Le flowcam : optimisation pour l'observation de Gomphonema gracile

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Le flowcam : optimisation pour l’observation de

Gomphonema gracile

Jade Ezzedine

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Jade Ezzedine. Le flowcam : optimisation pour l’observation de Gomphonema gracile. Sciences de l’environnement. 2015. �hal-02602566�

Rapport de stage

Le FlowCAM : optimisation pour

l’observation de Gomphonema gracile

Jade EZZEDINE

Master 1 Sciences pour l’environnement – Parcours Ecologie – 2015 Encadrant : Monsieur Jacky Vedrenne

Lieu : IRSTEA Bordeaux

Unité de recherche : EABX, équipe CARMA Début 20 avril – Fin prévu pour le 28 aout

Remerciements

En premier lieu, je tiens à remercier l’équipe CARMA de l’Irstea de Bordeaux pour m’avoir chaleureusement accueilli. Je remercie surtout la responsable de l’équipe Mme Rosebery Juliette.

J’adresse mes remerciements les plus sincères à mon maitre de stage Mr Vedrenne Jacky qui a suivi avec attention l’évolution de mon travail. Merci pour m’avoir généreusement accordé de votre temps et merci aussi pour vos conseils et vos explications.

Je remercie également Mme Soizic Morin pour ses remarques et conseils.

Merci à Mme Marie-Pierre pour m’avoir formé à la recherche bibliographique et à la gestion et l’édition de ma bibliographie avec EndNote.

Je tiens également à remercier tous les membres de l’Irstea qui ont contribué de près ou de loin, scientifiquement ou non, à la réalisation de ce travail.

Enfin, les dernières lignes de ces remerciements sont dédiées aux stagiaires que j’eu le plaisir de côtoyer tous les jours. Merci à Manon, Claire, Maen, Evane, Lamis, Sirina, Hélène et Louise pour leur amitié.

Je n’oublierai pas d’exprimer ma sincère gratitude à tous mes professeurs de l’Université de La Rochelle.

Résumé

Le FlowCAM combine la cytométrie en flux, la microscopie et la détection par fluorescence. C’est un appareil automatique muni d’une caméra capable d’identification et de comptage de particule vivante et non vivante dans un fluide en mouvement dans une cellule de passage orientée verticalement. L’appareil est souvent utilisé pour l’analyse de la dynamique des communautés de phyto ou de zooplancton marin (morphologie individus, identification). Dans le cadre de mon stage, l’espèce de diatomée d’eau douce étudiée est Gomphonema gracile. Cette espèce en milieu aquatique pollué affiche une forme tératogène qui permet de connaitre l’état de santé de l’écosystème. Au préalable, il est nécessaire de définir les bons paramètres de détection en mode AutoImage pour obtenir des images binaires exploitables étant les plus proches de l’image réelle. En effet, le FlowCAM après capture en image d’une diatomée, il retrace son image binaire en pixels. Cette image binaire peut être identique ou non à l’image réelle en fonction du paramétrage. Ainsi, dans un premier temps, je m’attarde à la recherche des paramètres adéquats qui d’après mon expérience relève de la subjectivité tant que celle-ci ne dépasse pas de trop les préconisations du constructeur. Cependant, il est impossible d’emblée de travailler avec les paramètres d’usine, puisque chaque espèce possède ses particularités. Puis dans un deuxième temps, je vérifie la précision de détection de la classification automatique du FlowCAM des diatomées à partir d’un filtre basé sur des caractéristiques propre de la diatomée rassemblées dans une librairie d’image. Les résultats montrent que la détection automatique du FlowCAM est peu fiable vis-à-vis de cette espèce par rapport à l’identification à l’œil d’un utilisateur. Enfin, je compare les biovolumes de la diatomée obtenus grâce aux mesures du FlowCAM à des biovolumes issus des mesures au microscope. Pour les diatomées digérées les biovolumes ne sont pas semblable alors que pour les diatomées vivantes les biovolumes du FlowCAM sont proches de ceux obtenus par le microscope. Il est important de préciser que mon stage ne fait que commencer, en effet je reste jusqu’à fin aout. Il me reste plein de choses à découvrir quant à l’utilisation du FlowCAM.

Abstract

The FlowCAM-based automated technique is an instrument for particles analysis contained in a moving fluid. The apparatus automatically count but has also an ability to analyze shapes regarding their nature. The FlowCell or flow chamber holds the liquid sample in an upright position. This technic is often used to study size structure and dynamic in plankton

community in a marine system. Here, I present my data collected from the FlowCAM during my internship after analysis of pennate diatom specie named Gomphonema gracile. The specie exhibit a teratogenic form when it comes into contact with contaminated aquatic ecosystem. Hence, according to the form of the diatom it’s possible to evaluate ecosystem health. Before starting the analysis, setup must be changed in the FlowCAM. Setting correctly the machine AutoImage mode gives the best picture quality. The binary image must look exactly like the real one. Otherwise bias may arises from errors in measuring. The first step was seeking the best setting. It appears that personal choices are fine if the maker’s recommendations are covered. However, it’s highly recommended not to use default factory settings since each species have its own features. Afterward, FlowCAM’s accuracy in recognizing the diatom was tested after running an auto-classification. My result shows that the FlowCAM might not be reliable enough. A user is need it to check and add the missing images of Gomphonema gracile. Finally, another result indicates that FlowCAM automatic method misestimate digested diatom biovolume when compared to microscopy-based estimation. It is necessary to clarify that my internship will only end in late August. I still have plenty to learn about the use of the FlowCAM.

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Sommaire

1. L’Irstea ... 2

1.1 Présentation de la structure d’accueil ... 2

1.2 Insertion personnelle dans l’équipe CARMA ... 2

2. Introduction ... 3

2.1 Contexte général ... 3

2.2 Descriptif du FlowCAM ... 5

Anatomie et configuration du FlowCAM : ... 5

Le programme VisualSpreadsheet, pilier du FlowCAM : ... 6

Le « context » ou le paramétrage de l’analyse : ... 6

Les mesures ... 7

3. Matériels et Méthodes ... 8

3.1 Matériel biologique ... 8

3.2 Protocole de digestion et préparation de lame permanente pour les diatomées digérées . 8 3.3 Ultrason et destruction du mucilage ... 8

3.4 Microscope optique et FlowCAM : ... 8

3.5 Calcul de biovolume : ... 9 4. Résultats ... 9 4.1 Les paramètres ... 9 4.2 Les effectifs ... 10 4.3 Les biovolumes ... 12 5. Discussion ... 13 6. Bibliographies ... 16

2 1. L’Irstea

1.1 Présentation de la structure d’accueil

Le stage est réalisé à l’institut national de recherche en sciences et technologies pour l’environnement et l’agriculture (IRSTEA) de Bordeaux durant une période de quatre mois et demi. L’IRSTEA, est un établissement public à caractère scientifique et technologique français de recherche (EPST). L’institut cible les projets en relation avec l’environnement et l’agriculture dans le cadre entre autres, d’études sur les eaux continentales de surfaces. Constituée de deux unités de recherche, l’IRSTEA de Bordeaux est localisée sur le secteur de Gazinet – Cestas et emploi 180 personnes. Les recherches entreprises portent sur deux domaines principaux : la gestion de l’eau et du fonctionnement des milieux aquatiques et l’interface entre eau et gestion des territoires.

L’unité de recherche « ETBX », environnement, territoires et infrastructures s’intéresse au développement territorial et à l’agriculture multifonctionnelle par l’intermédiaire de deux équipes, EADT, environnement, acteurs et dynamiques territoriales et l’équipe GPIE, gestion patrimoniale des infrastructures liées à l’eau.

L’autre unité de recherche « EABX », écosystèmes aquatiques et changements globaux, traite de l’état et la dynamique des écosystèmes aquatiques continentaux (les estuaires, les lacs et les rivières) et des espèces vis-à-vis de pressions anthropiques (la pêche, la fragmentation des milieux, la contamination et le changement climatique). Trois équipes la composent, l’équipe CARMA, contaminants anthropiques et réponses des milieux aquatiques (responsable d’équipe Mme Juliette Rosebery), l’équipe FEE, fonctionnement des écosystèmes estuariens, et l’équipe PMA, poissons migrateurs amphihalins.

1.2 Insertion personnelle dans l’équipe CARMA

Mon stage rentre dans la thématique de recherche écotoxicologique de l’équipe CARMA. Cette équipe travail globalement sur des espèces bioindicatrices, notamment les diatomées des eaux douces en recherchant des biomarqueurs spécifique des contaminants toxiques (pesticides, métaux lourds). Plusieurs spécialistes aguerris des diatomées et de renommé internationale font partie de l’équipe, particulièrement Mr. Coste Michel, Mme. Rosebery Juliette et Mme. Morin Soizic, et que j’ai l’honneur de côtoyer au quotidien.

Le comptage et l’identification des diatomées au microscope est un travail assez chronophage, pour cela l’équipe a décidé d’investir dans le FlowCAM. Ainsi, ma mission principale est de continuer le travail de Mr. Vedrenne sur le FlowCAM en essayant de trouver les bons paramétrages de la machine pour l’observation d’une diatomée : Gomphonema gracile.

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En toute honnêteté et modestie j’aspire à devenir un jour un chercheur, pour cela ce stage va m’aider à devenir autonome et me permettra de maitriser le FlowCAM un appareil qui dans un futur proche et après certaines améliorations occupera une place importante sur la scène scientifique. Ce stage est la première étape pour la réalisation de mon souhait parce qu’auprès de cette équipe j’ai acquis et j’acquerrai encore plus de connaissances scientifique. De plus, j’ai pu partager vécu et connaissance avec les doctorants et les chercheurs. Ainsi, j’ai pu avoir un aperçu de ce monde intéressant qui tourne autour de la science.

2. Introduction

2.1 Contexte général

Dans le but d’observer, de caractériser et de quantifier de manière rapide et aisée les petites particules allant de 1 à 50 µm un nombre de technique d’analyse se sont développés au fur et à mesure de l’avancée technologique. Ainsi, le FlowCAM (Fluid Imaging Technologies) a fait son apparition sur le marché en 1999 et depuis ce jour des myriades d’améliorations ont été apportées à l’appareil pour augmenter sa puissance (Wilson et Manning, 2012 ; Anonyme, 2014).

Le FlowCAM est un appareil automatique qui combine la cytométrie en flux, la microscopie et la détection par fluorescence (Anonyme, 2014). Il permet une analyse rapide (30 minutes maximum) en temps réel à haute résolution des particules qui sont dans un fluide en mouvement verticale. Il peut capturer jusqu’à 20 photos en une seconde. Ainsi il permet de traiter un grand nombre d’échantillon frai ou fixé en un jour.

En général, l’analyse sous microscope nécessite un prétraitement de l’échantillon, par exemple, dans un but de préservation une fixation au formaldéhyde ou au lugol ou au glutaraldéhyde est souvent employée. Outre leurs toxicités pour le manipulateur certains de ces produits provoquent la destruction des cellules fragiles et entrainent une réduction de la taille des cellules conservées (phénomène de « shrinkage »). Cela conduit donc à une estimation incorrecte des dimensions des cellules, et de la structure de taille des communautés (Alvarez et al., 2013). De plus, certains peuvent entrainer une disparition de l’auto fluorescence de la chlorophylle, qui est nécessaire à la différenciation des autotrophes, des hétérotrophes, notamment dans le cas de certaines espèces comme les dinoflagellés (Buskey et Hyatt, 2006 ; Poulton et Martin, 2010). A contrario, le FlowCAM permet une analyse plus précise des communautés de planctons naturelles, puisqu’il est capable de traiter des échantillons frais. Ainsi il pallie les inconvénients des méthodes destructrices de préservation. De plus, trois modèles de FlowCAM, ont été conçu ; un modèle portable, un modèle

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submersible et un modèle de paillasse dit « Benchtop ». Les modèles, portable et « Benchtop » peuvent être amenés facilement à bord d’un bateau pour une étude dans le cadre de la surveillance de la qualité des eaux (Poulton et Martin 2010).

Parmi les autres avantages offerts par le FlowCAM est l’archivage des observations après analyses. Le programme d’exploitation VisualSpreadsheet intégré au FlowCAM permet un accès faciles aux images enregistrées. Ainsi, elles sont consultables à tout moment. De plus, le programme propose de nombreux paramètres personnalisables (outils de post-traitement) en fonction de l’échantillon étudier mais aussi des mesures différentes pour caractériser les espèces (largeur, longueur, aire, biovolume…).

Maintes études récentes s’appuient sur l’utilisation du FlowCAM. Par exemple, Buskey et Hyatt (2006) par l’intermédiaire de la reconnaissance et de l’énumération du FlowCAM, ont étudiés les espèces génératrices de bloom algal nocif particulièrement l’espèce Karenia breyis responsable des marées rouge. Par ailleurs, Day et al. (2012) par la détection du FlowCAM ont examiné le broutage des protozoaires sur les algues. Les images récoltées par l’appareil permettent d’observer les algues contenues dans les protozoaires après ingestion. Un dernier exemple d’étude, est l’analyse de la dynamique des communautés des diatomées marines (Alvarez et al., 2013). Spaulding et al (2012) et ainsi que Alvarez et al. (2012) s’accordent sur le potentiel puissant du FlowCAM comme outil pour contribuer à la recherche sur la population des diatomées marines. En effet, l’appareil capture un grand nombre d’image de cellules et les mesures, il est donc possible de suivre l’évolution de la taille dans la population de diatomées et de déterminer leurs âges.

Ces avantages tous plus tentants les uns que les autres à amener l’équipe CARMA à investir dans un FlowCAM benchtop VS-IV pour réaliser l’inventaire de la microméiofaune et des diatomées présentes dans des biofilms maintenus en culture, ou fixées obtenus lors des tests d’écotoxicologie en eau douce (plan d’eau ou cours d’eau) sur supports immergés. Pour ma part, je m’intéresse à une diatomée pennée à valves rhomboïdales avec des extrémités symétriques : Gomphonema gracile Ehrenberg (GGRA). Cette espèce possède une grande plasticité, et se trouve dans les eaux plutôt acides. Elle secrète un mucilage dense d’exopolysaccharide (EPS) par des organites contenus dans la frustule pour assurer la locomotion ou pour s’attacher à un substrat (Taylor et al., 2007).

En contact avec certains pesticides cette diatomée adopte un morphotype dit « tératogène » caractéristique des eaux polluées (Morin Soizic, Irstea). Elle fait partie de la panoplie des espèces bioindicatrices souvent utilisé pour déceler la pollution dans un écosystème d’eau douce. Ainsi, l’intérêt du FlowCAM sera de fournir un biovolume permettant de reconnaitre

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une diatomée normale d’une diatomée tératogène après analyse d’un échantillon frai, afin de caractériser le milieu. En conséquence, l’analyse fastidieuse au microscope pourrait être évitée.

Dans le but de conclure éventuellement sur l’utilité du FlowCAM comme outil d’identification et de mesure dans la surveillance d’un milieu aquatique. Mes objectifs consisteront :

 à maitriser le paramétrage du FlowCAM pour l’observation de la forme normal et tératogène de GGRA après digestion au peroxyde d’hydrogène ou à l’état vivant (frais).

 à créer une classification, pour une détection automatique du taxon ou de la forme, selon des filtres sélectionnés à partir de plusieurs librairies d’images que j’ai élaborées.

 à vérifier sa précision et conclure vis-à-vis de son rendement, et de sa fiabilité dans le calcul du biovolume obtenu par rapport à un microscope classique.

2.2 Descriptif du FlowCAM

Ce descriptif est issu entre autre du manuel du FlowCAM (2014), de certaines bibliographies et de mon expérience après manipulation de l’appareil.

 Anatomie et configuration du FlowCAM :

L’échantillon sous forme liquide, filtré sur une toile à tamis est introduit via un cône d’admission. Il communique avec une chambre en verre ou chambre de passage, orienté verticalement dénommée « FlowCell » par l’intermédiaire de fin tuyau en silicone. Pour une FlowCell standard, la caméra ne couvre qu’une partie de sa largeur, à la différence d’une FlowCell FOV (Field Of View). Plusieurs épaisseurs de FlowCell sont disponibles selon la taille de l’espèce à analyser (Cf. Annexe Table 1). Au delà de la taille de la particule étudiée, le choix de la FlowCell dépend aussi de l’objectif installé, de la vitesse de passage du liquide (« Flow Rate ») et de sa viscosité. Autrement dit, la FlowCell fixe la limite supérieure de la taille des particules à analyser et l’objectif quant à lui fixe la taille minimale possible d’observation (Alvarez et al., 2011). La FlowCell est maintenu par un support « le FlowCell holder » qui permet d’aligner cette dernière dans le champ de vision de l’objectif. Les objectifs fournis avec le FlowCAM sont le X2, X4, X10 et le X20. Derrière l’objectif une caméra couleur capture une image des particules. L’ensemble objectif et caméra numérique grossis les particules jusqu’à 200 fois et un facteur de calibration (microns par pixel) fournit leurs taille réelle (Alvarez et al., 2013). Poulton et Martin (2010) précise que la portion de la

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Flowcell visualisée par la caméra est entre 33 à 95% en fonction de l’objectif et de la Flowcell utilisée. D’autre part, une seringue permet de contrôler le pompage du liquide à travers le circuit. Conséquemment de contrôler le « Flow rate » ou le débit de l’échantillon dans la FlowCell. Ainsi, le pompage influe à la fois sur la qualité de l’image et le nombre de particule qui traverse la FlowCell. Enfin, la seringue peut expédier le liquide analysé dans un récipient poubelle ou soit le remonter dans la FlowCell pour une autre analyse.

 Le programme VisualSpreadsheet, pilier du FlowCAM :

Le programme offre deux modes d’analyses, dont la différence principale réside dans la manière de déclencher l’acquisition de photo via la caméra; le premier mode est le seul mode que j’ai eu l’occasion de tester jusqu’à présent dans mon étude, est le mode AutoImage. Il permet de numériser des photographies des particules à un intervalle régulier lors de leurs passages dans la FlowCell et ceci indépendamment de la concentration des particules dans l’échantillon (Anonyme, 2014). A fortiori, ce mode est recommandé pour l’analyse de cellules préservées au lugol, puisque leur fluorescence chlorophyllienne tend à diminuer avec l’augmentation du temps de stockages (Poulton et Martin 2010). Cependant, il est nécessaire de maintenir une concentration adéquate des particules à étudier et avoir une bonne homogénéité de l’échantillon pour obtenir des résultats fiable (Alvarez et al., 2011).

Le deuxième mode, est le « Trigger » mode. Il permet un déclenchement de la caméra soit par une détection de la fluorescence (« fluorescence-triggered mode »), soit par une détection de la diffusion latérale de la lumière (« side-scatter-triggered »), soit une détection par la combinaison des deux. Ces modes de détection sont beaucoup plus sélectives par rapport au mode AutoImage (Alvarez et al. 2011).

Nota bene : Faute de temps, ce mode « Trigger » n’a pas été testés jusqu’à présent, ainsi il ne sera pas détaillé dans le rapport.

Dans les deux modes, et après la prise des photos, le logiciel extrait chaque particule présente dans la photographie. Ce processus s’intitule la segmentation d’image, ainsi le logiciel définit une image binaire ou « binary overlay image » de la particule. Puis défini son bord ou « Edge », ainsi que 36 paramètres de taille et de forme pour chaque particule. L’utilisateur peut ainsi sélectionner (par un filtre personnalisable) certaines particules selon un paramètre recherché tel que la gamme de taille ou le niveau de fluorescence (Alvarez et al. 2011).

 Le « context » ou le paramétrage de l’analyse :

Le but est de trouver les bons paramètres (« settings ») d’acquisition pour l’espèce Gomphonema gracile qu’elle soit digérée ou vivante mais aussi normal ou tératogène dans la culture pure. Le logiciel permet de modifier deux paramètres primordiaux pour la détection.

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Le premier, la luminosité du fond et le deuxième, entre autres, les seuils de détection noir et blanc de la particule (Pixels).

La couleur du fond passe par la modification du gain de la caméra. Le gain défini en niveaux de gris l’arrière-plan (« background »). Il est préférable de le choisir d’une manière à obtenir un niveau de gris le plus neutre possible (Anonyme, 2014). A chaque nouvelle valeur du gain, une intensité moyenne du fond est attribuée. Le constructeur préconise une intensité moyenne autour de 150 et 200 pour une caméra couleur.

Nota bene : Il existe d’autres paramètres que je choisis de ne pas détailler dans ce rapport. En général, c’est dans l’onglet capture que la majorité des modifications importantes sont centralisées. Considérant qu’une particule présente des intensités de noir et blanc différentes de la couleur du fond. Il est possible à partir du réglage des seuils de segmentation (« Dark » et « Light » Pixels) de détecter la particule.

Un autre paramètre à changer est la fermeture des trous ou « Closes Holes (iterations) » qui permet de combler les trous dans l’image binaire (« overlay binary image ») et ainsi permet d’obtenir une surface binaire (pixel) égale à la surface réelle de l’image photographiée. D’autres paramètres existent, mais ne seront pas détaillés dans ce rapport.

 Les mesures

Il existe deux manières différentes pour mesurer la longueur et la largeur (Figure 1). La première se base sur un algorithme de mesure de Feret. Il correspond théoriquement à la distance perpendiculaire entre les tangentes parallèles touchant les côtés opposés de la particule (Anonyme, 2014). La deuxième correspond à un nouvel algorithme intégré récemment dans le logiciel, la mesure géodésique. Il modélise la particule comme étant un rectangle et se base sur des équations pour déterminer la plus petites distances.

Fig. 1 : Illustration des deux procédés de mesures effectuées par le FlowCAM pour la largeur et la longueur (Manuel FlowCAM, 2014).

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Le choix et l’utilisation de l’algorithme de Feret ou du géodésique dépend principalement de la morphologie de l’espèce considérée. Dans le cas d’une espèce de diatomée penné à symétrie large et d’une espèce en forme de disque centrique, l’algorithme de Feret est plus approprié pour les estimations des dimensions. En contrepartie, pour les espèces asymétriques l’algorithme géodésique est le plus adapté (Spaulding et al., 2012). Ainsi, grâce à ces mesures un filtre personnalisable peut être réalisé après sélection de certaines images contenues dans une librairie. Puis, ce filtre permettra la constitution d’une classification automatique afin de déceler les particules ayant des caractéristiques communes.

3. Matériels et Méthodes

3.1 Matériel biologique

L’espèce de diatomée étudiée est Gomphonema gracile (GGRA). Différentes générations ont été analysées et sont issues des cultures présentes au laboratoire de l’Irstea. Cette diatomée peut être observée en vue valvaire (de face) et vue connective (sur le côté) au microscope. Cependant, au FlowCAM d’autre type de vue peuvent être aperçus, puisque le liquide est en mouvement et les diatomées ne sont pas orientées par l’épaisseur de la FlowCell. Les diatomées normales en culture observé au microscope mesurent entre 14 et 21 µm pour la longueur et 5 à 6,5 µm pour la largeur. Par contre, les tératogènes mesures entre 29 et 35 µm en longueur et 5,5 à 7 µm en largeur.

3.2 Protocole de digestion et préparation de lame permanente pour les diatomées digérées

Le protocole utilisé est un protocole universel connu par tous les diatomistes. La digestion se fait par de l’eau oxygénée, et les lames permanentes sont préparés avec du Naphrax (Cf. Annexe 2), ceci permet d’éliminer la matière organique et garder uniquement la frustule.

3.3 Ultrason et destruction du mucilage

Pour les diatomées vivantes le mucilage épais est séparé au sonicateur pendant 7 minutes avant d’être analysées au FlowCAM. Dans le but d’éviter le colmatage de la FlowCell et pour éviter aussi les amas de diatomées lors de l’observation.

3.4 Microscope optique et FlowCAM :

Le microscope utilisé est le modèle Leica DMLS relié à un ordinateur par l’intermédiaire d’une caméra Baumer et du logiciel de traitement d’image « Archimed ». Les grossissements utilisés pour les mesures des diatomées digérées est X1000 et X400 pour les vivantes.

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Concernant le FlowCAM, en mode AutoImage, les objectifs utilisés sont le X10 et le X20 avec les FlowCells et les seringues adaptées. Les deux objectifs utilisés sont actuellement ceux qui permettent les plus forts grossissements sur un flowcam. Avant chaque introduction d’un échantillon dans le FlowCAM, une filtration sur une toile à tamis de 100 ou de 53 µm est employée pour éviter le colmatage de la FlowCell. Parfois, il a été nécessaire de diluer les échantillons au 20éme pour le mode AutoImage, afin que durant l’acquisition le nombre de particules par photos (PPUI) soit compris entre 1 et 5 (meilleure compromis entre vitesse acquisition et confort visuel).

3.5 Calcul de biovolume :

Seulement le biovolume de GGRA tératogène, vivante et digérée à X20 a été calculé pour ce rapport, la poursuite du stage me permettra de réaliser les mêmes calculs à X10. Le calcul du biovolume à partir des données du FlowCAM correspond à l’aire remplie de la vue valvaire par l’épaisseur de la vue connective obtenu soit par l’algorithme de Feret soit par l’algorithme géodésique. Ce « biovolume Flowcam » sera comparé au « biovolume microscope » calculé sur la base de la formule mathématique après mesures au microscope :

π

4 × µ(Lvv +Lvc)×µlvv × µEvc ⁄

Où :

µ(Lvv + Lvc) : Moyenne de la longueur de la vue valvaire et de la longueur de la vue connective µlvv : Moyenne de la largeur de la vue valvaire

µEvc : Moyenne de l’épaisseur de la vue connective

De plus, une comparaison des mesures de Feret et des mesures géodésique dans le calcul du « biovolume Flowcam » sont faites par rapport au « biovolume microscope ».

4. Résultats

4.1 Les paramètres

Dans le but d’obtenir la meilleure qualité d’image le gain, ainsi que les seuils de segmentation ont été adaptés. Le comportement de la caméra n’est pas le même d’un objectif à un autre c’est-à-dire que les paramètres qui s’appliquent correctement sur l’objectif X10 ne sont pas valable sur l’objectif X20. Pour démontrer l’intérêt des modifications des paramètres les photos suivantes illustrent quelques exemples de la résultante de ces modifications. (L’annexe 5 contient d’autre illustration)

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Le « Edge » ou le bord de la cellule GGRA normal vivante (X10) déborde pour un gain de 50 avec un « Dark Pixels » de 15. La longueur de la cellule est donc biaisée. Pour un gain de 195 et un « Dark Pixels » de 17 le bord considéré

par l’appareil est identique au bord réel de la GGRA vivante normal (X10)

L’image binaire en rose (à droite) correspond à l’image réelle de la GGRA tératogène (X20) en vue valvaire (à gauche). Pour un gain de 195 et un « Dark Pixels » de 20.

Les valeurs testées à l’objectif X10 et X20 sont résumés dans tableau récapitulatif de l’annexe 3 table 2. Le Tableau ci-dessous synthétise le paramétrage que je préconise pour la constitution de librairies pour les GGRA tératogènes et normaux, digérées ou vivantes.

Gain* Dark Pixels Flow rate mL/min Close Holes

X10(1) 240 15 0,15 6

X20(2) 195 20 0,02 15

* conférant une intensité moyenne de 180 ce qui correspond aux préconisations du constructeur

Lors de la constitution des librairies pour la classification automatique de reconnaissance de GGRA. Il est important de travailler avec les mêmes paramètres pour le X10(1) et pour le X20(2), d’un échantillon à un autre (vivant et digérée), sinon la reconnaissance est moins fiable.

4.2 Les effectifs

L’analyse effectuée par le FlowCAM a été réalisée sur un échantillon de GGRA tératogène digérées et vivantes à l’objectif x20dans le but de vérifier la précision du FlowCAM dans la reconnaissance automatique de ces diatomées et des estimations de biovolumes. Une analyse ultérieure de GGRA non tératogène est planifiée dans la poursuite du stage. De plus, un même effectif est mesuré au microscope pour le calcul de biovolume afin de comparer les biovolumes obtenus par le FlowCAM à ceux du microscope.

Après classification automatique les individus ont été scindés en plusieurs effectifs, seuls les vues valvaires et vues connectives sont présentées dans ce rapport et sont dénommées « TOTAL ».

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Toutes les diatomées ayant un « Edge » qui épouse la forme réelle de la GGRA ont été répertoriées et ont été dénommées « EDGE», elles pourront être utilisées pour le calcul du biovolume puisque la surface identifiée est fiable.

Quitte à me répéter, définir les bons paramètres de l’appareil est primordial pour obtenir une image binaire qui épouse les formes de l’image réelle afin d’acquérir la bonne surface et de calculer le biovolume de la cellule. Par ailleurs, malgré la définition des paramètres adéquats certaines images de GGRA apparaissent floues. Ce phénomène est dû à la mauvaise mise au point pour les particules qui se trouvent loin du plan focal. En effet, la technologie du FlowCAM ne permet pas un déplacement de la caméra lors du passage des particules pour s’adapter à la position des particules dans l’épaisseur de la FlowCell. (Annexe 4).

Table1 : Résultats de l’identification de GGRA tératogène digéré au FlowCAM et par l’utilisateur

Flowcam après classification

automatique Œil humain

Vue valvaire Vue connective Vue valvaire Vue connective

Nombre d’individus

TOTAL 45 43 180 161

Surface moyenne TOTAL

(µm2) 155 174 152 68

Nombre d’individus EDGE 12 17 15 19

Surface moyenne individus

EDGE (µm2) n.c* n.c* 156 182

La table 1 permet de constater trois tendances. La première, le FlowCAM détecte moins d’individus qu’un utilisateur parcourant les images capturées. La classification automatique ne permet pas de retrouver toutes les diatomées quelques soit la vue. Par exemple un utilisateur sélectionne 180 GGRA en vue valvaire alors que le FlowCAM détecte 45 suite à la classification automatique. Deuxièmement, en triant les images binaires pour en sélectionner les images exploitables, les effectifs obtenus sont proches, que ce soit pour la classification automatique ou suite à l’observation de l’utilisateur. Enfin, même les surfaces moyennes sont très proches malgré la différence d’effective, que ce soit pour la vue valvaire ou la vue connective. La valeur faible de 68 µm² est expliquée par ma sélection des diatomées en vue connective qui se scinde en deux souvent après digestion.

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Table 2 : Résultats de l’identification de GGRA tératogène vivante au FlowCAM et par l’utilisateur

Flowcam après classification

automatique Œil humain

Vue valvaire Vue connective Vue valvaire Vue connective

Nombre d’individus TOTAL _{59 42 61 32}

Surface moyenne TOTAL

(µm2) 169 182 179 187

Nombre d’individus EDGE _{23 20 21 21}

Surface moyenne individus

EDGE (µm2) n.c* n.c* 172 190

Dans ce cas le FlowCAM par sa classification automatique surestime le nombre de diatomées en vue connective par rapport à un utilisateur. En effet, malgré un filtre précis issu d’une librairie de photos, le FlowCAM détecte des diatomées qui ne sont pas en vue connective et les attribues à la vue connective. Par contre, pour la vue valvaire un utilisateur détecte plus de GGRA (61) que la classification automatique (59). Mais dans ce cas aussi les effectifs des individus possédant une image binaire correcte (nombre d’individus EDGE) sont proches. Les surfaces moyennes sont aussi très similaires.

4.3 Les biovolumes

Le « biovolume FlowCAM » est calculé en considérant l’aire remplie (« Air Filled »

FlowCAM) par l’épaisseur donnée par le logiciel selon l’algorithme de Feret ou Géodésique. Puis, les mesures de longueurs et de largeurs obtenues par le logiciel en Feret ou en

géodésique sont utilisées dans l’équation mathématique de calcul du biovolume (Cf. 3.5 calcul de biovolume) afin de constater s’il y a des différences au niveau des algorithmes. Et finalement, les mesures issues du microscope de largeurs et de longueurs sont intégrées dans la formule mathématique pour le calcul du « biovolume microscope ». Ceci permettra d’observer la présence ou non de différence de calcul entre toutes ces méthodes.

Pour GGRA tératogène digérée, la table 3 indique que les biovolumes du FlowCAM sont largement supérieur au biovolume calculé à partir des mesures du microscope dans le cas des Gomphonema gracile digérée tératogène.

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Table 3 : Résultat des calculs du biovolumes pour Gomphonema gracile digérée tératogène.

Pour GGRA tératogène vivante, la table 4 présente des biovolumes similaires que ce soit par le FlowCAM, par l’équation mathématique de biovolume basée sur les mesures du FlowCAM et par la formule mathématique de biovolume basé sur les mesures au microscope.

Table 4 : Résultat des calculs du biovolumes pour Gomphonema gracile vivante tératogène.

5. Discussion

La détection de GGRA par la classification automatique renvoie un rendement faible comme l’indique le tableau 5 ci-dessous. Le taux de détection par classification automatique pour GGRA tératogène digérée est de 25% pour la vue valvaire et 27% pour la vue connective. Dans le cas présent, le FlowCAM manque de discernement. Ce rendement diminue encore, en considérant seulement les bonnes images binaires issues de cette classification automatique qui ressemblent parfaitement à l’image réelle. En effet, les pourcentages deviennent de 7% pour la vue valvaire et 11% pour la vue connective. En outre, en sélectionnant manuellement à partir de mes observation les images possédant un « Edges » parfait de l’ensemble des 180 diatomées en vue valvaire et des 161 en vue connective, le rendement est respectivement de 8% et 12%. Finalement, il s’avère que le pourcentage d’images exploitables pour calculer le biovolume est équivalent. Il est donc possible de compter seulement sur la classification automatique.

GGRA Digérée

tératogène FlowCam (X20) Feret

FlowCam (X20) Geodesic Formule math + Feret Formule math + Geodesic Microscope Formule math (X1000) Biovolume µm3 1015,07 ± 19,84 1003,16 ± 18,69 1072,42 ± 0,58 946,99 ± 0,82 672,91 ± 0,30 GGRA Vivante

tératogène FlowCam (X20) Feret

FlowCam (X20) Geodesic Formule math + Feret Formule math + Geodesic

Microscope Formule math (X400)

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Table 5 : Rendement de détection de GGRA tératogène digéré en pourcentage

Flowcam après classification

automatique Œil humain

Vue valvaire Vue connective Vue valvaire Vue connective

% d’individus

TOTAL 25 27 100 100

% d’individus

EDGE 7 11 8 12

Pour l’échantillon de GGRA vivante, une tendance un peu différente est notée. Premièrement, le rendement de détection par la classification automatique de vue valvaire, à l’inverse de l’expérience précédente est beaucoup plus performant, il est de 97%. Cependant, le taux d’images exploitables est de 37%. Deuxièmement, concernant la vue connective le FlowCAM sur-détecte, le rendement est de 131% (expliquée par des vue connective fausses). Mais seulement 63% possèdent une image binaire correcte. Par ailleurs, ma sélection manuelle des images possédant une image binaire en accord avec l’image réelle, confère un rendement de 34% pour la vue valvaire et 66% pour la vue connective. A l’instar du tableau précèdent, les rendements finaux c’est-à-dire les pourcentages d’images exploitables sont similaires entre la classification automatique et la sélection par l’utilisateur. Il suffit donc de trier les bonnes images binaires parmi celle obtenues à partir de la classification automatique.

Table 6 : Rendement de détection de GGRA tératogène vivante en pourcentage

Flowcam après classification

automatique Œil humain

Vue valvaire Vue connective Vue valvaire Vue connective

% d’individus

TOTAL 97 131 100 100

% d’individus

EDGE 37 63 34 66

Finalement le pourcentage d’images exploitables (EDGE) pour calculer le biovolume est équivalent. Cela va de soi, qu’un utilisateur améliore l’identification du FlowCAM en sélectionnant plus d’images non détectées par l’appareil, mais aussi en éliminant des images qui ne correspondent pas au profil recherché. Mais ceci semble ne pas être nécessaire.

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La comparaison des biovolumes entre le FlowCAM et le microscope n’a pas abouti à une conclusion satisfaisante pour la GGRA digérée. Il y a une différence de 33% entre le biovolume obtenu par le biais du FlowCAM par rapport à celui issues des mesures du microscope. Il semble que le FlowCAM surestime les épaisseurs des vues connectives. En effet, en se référant aux données brutes, les épaisseurs du FlowCAM sont différentes de celles mesurées au microscope. Par contre, le calcul de surfaces des vues valvaires entre le microscope et le FlowCAM correspondent pour les GGRA digérée à l’inverse des biovolumes (non joint dans le rapport). Une autres hypothèse pour expliquer cette différence est que les individus observés au FlowCAM et microscope ne soient pas les même malgré qu’ils soient tous les deux issues du même échantillon.

D’autre part, malgré l’asymétrie de la GGRA, dans le cas de la vivante, le biovolume obtenu avec les mesures de Feret correspond le mieux au biovolume atteint par les mesures au microscope (par rapport à l’algorithme géodésique). Sachant qu’il est conseillé d’employer les mesures géodésiques au lieu des mesures de Feret pour les formes asymétriques.

Suite à des vérifications d’échelle et de mesure, je souhaite préciser que l’utilisation de différent grossissement au microscope (X400 pour GGRA vivante et X1000 pour GGRA digérée) n’est pas la source de cette différence.

Pour l’instant, je n’ai travaillé qu’avec un seul mode de détection (AutoImage), il me reste à découvrir le mode « Trigger ». Alvarez et al. (2013) en utilisant le mode « Trigger » ont démontré qu’il n’existe pas de différence significative relatif à la mesure des tailles des cellules fixées au formol entre la microscopie et le FlowCAM. Par contre, entre un échantillon fixé puis analysé au microscope versus un échantillon frais passé au FlowCAM la différence est frappante. D’autre part, ils conseillent d’utiliser un logiciel indépendant de reconnaissance (logiciel open source de R), du nom de Phyto/zoo Image pour améliorer l’auto-classification des images.

Un avantage indéniable du FlowCAM est la possibilité de multiplier les réplicats et ainsi obtenir plus d’individus pour calculer des biovolumes. Puisque dans la plupart des analyses de routine des échantillons au microscope, les taxonomistes mesurent seulement une faible partie des effectifs de cellules et attribuent par extension aux autres cellules un biovolume moyen du fait de l’approche chronophage du microscope. Ainsi, l’utilisation d’un biovolume moyen peut biaiser l’estimation de l’abondance et de la biomasse dans certains taxons (Alvarez et al., 2012).

Concernant toujours la comparaison entre l’observation au microscope et l’utilisation du FlowCAM pour l’identification taxonomique. Le dernier, n’atteint qu’une faible résolution

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taxonomique alors que le premier permet de différencier correctement les taxons et même les espèces et les sous espèces. Donc il faut toujours réfléchir concernant le choix d’utilisation d’une méthode ou d’une autre, en fonction du temps d’analyse disponible, de la méthode d’échantillonnage et du sujet de recherche (Alvarez et al., 2013).

Au final, malgré mon pessimisme concernant la précision du FlowCAM à l’heure actuelle pour ces diatomées, plusieurs études ont montrés son utilité comparé au microscope dans l’analyse des échantillons marins. D’ailleurs, Poulton et Martin (2010) estime qu’il faut 6 mois d’expérience pour comprendre intégralement le fonctionnement du FlowCAM.

6. Bibliographies

Anonyme (2014). FlowCAM Operators Manual, Fluid Imaging Technologies, Inc., April 2014 Version 3.4 Alvarez, E., Lopez-Urrutia, A., & Nogueira, E. (2012). Improvement of plankton biovolume estimates

derived from image-based automatic sampling devices: application to FlowCAM. Journal of Plankton Research, 34(6), 454-469. doi: 10.1093/plankt/fbs017

Alvarez, E., Moyano, M., Lopez-Urrutia, A., Nogueira, E., & Scharek, R. (2013). Routine determination of plankton community composition and size structure: a comparison between FlowCAM and light microscopy. Journal of Plankton Research, 36(1), 170-184. doi: 10.1093/plankt/fbt069

Buskey, Edward J., & Hyatt, Cammie J. (2006). Use of the FlowCAM for semi-automated recognition and enumeration of red tide cells (Karenia brevis) in natural plankton samples. Harmful Algae, 5(6), 685-692. doi: 10.1016/j.hal.2006.02.003

Day, J. G., Thomas, N. J., Achilles-Day, U. E., & Leakey, R. J. (2012). Early detection of protozoan grazers in algal biofuel cultures. Bioresour Technol, 114, 715-719. doi: 10.1016/j.biortech.2012.03.015 Poulton, N.J., & Martin, J., (2010). Imaging flow cytometry for quantitative phytoplankton

analysis-Flowcam. In: Intergovernmental Oceanographic Commission of UNESCO. Karlson, B., Cusack, C. and Bresnan, E. (editors). Microscopic and molecular methods for quantitative phytoplankton analysis. Paris, UNESCO. (IOC Manuals and Guides, no.55.) (IOC/2010/MG/55), 110 pages.

Spaulding, Sarah A., Jewson, David H., Bixby, Rebecca J., Nelson, Harry, & McKnight, Diane M. (2012). Automated measurement of diatom size. Limnology and Oceanography: Methods, 10(11), 882-890. doi: 10.4319/lom.2012.10.882

Taylor, J.C., Harding,W.R., & Archibald CGM. (2007). A methods manual for the collection, preparation and analysis of diatom samples. Report to the water research commission, 60 p.

Wilson, G. A., & Manning, M. C. (2013). Flow imaging: moving toward best practices for subvisible particle quantitation in protein products. J Pharm Sci, 102(3), 1133-1134. doi: 10.1002/jps.2344

Annexe 1

Table 1 : Tableau récapitulatif des caractéristiques des éléments en relation avec le FlowCAM

Gamme de taille des cellules Objectif Bead Size Minimum Sample Volume (mL) Taille minimale (diamètre ESD) Flow cell Dimension de la Flow cell (Epaisseur x largeur) Seringue Gamme du taux du flux (flow rate) FPS (Frame per second) Mode AutoImage Filtre (mesh) X 20 20 µm 0.3 1 µm FC 50 50 µm x 1 mm 0.5 mL 0.005-10 ml/min 20 53 ou 35 µm 10-100 µm X 10 20 µm 1.0 2 µm FC 100 100 µm x 2 mm 1/0.5 mL 0.01-20 ml/min 20 100 µm 20-300 µm X 4 50 µm 4.3 12 µm FC 300 300 µm x 3 mm 1/5/12.5 mL 0.05-100 ml/min 20 300 ou 100 µm 60-600 µm X 4 50 µm 8.6 FC 600 600 µm x 6 mm 1/5/12.5 mL 0.125-250 ml/min 20 300 µm X 2 50 µm 40 µm FC 1000 1000 µm x 10 mm 12.5 mL 4 Dépend de l’échantillon

Annexe 2

Protocole de digestion et préparation de lame permanente pour les diatomées digérées :

Dans un tube à essais contenant 5 mL d’un échantillon de diatomées, 20 mL d’eau oxygénée sont ajoutées. Le tube est porté à ébullition dans un four à sable sous la hotte pour une durée d’environ deux heures. Après refroidissement et décantation, l’excédent est éliminé et seulement 5 mL sont retenus. Ils sont ensuite ré-suspendue dans de l’eau distillée pour un volume final de 15 mL. Le tout est centrifugé à 4000 rpm pendant 3 minutes. Par la suite, le surnagent est chassé et le culot est ré-suspendue encore une fois dans l’eau distillée pour une nouvelle centrifugation (opération répétée deux fois).

Sur une lamelle ronde posée sur une plaque chauffante, un volume de 500 µL de diatomée digérée est déposé. Un chauffage de 15 minutes est réalisé jusqu’à évaporation de l’eau. Ensuite sur une lame, une goutte de Naphrax liquide (toluène) est déposée et la lamelle sèche est posée par-dessus. Après, le chauffage de la lame est réalisé jusqu’à élimination des grosses bulles d’air. Ces lames seront utilisées pour l’observation microscopique en immersion à X1000.

Annexe 3

Table 2 : Valeurs testées pour les différents paramètres

Gain Dark Pixels Light

Pixels Flow Rate

Close Holes GGRA X10 Digérée Normal et Tératogène 195/200/230/ 250/280/380 1/5/10/15/30/ 1/10/50 0,10/0,15/ 0,20/0,30/ 3/6 GGRA X10 Vivante Normal et Tératogène 50/170/195/2 20/240/270/ 1/5/10/15/17/2 0/ 30/45/50/60/1 00 0 0,15 6 GGRA X20 Digérée Normal et Tératogène 165/195 5/10/15/20/30 5/15/10/40 /50/70/80 0.02 6/15 GGRA X20 Vivante Normal et Tératogène 195 20 0 0.02 15

Annexe 5

Image réelle Image avec EDGE Image binaire GGRA Normal Pixel rose Digérée

Image réelle Image avec EDGE Image binaire GGRA Normal Pixel rose Digérée