôle d'évaluer l'échantillon

et

I'anal5rte

et

de

choisir

la

technique

la

mieux adaptée

parmi le

large éventail actuellement disponible"

C'est dans cette optique qu'a été réalisé le présent travail

PARTIE THEORI ^UE

Entraltbs Cobcxlongobarùlcuc bc Dloclturlbcl ^(lX slèclc)

1

1. ^Les principes actifs végétaux

1,.1 Définition et origine

Les plantes ont toujours constitué une des principales sources d'alimentation

pour I'homme. D'autre

part, elles ont également joué un rôle

essentiel dans les

^pratiques

religieuses

et

médicinales, ces

deux

dernières

étant

souvent intimement liées.

Princlpe

actif:

substance chimiquement définie, extraite de la drogue, responsable de son activité pharmacologique.

Dans d'autres,

^I'activité

thérapeutique des préparations végétales a été peu à peu dissociée de la religion, ce qui a abouti à une association directe entre I'effet observé et la plante. Cette démarche a conduit à l'élaboration d'une pharmacie ^végétale.

La préparation de drogues est

le

moyen de conserwation

le plus

simple des

plantes médicinales.

En

effet,

la diminution

de

la

teneur

en

eau évite les moisissures et diminue fortement voire complètement I'activité enzymatique à

I'intérieur des tissus.

Généralement

on utilise certains

organes végétaux particuliers pour leurs teneurs élevées en principe actif tels que racines, rhi-

zomes, bulbes, écorces, feuilles, tubercules, fleurs, fruits, graines, bois ou tiges.

Dans notre pratique médicale, tous les phénomènes sont rapportés au niveau moléculaire. Dès lors, on a cherché à identifier les substances actives dans les plantes médicinales afin d'expliquer ou de comprendre leurs effets selon nos connaissances biochimiques. ^Ces recherches ont finalement mené à I'utilisation des principes actifs purifiés en lieu et place des drogues. Ceux-ci peuvent être extraits de plantes fraîches ou de drogues.

Drogue: plante ou partie d'une plante séchée.

Dans certaines civilisations, ^les

plantes seront

considérées

comme éléments d'un

^rituel

visant à la guérison.

Les principes actifs végétaux 2

1.2 ^Formes d'utilisation ^{des plantes} médicinales

1.2.

1

^{Les extraits}

Les drogues peuvent faire l'objet

de procédures

d'extraction

rapides et peu

^sélectives

destinées

à obtenir un

extrait brut, directement administrable;

quelques exemples sont donnés dans le tableau 1.1 _[1].

La teneur en substance active de

ces préparations est en général

ajustée par adjonction

d'un excipient afin de garantirun dos- age précis.

Extrait

sec: résidu obtenu par

évaporation d'une

^solution

contenant une partie des p.a. de la plante soumise à traitement.

Teinture: extrait sec

dissous dans de l'éthanol

Essence: huile essentielle obte-

nue par entraînement à

^la

lableau 1.1 : Quelqueo exemplea à'exlrails àe _VlanT,eo commercialieée

Arnica lArnica

montanaL.) Teinture Anti-inflammatoire Euceta@

Ginseng fPanax

ginseng C.A.Meyerl Extrait sec Roborant Geriavito

Gingko _lGingko

bilobaL.l Extrait sec Stimulant Symfona No

Ipeca lCephaelis

ipecacuanha A. Rich.l Extrait liquide Antitussif Expectoranto^Phenergan Bourdaine lRhamnus

frangulaL.l ^{Extrait sec Laxatif Colosan@}

Clou de girofle lSgzggium aromaticum

(L.) Merill et L.M.

Perryl

Essence

Désinfectant, anesthésique en

méd. dentaire

Aloclonto

Les principes actifs végétaux ³

1.2.2

^Les

^principes

^actifs

Le

tableau 1.2

cite quelques exemples

de

médicaments ayant

une

origine végétale. Notons que

pour

des raisons économiques, ou de production, bon nombre d'entre eux sont actuellement obtenus par voie de s5mthèse.

Tableau 1.2: Quelquee exemplee àe _Vrincipee acl'ifs àe planveo commercialieée

L.3 ^{La recherche} phytochimique

La Matière Médicale, encore dénommée Pharmacognosie, est l'étude des matiè- res premières d'origine naturelle, à usage médical. La phytochimie sbccupe plus

.

Analgésique

.

Anti-inflammatoire

.

_Fébrifuge

.

_Anti agrégant

plaquettaire

Aspirineo Saule [Saftx sp.] Acide

acétylsalicylique

Digitale lDigitalis lanata, Digitalis

purpureaL.l

Digitoxine ^Combat llnsuffisance

cardiaque ^Digoxine@

Melilot _lMelilotus

officinalis ^(L. ₎ Pallasl _l Dicoumarol Anticoagulant Sintromo

Morphine Analgésique MST

continus@

Codéine Antitussif Codipront@

Pavot lPapauer somniferumL.l

Parasympatholytique Reasec@

Belladone lAtropa

belladonnaL.l Atropine

Antimalarique ^Sulfate quinine^de Quinquina lCinchona

pubescensYalell Quinine If du Pacilique [laxus

breuifolia Nutt.l ^Taxol Anticancéreux Paclitaxelo

Vincamine Vasodilatateur

cérébral O>rygérono Petite Pervenche

lVinca minorL.l

Les principes actifs végétaux

particulièrement dlsoler et dldentifier les principes actifs d'origine végétale. Elle comporte plusieurs étapes:

. La sélection et I'identification botanique d'une plante

potentiellement intéressante.

.

La récolte et le séchage.

.

_La préparation d' extraits.

.

_Des

_tests

biologiques

sur les

extraits obtenus

afin de

déterminer

si

des

propriétés pharmacologiques peuvent être mises en évidence.

.

La séparation des extraits par diverses techniques chimiques afin d'isoler et de caractériser les substances actives.

.

Des essais

de

synthèse chimique peuvent

alors être

entrepris.

tl

se peut également que des modifications chimiques des composés augmentent leur efficacité

ou facilitent leur

administration. Les composés obtenus devront ensuite être soumis à des tests toxicologiques permettant de décider si leur

uti-

Iisation à des fins thérapeutiques peut être envisagée.

Synthèse Plantes sauvages

4

Caractérisation

Extrait(s)

FRACTIONNEMENT DE L'EXTRAIT

\l/

,1,

Plantes médicinales

EXTRACTION

Toxicologie

I

ESSATS BIOLOGIOUES sur les fractions

Modification de structure

Plantes cultivées Essais biologiques

Essais biologiques

FiTure 1 .1: Diaqramme eymbolioant la àémarche à'une recherche phyaochimique ^(à' aprèo l2))

On notera qu'on estime le nombre d'espèces de végétar.rx supérieurs entre 375000 et 500000, dont seules 10% ont été investiguées par rapport à leurs propriétés pharmacologiques .

Tous les végétaux contiennent un certain nombre de métabolites secondaires qui peuvent, potentiellement, _être d'intérêt pharmaceutique. Dès lors qu'une recher- che systématique est évidemment impossible, des choix deviennent inévitables.

Les critères suivants peuvent être appliqués:

Les informations tirées des

médecines

traditionnelles permettent

de

sélectionner des espèces possédant

un

effet pharmacologique potentiel. Une

Principes actifs

a

Les principes actifs végétaux

étude en laboratoire permettra de vérifier

si un tel

effet peut être mis ^en

évidence.

.

Les plantes à toxicité établie peuvent être particulièrement intéressantes. En effet, de nombreux principes actifs actuellement utilisés proviennent ^de telles plantes, citons par exemple l'atropine ou la physostigmine _[3;4].

En plus

de

leur

activité propre, les métabolites secondaires

ont

deux rôles accessoires très importants: ils peuvent servir de modèle (pharmacophore) pour

la

mise au point de nouvelles substances pharmaceutiques slmthétiques. Ils servent également de produits de départ pour I'hémi-s5rnthèse de médicaments.

5

La première voie a été largement développé€,

ptr

exemple dans le cas de la morphine et de

la

co- caïne, deux substances d'origine végétale, qui ont servi de modè-

les pour la mise au point

de nombreux analgésiques et anes- thésiques locaux

de

synthèse.

D'autres exemples sont donnés par I'atropine, la physostigmine et la quinine qui ont respective-

ment servi à

l'élaboration d'anticholinergiques, d'anticho- linestérases et d'antimalariques I4l.

Métabolites primaires : Sub- stances intenrenant dans les réactions biochimiques vitales de la plante. Elles sont com- munes à de nombreux organismes.

Métabolites secondaires ^: Substances intervenant dans des voies métaboliques particu- lières non indispensable à la vie. Souvent caractéristiques d'un genre ou d'une espèce donnée. Leur rôle est souvent mal connu.

L'hémi-synthèse de

médica-

ments à partir de métabolites secondaires peut être illustrée par la diosgénine, I'hécogénine et le stigmastérol, qui servent de produits de départ à la synthèse d'hormones entrant dans la formulation de contraceptifs oraux _[4].

1.4 La production ^des principes actifs végétaux

I1 existe trois voies d'obtention d'un principe actif d'origine végétale

.

L'extraction à partir de matériel végétal, d'origine sauvage ou de culture.

.

_{La synthèse} chimique totale, ou partielle à

partir

d'un précurseur d'origine naturelle.

.

Laproduction à partir de cultures cellulaires ou d'organismes génétiquement modifiés.

Les principes actifs végétaux

La récolte de plantes sauvages est

un

travail long et fastidieux nécessitant de bonnes connaissances botaniques. De plus, ce t5rye de récolte peut représenter un risque pour I'espèce puisque des quantités importantes de matériel végétal sont généralement nécessaires. A titre d'exemple, I'obtention d'un kilo de taxol nécessite 10 tonnes d'écorce d'if du Pacifique; cet arbre a d'ailleurs été déclaré espèce protégée aux Etats-Unis.

La

^grande majorité des principes actifs d'origine végétale

est

actuellement produite par culture de la plante, extraction et purification du composé _[4].

Seuls les

^composés

ayant une structure chimique

relativement simple permettent une synthèse chimique rentable. De

plus,

malgré le

fait

que les produits naturels contiennent fréquemment plusieurs carbones asymétriques,

les

biosynthèses végétales produisent

des

substances

de

^grande pureté énantiomérique. L'obtention d'un tel résultat parvoie de synthèse, bien que pos- sible, n'est pas encore rentable et les nouvelles législations concernant les for- mulations pharmaceutiques rendent de

plus

en

plus

difficile

la

mise

sur

^le

marché de mélanges racémiques. En effet, deux énantiomères peuvent avoir une activité pharmacologique différente. Par exemple, la quinine est utilisée comme antimalarique alors que son énantiomère

la

quinidine possède

une

activité antiarythmique.

Bien que la production de métabolites secondaires par des techniques de cul- ture de tissus fasse I'objet de nombreuses recherches, aucune substance n'est à

ce jour produite de cette façon à l'échelle industrielle _[a].

1.5 ^{Le rôle de} la chimie analytique

La chimie analytique joue

un

rôle prépondérant dans

le

développement de produits pharmaceutiques. Elle intervient en effet à tous les niveaux depuis la recherche d'un nouveau principe actifjusqu'à son administration au patient.

Il

faut cependant distinguer deux rôles fondamentalement différents:

.

_L'analyse qualitative d'un extrait afin d'isoler et de caractériser de nouveaux principes actifs,

qui a

été brièvement décrite

au _S

1.3

sur la

recherche phytochimique.

.

L'analyse quantitative du principe actif dans des échantillons végétaux ou des fluides physiologiques lors de l'optimisation des conditions de culture ou lors des tests pharmacologiques de la nouvelle substance, par exemple.

Dans ce travail nous allons nous

limiter

aux méthodes utilisées en analyse quantitative.

Au cours de

l'étape

de

sélection génétique

d'une plante, le

dosage des métabolites secondaires est indispensable. En effet, cette information permet de 6

Les principes actifs végétaux

choisir I'hybride ^végétal ayant une teneur maximale en principe actif et de suivre celle-ci en fonction de divers paramètres agronomiques ou climatiques. ^{I1 a été} constaté, par exemple, que la teneur en métabolites secondaires pouvait subir

de fortes variations saisonnières, voire journalières; un suivi quantitatif régulier est donc nécessaire afin de choisir judicieusement le moment de récolte.

Dans un

^deuxième

^temps, il

s'agira

de mettre au ^point des

méthodes d'extraction du principe actif, l'analyse des extraits obtenus permettra de choisir les conditions optimales.

Lors de l'élaboration d'une formulation pharmaceutique contenant le principe

actit

certaines étapes de contrôle de teneur et de qualité au cours du temps sont également indispensables.

Enfin, lors de

l'évaluation pharmacologique

ou clinique du

composé, des méthodes d'analyse sélectives, sensibles et fiables seront indispensables afin de

suivre les taux plasmatiques de la substance. Même si les méthodes utilisées dans

le

cas des extraits de ^plantes

ne sont

généralement pas directement applicables aux fluides biologiques, elles constituent cependant une base de

départ pour le développement de méthodes plus sensibles.

7