Comparaison des protéomes de Pseudomonas aeruginosa cultivée en suspension et en biofilms

(1)

Comparaison des protéomes de

Pseudomonas aeruginosa cultivée en suspension et en biofilms

Dr. Sébastien Vilain

ESTBB – Plateforme Génomique Fonctionnelle (Pôle Protéomique)

sebastien.vilain@u-bordeaux2.fr

(2)

Matrix

Introduction – Qu’est-ce qu’un biofilm?

Definition :

A biofilm is an aggregate of bacterial micro-colonies fixed to a substratum and embedded in their own exopolymers which form a protective gangue called matrix.

Substratum

Primitive circular system

Micro- colonies

Composition :

Micro-colonies 10% – 25%

98% H₂O

2% Exopolysaccharides Proteins

DNA

Matrix 75% – 90%

(3)

Introduction - biofilm formation

bacterial micro-colony

Twitching

High production of exopolymers = Maturation of the biofilm

Quorum sensing Free-cells

(4)

Introduction - Specificité des bactéries « sessiles »

HIGH RESISTANCE TO ANTIBIOTICS

Possible cause

Mah et O’toole. 2001. TRENDS in Microbiology

Physico-chemical way

Physiological way

« Resistant » Phenotype

Limitation in the antibiotic diffusion

Drenkard and Ausubel.

2002. Nature

Low probability

(O’toole et al. 2000. Annu.

Rev. Microbiology)

Resistance to U.V and shear forces Escape from immune system

(5)

Maladies nosocomiales:

 60% sont liées à la présence de biofilms

 800000 personnes touchées / an (soit 7%

des personnes hospitalisées)

 4000 à 13000 décès par an

 Coût: 1 à 3 milliard € / an

 Installations hospitalières Où trouve-t-on les biofilms?

 dans la Nature

 Installations industrielles

(6)

Introduction - Cystic fibrosis (mucoviscidose)

CYSTIC FIBROSIS

Frequency

1/2500 North Europe countries 1/3500 Mediteraneen countries 1/12000 Middle-East countries

Life expectancy

≈ 30 years

Genetic disease

Gene finding in 1989

Gene cftr on chromosome 7

Features

Mutation on protein CFTR

Diminished permeability to Cl^- ions in epithelium cells

Low hydrated mucus accumulation in respiratory tractus

(7)

Introduction - Pseudomonas aeruginosa and cystic fibrosis

Cystic fibrosis Pseudomonas aeruginosa

Mucus accumulation on pulmonary epithelium

Gram negative bacteria Opportunistic pathogen

 Mucoïde phenotype

 Alginate production

 Biofilm formation

 Antibiotic resistance

 Virulence factors

Epithelium

(8)

Comprendre la physiologie « biofilm »

Identifier de nouvelles cibles moléculaires: existe-t-il des protéines « biofilm » spécifiques responsables du phénotype « résistant »?

1^ère étape Modification in

situ de la physiologie

Tuer les bactéries Nouveaux

traitements Objectif final Antibiothérapie

Echec

Objectif principal des recherches

(9)

STRATEGIE

ANALYSE GLOBALE DES PROTEOMES PAR ELECTROPHORESE 2D

PROTEOME (1995):

PROTEins expressed by a genOME or a tissue,

in one C condition and at a T time

(10)

Material and methods – Bacterial strain

Bacterial strain : Pseudomonas aeruginosa PAO1

 Opportunistic pathogen

 Gram negative

 Polar flagellum

 Alginate production

 Numerous virulence factors

Clinical significance :

 Cystic fibrosis

 Nosocomial diseases (≈10%)

(11)

Material and methods – Natural biofilms (1/2)

Process 1- « Glass wool » system (GW)

Growth medium : 100 mL of MMG P. aeruginosa : initial 10⁷CFU/mL Temperature : 37°C

Incubation time : 18h / 48h

SIP-GW 18h (data not presented) SIP-GW 48h (data not presented) Additional population :

T-GW 5h30 (middle-exponential phase) Glass wool : 0 or 2 g (2600 cm²)

6 bacterial populations : T-GW 18h (stationary phase) T-GW 48h (late stationary phase) GW 18h (18h old sessile cells) GW 48h (48h old sessile cells)

(Steyn et al. 2001. Proteomics)

(12)

Material and methods – Natural biofilms (2/2)

Process 2- « Clay beads » system (CB)

Growth medium : 800 mL of MMG P. aeruginosa : initial 10⁷CFU/mL Temperature : 37°C

SIP-CB 18h (data not presented) SIP-CB 48h (data not presented) Clay beads : 0 or 640 (2010 cm²)

6 bacterial populations : T-CB 18h (stationary phase) T-CB 48h (late stationary phase) CB 18h (18h old sessile cells) CB 48h (48h old sessile cells)

(13)

Process 2- « Clay beads » system (CB)

(14)

Material and methods – « Artificial » biofilms

Process 3- « Agar » system (AG)

AGAR 2% (W/V) : 0 or 25 mL

P. aeruginosa : initial 10⁷CFU/mL

Growth medium : 45 or 20 mL of MMG Temperature : 37°C

SIP-AG 18h (data not presented) SIP-AG 48h (data not presented) 6 bacterial populations : T-AG 18h (stationary phase) T-AG 48h (late stationary phase) AG 18h (18h old sessile cells) AG 48h (48h old sessile cells)

(15)

Caractéristiques

architecturales des biofilms obtenus sur Laine de Verre

et Billes d’Argile

(16)

Résultat – Caractéristiques Structurales du biofilm sur LV

(17)

Résultat – Caractéristiques Structurales du biofilm sur LV

(18)

Résultat – Caractéristiques Structurales du biofilm sur LV

(19)

Résultat – Caractéristiques Structurales du biofilm sur LV

(20)

Résultat – Caractéristiques Structurales du biofilm sur LV

(21)

Résultat – Caractéristiques Structurales du biofilm sur BA

(22)

Résultat – Caractéristiques Structurales du biofilm sur BA

(23)

Résultat – Caractéristiques Structurales du biofilm sur BA

(24)

Résultat – Caractéristiques Structurales du biofilm sur BA

(25)

Conclusion

The 2 biofilms exhibit different architectures according to the nature of the substratum

(Dalton et al., 1996)

Are those differences

observed at the

proteomic level ?

(26)

Stratégie: Approche protéomique via la 2D

Préparation de l’échantillon

Séparation

acquisition de l’image

Analyse d’image

Découpe des spots (Digestion)

Identification

1. Séquençage

2. Empreinte peptidique

(27)

LES POPULATIONS BACTERIENNES ETUDIEES

19 bacterial populations discriminated according

to…

Incubation time (18 or 48h)

Mode of growth (planktonic vs sessile)

Nature of the substratum (GW, CB, AG)

PROTEOMIC MAPS

and / or

1. Existe-t-il des protéines « biofilm » spécifiques

2. Sont-elles universelles? (quelque soit la

nature de la surface colonisée)

(28)

Material and methods – Proteomic studies

For each bacterial population (19)

Protein extract

1

Protein extract

2

Protein extract

3

Gel numerisation (GS-800) PDQuest analysis

Reference gel = Proteomic map Spots which are present in this condition Reference gel of bacterial

population 1

Quantity on Gel 1, 2 and 3

Reference gel of bacterial population 2

Quantity on Gel 1, 2 and 3

19 reference gels

(29)

Material and methods – 2D Electrophoresis

First step : Protein extraction

Extraction buffer

Ampholytes Urea

CHAPS DTT H₂O

+ cold shock + sonication

(30)

Material and methods – 2D Electrophoresis

3 10

Second step : Protein separation First dimension : Iso-Electro-Focalisation

+ -

62kV.h

Calibrated sample

Proteins are separated according to their pI

(31)

pI (pHi) = Charge

globale nulle pH > pI = Charge négative

pH < pI = Charge positive

(32)

1) Cassette de réhydratation 2) Bandelettes sur multiphore II 3) 1

^ère

dimension sur multiphore II

1

2 3

(33)

Material and methods – Electrophoresis 2D

+ -

- - -

Second dimension : SDS-PAGE

Third step : Protein revelation by silver staining

- -

Acrylamide / Bis-acrylamide (Acrylamide 12%)

Proteins are separated according to their

molecular weight

(34)

1) Gel 2

^ème

dimension (SDS- PAGE)

2) Dépôt de bandelette sur le gel SDS-PAGE après équilibration 3) Migration

1 2

3

(35)

LIMITES DE LA TECHNIQUE

Choix du gradient du pH

Choix du %

d’acrylamide pour le gel SDS-PAGE

Choix de la coloration

3 4 7 10

% Acrylamide Size Range of Molecules

7.5 45,000 - 400,000

10 22,000 - 300,000

12 13,000 - 200,000

15 2,500 - 100,000

(36)

pI (pHi) = Charge

globale nulle pH > pI = Charge négative

pH < pI = Charge positive

(37)

NUMERISATION DES GELS NUMERISATION DES GELS

Densitomètre (GS800 Bio-Rad)

Définition:

Appareil permettant de mesurer la quantité de lumière transmise (mode transmission) ou réfléchie (mode réflexion).

 200 à 700 dpi (dots per inch)

 ■ = 36,6 µm à 127 µm

 8 bit (2⁸=256 niveaux de gris, valeur de 0 à 255)

 12 bit (2¹²=4096 niveaux de gris, valeur de 0 à 4095)

 0 = Noir – Max = Blanc

(38)

Volume du spot = Σ I

_pixel

NUMERISATION DES GELS

(39)

Organisation du Matchset - Landmark Organisation du Matchset - Landmark

D D, α α

(40)

Comparaison des données quantitatives

(41)

CONSTITUTION DE LA DATABASE

Spot Spot

n°n°

Population 1

Population 1 Population 2Population 2 Gel 1

Gel 1 Gel 2Gel 2 Gel 3Gel 3 Gel 1Gel 1 Gel 2Gel 2 Gel 3Gel 3 000000 00 00 00 100100 110110 120120 001001 5656 5050 7272 2020 2525 2323

19 bacterial populations

958 spots

958 spots × 19 populations × 3 gels = 54606 data

VOLUME (détection Gaussienne) = Spot Height × σ_x × σ_y × π

Volume = Σ I_pixel

(42)

COMMENT ANALYSER LA DATABASE ?

Pop. 1

Pop. 1 Pop. 2 Pop. 2 Pop. 3 Pop. 3 Pop. 4 Pop. 4 Pop. 5 Pop. 5 000 000 0 0 80 80 54 54 100 100 110 110 001 001 56 56 50 50 72 72 20 20 25 25

« Variable » = « Volume »

(moyenne des 3 gels expérimentaux)

« Individu » = « Spot »

« Population » = « Population bactérienne »

958 spots

(43)

Pop. 1

Pop. 1 Pop. 2 Pop. 2 Pop. 3 Pop. 3 Pop. 4 Pop. 4 Pop. 5 Pop. 5 000 000 0 0 80 80 54 54 100 100 110 110 001 001 56 56 50 50 72 72 20 20 25 25

958 spots

COMMENT ANALYSER LA DATABASE ?

ANALYSE EN LIGNE:

 Variation du volume d’un seul spot selon la population bactérienne

 Identification des protéine(s) « biofilm » spécifique(s)

ANALYSE EN COLONNE:

 Variation de l’ensemble du protéome selon les conditions de culture

 Identification des facteurs responsables de la variation du protéome

(44)

ANALYSE EN COLONNE:

ANALYSE EN COMPOSANTE PRINCIPALE (ACP) ANALYSE EN COMPOSANTE PRINCIPALE (ACP)

Component 1 (60%)

Component 2 (25%) Component 2 axis

Component 1 axis Character 1

Character 2

Character 3

Character 4

Character 5

Axis origine

 Réduction de la matrice

 Représentation géométrique des individus et/ou des populations

 Regroupe les populations communes

 Identification intuitive des composantes

(45)

Résultats – ACP des protéomes des biofilms « Naturels » Résultats – ACP des protéomes des biofilms « Naturels »

1st component (36,0%)

2n d c o m po n en t ( 24 ,9 % )

Composante 1: 36%

Protéomes sont discriminés selon le mode de croissance (Biofilm vs Suspension)

Statgraphics: 3 composantes principales (+ 78%)

(46)

1st component (36,0%)

2n d co m po n en t ( 24 ,9 % )

Composante 2: 25%

Affecte peu les protéomes « biofilm »

Protéomes « suspension » sont discriminés selon le temps d’incubation Résultats – ACP des protéomes des biofilms « Naturels »

Résultats – ACP des protéomes des biofilms « Naturels »

(47)

2nd component (24,9%)

3 rd c o m p on e nt ( 1 7, 5 % )

Composante 3: 17,5%

Affecte peu les protéomes « suspension »

Protéomes « biofilm » sont discriminés selon la nature de la surface colonisée…

Résultats – ACP des protéomes des biofilms « Naturels »

(48)

Results – ACP des biofilms « naturels » et « artificiels » Results – ACP des biofilms « naturels » et « artificiels »

1st component (31,0%)

2n d co m po n en t ( 22 ,5 % )

Composante 1: Mode de croissance

Composante 2: Temps d’incubation

(49)

3rd component (13,0%)

4 th c o m po n en t ( 8 ,5 % )

Composante 3: ?

Regroupe les biofilms « Billes d’argile » et « Agar » et les discrimine des biofilms « Laine de verre »

Composante 4: ?

Discrimine les biofilms « Billes d’argile » et « Agar »

Results – ACP des biofilms « naturels » et « artificiels »

(50)

Conclusion de l’analyse en colonne (ACP) Conclusion de l’analyse en colonne (ACP)

Hancock (2001) in Nature Genetics :

« bacteria growing in biofilms are not that different from free-living bacteria »

The « biofilm » proteome is a

reality ?

This « biofilm » proteome is influenced by incubation time (slightly) and the nature of the substratum

In natural biofilms ?

Vilain et al. 2003. J. Prot. Res. NO YES

In « artificial » biofilms ?

Vilain et al. 2003. Proteomics. NO YES

Statistical clue

Unique biofilm phenotype (Davies.

2003. Nature Rev. 2: 115-)

Wrong at the proteomic

level

Versatility in

« biofilm » proteome

A concept not so evident…

(51)

Pop. 1

Pop. 1 Pop. 2 Pop. 2 Pop. 3 Pop. 3 Pop. 4 Pop. 4 Pop. 5 Pop. 5 000 000 0 0 80 80 54 54 100 100 110 110 001 001 56 56 50 50 72 72 20 20 25 25

958 spots

ANALYSE EN LIGNE DE LA DATABASE

ANALYSE EN LIGNE:



Spot protéique dont le volume varie

« significativement »

(52)

Results – Proteomic modifications induced by immobilisation Results – Proteomic modifications induced by immobilisation

Proteomic map of free cells

Unmodified

Diminished

X

Disappeared

Accumulated

X ^Appeared

Proteomic map of immobilized cells

Over- expression

Under- expression VOLUME

(53)

3 10

PAO1 suspension

3 10

PAO1 biofilm

Analyse en ligne – Recherche de cible moléculaire

(54)

Les 2 moyennes ne sont pas simultanément < 20

Moyenne B / Moyenne S < 0,5

T-test significatif (α = 0,05) ???

Spot protéique dont le volume varie

Spot protéique dont le volume varie « significativement » d’une « significativement » d’une population à une autre

population à une autre

… …

Quand peut-on considérer un spot protéique comme Quand peut-on considérer un spot protéique comme

« modifié »?

Volume en « suspension » : Moyenne S ± SD

Volume en « biofilm » : Moyenne B ± SD

Spot sous-exprimé lorsque… Spot surexprimé lorsque…

Moyenne B / Moyenne S > 2

Spot « modifié »?

ET

(55)

Moyenne B / Moyenne S < 0,5

Spot protéique dont le volume varie

Spot protéique dont le volume varie « significativement » d’une « significativement » d’une population à une autre

population à une autre

… …

Quand peut-on considérer un spot protéique comme Quand peut-on considérer un spot protéique comme

« modifié »?

Volume en « suspension » : Moyenne S ± SD

Volume en « biofilm » : Moyenne B ± SD

Spot sous-exprimé lorsque… Spot surexprimé lorsque…

Moyenne B / Moyenne S > 2

Spot « modifié »?

ET

REALITE BIOLOGIQUE???

(56)

Test statistique…Le « fabuleux » test de Student Test statistique…Le « fabuleux » test de Student

William Sealey Gosset (alias…Student)

1876 – 1937

 Créé en 1915 pour les Brasseries Guiness à Dublin

 Test paramétrique

 Utilisé pour comparer les moyennes de deux échantillons

 Test « robuste »

 Homogénéité des variances

 Distribution normale (courbe de Gauss, n ≥ 30)

(57)

Tests statistiques non paramétriques

Test de Wilcoxon et Mann-Whitney (classe par ordre croissant les différences entre les échantillons)

n≥5

Transformer les valeurs en Log

T-test (Test de Student) sans s’assurer de la normalité des distributions

Introduire la variabilité des données dans le rapport des volumes moyens…

) 2 (

)

( 





ET Suspension

Vmoy

ET Biofilm

Vmoy 0 , 5

) (

)

( 





ET Suspension

Vmoy

ET Biofilm

Vmoy

Test statistique…

(58)

Results – Proteomic modifications induced by immobilisation Results – Proteomic modifications induced by immobilisation

Spot class

Spot class Spot numberSpot number GW 18h

GW 18h CB 18hCB 18h GW 48hGW 48h CB 48hCB 48h Present

Present 843843 816816 838838 841841

Under-expressed

Under-expressed 65 65 (7,7%)

(7,7%) 156 156 (19,1%)

(19,1%) 60 60 (7,2%)

(7,2%) 94 94 (11,2%) (11,2%) Over-expressed

Over-expressed 70 70 (8,3%)

(8,3%) 75 75 (9,2%)

(9,2%) 216 216 (25,8%)

(25,8%) 92 92 (10,9%) (10,9%)

GW 18h GW 48h CB 18h CB 48h

(59)

N-terminal sequence M-A-L-T-N-E-D-I-I-N

Search homologies with protein sequences available in databases

(http://pbil.ibcp.fr/)

50S Ribosomal protein (PA4271)

Pseudomonas aeruginosa 100.000% identity

MALTNEDIIN

: : : : : : : : : :

1-MALTNEDIINAVSEMSVMQV

Protein identification by chemical sequencing

(60)

DATABASE ProteinProspector (http://prospector.ucsf.edu)

22/37 matches (59%). 30972.2 Da, pI = 5.92. P.

aeruginosa (PA3456) conserved hypothetical protein

M/z MH+ Delta start end peptide Sequence submitted matched Da

917.5000 917.5056 -0.0056 67 74 (K)ERLGVESK(A) 1248.9000 1248.5973 0.3027 131 141 (R)AAGAPEEEYRR(V) 1420.1000 1419.7848 0.3152 142 154 (R)VLLALDFSPTSTR(A) 1627.3000 1626.8889 0.4111 227 241 (R)VGEGLPINVIMTEVR(R) 1770.4000 1768.9710 1.4290 105 119 (R)HTPLRDLFIGTTLER(V) ……

The matched peptides cover 86% (248/286AA's) of the protein.

Protein identification by peptide fingerprinting

Trypsin cut after Arginin and Lysin

MALDI-TOF

(61)

(62)

Results – Proteomic modifications induced by immobilisation

(63)

(64)

Results – Proteomic modifications induced by immobilisation

(65)

Results – Proteome modifications induced by immobilisation Results – Proteome modifications induced by immobilisation

Spot class Spot class

Spot number Spot number

GW 18h

GW 18h CB 18hCB 18h GW GW

48h48h CB 48hCB 48h Present

Present 843843 816816 838838 841841

Under-expressed

Under-expressed 65 65

(7,7%)

(7,7%) 156 156 (19,1%)

(19,1%) 60 60 (7,2%)

(7,2%) 94 94 (11,2%) (11,2%) Under-expressed in both biofilm (time-dependent)

Under-expressed in both biofilm (time-dependent) 3333 2424 Under-expressed in both biofilm

Under-expressed in both biofilm 88

Over-expressed

Over-expressed 70 70

(8,3%)

(8,3%) 75 75 (9,2%)

(9,2%) 216 216 (25,8%)

(25,8%) 92 92 (10,9%) (10,9%) Overexpressed in both biofilm (time-dependent)

Overexpressed in both biofilm (time-dependent) 1515 3838 Overexpressed in both biofilm

Overexpressed in both biofilm 55

Cibles moléculaires potentielles

(66)

Results – PA3731, a « biofilm » specific protein ? Results – PA3731, a « biofilm » specific protein ?

CB 48h T-CB 48h

GW 48h T-GW 48h

CB 18h T-GW 18h GW 18h

T-CB 18h

Overexpression of PA3731 Observation: 29,5 kDa / pI 8,23

Identified by microsequençage and MALDI-TOF

N-term: TVLSXKLLSAL Identification :

PA3731 – Conserved hypothetical protein

(67)

Results – PA3731, a « biofilm » specific protein ? Results – PA3731, a « biofilm » specific protein ?

Hypothetical protein = molecular target?

Virulence factor

VIRULENCE Antibiotic

resistance

Antibiotic resistance

ANTIBIOTIC RESISTANCE

Quorum sensing

QUORUM SENSING

Increased properties in sessile bacteria

(68)

Conclusion – Proteome modifications induced by immobilisation

5 spots are over-expressed by immobilized cells in both biofilms

= potential molecular targets Proteomic modifications induced

by immobilisation concern ≈ 20%

of observed spots

These modifications are « biofilm »- and time-dependent

These observations confirm the PCA

results

(69)

Perspective – Bacterial adhesion on pneumocyte cells

B

C

PAO1 grown on pneumocyte cells A549

3h of contact

24h of contact

2D gel – adherent PAO1 cells on pneumocytes (48h)

PA3731

(70)

Find an inhibitor of the protein target

Construction of PAO1 mutants for target genes (mutagenesis)

Perspectives – Construction of PAO1 mutants Perspectives – Construction of PAO1 mutants

To test mutant capacity to form biofilms To test mutant antibiotic resistance

Known fonction :

High output screening

Unnown fonction : Antisens mRNA

Small interfering RNA (SiRNA)

(71)

(72)

Protéome global in silico de P. aeruginosa selon JVirGel (http://www.jvirgel.de)

Forte densité de spots

Perte d’information: Gradients de pH étroits et recouvrant

Absence des protéines LMW

LMW protéines: 25% du protéome (dont 75% de protéine hypothétique) → Tricine SDS-PAGE

Modification d’expression du génome de P. aeruginosa organisée en biofilm