Effet du zinc sur les métabolites secondaires de certaines moisissures

(1)

تٍبعشلا تٍطازقوٌدلا تٌزئاشجلا تٌرىهوجلا

ًولعلا ثحبلا و ًلاعلا نٍلعتلا ةراسو

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique

ىٍحٌ نب قٌدصلا دوحه تعهاج

لجٍج

Université de Mohammed Seddik Ben Yahai -Jijel

Mémoire de fin d’étude

En vue de l’obtention du Diplôme: Master en Biologie

Option : Microbiologie Appliquée

Thème

Membres du Jury Présenté par :

Présdente: DrAkroum S. Bennoune Saliha Examinatrice: DrOuled Haddar H. Atriche Nesrine

Encadreur : MmeBourzama G .

Numéro d’ordre………

Effet du zinc sur les métabolites

secondaires de certaines moisissures

Année Universitaire : 2016-2017

Faculté des Sciences de la Nature

et de la Vie

Département de Microbiologie Appliquée et Sciences Alimentaire لا مىلع تٍلك ط ةاٍحلا و تعٍب نلا نسق ي مىلعو تٍقٍبطتلا اٍجىلىٍبو زك تٌذغتلا

(2)

Remerciements

Nous tenons tout d’abord à remercier Dieu tout puissant,

qui en son nom et avec sa protection, nous avons réussi à

réaliser ce travail.

Nous tenons aussi à présenter nos vifs remerciements et

notre respect au jury pour l’honneur qu’il nous a fait en

acceptant de juger ce mémoire :

D

r

_{Akroum S.}

_{En tant que présidente du jury}

D

r

_{Ouled Haddar H. en tant qu’examinatrice}

Nos profonds remerciements et notre gratitude s’adressent

à notre encadreur

M

me

_{. Bourzama G. pour sa précieuse aide, ses orientations}

et le temps qu’elle nous a accordé pour notre encadrement.

Nous remercions également l’ensemble du personnel du

laboratoire de la microbiologie appliquée

Nos sentiments de reconnaissance et nos remerciements

vont également à

l’ensemble de tous nos enseignants qui ont contribué dans

notre formation de long de notre parcours pédagogique.

Nous spécifions ceux qui nous ont dirigé et encadré

principalement en licence et en master.

(3)

Dédicaces

Je remercie, tout d’abord, Dieu tout puissant De m’avoir donné

la force et le courage pour accomplir ce modeste travail

De tout mon cœur, je dédie ce travail :

A mes grands-pères

A mes parents

A mes frères et mes sœurs

À ma grande famille

À mes sœurs en dieu

(4)

Liste des abréviations

Aw: Activité de l'eau

CCM: Chromatographie sur Couche Mince

pH : potentiel Hydrogéne.

RF : Rapport Frontal

UV: Ultra-Violet

CYA: Czapek Yeast Agar

PDA: Pomme de terre Dextrose Agar

HR: Humidité relative

SAA : spectrométrie d’absorption atomique

Liste des tableaux

Tableau 01 : les caractères macroscopiques de la souche Penicillium

chrysogenum………p18

(5)

Liste des figures

Figure 1 : Représentation schématique de l’hyphe……...page1.

Figure 02 : Indice de tolérance de la souche fongique Alternaria alternata testée en

différentes concentrations du zinc sur le milieu CYA à 25 °C……….page15.

Figure 03 : Indice de tolérance de la souche fongique Cladosporium cladosporoides

testée en différentes concentrations du zinc sur le milieu CYA à 25°C……..page16.

Figure 04 : Indice de tolérance de la souche fongique Penicillium chrysogenum

testée en différentes concentrations du zinc sur le milieu CYA à 25°C………page16.

Figure 05 : Aspect des colonies de la souche fongique Penicillium chrysogenum

après 7 d’incubation sur le milieu CYA à 25°C après l’ajout de différentes

concentrations du zinc (a:Témoin ; b:600mg.l

-1

; c:800mg.l

-1

; d:1000mg.l

-1

;

e:1200mg.l

-1

; f:1400mg.l

-1

)……….. page17.

Figure 06 : Aspect microscopique de la souche Penicillium chrysogenum sur le

milieu CYA après sept jours d’incubation à 25 °C (x40)……….page19.

Figure 07 : Effet de pH sur la croissance de Penicillium chrysogenum à 28°C après 7

jours d’incubation sur le milieu CYA………page20.

Figure 08 : Aspect des colonies de la souche fongique Penicillium chrysogenum

après 7 jours d’incubation à 25°C sur le milieu CYA à différentes valeurs du

pH……….page20.

Figure09 : Effet de la température sur la croissance du Penicillium chrysogenum

après sept jours d’incubation à pH=6.5 sur le milieu CYA ………page21.

Figure 10 : Aspect des colonies de la souche fongique Penicillium chrysogenum

après 7 d’incubation à pH=6.5 sur le milieu CYA à différentes

températures……….page22.

Figure

11 : La bioaccumulation du zinc par la souche

Penicillium

chrysogenum……….page23.

(6)

Figure 12 : La plaque (CCM) réalisée à partir du surnagent de la souche Penicillium

chrysogenum sur milieu CYA après révélation sous UV………page25.

(7)

Table des matières

Partie I : Etude bibliographique

I.1.Les moisissures ……….1

I.1.1.Définition………..1

I.1.2.Structure et morphologie………1

I.1.3.Habitat………1

I.1.4.Mode de nutrition………1

I.1.5.Les conditions de développement……….2

I.1.6.Cycle de vie ……….2

I.1.7.Classification des moisissures………..2

I.1.8.Les métabolites secondaires………..3

I.1.8.1.Antibiotiques……….3

I.1.8.2.Aromes………..3

I.1.8.3.Enzymes………3

I.1.8.4.Mycotoxines……….3

I.2. Zinc………4

I.2.1.Les métaux lourds……….4

I.2.1.1 Introduction………..4

I.2.1.2. Définition……….4

I.2.2. Zinc……….4

I.2.2.1.Définition………..4

I.2.2.2. Zinc dans l’environnement………..4

I.2.2.3.Les intérêts du zinc chez les organismes ………5

(8)

Table des matières

I.2.2.4.a.Phytotoxicité ………...5

I.2.2.4.b

.

Toxicité chez les animaux et les humains ……….5

I.2.2.4.c.Toxicité chez les micro-organismes du sol ………5

I.2.2.5.Mécanismes de toxicité………6

I.2.2.5.a.Altération des membranes cellulaires ……….6

I.2.2.5.b.Inhibition d'enzymes………...6

I.2.2.5.c.Interaction avec les acides nucléiques ………6

I.3. Les méthodes d’élimination du zinc………....7

I.3.1.Introduction………7

I.3.2.Les méthodes d’élimination du zinc………....7

I.3.2.1.Les méthodes biologiques………...7

I.3.2.2.Mécanismes de tolérance au zinc chez les moisissures………...7

I.3.2.2.a.Biosorption

(Fixation aux parois cellulaires

)………7

I.3.2.2.a.1.Définition………..7

I.3.2.2.a.2.

Mécanisme de tolérance………8

I.3.2.2.b.Bi

oaccumulation………...8

I.3.2.2.b.1.

Définition………...8

I.3.2.2.b.

2.Mécanisme de la tolérance……….8

Partie II : Matériel et Méthodes ………..10

II.1.Matériel……….10

II.1.1.Milieux des cultures………10

II.1. 2.Produis chimiques et réactifs………..10

II.1.3.Appareillage………10

II.1.4.Matériel………10

II.2.Méthodes………....11

II.2.1.Zone d'étude et collection d'échantillons……….11

(9)

Table des matières

II .2.3.Purification des isolats………11

II.2.4.Identification des souches………..………..11

II.2.4.1.Etude macroscopique………11

II.2.4 .2.Etude microscopique………12

II.2 .5.Conservation des souches isolées………12

II.2.6.

Screening des moisissures tolérantes au zinc………....12

II.2.7.Optimisation de la croissance du Penicillium chrysogenum……….12

II.2.7.1.Effet de pH sur la croissance de la souche fongique sélectionnée…….12

II.2.7.2 .Effet de la température sur la croissance de la souche fongique

sélectionnée……….13

II.2.8.Bioaccumulation du zinc par l’isolat fongique

sélectionnée……….13

II.2.8.1.Préparation de la suspension fongique (Inoculum)………13

II.2.8.2.Inoculation des tubes………..13

II.2.9.Mesure de la concentration du zinc dans la biomasse séchée………13

II.2.10.Identification des métabolites secondaires………14

II.2.10.1.Sur milieu solide CYA………14

II.2.10.2.Chromatographie sur couche mince (CCM)………...14

Partie III : Résultats et discussion………...…..15

III.1. Isolement, purification et identification des souches fongiques…………..15

III .2.

Screening des moisissures tolérantes au zinc……….15

III.3.1.les caractères macroscopiques de la souche Penicillium chrysogenum….18

III.3.2.Les caractères microscopiques de la souche Penicillium chrysogenum…..19

III.4.Optimisation

de la croissance du Penicillium chrysogenum

………....19

(10)

Table des matières

III.4.2.Effet de la température sur la croissance de la souche fongique

sélectionnée………..21

III.5.Bioaccumulation du zinc par

Penicillium chrysogenum……….22

III.6.La mise en évidence des métabolites secondaires………...24

III.6.1.Sur milieu solide………...24

III.6.2.Chromatographie sur couche mince (CCM)………25

Conclusion

(11)

Introduction

La pollution de l’environnement par les métaux lourds est un problème mondial récent menaçant la vie humaine à travers la chaine alimentaire. Les métaux lourds sont parmi les polluants dangereux en raison de leur toxicité élevée nécessitant des traitements avant la décharge dans l'environnement. Les métaux traces ne peuvent pas être dégradés et sont toxiques pour l'homme même à faible concentration (Sharma et al., 2014).

Une large gamme de technologies de traitement a été développée, comprennant les méthodes chimiques (précipitations, neutralisations) et physiques (échange d'ions, séparation par membrane). Mais elles sont très coûteuses et possèdent des résultats moins précis. Les approches biologiques ont une capacité d'accumulation plus élevée avec un faible coût d'exploitation, minimisation des produits chimiques, boues biologiques facilement éliminées et une efficacité élevée dans la détoxification de l’effluent très dilué (Mrudula et al., 2016).

Les métaux les plus dominants sont le cadmium, le cobalt, le zinc, le nickel, le cuivre, le mercure et le plomb. Beaucoup de microorganismes, y compris les moisissures ont été identifiés comme biosorbants de ces ions métalliques. La tolérance de certaines moisissures à une variété de métaux traces est bien documentée. Les moisissures sont caractérisées par l'avantage d'avoir un matériau de paroi cellulaire qui présente d'excellentes propriétés de liaison métallique. Généralement, les biomasses de ces champignons filamenteux ont développés diverses mesures pour répondre au stress des métaux lourds par des procédés tels que le transport à travers la membrane cellulaire, la biosorption aux parois cellulaires, le piégeage extracellulaire, ainsi que les précipitations et la transformation des métaux. Des études scientifiques ont montrés que les souches isolées à partir de sites contaminés ont une excellente capacité pour éliminer des quantités importantes de métaux (Gadd,1993).

Des espèces comme Penicillium, Aspergillus, Alternaria, etc , sont très utiles pour l'élimination des métaux lourds comme le zinc, le chrome et le nickel. Le Pénicillium en général est un genre de champignons ascomycétes, qui est caractérisé par une grande importance économique dans le domaine de l'agriculture et des produits pharmaceutiques et un bon nombre de ses sont espèces connues pour produire un spectre très diversifié de métabolites secondaires bioactifs (Jyoti et Singh,

2016 ).

La production de ces composés peut être affectée par des conditions environnementales. D'autre part, les métabolites secondaires pourraient être affectés par la présence de facteurs chimiques tels que les facteurs nutritionnels, les sels de sucre, les oligo-éléments et les métaux lourds (Shivakumar et al., 2014).

(12)

Introduction

L’objectif de notre travail est la sélection de certaines souches des moisissures les plus tolérantes au zinc et la détermination de l’effet du zinc sur ces souches à la production des métabolites secondaires qui ont des intérêts pharmaceutiques, économiques…..ect.

(13)

Partie 01 : Etude bibliographique

Page | 1

I .Etude bibliographique

I.1.les moisissures

I.1.1.Définition

Les moisissures sont des champignons filamenteux thallophytes, eucaryotes c’est -à-dire dont les cellules possèdent un appareil mitochondriale, un noyau pourvu d’une membrane nucléaire de chromosome et d’un nucléole (Gadd et al., 2007). L’absence de chloroplaste en fait des organismes hétérotrophes comme des animaux c’est -à- dire que pour vivre il leur faut trouver des matières organiques déjà existantes, produites par d’autres êtres vivants (Boiron, 1996).

I.1.2.Structure et morphologie

L’élément structural de base est l’hyphe, ramifiés entre eux, plusieurs hyphes forment le mycélium ou thalle pluricellulaire (Meyer et al., 2008). C’est un appareil végétatif bien adapté aux divers modes de vie hétérotrophe des champignons (Webster et Weber, 2007). Selon les classes fongiques, les hyphes peuvent être segmentés (septés) par des cloisons transversales solidaires de la paroi (septum) qui se forment à intervalles irréguliers. Mais leur structure est souvent mycélienne et coenocytique (cellules fusionnées à plusieurs noyau) (figure 01) (Boiron, 1996).

I.1.3.Habitat

Leur réservoir naturel se situe à l’extérieur, sur des végétaux en décomposition, à la surface de l’eau stagnante, ainsi que sur ou dans le sol (Legris, 2012).

I.1.4.Mode de nutrition

Les moisissures sont tributaires pour leur nutrition de matière organique, suivant leur comportement vis-à-vis de cette nutrition organique on les classe en : saprophytes : dans ce cas, les champignons dégradent la matière organique morte ou en décomposition afin de prélever les éléments minéraux essentiels. Symbiotiques: les moisissures obtiennent leurs nutriments grâce à un autre organisme en

(14)

Partie 01 : Etude bibliographique

Page | 2

échange certains bénéfices et parasites : dans ce cas, les champignons filamenteux extraient leurs nutriments de la matière vivante. Ils tirent profit de leurs hôtes en vivant à leurs dépens entraînant parfois leur mort (Roland et Vian, 1990).

I.1.5.Les conditions de développement

Le développement des moisissures est également dépendant de l’environnement. Les facteurs environnementaux les plus importants sont : 1) Humidité relative (HR) : qui est évaluée par la formule HR = Aw*100. AW : représentant l’activité de l’eau, c'est-à-dire la disponibilité en eau d’un substrat, la majorité des moisissures se développent pour une activité de l’eau comprise entre 0,85 et 0,99 ;2). Température: La plupart des espèces de moisissures se développent dans une gamme de température comprise entre 4 et 40°C. La valeur idéale pour leur développement se situe entre 24 et 30°C ; 4) oxygène : 5) le pH: la vitesse de croissance fongique est maximum pour des substrats de pH acides à neutres (entre 4 et 7). La gamme de pH permettant la croissance est toute fois bien plus étendue avec des valeurs limites comprises entre 2,2 et 9,6 pour les espèces les plus communes (Guiraud, 1998).

I.1.6.Cycle de vie

Le développement des moisissures comprend deux phases : la phase végétative et reproductive. La Phase végétative correspond à la phase de croissance, l’appareil végétatif colonise le substrat par extension et ramification des hyphes. Il existe deux types de ramifications, la ramification par dichotomie (apex) ou par bourgeonnement (latéral) (Kavanagh, 2005). La phase reproductive comprend deux types de reproduction, la reproduction asexuée qui se fait sans fusion de gamètes. Elle correspond majoritairement à la dispersion de spores asexuées, permettant la propagation des moisissures. Cette forme de reproduction asexuée est appelée la sporulation. La reproduction sexuée qui se base sur la fusion de deux gamètes haploïdes (n) donnant un zygote diploïde (2n). Une structure (+) à n chromosomes rencontre une autre structure (-) et la fusion des cytoplasmes donne naissance à un nouveau mycélium à 2n chromosomes (Boiron, 1996).

I.1.7.Classification des moisissures

La taxonomie la plus courante est basée sur les modalités de reproduction et la morphologie, elle classe les mycètes en quatre grands embranchements: Les zygomycètes: dont la plupart vivent dans le sol sur des matières organiques animales ou végétales en décomposition, ont des hyphes non septes. Les ascomycètes: Ont un thalle. Si leur reproduction peut être sexuée, avec formation, dans des asques en forme de massue ou de sac, de spores méiotiques (ascospores), beaucoup d’ascomycètes se reproduisent par multiplication asexuée (conidies). Les basidiomycètes: Comme

(15)

Partie 01 : Etude bibliographique

Page | 3

les Ascomycètes, ont un thalle septé ou unicellulaire (levures), la reproduction de ces champignons est soit sexuée avec formation de spores méiotiques (basidiospores) sur des basides, soit asexuée (conidies). Les deutéromycètes (Fungiimperfecti) regroupent les moisissures pouvant vivre et se multiplier sans phase sexuée (Botton, 1990).

I.1.8.Les métabolites secondaires

Plus récemment, et avec l’essor de la biotechnologie, des procédés exploitant certaines caractéristiques des moisissures ont été développés, soit pour dégrader de nombreuses molécules organiques ou minérales afin de dépolluer les sols, soit pour la production de plusieurs métabolites secondaires ayant des valeurs ajoutées et des activités biologiques très importantes ou des effets pathologiques nocifs (mycotoxines) (Hendey et Cole, 1993).

I.1.8.1.Antibiotiques

Sont des substances naturelles qui ont une action d’inhibition ou de destruction spécifique contre les bactéries. Avec la découverte des antibiotiques, l’humanité a disposé d’un moyen et d’un remède extrêmement efficace contre les bactéries pathogènes qui l’accablaient depuis des millénaires (Smaoui, 2010). Parmi un total de quelques 10700 antibiotiques décrits pour l’ensemble du monde vivant, environ1600 proviennent de champignons (Botton, 1990).

I.1.8.2.Aromes

En 1924, Storkle notait que des champignons sont responsables de la synthése de nombreux composés aromatiques d’origine fongique comme les méthyl-cétones utilisés dans le fromage (Boiron, 1996).

I.1.8.3.Enzymes

De nombreuses enzymes industrielles, généralement des hydrolases, sont produites par les champignons. Il s’agit d’enzymes endocellulaires(glucose oxydase, catalase,..) ou exocellulaires (amyloglucosidases, pectinases, cellulases lipases, proteases) (Boiron, 1996).

I.1.8.4.Mycotoxines

Les mycotoxines sont des métabolites secondaires peu volatiles, élaborés par diverses moisissures sous certaines conditions environnementales. A l’heure actuelle seules certaines espèces de moisissures sont connues comme ayant la capacité de produire des toxines. Leur biosynthèse est dépendante de plusieurs facteurs, dont la température, les éléments nutritifs disponibles et la présence d’autres espèces en compétition (Hendey et Cole, 1993).

(16)

Partie 01 : Etude bibliographique

Page | 4

I.2. Zinc

I.2.1.les métaux lourds

I.2.1.1 Introduction

Les éléments métalliques sont, sous différentes formes, toujours présents au sein de l’environnement. A l’état de traces, ils sont nécessaires voire indispensables aux êtres vivants (Winkelmann et Winge, 1994). A concentration élevée, en revanche, ils présentent une toxicité plus ou moins forte ( Dulay et Castro, 2016). Ces métaux lourds ne présentent pas tous les mêmes risques en raison de leurs effets sur les organismes, leurs propriétés chimiques, physico-chimiques et biologiques. Leur toxicité est très variable et leur impact sur l’environnement est très différent (Bradl, 2005).

I.2.1.2. Définition

Les éléments traces métalliques sont généralement définis comme des métaux lourds. On appelle métaux lourds tout élément métallique naturel dont la masse volumique dépasse 5g/cm3. Ils englobent l'ensemble des métaux présentant un caractère toxique pour la santé et l'environnement (Wang et Chen, 2006).

I.2.2. Zinc

I.2.2.1.Définition

Le zinc est un élément chimique de symbole (Zn), qui couvre environ 0,004% de la croûte terrestre avec un nombre atomique de 30 et un nombre atomique relatif de 65,39. Il est possède une couleur bleu-grise et son état d'oxydation le plus commun est +II (Baize, 1997).

Le Zn à la moyenne contient environ 80 ppm en lithosphère et entre 10 et 300 ppm dans le sol, et est considéré l'un des métaux les plus importants que l'on trouve dans les effluents déversés des industries, et l’un des micronutriments essentiels pour tous les organismes, la croissance ralentit lorsque Zn est déficient en environnement, bien qu'une quantité excessive du zinc puisse se révéler toxique pour les cellules (Moreno et al., 2005).

I.2.2.2. Zinc dans l’environnement

Les sources naturelle du zinc dans l’environement sont l’altération de roche (50%), le volcanisme(22%) et la végétation (Horowitz, 1989). Mais ces sources naturelles ne représentent qu’environ 7% des émissions totales de cet élement dans l’environement, étant donné que la production et le traitement de minerai et les activités industrielles représenteraient 75% et 18% respectivement, des émissions du zinc dans le milieu naturele (Nriagu, 1996).

(17)

Partie 01 : Etude bibliographique

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I.2.2.3.Les intérêts du zinc chez les organismes

Le zinc joue un rôle dans la stabilisation de la structure des protéines, la réplication cellulaire, la stabilisation de la membrane et du cytosquelette et dans la structure des hormones (Doillon, 2010). . Il intervient dans le métabolisme des sucres, des graisses et des protéines. Son action se fait par l’intermédiaire de plus de 300 enzymes dans les 6 classes : oxydoréductases, transférases, hydrolases, lyases, isomérases et ligases. Dans ces métallo enzymes, son rôle peut être structural, catalytique, régulateur ou mixte (Jondreville et al., 2003).

I .2.2.4.Toxicité du zinc

Le zinc, tout particulièrement sous forme de métal, n’est relativement pas toxique. Toutefois il peut réagir avec d’autres matières telles l’oxygène et les acides, pour former des composés potentiellement toxiques (Gillet, 2005).

I.2.2.4.a.Phytotoxicité

Lorsque la concentration du zinc atteint le seuil de toxicité dans les tissus, les fonctions physiologiques de la plante sont perturbées et la croissance peut être ralentie. La nécrose et la chlorose sont les principaux symptômes d’une toxicité due au zinc (Jondreville et al., 2003).

I.2.2.4.b

.

Toxicité chez les animaux et les humains

La toxicité du zinc peut porter sur différents organes, sur la reproduction ou être cancérogène. Bien sûr, ces effets toxiques dépendent des voies et niveaux d'exposition, ainsi que de l'espèce considérée. Trois voies d'entrée dans le corps humain sont à considérer: l’inhalation, le contact cutané et l’ingestion (Plum et al., 2010) .

I.2.2.4.c.Toxicité chez les micro-organismes du sol

Pour appréhender l’effet toxique du zinc sur les microorganismes du sol, trois paramètres sont à prendre en compte :le risque direct pour les organismes du sol, la diminution de la biodiversité des organismes du sol et le risque de transfert dans la chaîne alimentaire naturelle (oiseaux, rongeurs, ..) (Dijksterhuis et Samson, 2007).

Des fortes concentrations de zinc nuisent sur l’écosystème et interrompent l’activité du sol car elle influent négativement sur l’activité des microorganismes qui sont responsables de la décomposition de la matière organique, en règle générale, les pollutions métalliques réduisent la diversité et l'abondance des espèces fongiques, notamment en exerçant une pression de sélection favorisant les populations tolérantes (Gadd, 1993).

(18)

Partie 01 : Etude bibliographique

Page | 6

I.2.2.5.Mécanismes de toxicité

Les effets toxiques dans les cellules comprennent le blocage des groupes fonctionnels des molécules à fonctions biologiquement importantes (par exemple:les enzymes et les systèmes de transports de nutriments essentiels et d’ions), le déplacement et/ou la substitution des ions métalliques essentiels dans des biomolécules, les modifications conformationnelles, les perturbations de membranes cellulaires (Appenroth, 2010).

I.2.2.5.a.Altération des membranes cellulaires :

Une condition préalable à la toxicité métallique est le contact direct avec les composants cellulaires (Gadd, 1993). Ainsi, un des effets les plus importants du métal toxique au niveau cellulaire est l'altération de la perméabilité membranaire (Belagyi et al., 1999; Sanz et al., 2009).causant souvent un efflux d’ions. Ceci entraînent souvent une dépolarisation de la membrane plasmique (Gurer et Ercal, 2000 ).

I.2.2.5.b.Inhibition d'enzymes

Les deux principaux mécanismes d’inhibition des enzymes par le métal toxique sont :

1) l’induction d'une carence en métal nécessaires aux métallo enzymes et la substitution d'un métal nécessaire par le métal toxique au niveau du complexe enzymatique, 2)l'interaction de métal toxique avec les groupes fonctionnels des enzymes (Flora et al., 2008).

I.2.2.5.c.Interaction avec les acides nucléiques

On peut observer une réduction des appariements entre les deux brins de l'ADN, ainsi que la formation de complexes avec l’ADN (Chiaverini et De Ley, 2010). On peut observer aussi les réactions similaires entre le métal et les ARN. Le métal peut induire une dépurination de l'ADN ayant pour conséquence des effets mutagènes. Les radicaux libres générés par le métal peuvent induire des cassures dans les brins d'ADN ainsi que leur dégradation (Bregadze et al., 2008).

(19)

Partie 01 : Etude bibliographique

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I.3. Les méthodes d’élimination du zinc

I.3.1.Introduction

Les métaux lourds rejetés dans l'environnement ont augmenté de façon continue en raison des activités industrielles et du développement technologique et présentent une menace importante pour les êtres humains, les plantes, les animaux et l'environnement en raison de leur toxicité, de leur accumulation dans la chaîne alimentaire et de leur persistance dans la nature (Wang et Chen, 2006).

I.3.2.Les méthodes d’élimination du zinc

Pour atténuer la pollution par les métaux lourds, de nombreux procédés chimiques comme

l'adsorption, les précipitations, l'échange d'ions, l'électro-coagulation, et l'osmose inverse ont a été développé (Mrudula et al. , 2016).

Ces méthodes présentent plusieurs inconvénients tels que : sont limitées à certaines concentrations d'ions métalliques générant de grandes quantités de boues toxiques et les coûts sont trop élevés pour être économiques (Gadd, 2008).

I.3.2.1.Les méthodes biologiques

Les microorganismes possèdent une capacité à survive en s'adaptant à des concentrations élevées de métaux lourds toxiques. Des études de recherche ont été réalisées pour approcher biologiquement l'accumulation de métaux lourds par des champignons (Ezzouhri et al., 2009).

En général, deux mécanismes ont été proposés pour la tolérance au métal dans les champignons: 1. Séquestration extracellulaire (fixation sur la paroi cellulaire).

2. Séquestration physique intracellulaire du métal en se liant à des protéines ou d'autres ligands pour l'empêcher d'endommager les cibles cellulaires sensibles aux métaux. Les mécanismes extracellulaires sont principalement impliqués dans l'empêchement de l'entrée des métaux, alors que les systèmes intracellulaires visent à réduire le fardeau du métal dans le cytosol (Anahid et al., 2010).

I.3.2.2.Mécanismes de tolérance au zinc chez les moisissures

a.Biosorption

(Fixation aux parois cellulaires

)

a.1.Définition

Est une propriété de certains types de biomasse microbienne pour lier et concentrer les métaux lourds de la solution aqueuse même très diluée. La biomasse présente la propriété d'agir simplement comme substance chimique et comme échangeur d'ions d'origine biologique. C'est en particulier la structure de la paroi cellulaire de certains champignons qui est responsable de ce phénomène (Gadd,

(20)

Partie 01 : Etude bibliographique

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2008). L'ensemble des interactions (échange ionique, complexation, précipitation,...) entre une moisissure et les éléments métalliques est nommé biosorption (Gadd, 1993).

a.2.Mécanisme de tolérance

La paroi cellulaire est le premier site d'interaction directe. La surface de la cellule des moisissures est chargée négativement en raison de la présence de diverses structures anioniques, telles que le glucane et la chitine cela donne aux moisissures la capacité de lier des cations métalliques (Anahid

et al., 2010).

La biosorption montre une dépendance au pH extracellulaire, ainsi si ce dernier est bas, il diminue la biosorption d’ions tels que Zn2+

(Gadd, 1993). Au niveau des parois, une compétition entre d'autres anions et cations et les métaux peut avoir lieu pour les sites de fixation (Gadd, 1990).

Les champignons filamenteux appartenant aux genres Aspergillus, Penicillium, Fusarium,

Alternaria et Geotrichum. Sont connus pour leur résistance aux métaux lourds. Ils présentent

l'avantage d'avoir un matériau de paroi cellulaire qui présente d'excellentes propriétés de liaison aux métaux. La majorité de ces souches sont résistants à Pb, Cr, Cu et Zn. Le niveau de résistance dépend de la souche étudiée, ainsi que du site de son isolement. Des concentrations inhibitrices minimales (CMI) pour Pb2 +, Cr6 +, Cu2 + et Zn2 + ont également été déterminées. Les souches d'Aspergillus et de Penicillium étaient les plus tolérants aux métaux lourds et présentaient une forte croissance. Leur CMI variait de 15 à 20 mM respectivement pour Cu et Zn (Ezzouhri et al., 2009).

b.Bioaccumulation

b.1.Définition

Le métal lourd peut également passer dans la cellule à travers la membrane cellulaire par le cycle métabolique cellulaire. Ce mode de l'absorption du métal est appelé bioaccumulation (Malik, 2003).

.b.2.Mécanisme de la tolérance

Dans le mécanisme intracellulaire, des protéines de transport des composés métalliques peuvent être impliquées dans la tolérance aux métaux soit par l’efflux hors de la cellule des ions métalliques à partir du cytosol et le maintient de l'homéostasie des oligo-éléments essentiels tels le zinc et le cuivre ou l'immobilisation des métaux plus toxiques pour l'environnement, tels le cadmium et le mercure (Hall, 2002).

L'immobilisation des métaux intracellulaires implique deux processus qui sont la compartimentation dans des vacuoles et la complexation par des protéines cytoplasmiques, appelées métallothionéines et phytochelatines, celles-ci forment des classes de protéines riches en cystéine et sont présentes de façon ubiquitaire. Elles ont un faible poids moléculaire et contiennent des agrégats de métaux à base de soufre ( Siddiquee et al., 2015). Un autre moyen qui peut être mis en place est

(21)

Partie 01 : Etude bibliographique

Page | 9

la répression des gènes de transporteurs impliqués dans l'absorption de métaux au niveau de la membrane plasmique (Adriaensen et al., 2005).

(22)

Partie 02 : Matériels et Méthodes

Page | 10

II. Matériels et Méthodes

II.1. Matériels

II.1.1.Milieux des cultures

PDA , CYA (annexe 01,02) .

II.1. 2.Produis chimiques et réactifs

Acide nitrique ( HNO3 ) 69%. Acide chlorhydrique (HCl ) 1mol/L Zinc Butanol acide acétique 99% Chloroforme Méthanol

II.1.3.Appareillage

Bec Bunsen Bain marie Balance

Plaque chauffante agitatrice Etuve +Agitateur-incubateur Autoclave

Vortex pH mètre

Microscope optique

Spectrophtométre d’absorption atomique Réfrigérateur Centrifugeuse

II.1.4.Matériaux

Boites de Pétri Tubes à essai Lames Lamelles Plaques CCM (aluminium)

(23)

Partie 02 : Matériels et Méthodes

Page | 11

II.2. Méthodes

Le but principal de cette étude était de voir l’effet du zinc sur la production des métabolites secondaires par les moisissures isolées à partir du sol pollué par le zinc.

II.2.1.

Zone d'étude et collection d'échantillons

Un échantillon a été prélevé à partir du sol pollué par les déchets de l’Asmidal Annaba. Les gros débris sont enlevés (plantes, racines, pierres) le reste du sol est récupéré et mis dans des flacons stériles. Ces derniers sont déposés dans une glacière et transportés rapidement au laboratoire à 4°C (Ezzouhri et al., 2009).

II. 2.2.Isolement des moisissures

La solution mère a été préparée par l’ajout de 10g du sol à 90 ml d’eau distillée stérile suivie d’une agitation pendant 10 minà l’aide d’un vortex. Cette solution a servi à préparer des dilutions décimales par l’ajout successif de 1 ml de la solution à 9 ml d’eau distillée stérile jusqu’à l’obtention de la dilution de 10-4, ensuite un volume de 0.1ml de chaque dilution est ensemencée en surface par touche en trois points sur le milieu solide PDA. Trois boites de chaque dilution ont été ensemencées pour assurer la croissance des micro-organismes présents dans l’échantillon après au moins 3 jours d'incubation à 25 ° C, puis l’antibiotique gentamicine a été ajouté pour minimiser la croissance bactérienne

(Ezzouhri et al ., 2009 (.

II .2.3.Purification des isolats

Trois boites de Pétri contenant du milieu PDA ont été ensemencées à partir d’une colonie développée à l’aide d’un anse de platine, ensuite les boites ont été incubées au moins 3 jours à 25 ° C (Ezzouhri et al . , 2009).

II.2.4.Identification des souches

L’identification d’une souche représentative est effectuée par deux techniques classiques : une observation macroscopique et une étude microscopique des souches.

II.2.4.1.Etude macroscopique

Les caractères morphologiques et culturaux sont déterminés après ensemencement des souches pures sur le milieu de culture CYA. L’identification se fait à l’œil nu, elle se base essentiellement sur les caractères suivants: la vitesse de croissance, l’aspect du mycélium aérien, couleur de l’envers de la colonie, l’odeur et la couleur des moisissures (Botton et al., 1990).

(24)

Partie 02 : Matériels et Méthodes

Page | 12

II.2.4 .2.Etude microscopique

L’identification microscopique repose sur la morphologie du mycélium (septation dans le mycélium, couleur) et la présence de spores (couleur,forme,disposition des spores, texture des parois) (Botton et al., 1990).

II.2 .5.Conservation des souches isolées

La conservation a été effectuée par le repiquage des souches en tube sur gélose (PDA)inclinée, qui a été incubée pendant une semaine à 25°C puis a été stockée à 4°C (Botton et al., 1990).

II.2.6.

Screening des moisissures tolérantes au zinc

Les isolats purifiés ont été testés pour leur tolérance à différentes concentrations du zinc, le milieu CYA est utilisé dans cette expérience. Les souches purifiées ont été repiquées dans des boites de Pétri qui contiennent la gélose CYA avec différentes concentrations du zinc (600, 800, 1000,1200 et 1400 mg.l1).

Comme témoin les moisissures ont été cultivées sur le même milieu sans l’addition du zinc. Les boites ensemencées en trois points ont été incubées à 28° C pendant au moins 7 jours. L'effet du zinc sur la croissance des isolats testés a été estimé en mesurant le diamètre du mycélium (mm) par la comparaison avec le témoin et la détermination de l'indice de tolérance.

L'indice est défini comme le rapport du diamètre de mycélium traité à celui du mycélium non traité. Des isolats présentant une résistance au Zn2 + ont été sélectionnés pour les expériences suivantes (Iram et al.,

2012).

II.2.7.Optimisation de la croissance du penicillium chrysogynum

Cette étape consiste à évaluer la croissance de la souche fongique sélectionnée en fonction de différentes conditions du milieu. Les paramètres faisant l’objet de l’optimisation sont : pH et température.

II.2.7.1.Effet du pH sur la croissance de la souche fongique sélectionnée

L’effet du pH du milieu CYA sur la croissance de la souche fongique sélectionnée a été étudié par l’ajustement du pH à trois valeurs différentes 1,6, et 12 à l’aide de HCl et Na OH . L’incubation a été faite à 25°C pendant 7 jours(

Li

et al., 2009).

II.2.7.2 .Effet de la température sur la croissance de la souche fongique

sélectionnée

(25)

Partie 02 : Matériels et Méthodes

Page | 13 L’effet de la température sur la croissance de la souche fongique sélectionnée a été étudié dans les même conditions sauf que l’incubation de la souche sélectionnée a été faite à températures différentes 5°C, 25°C, 37°C et 45°C (Miller et al., 1974).

II.2.8.Bioaccumulation du zinc par l’isolat fongique

sélectionnée

II.2.8.1.Préparation de la suspension fongique (Inoculum)

Une suspension fongique a été préparée par un frottement à l’aide d’une anse de platine, à partir de la boite de Pétri pure, puis la biomasse prélevée a été suspendue dans un tube à essais remplis de 9 ml d’eau Physiologique. Après agitation, les dilutions décimales de 10-1 jusqu’à 10-4 ont été préparées (Dwivedi et al. , 2012).

II.2.8.2.Inoculation des tubes

Le bouillon CYA à diverses concentrations de zinc ( 600, 800, 1000,1200 et 1400 mg /l) a été distribué en 5 ml dans des tubes à essai stériles . Un témoin sans addition du zinc a été réalisé. Ces tubes ont été inoculés avec 1 ml de la suspension préparée de l’isolat fongique la plus résistante et maintenus dans Incubateur-agitateur à 25 ± 2 ° C pendant 7 jours. La biomasse fongique a été récoltée après 4 jours par centrifugation à 6000rpm pendant 5min. le culot obtenu a été lavé trois fois avec l’eau distillée et séché dans un four à air chaud à 70 ± 5 ° C pendant 1 jour (Dwivedi et

al., 2012).

II.2.9.Mesure de la concentration du zinc dans la biomasse séchée

Les biomasses sèches ont été pesées, digérées avec 17.5ml d’ acide nitrique (HNO3) et 12.5ml d’acide hydrochlorique (HCl) pour 1g de la biomasse sèche dans un bain marie. Après le temps de digestion (20min), les tubes ont été refroidis à température ambiante et le volume de solution a été complété jusqu’à 50ml par l’eau distillée et analysés par spectrométrie d’absorption atomique (MacDiarmid et al., 2000 ).

II.2.10.Identification des métabolites secondaires

II.2.10.1.Sur milieu solide CYA

L’identification des métabolites secondaires sur milieu solide s’effectuée par l’observation directe de la pigmentation du milieu de la culture et du contour des colonies (Sajjad et al, 2012).

II.2.10.2.Chromatographie sur couche mince (CCM)

La chromatographie sur couche mince constitue la méthode de base qui permet une séparation efficace des métabolites secondaires et leur identification avec une bonne précision. Elle se fait sur

(26)

Partie 02 : Matériels et Méthodes

Page | 14 une plaque de gel silice sur laquelle est déposé un spot de 10μl de surnagent d’une culture de

Penicillium chrysogenum (Figure 01) (Jyoti et Singh , 2016) . La plaque est ensuite placée dans

une cuve chromatographique et trempée dans un mélange de solvant : (Behnas, 2015 ; Jyoti et Singh , 2016 ).

Butanol, acide acétique et l’eau de volume (1/1/ 1). Chloroforme et méthanol de volume (90 /10).

Après migration et évaporation du produit d’élution, la plaque est examinée sous une lampe à UV à une longueur d’onde de 365 nm. La présence des métabolites secondaires se traduit par une fluorescence et un facteur de rétention (RF) qui est calculé comme suite :

Distance parcourue par un constituant RF= (

Distance parcourue par l’éluant

(27)

Partie 03 : Résultats et Discussion

Page | 15

III. Résultats et discussion

III.1. Isolement, purification et identification des souches fongiques

L’élimination des autres microorganismes a été nécessaire dans l’isolement des moisissures par l’utilisation des milieux sélectifs pour les souches fongiques. L’ajout d’un antibiotique (gentamicine) a été utilisé pour l’inhibition de la croissance bactérienne. L’utilisation du milieu PDA a permis d’isoler et identifier 3 souches fongiques Penicillium chrysogenum, Cladosporium

cladosporoides et Alternaria alternata à partir du sol contaminé par 68.4mg.g-1 du zinc (Botton

et al., 1990).

III .2. Screening des moisissures tolérantes au zinc

Ce test a été fait pour la détermination de la capacité des souches Penicillium chrysogenum

Cladosporium cladosporoides et Alternaria alternata de croitre sur le milieu qui contient

différentes concentrations élevées de zinc. Le test de screening a révélé une hétérogénéité de la tolérance au zinc de ces moisissures (figures 02, 03 et 04). Le niveau de tolérance varie en fonction de la variation des espèces. Des résultats similaires ont été rapportés par Sharma et al. (2014). La moisissure la plus tolérante qui peut se développer à fortes concentrations du zinc 1200mg.l-1 et 1400mg.l-1 par des indices de tolérance 35% et 18% respectivement (figure 02) est

Penicillium chrysogenum qui a montré des changements morphologiques marqués au cours de

son développement (figure 05) et qui a été sélectionnée pour cette étude.

0 20 40 60 80 100 120 0 600 800 1000 Concentration du zinc (mg.l-1₎ L' in d ic e d e to lé ran ce (% )

Figure 02 : Indice de tolérance de la souche fongique Alternaria alternata testée

(28)

Partie 03 : Résultats et Discussion

Page | 16 0 20 40 60 80 100 120 0 600 800 1000 Concentration du zinc (mg.l-1₎ L 'indi ce de t ol éra nc e (%)

Figure 03 : Indice de tolérance de la souche fongique Cladosporium cladosporoides

testée avec différentes concentrations du zinc sur le milieu CYA à 25°C.

0 20 40 60 80 100 120 0 600 800 1000 1200 1400 Concentration du zinc (mg.l-1₎ L' in d ic e d e to lé r anc e ( % )

Figure 04 : Indice de tolérance de la souche fongique Penicillium chrysogenum

(29)

Partie 03 : Résultats et Discussion

Page | 17

D’après les résultats obtenus dans les figures 02, 03 et 04 l’augmentation des concentrations du zinc (600, 800 et 1000 mg.l-1) dans le milieu a été accompagnée à une croissance des trois souches fongiques. Ceci indique qu’ il ya une tolérance de ces souches avec des concentrations trop fortes de zinc.

La moisissure la plus sensible était Alternaria alternata qui a montré une diminution respective de sa croissance avec l’augmentation des concentrations du zinc (600 , 800,1000 mg.l-1

) et elle a présenté un indice de tolérance plus faible (0.10) à la concentration la plus élevée 1000mg.l-1 (figure 02).

La moisissure Cladosporium cladosporoides a montré une diminution respective de sa croissance avec l’augmentation des concentrations du zinc (600,800 et1000mg/l) et elle a présenté un indice de tolérance plus faible (0.13) à la concentration la plus élevée 1000mg.l-1 (figure 03).

La moisissure Penicillium chrysogenum a montré une diminution respective de sa croissance avec l’augmentation des concentrations du zinc (600,800 et 1000 mg.l-1

) et elle est peut être capable de

Figure 05 : Aspect des colonies de la souche fongique Penicillium chrysogenum après

sept d’incubation sur le milieu CYA à 25°C après l’ajout de différentes concentrations du zinc (a:Témoin ; b:600mg.l-1 ; c:800mg.l-1 ; d:1000mg.l-1 ; e:1200mg.l-1 ; f:1400mg.l-1). a b c d e f

(30)

Partie 03 : Résultats et Discussion

Page | 18

se croitre même à des concentrations supérieur à 1400mg.l -1, car cette souche a continué leur développement aux concentrations les plus élevées 1200mg.l-1 ,1400 mg.l -1 par des indices de tolérance de 0.35, 0.18 respectivement (figure 04).

Les souches Penicillium chrysogenum, Cladosporium cladosporoides et Alternaria alternata ont capable de continuer leur croissance en présence du zinc dans le milieu. Ceci est en accord avec les résultats de Ezzouhri et ces collaborateurs (2009), qui ont trouvés dans leur étude que la souche fongique (Penicillium chrysogenum ) était capable de tolérer jusqu’à 20mM de zinc. D’autres chercheurs, Sharma et ces collaborateurs (2014) ont démontré que la souche Penicillium

chrysogenum peut tolérer le zinc jusqu’à 25mM. Les valeurs obtenues d’après ces travaux sont

supérieurs à nos valeurs obtenues ce qui signifie que ces résultats sont en accord avec nos résultats. Mais cette différence peut avoir l’ explication suivante : la présence de différents types des processus de tolérance ou mécanismes de résistance exposés par différentes espèces fongiques, autre facteur est le milieu de culture utilisé, car ces facteurs peuvent avoir une grande influence sur les valeurs maximales capables d’être tolérées par cette souche fongique ( Shivakumar et al., 2014).

III.3.1.Les caractères macroscopiques de la souche Penicillium

chrysogenum

L’étude macroscopique a été réalisée par l’observation à l’œil nu. L es résultats obtenus, ont été rassemblés dans le tableau (01).

Tableau 01 : les caractères macroscopiques de la souche Penicillium chrysogenum.

III.3.2.Les caractères microscopiques de la souche Penicillium chrysogenum

Souche Milieu

de culture

Température Aspect macroscopique des isolats Description des colonies Diamétre des colonies (mm) surface Revers Penicillium chrysogenum

CYA 25± 2°C Recto : colonie

verte bleuâtre, à texture velouté et poudreuse , avec un contour blanc. -Verso : marron Jaunâtre colonie à croissance moyenne 33

(31)

Partie 03 : Résultats et Discussion

Page | 19 Penicillium chrysogenum a été observé au grossissement x40. Le résultat obtenu est montré dans

la figure 06.

L’observation microscopique de la souche étudiée montre des pénicilles asymétriques à ramifications divergentes. Des conidiophores lisse, terminés par un groupe de 3-5 métules. des hyphes cloisonnés. Les phialides sont en verticille, ampuliformes. Les conidies sont sub-globuleuses, lisse, disposées en longues colonnes irrégulières. Ils’agit de Penicillium chrysogenum. Ces caractères sont décrits par Botton et ses collaborateurs (1990).

III.4.Optimisation de la croissance du Penicillium chrysogenum

III.4.1.Effet du pH sur la croissance Penicillium chrysogenum

La souche Penicillium chrysogenum a montré une croissance rapide à pH=6 et le taux de croissance a été mesuré à environ 90% (figure 07) après sept jours d’incubation. A pH=12 après sept jours d’incubation le taux de croissance a été mesuré à environ 66% (figure 07). Dans les même conditions à pH=01 il ya une croissance lente avec un taux de croissance de 24% (figure 07). D’après ces résultats, la souche fongique Penicillium chrysogenum est capable de croitre dans une gamme de pH de 1 jusqu’ à pH=12 avec un optimum à pH=6. Les mêmes résultats ont été rapportés par Abdul Rasol et ces collaborateurs (2009). L’influence du pH sur la croissance du

Penicillium chrysogenum et sur l’aspect des colonies a été représentée dans les figures (07), (08)

respectivement.

Figure 06 : Aspect microscopique de la souche Penicillium chrysogenum sur le milieu CYA

(32)

Partie 03 : Résultats et Discussion

Page | 20

La capacité de croissance sur milieu à pH extrême est déterminée en grande partie par la capacité de

Penicillium chrysogenum à montrer des systèmes de contrôle du pH. Cela implique une efficacité des systèmes de transport trans-membrane, de sorte que cette solutés nécessaire pour réaliser des modifications intracellulaires peut être utilisé efficacement pour maintenir le potentiel de la membrane par rapport à l'environnement extérieur. Cela implique le contrôle efficace du

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 6 12 pH T a u x d e cr o is sa n ce ( % ).

Figure 07 : Effet de pH sur la croissance de Penicillium chrysogenum

à 25°C après 7 jours d’incubation sur le milieu CYA.

Figure 08 : Aspect des colonies de la souche fongique Penicillium chrysogenum

après 7 jours d’incubation à 25°C sur le milieu CYA à différentes valeurs du pH.

pH=6 pH=12

(33)

Partie 03 : Résultats et Discussion

Page | 21

mouvement du proton dans et hors des cellules. Il est également lié avec le contrôle de la pression osmotique, à cause de l'implication des cations et des anions (Gonzalez-Guerrero et al., 2005)

III.4.2.Effet de la température sur la croissance de la souche fongique

sélectionnée

Penicillium chrysogenum a montré une croissance lente à 5°C avec un taux de croissance 45% après sept jours d’incubation (figure 09). Une bonne croissance (taux de croissance 100%) après sept jours d’incubation à 25 °C a été observée. A 37°C et à 45 °C il ya une croissance rapide avec des taux de croissance de 150% et 90% respectivement (figure 09) avec un changement dans la morphologie des colonies (figure 10).

0 20 40 60 80 100 120 140 160 5 25 37 45 Température (°C) Tau x d e cr o is san ce (% )

Figure 09 : Effet de la température sur la croissance du Penicillium chrysogenum après sept jours d’incubation à pH=6.5 sur le milieu CYA .

(34)

Partie 03 : Résultats et Discussion

Page | 22

A partir de ces résultats obtenus, la souche Penicillium chrysogenum pu se développe à différentes températures de 5°C jusqu’à 45°C avec un optimum à 25°C, des résultats similaires ont été rapportés par Hugh et al (1974) qui ont trouvé que Penicillium chrysogenum est une souche thermotolérante qui pousse à 45°C et en même temps psychrotolérante qui pousse à 5°C. Plusieurs hypothèses ont été proposées pour expliquer la base de la thermophilie. plusieurs possibilités principales ont été suggéré: 1) la solubilisation des lipides; 2) résynthèse rapide des métabolites essentiels; 3) la thermostabilité moléculaire

.

III.5.Bioaccumulation du zinc par

Penicillium chrysogenum

Ce test permet d’étudier le processus de la bioaccumulation du zinc par la souche fongique sélectionnée Penicillium chrysogenum dans le témoin et avec l’adition de différentes concentrations du zinc pour tester sa capacité d’accumulation. Les résultats sont montrés dans la figure (12) sachant que les concentrations initiales du zinc étaient respectivement (600 ,800, 1000,1200 et 1400 mg.l-1).

Figure 10 : Aspect des colonies de la souche fongique Penicillium chrysogenum après 7

jours d’incubation à pH=6.5 sur le milieu CYA à différentes températures.

5°C 37°C 45°C 45°C 25°C 5°C 37°C 45°C

(35)

Partie 03 : Résultats et Discussion

Page | 23

Les résultats obtenus ont été mesurés par la SAA et sont exprimés en mg .l-1. La capacité de cette souche d’accumuler ce métal a augmenté rapidement avec l’élévation des concentrations initiales du zinc jusqu’à atteindre une valeur maximale (248mg.g-1

) à 1200 mg.l-1, à des concentrations plus élevées à 1200 mg.l-1, cette capacité d’accumulation a diminué jusqu’à atteindre une valeur de (155mg.g-1) à 1400mg.l-1 (figure 11).

Figure 11 : La bioaccumulation du zinc par la souche Penicillium chrysogenum.

Ces résultats sont corrélés avec les observations obtenus à partir de la sélection de Penicillium

chrysogenum résistant au zinc sur milieu solide (figure 05), qui ont montré une augmentation de

l’indice de tolérance à 0.35 dans la concentration 1200 mg.l-1_{suivi d’une diminution dans cet indice} à 0.18 dans la concentration 1400mg.l-1.

La capacité d’accumulation du zinc par Penicillium chrysogenum est interprétée par la possession des mécanismes de tolérance soit extracellulaires par la biosorption aux parois cellulaires qui présente d'excellentes propriétés de liaison métallique car elle est chargée négativement en raison de la présence de diverses structures anioniques, telles que le glucane et la chitine cela donne aux moisissures la capacité de lier des cations métalliques (Anahid et al., 2010), soit intracellulaires par

des protéines de transport de composés métalliques qui peuvent être impliquées dans la tolérance aux métaux par l’efflux hors de la cellule des ions métalliques ou par la compartimentation dans

0 50 100 150 200 250 300 0 500 1000 1500 Io n s d u z in c ab so rb és (m g.g -1 ) Concentration initiale mg. l-1

(36)

Partie 03 : Résultats et Discussion

Page | 24

des vacuoles ou aussi par la complication par des protéines cytoplasmiques appelés métallothionéines ( Siddiquee et al. , 2015).

III.6.La mise en évidence des métabolites secondaires

III.6.1. La mise en évidence des métabolites secondaires sur milieu solide

La détermination des composés naturels produits par la souche Penicillium chrysogenum était basée sur leur culture dans des conditions standard du laboratoire. la purification de Penicillium

chrysogenum sur le milieu CYA a donné des colonies en verso de couleur marron jaunâtre et en

recto vertes bleuâtres, à texture veloutée et poudreuse, avec un contour blanc (tableau 01), cette couleur indique la production de métabolites secondaires par la souche Penicillium chrysogenum qui peuvent être des antibiotiques comme les β-lactame (pénicilline….etc.), ou des mycotoxines.

Les efforts des chercheurs sont toujours axés sur les espèces de Penicillium comme une source continue de la production d'antibiotiques. Sajjad et al. (2012), ont isolé la pénicilline à partir d’une culture pure de Penicillium chrysogenum sur le milieu CYA. Sunesson et al. ( 1996), Lugauskas (2005), Lugauskas et al.( 2005) ont montrés que Penicillium chrysogenum synthétise des mycotoxines de la famille des alcaloïdes et certaines mycotoxines du groupe des stérols comme le fungisterol. Ce qui signifie que ces travaux sont en accord avec nos résultats. La couleur et la morphologie fongique sont affectés par les concentrations élevées du zinc (figure 05). Leur mycélium devient épais en comparaison avec le témoin. En outre, la croissance de l’isolat de

Penicillium chrysogenum sur le milieu CYA à des concentrations élevées en ions du zinc a été accompagnée avec la production d'une substance jaune (un métabolite secondaire) (figure 05 (f)), qui est probablement une réponse au stress imposé par la présence du zinc dans le milieu. Des résultats similaires ont été rapportés par Sharma et ces collaborateurs (2014); Ezzouhri et ces collaborateurs (2009) et Yazdani et ces collaborateurs (2010), qui ont noté que la plupart des souches fongiques présentent des changements dans leur morphologie ou leur milieu sur certains métaux lourds (surtout le zinc) en raison de la formation de mycélium coloré en présence de ces métaux lourds.

(37)

Partie 03 : Résultats et Discussion

Page | 25

III.6.2.Chromatographie sur couche mince (CCM)

La séparation des métabolites secondaires a été faite par chromatographie sur couche mince (CCM) avec une révélation par radiation UV à 365 nm.

La chromatographie sur couche mince du surnagent d’une culture de Penicillium chrysogenum utilisant le mélange de solvants chloroforme/méthanol (90/10) volume par volume, entraine une migration suffisante des molécules a permis de séparer un spot, apparu sous forme de tache colorée après révélation sous lumière UV. Le système de séparation formé de : Butanol/Acide acétique/Eau (1/1/1) volume par volume est le plus performant, et permet de déplacer les molécules à une distance d’environ 4.2 cm du front du solvant pour la tache 01et 4.1cm pour la tache 02 (figur12). La révélation de la plaque (CCM) sous UV à 365nm a permis d’observer deux taches correspondantes à la production des mycotoxines par la souche de Penicillium chrysogenum. Les deux taches 01, 02 avaient des rapports frontals Rf=0.65, Rf=0.64, respectivement. Les résultatsobtenus sont montré dans la figure (12).

La figure 12 a démontré qu’il ya une tache 01 correspondante à la production d’un métabolite dans le témoin et une tache 02 correspondante aussi à la production d’un métabolite dans la concentration 800mg.l-1 du zinc. Le rapport frontal dans le témoin (0.65) est presque le même dans

Tache 01: témoin

Tache 02 : 800mg/l

Tache 04: 1000mg/l

Tache 05 : 1400mg/l

Figure 12 : La plaque (CCM) réalisée à partir du surnagent de la souche Penicillium chrysogenum sur milieu CYA après révélation sous UV.

(38)

Partie 03 : Résultats et Discussion

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la concentration 800mg.l-1 , ce qui a indiqué que les deux taches correspondent au même métabolite qui peut être un mycotoxine. Aux spots des concentrations (1000 et 1400) il n’ya pas une migration des molécules, c’est-à- dire il n’ya pas une production de ce métabolite secondaire à ces concentrations. En comparaison aux résultats obtenus dans la figure (05, (f )) , la croissance de

Penicillium chrysogenum à ces concentrations élevées en ions du zinc (1400ppm) a démontré une production d’une substance de couleur jaune qui peut être un antibiotique, ce qui indique que la concentration élevée du zinc (1400mg.l-1 ) a un effet positif sur la production d’antibiotique, mais il n’ya pas un effet sur la production de la mycotoxine révélée sur la plaque (CCM) .

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Conclusion

Le zinc est un micronutriment essentiel pour tous les organismes, la croissance ralentit lorsque le zinc est déficient en environnement, bien qu'une quantité excessive devienne toxique pour les cellules.

Parmi les trois souches fongiques isolées à partir du sol pollué par le zinc, Penicillium chrysogenum est capable de tolérer des concentrations élevées de ce métal (1400mg.l-1), et est capable de croitre à des conditions extrêmes de l’environnement. L’optimisation a révélée que la souche Penicillium chrysogenum est thermophile et au même temps psychrotolérante qui a poussé à 5°C avec un optimum à 25°C. Aussi cette souche a poussé dans une large gamme du pH acide et alcalin avec un optimum à pH =6.

La mise en évidence de la production des métabolites secondaires par le Penicillium chrysogenum

sous l’effet du zinc sur un milieu solide a révélé qu’il ya une production d’un antibiotique à la concentration la plus élevée (1400mg.l-1 ). La plaque CCM a présenté deux taches dans le témoin et la concentration 800mg.l-1 a donné lieu à la production d’une mycotoxine, mais il n’ya pas l’apparition de ces taches dans les concentrations les plus élevées ce qui indique qu’il n’ya pas un effet du zinc sur la production de cette mycotoxine.

Donc, cette moisissure isolée est capable de tolérer les concentrations élevées en zinc qui influencent positivement sur la production des métabolites secondaires ayant des activités biologiques très importantes qui pouvent être démontrer aux prochaines études.

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