N0 ……../SNV/2021
Département de Biologie Végétale et Ecologie
MEMOIRE
Présentée par : BENZIDANE CHAHRAZED
Pour obtenir le diplôme de Magister
Option : Biodiversité et gestion des écosystèmes
THEME :
Effet toxique des résidus des pesticides utilisés sur la flore de la région de Sétif
Soutenu publiquement le 13/11/2012
Devant le jury
Président : M. KAABECHE Pr. UFA- Sétif Rapporteur : S. DAHAMNA Pr. UFA- Sétif Examinateur : H. BOUZERZOUR
Examinateur : M. BOUNECHADA
Pr. UFA-Sétif M.C.A. UFA- Sétif
Année universitaire 2011-2012
Remerciements
La réussite d’une thèse doit beaucoup à l’environnement scientifique et humain dans laquelle elle se déroule.
La rédaction de ces pages clôt une aventure de trois années qui n’a pas toujours été facile et je tiens à exprimer ma reconnaissance à tous ceux et celles qui, par leur soutien, leur aide et/ou leurs encouragements, ont contribué, de près ou de loin, à la concrétisation de ce travail.
J’exprime toute ma reconnaissance et ma profonde gratitude à ma directrice de thèse, Mme
DAHAMNA pour le temps qu’elle m’a consacré, son aide constante et ses conseils avisés.
J’ai beaucoup apprécié de travailler à vos côtés, pour votre dynamisme, votre franchise, votre rigueur, votre soutien et disponibilité au quotidien et pour toutes les conversations échangées.
Mes remerciements les plus sincères s’adressent tout particulièrement à Mer KAABECHE, qui m’a fait l’honneur d’accepter de présider le jury de cette thèse, veuillez trouver ici l’expression de ma profonde gratitude. Vous m’avez épaulée lors de mes recherches et mes moments de doute. Je vous prie de trouver le témoignage de mon plus profond remerciement.
Ma gratitude va aussi à Mers BOUZERZOUR et BOUNECHADA, je suis honorée de vous compter parmi les membres de mon jury malgré votre emploi du temps chargé. Merci pour votre disponibilité, votre aide et votre soutien moral et d’avoir accepté d’évaluer ce travail.
Je souhaiterais remercier également Mer BOUHARATHI, pour son aide précieuse au début des recherches bibliographiques, ses conseils scientifiques sa gentillesse et sa patience. Ses commentaires et critiques ont permis l’amélioration du manuscrit final.
Je remercie profondément Pr. TOUABTI pour son soutien, sa précieuse aide. Merci de m’avoir aidé à mener à bien ce travail avec tant de bienveillance.
Je n’oublierai pas de remercier Dr. ABDELLOUCHE, Directeur du laboratoire d’Anatomie-Pathologique pour m’avoir si bien accueillie au sein de son laboratoire mais également pour sa sympathie et son encouragement. Merci pour tout ce que j’ai appris à vos côtés.
Je réserve une mention particulière à toutes les personnes qui m’ont apporté leur soutien et leur aide et tout particulièrement ma tante Malika et à mon beau frère Nacir.
Mes remerciements s’adressent également à Sonia, Nadia et Karima ainsi qu’a toutes les autres personnes que je n’ai pas citées. Merci pour votre gentillesse et votre amabilité, Cette thèse marque la fin de 2 années au sein de l’écosystème que forme le laboratoire de biologie animale.
Je dédie ce travail à la mémoire de ma chère et regrettée maman, c’est pour toi que j’ai fait ce parcours et je regrette que tu ne sois pas parmi nous en ce moment tant attendu. Tu es dans mon cœur et mon esprit en toute circonstance.
Merci à mon père adoré, à ma sœur, à mes frères et à tout le reste de la famille. Je dédie également ce travail à mon cher époux Halim et à ma tendre fille Sérine auxquels je suis redevable pour leur soutien inconditionnel et leurs sacrifices. Ce travail n’aurait jamais pu être mené à bien sans leur encouragement et compréhension. Sérine, ton amour me donne des ailes pour avancer dans la vie. Je ne crois pas avoir besoin d’en dire plus je t’aime très fort.
A ma frangine Nadia: Aujourd’hui tu es présente pour moi, demain ce sera mon tour de faire partie de ton auditoire, avec autant de fierté. J’espère que tu t’épanouiras toujours dans ta vie, notamment au travers d’une belle carrière qui t’attend. On a partagé beaucoup de bons moments, et c’est loin d’être fini.
Liste des abréviations
ACh Acétylcholine
AChE Acétylcholinestérase
AFSSA Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments AMM Autorisation de mise sur le marché
ANOVA AU CCM
Analyse de variance Acide urique
Chromatographie sur Couche Mince
CEC Commission of the European Communities Chol T
Créât CPF
Cholestérol total Créatine
Chlorpyrifos
CPO Chlorpyrifos-oxon (métabolite actif du CPF) CYP
D DDT DEP DES DF DJA
DL50 E ou E C EDTA
F FAO FNS Glu
Cytochrome
Poussière ou poudre
(Dichloro-Diphényl-Trichloroéthane), Diéthylphosphate
Dose sans effet Pâte granulée
DJA Dose journalière administré, Dose létal
Concentré émulsifiable Ethylène-diamine-tétra-acétate Suspension concentrée
Food and Agriculture Organization Formule numérique sanguine Glucose
GR Granulé
HCT Hématocrite
HGB HPLC IBS K LMR MCH
MCHC ou CCMH MCV ou VGM mEq/L
MPV Na NOAEL O.M.S OP ORP P PAL PLT POPs PPP REACH RBC SC SEM SN
SP TCPY TG T TGO TGP UI/L WBC WDG
Hémoglobine
Chromatographie Liquide Haute Performance Inhibiteurs de la synthèse des stérols
Potassium
Limite Maximale de Résidus
Teneur corpusculaire en Hémoglobine
Concentration corpusculaire moyenne en Hémoglobine Volume globulaire moyen
Milliéquivalent par litre Volume plaquettaire moyen Sodium
Non Observable Adverse Effect Level) Organisation mondiale de santé Insecticides organophosphores
Observatoire des résidus des pesticides Pastille
Phosphatase alcaline Plaquette
Polluants Organiques Persistants produits phytopharmaceutiques
Registration, evaluation and authorization of chemicals Red Blood Cells ou globules rouges
Concentré pulvérisable
Erreur standard de la moyenne Solution
Poudre soluble Trichloro-2-pyridinol Triglycérides totaux
Transaminase Glutamate Oxolo-acétate Transaminase Glutamate Pyruvate Unité internationale par litre
White Blood Cells ou Globules blancs Granulé soluble
WP Poudre mouillable
WS Concentré soluble dans l'eau
ERROR: undefinedresource
OFFENDING COMMAND: findresource STACK:
/4 /CSA /4 /CSA -mark-
CHAPITRE II
MATÉRIELS ET MÉTHODES
Chapitre II
II. 1. Méthodes et dosage des pesticides
Matériels et méthodes
La recherche et le dosage de résidus de pesticides dans les aliments et notamment dans les légumes et fruits nécessitent des techniques d'extraction, de séparation et de détection très performantes afin de traiter rapidement un grand nombre d'échantillons susceptibles de contenir plusieurs substances actives.
Les méthodes chromatographiques sont parmi les techniques les plus utilisées, les techniques mises en œuvre: chromatographie en phase liquide ou en phase gazeuse sont associées aux méthodes de détection courantes ou bien à la spectrométrie de masse pour atteindre des limites de détection de plus en plus basses garantissant ainsi la qualité des produits de consommation.
II.1. 1. Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)
Elle permet le dosage des composés thermolabiles et ioniques. La colonne la plus utilisée est celle qui contient une phase stationnaire greffée en C18. Le détecteur UV est très sollicité dans les dosages de routine cependant le détecteur à barrette diode (DAD) offre de grandes possibilités d’identification des composes grâce à sa banque de spectres de référence. Cun et al. (2002) ont mis en place une méthode d’analyse de 14 pesticides de la famille des carbamates avec une HPLC/UV-DAD.
Le couplage de la HPLC et la SM permet le dosage d’un éventail de produits et surtout d’éliminer les interférences de la matrice. Beaucoup de travaux sont de plus en plus cités qui utilisent ce couplage (Ramos et al. 1999, Jeannot et al. 2000 et Zambonin et al. 2002).
II.1. 2. Dosage par HPLC
La Chromatographie Liquide Haute Performance permet de séparer et de doser différents composés d’une solution qui absorbe dans l’UV. Pour des conditions opératoires précises, chaque compose présente un pic avec un temps de rétention bien défini. La hauteur des pics ou l’intégration de la surface de ces pics permet d’obtenir la concentration des produits.
II. 2. Matériel
II.2.1. Matériel chimique
Le pesticide : chlorpyrifos testé est choisi parmi ceux communément utilisés pour les traitements phytosanitaires des légumes et fruits dans la région de Sétif. Les pesticides
Chapitre II Matériels et méthodes
peuvent être testés en mélange en fonction de leur nature chimique, de leurs modes d’action ou de leurs cibles selon l’index phytosanitaire ACTA, 2005). Pour l'analyse chimique l’acétonitrile eau extra pure. Tous les solvants utilisés sont de pureté chromatographique (Fluka, HPLC grade).
II.2. 2. Choix du pesticide
Pour notre étude nous avons choisi dans un premier temps de déterminer les pesticides les plus utilisés sur les fruits et légumes en Algérie et particulièrement dans la région de Sétif.
Ensuite, nous avons établi une liste afin de déterminer les pesticides les plus fréquemment utilisés. Cette démarche nous a conduit à définir le pesticide à tester. Les légumes ont été récoltés en juillet 2011 aux environs de Mezloug et Guellal zones situées respectivement au Nord de Sétif. Quant aux fruits ils proviennent de Cheikh El-Aifa situé à Ain Roua.
II.2. 3. Matériel biologique
Nous avons utilisé dans le cadre de cette étude des rats mâles et femelles albino Wistar ayant un poids variant entre 150 et 350 g et provenant de l’institut Pasteur d’Alger. Ils sont hébergés dans des cages en plastique transparentes d’une longueur de 55 cm, d’une largeur de 33 cm et d’une hauteur de 19 cm. Chaque cage est marquée d’un numéro de lot qui lui correspond. Les animaux ont été disposés d’une alimentation standard (Croquettes, Ets ONAB El Kseur, Béjaia) et soumis à des conditions de température et d’éclairement contrôlés. La litière utilisée est la sciure renouvelée trois fois par semaine pour assurer le bon état hygiénique des animaux. Les animaux sont acclimatés aux conditions de l’animalerie du département de Biologie- Sétif pendant une quinzaine de jours avant l’expérimentation.
(Figure 5).
Figure 5 : Conditionnement des rats dans l’animalerie de l’université.
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Chapitre II
II. 3. Méthodes
Matériels et méthodes
La méthode d'extraction mise en œuvre est celle proposée par Steinwandier ; 1985 C’est une extraction simple de résidus par de l’acétone suivie d’un partage acétone eau dichlorométhane (2 :1: 1.5) pour avoir la phase organique contenant les résidus qui seront concentrés à 1ml.
II.3. 1. Préparation de l'échantillon et procédure d'extraction a. Préparation de l’échantillon
Pour l’extraction des résidus dans les végétaux nous devons respecter 3 points d’intérêt essentiel.
Le rapport acétone eau doit être deux volumes d’acétone pour un volume d’eau c'est-à- dire que 200 ml d’acétone sont rajoutés pour l’extraction d’un volume eau + échantillon égal à 100 ml. 30 grammes de chlorure de sodium (NACL) sont utilisés pour séparer les résidus de pesticides dans la phase organique, 150 ml de dichlorométhane sont ajoutés pour enlever l’eau de la phase organique.
b. Préparation de la solution aqueuse
La teneur en eau des échantillons sur lesquels nous avons travaillé pour déterminer les résidus de pesticides est supérieure à 70%. Chaque échantillon (salade, concombre, courgette, poivron, tomate, pomme et poire) doit peser 100 g.
Une quantité d’eau est additionnée à chaque échantillon afin d’obtenir un total de 100 g selon la formule 100-TE où TE représente la teneur en eau de l’échantillon. Pour tout ce qui est concombre, courgette, poivron, pomme et poire, on ajoute 15ml d’eau distillée. Pour la salade et tomate l’apport en eau distillée est seulement 5ml.
c. Extraction
Extraction liquide – liquide
La méthode consiste à extraire les pesticides hydrophobes se trouvant dans l’eau par un solvant approprié et non miscible avec l’eau. L’extraction est effectuée sur un volume important de l’échantillon dans une ampoule à décanter puis le solvant est évaporé et le résidu est repris dans le milieu adéquat pour être analysé. Boussahel, (2001) note l’utilisation du dichlorométhane comme solvant d’extraction et souligne que cette méthode est déjà homologuée et normalisée pour le dosage de 15 pesticides organochlorés et
Chapitre II Matériels et méthodes
21organophosphorés. L’extrait obtenu est injecté directement en chromatographie (Boussahel., 2001).
II.3. 2. Mode opératoire et technique d’extraction
Les aliments sont d’abord coupés séparément en petits morceaux puis mixés dans un robot. Nous rajoutons 200 ml d’acétone à chaque échantillon. Le tout est mélangé pendant 3 minutes à l’aide d’un mixeur à grande vitesse et laissé au repos pendant 20 minutes à température ambiante. Les mélanges obtenus sont définitivement homogénéisés par agitation durant 3 minutes. Partage acétone / eau / dichlorométhane (2 : 1: 1.5) :
Dans un entonnoir de Buchner doté d’un papier filtré Wattman n°1, nous filtrons l’homogénat préparé lors de l’opération d’extraction. Dans l’ampoule nous ajoutons 30 g de chlorure de sodium (NaCl) à 200 ml de filtrat; le tout est agité pendant 3 minutes.
Ensuite, 150 ml de dichlorométhane sont ajoutés à la préparation et l’ensemble est agité pendant 2 minutes.
Enfin, le mélange est laissé au repos une deuxième fois pendant 15 minutes et à température ambiante jusqu’à séparation des deux phases : la phase aqueuse et la phase organique. Cette séparation permet de réserver la phase aqueuse afin de procéder au séchage de la phase organique isolement avec 30 g de sulfate de sodium (Na2SO4) et ce durant 30 minutes. La phase organique est filtrée dans un ballon de 500 ml dans un entonnoir contenant une couche de sulfate de sodium. L’ampoule à décanter est rincée à l’aide de 40 ml de dichlorométhane. La filtration de cette phase aqueuse est alors effectuée. Une seconde et une troisième concentration sont obtenues par addition de dichlorométhane afin d’évaporer tout l’acétone et cela dans le but d’obtenir un extrait égal à 1 ml. Cet extrait mis dans un flocon de 5ml est alors prêt à être analysé.
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Chapitre II Matériels et méthodes
. Homogénéisation par agitation 3 min
Partage acétone / eau / dichlorométhane
Filtrer
+ 30 g de chlorure de sodium (NaCl)
+150 ml de dichlorométhane
Agiter 2 min.
Repos 15 minutes, séparation
Séchage de la phase organique avec 30g de (Na2SO4) pendant 30 min
Filtrer avec une couche de sulfate de sodium .
2éme et 3éme concentration + dichlorométhane
Evaporer tout l’acétone
1 ml d’extrait dans un flacon de 5ml
Analyse
Figure 6 : Méthode d’extraction des résidus de pesticides
Chapitre II
II. 4. Evaluation de la toxicité aiguë chez les rats
Matériels et méthodes
Les tests de toxicité aiguë (DL50 orale, DL50 cutanée et CL50) inhalatrice chez le rat, permet d’estimer la dose létale ainsi que les effets irritants ou sensibilisants d’un produit qui apparaissent dans un temps court entre 1 et 14 jours après l’administration d’une substance (pour notre étude le chlorpyrifos (CPF) administré par dose unique Les principaux effets recherchés sont :
les signes cliniques.
les modifications pathologiques visibles à l’œil nu.
La mortalité.
II. 4. 1. Toxicité aiguë
La toxicité aiguë d’une substance chimique est estimée par une série de tests réalisés sur des animaux de laboratoire. La DL50 est la dose requise pour tuer la moitié d’une population d'animaux de laboratoire. Le pesticide à tester est dilué dans de l’eau physiologique et est administré à une dose unique, par voie orale, à raison d’une dose pour tous les groupes. La DL50 pour le chlorpyrifos se situe entre 82 et 270 milligrammes par kilogramme (mg / kg) de poids corporel de rats.
Pour le rat femelle la dose létale par voie orale : DL50 : 96 mg / kg (72-140) Pour le rat male la dose létale par voie orale : DL50 : 102 mg / kg (94-110)
II. 4. 2. Choix de la dose
La plupart des études entreprises en toxicologie s'effectuent à la suite de l’administration de la dose par voie orale. Cependant d'autres voies d'administration sont possibles : intra veineuse, intramusculaire, sous-cutanée, percutanée et par inhalation. D’après les valeurs expérimentales des DL50, les rats males paraissent plus sensibles que les rats femelles, cette sensibilité liée au sexe pourrait être due aux différences physiologiques. Pour notre étude nous choisissons les doses 1/5 pour la toxicité aiguë et 1/20 pour la toxicité subaiguë (Dahamna 2004).
Mode opératoire
Le produit à tester est dilué dans de l’eau distillé et administré à une dose unique, par voie orale. L’étude porte sur 60 rats adultes mâles et femelles de la souche Wistar.
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Chapitre II Matériels et méthodes
Après une période d’habituation, les rats sont pesés, identifiés par une marque sur la queue. Les animaux, sont répartis en 6 groupes de dix animaux (cinq males et cinq femelles) Chacun, dont un, est le groupe témoin, sont privés de nourriture 24 heures avant l’essai. Le chlorpyrifos est administré par voie orale aux animaux en une dose unique et par sonde gastrique Les 5 lots ont reçu la dose de 1/5 de la DL50. Le groupe témoin a reçu de l’eau physiologique. Après l’administration du chlopyrifos, les animaux sont observés individuellement chaque heure pendant le premier jour et chaque jour pendant 14 jours. Le comportement et les symptômes cliniques des animaux sont notés pendant toute la durée de l’expérience.
II.4.3. Toxicité subaigüe Ces épreuves ont pour objet :
1/ De mettre en évidence les altérations fonctionnelles et/ou pathologiques consécutives à l’administration répétée des substances actives examinées.
2/ D’établir les conditions d’apparition de ces altérations en fonction de la posologie.
Notons que les expérimentations durent de 2 à 6 semaines. (Manahan, 2003). Il est utile de choisir la dose la plus élevée de façon à faire apparaître les effets nocifs tandis que les doses inférieures permettent de situer la marge de tolérance du nouveau produit chez l’animal.
L’appréciation des effets toxiques est faite sur la base de l’examen du comportement, de la croissance pondérale, de la formule sanguine. Nous prenons en compte de surcroît la base des comptes rendus nécrosiques, accompagnés des examens histologiques qui s’y rattachent (Diallo, 2005)
Les 30 rats sont repartis en deux lots : un lot témoin de dix rats et un lot traité de vingt rats (cinq par cage). Les rongeurs sont traités par voie orale avec du chlorpyrifos dissout dans de l’eau distillée. Une dose de 1/20 de DL 50 et qui correspond à 22 mg/kg/semaine leur est données au rythme d’un jour sur sept pendant 6 semaines. On note un retard dans l’apparition des symptômes d’intoxication (30 min), salivation, difficulté de se mouvoir, l’administration par voie orale du pesticide a provoqué une accélération du rythme respiratoire, une vasodilatation au niveau des oreilles une excitation enregistrée dans les lots aucune toxicité n’est apparue dans les conditions de la toxicité subaiguë, les seuls signes cliniques observés chez les rats traités, sont des diarrhées et une faiblesse (manque de vivacité), après chaque opération, qui se déroule une fois par semaine, on observe une légère diminution de
Chapitre II Matériels et méthodes
croissance pondérale les 15 premiers jours. Cette diminution pourrait être expliquée par une réduction de la consommation des aliments, une diminution de l’activité motrice. Nous pesons les rats chaque semaine. Au terme de 42 jours nous sacrifions les rats. Nous prélevons les organes tels que les reins, la rate, le foie, les testicules, les poumons et le cœur que nous observons macroscopiquement. Les organes prélevés sont débarrassés de l'excès de graisse.
Ils sont alors séchés avec du papier filtre préalablement pesés. Nous conservons les organes dans du formol à 10% pour des études anatomopathologiques.
II. 5. Dosage de quelques paramètres hématologiques et biochimiques II.5.1. Prélèvement sanguin
Le prélèvement du sang est effectué à l’aide d’un tube capillaire d’hématocrite à travers le sinus rétro-orbital au niveau de la veine orbitale des rats anesthésiés au départ par l’éther par voie ophtalmique. Nous recueillons le sang dans un tube EDTA pour la FNS, et dans un tube héparine pour le bilan rénal. Nous centrifugeons les tubes héparines à 4000 g/5min. à 4°C. Le sérum obtenu est aliquoté et conservé à une température de –20°C jusqu’au moment des analyses biochimiques.
II. 5. 2. Examens Biochimiques
Le dosage des paramètres sériques : Glucose (Glu), Urée, Créatinine (Créat), Acide urique (AU), Sodium (Na), Potassium (K), Cholestérol total (Chol T), Triglycérides totaux (TG T), Transaminase Glutamate Oxolo-acétate (TGO), Transaminase Glutamate Pyruvate (TGP), Phosphatase alcaline (PAL) sont mesurés par des méthodes enzymatiques réalisés au niveau du Laboratoire Central (CHU) de Sétif à l’aide d’un Beckman coulter Synchro CX-9 clinical system ALX.
II. 5. 3. Examens hématologiques
Dans la formule numérique sanguine (FNS) on trouve les paramètres suivants :
Red Blood Cells ou globules rouges (RBC), volume globulaire moyen (MCV) ou (VGM), hématocrites (HCT), plaquette (PLT), volume plaquettaire moyen (MPV), white Blood Cells ou globules blancs (WBC), hémoglobine (HGB), teneur corpusculaire en hémoglobine (MCH), concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (MCHC). Les analyses des paramètres hématologiques sont effectuées à l’aide d’un Beckman coulter Médonic au laboratoire central de Sétif.
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Chapitre II
II. 5. 4. Technique histologique
Matériels et méthodes
Pour l’examen anatomo-histo-pathologique, les organes fixés dans du formol 10 %, sont déposés dans des cassettes en plastique, puis sont déshydratés (par immersion dans des bains successifs d’alcool, l'alcool est éliminé par des solvants (xylène)) avant d’être coulé dans des moules contenant de la paraffine fondue par chauffage (paraffine liquide). Après refroidissement, le bloc solide de paraffine contenant le tissu est coupé à l’aide d’un microtome permettant de réaliser des coupes de 5 m d’épaisseur.
Les coupes obtenues sont étalées et collées sur des lames, puis séchées dans une étuve pendant une nuit. Elles sont ensuite colorées par une solution d'hématoxyline-éosine. Après coloration, le montage se fait à l’aide de l’eukitt placé entre lame et lamelle. La préparation est séchée à l'air. Ces coupes histologiques sont réalisées au laboratoire d'anatomopathologie de CHU de Sétif.
II. 6. Analyses statistiques
Les résultats expérimentaux sont exprimés sous forme de moyennes arithmétiques, accompagnées de l’erreur standard (m ± SEM). La comparaison des moyennes est réalisée à l’aide du test t de « Student», grâce au logiciel GraphPad et ANOVA uni-variée suivie du test de Dunnett pour les comparaisons multiples et la détermination des taux de signification. Les valeurs de p < 0.05 sont considérées statistiquement significatives.
CHAPITRE III
RÉSULTATS
Chapitre III
III.1. Extraction
Résultats
L’extraction liquide-liquide du chlorpyrifos à partir des légumes et fruits a permis d'obtenir des extraits de couleur jaune et orange avec un rendement d'extraction de
5mg /100g de légume.
III.2. Chromatographie sur couche mince (CCM) a. Principe de la technique
Lorsque la plaque sur laquelle est déposé l’échantillon est placée dans la cuve, l’éluant monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque composant de l’échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant. Cette vitesse dépend d’une part des forces électrostatiques retenant le composant sur la plaque stationnaire et, d’autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. Les composés se déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile, l’action de rétention de la phase stationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes d’adsorption.
Généralement, en chromatographie sur couche mince, les substances de faible polarité migrent plus rapidement que les composants polaires.
b. Révélation.
Lorsque les composants de l’échantillon analysé sont colorés, leur séparation est facilement observable sur la plaque ; dans le cas contraire, on doit rendre les taches visibles par un procédé de révélation. Les taches sont ensuite cerclées au crayon. Les méthodes usuelles de révélation sont les suivantes : radiations UV, fluorescence, iode, atomisation. Si un indicateur fluorescent est incorporé à l’adsorbant, la plaque entière devient fluorescente lorsqu’elle est soumise à une radiation UV ; les composés y sont révélés sous forme de taches sombres.
III.2.1. Conditions chromatographiques
Les extraits ont été analysés en utilisant une série 1100 HPLC (Agilent Co., Sunnyvale, CA) muni d'un détecteur UV / Vis (UV à 230 nm). Un Phenomenex (Torrance, CA) Prodigy ODS / 3, C18, 5mm, 4,6 mm Identifiant 250 mm analytique colonne a été utilisé, avec une colonne Phenomenex garde Security Guard (4mm 2 mm, C18). Les extraits ont été chromatographiés avec un pré-mélangé phase mobile composée de 75% acetonitrile/25%
1mM PO4 (pH 4,5) à température ambiante.
Chapitre III
Méthode
L'injection de 25 ml à un débit de 1 ml/min pendant 25 min.
III.2.2. Analyse qualitative
Résultats
La chromatographie sur couche mince de l’extrait a permis de séparer deux substances qui sont apparues sous forme de tâches colorées après révélation, un spot en bas de la plaque CCM situé à un niveau inferieur que celui de chlorpyrifos (témoin), et qui correspond à celui d’un de l’extrait de concombre. Les 2 spots correspondent donc au chlopyrifos.
Figure 7 : Séparation par chromatographie sur couche mince du chlopyrifos Model : Phase mobile : acétonitrile/eau: 20/80V.
III.3. Dosage par HPLC
La Chromatographie Liquide Haute Performance permet de séparer et de doser différents composés d’une solution qui absorbent dans l’UV. Pour des conditions opératoires précises, chaque composé présente un pic avec un temps de rétention bien défini. La hauteur des pics ou l’intégration de la surface de ces pics permet d’obtenir la concentration des produits.
III.3.1. Résultats de l’analyse par HPLC
La figure (8) montre le chromatogramme standard.
Le temps de rétention pour chlopyrifos est respectivement 10,81min.
-38-
Chapitre III
Figure 8 : Chromatogramme en HPLC du chlorpyrifos.
Résultats
Index 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Total
Nom Inconnu N Inconnu N Inconnu N Inconnu N Inconnu N Inconnu N Inconnu N Inconnu N Inconnu N Inconnu N Chlorpyrifos
Temps [min]
2,38 2,68 3,20 3,30 3,39 4,21 4,89 5,73 8,29 9,24 10,81
Quantité [% Surface]
8,45 50,58 13,85 4,63 8,18 0,08 1,00 0,59 0,97 2,45 9,22 100,00
Hauteur [mAU]
0,4 4,5 1,0 0,8 0,7 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,4 8,1
Surface [mAU.min]
0,119 0,714 0,196 0,065 0,116 0,001 0,014 0,008 0,014 0,035 0,130 1,412
Surface [%]
8,447 50,580 13,853 4,628 8,184 0,084 0,998 0,591 0,966 2,448 9,221 100,000 Tableau 2 : Révélation du temps de rétention en HPLC du chlorpyrifos
Le Chromatogramme en HPLC du chlorpyrifos dans le poivre rouge L'identification du composé de l’extrait des légumes et fruits se fait par comparaison de leurs temps de rétention avec celui obtenu pour le même composé standard. Cette comparaison, nous a permis de confirmer la présence du chlorpyrifos dans le poivre rouge, avec un temps de rétention 11,12 min, la figure 9 est illustrée ci après.
Chapitre III
Figure 9 : chromatogramme en HPLC du chlorpyrifos dans le poivre rouge
Quantité
Résultats
Index Nom Time
[% Surface] Hauteur Surface
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Inconnu N Inconnu N Inconnu N Inconnu N Inconnu N Inconnu N Inconnu N Inconnu N Inconnu N Inconnu N Inconnu N Inconnu N Inconnu N
[min]
2,61 2,83 3,19 3,41 3,65 3,92 4,12 4,45 4,71 4,92 5,04 7,62 9,05
21,70 16,14 14,34 9,33 9,54 1,56 1,75 6,67 5,54 4,39 7,58 1,20 0,21
[mAU]
265,8 265,3 215,8 169,0 212,5 59,4 56,9 82,4 74,2 99,5 57,6 4,9 1,6
[mAU.Min]
58,548 43,528 38,678 25,162 25,722 4,216 4,720 17,988 14,940 11,834 20,445 3,245 0,575
Surface [%]
21,705 16,137 14,339 9,328 9,535 1,563 1,750 6,669 5,539 4,387 7,580 1,203 0,213 14
Total
Chlorpyrifos 11,12 0,05 100,00
0,5 1565,4
0,143 269,746
0,053 100,000
Tableau 3 : Révélation du temps de rétention en HPLC du chlorpyrifos dans le poivre rouge
-40-
Chapitre III Résultats
Les temps de rétention du chlorpyrifos sont présentés dans les tableaux 2 et 3 respectivement. Ils sont déterminés sur les chromatogrammes donnés dans les figures 8 et 9 respectivement. Les temps de retentions du produit CPF identifié à partir de leur chromatogramme est de 10,81 et 11,12 minutes.
La droite d'étalonnage exprime la variation de l'absorbance en fonction de la concentration en Chlorpyrifos. Elle est représentée par la figure 10. Cette droite nous servira de base dans l'analyse quantitative de nos résidus. Les droites d’étalonnage sont réalisées pour chacun des composés avec des solutions étalons, les équations des droites (y=ax) ou hauteur en fonction des concentrations permettent ensuite de remonter à des concentrations inconnues. La corrélation est bonne avec R2 > 0,999 Les phases éluantes sont préparées avec de l'eau ultra pure et de l’acétonitrile (qualité HPLC), elles sont filtrées et dégazées avant utilisation.
Chlorpyrifos
0,2 0,15
0,1 0,05
0 0
y = 0,1748 x R² = 0,999
0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Concentration en µg/ml
Figure 10 : Droite d’étalonnage de chlorpyrifos
Chapitre III
Les résultats d’analyse des concentrations sont représentés sur le tableau 4.
Résultats
Tableau 4 : Résultats des concentrations en Chlorpyrifos dans les échantillons végétaux
Concentration µg/ml Echantillons
1 2 Poivre vert
Poivre rouge Concombre
Courgettes Pommes
Poires Laitues Tomates
ND= Non Détectable DL = 0.1 µg/ml
ND 0,5378 ± 0.043
ND ND 0,9124 ± 0,057
ND ND ND
-42-
ND 0,5092 ± 0,041 0,8524 ± 0,065
--- 0,5187 ± 0,028
--- --- 1,4817 ± 0,107
Chapitre III
III.4. Interprétation des résidus
Résultats
L’interprétation des résultats étant fonction de la connaissance des facteurs susceptibles de modifier la réponse.
Pour examiner la quantité de résidus de pesticides dans les fruits et légumes un total de 50 échantillons ; 4 fruits et 6 légumes différents ont été recueillis en 2011. Nos résultats ont révélé les concentrations en résidus de chlorpyrifos dans les pommes qui nous proviennent de la Nouvelle-Zélande, les tomates provenant du Mexique, poivre vert et rouge cultivés au pays et le concombre comme suit : L’insecticide chlopyrifos est présent à raison de 0,5378 µg/ml dans poivre rouge, 1,4817 µg/ml dans les tomates, 0,9124 µg/ml dans les pommes et 0,8524 µg/ml dans le concombre. Dans la courgette, poires et la laitue nous n’avons pas trouvé de traces de résidus, le chlorpyrifos n’a pas été détecté dans ces échantillons.
Les résultats d’analyses en résidus de pesticides dans nos échantillons de fruits et légumes frais sont les suivants : Plus de 67% des échantillons étaient sans résidus détectables, (6,5 %) des échantillons contenaient des résidus de pesticides inférieurs ou égaux à la LMR et (6,5%) des échantillons nettement supérieur à la LMR. Les taux égaux ou inférieurs à la LMR ont été trouvés le plus souvent dans les pommes, les tomates, suivis par les poivres rouges, les poivres verts et le concombre. Au niveau des fruits les dépassements concernent essentiellement les pommes nos résultats montrent que 61% des échantillons analysés en Italie présentent des valeurs de résidus de pesticides qui sont largement supérieures à la limite maximale de résidus.
III.4.1. Test de la DL50
Le test de la DL50 a été effectué sur des rats ayant reçu différentes doses 1/5, 1/10, 1/20 respectivement.
III.4 .2. Comportement des rats après traitement
Rats injecté à 9h 05min a tendance à boire juste après. Après 20 minutes on a remarqué les signes cliniques suivants :
Rythme cardiaque accéléré; difficulté respiratoire, perte d’équilibre, agitation suivie d’une diminution de la mobilité, poils piqués, paralysie des membres postérieurs puis des membres
Chapitre III
antérieurs, enfin une exophtalmie des yeux suivie de la mort après 40 min.
III.4.3. Observation du comportement et tableau clinique des animaux
Résultats
Les symptômes observés chez les rats mâles et femelles traités par une dose unique de 1/5 de la DL50 au chlopyrifos présentent les symptômes ci-après :
De fortes convulsions et agitation, accélération du rythme cardiaque et une difficulté respiratoire. Une légère irritation de l'iris est observée. L’activité des animaux est réduite, leur démarche devient lente jusqu’à ce qu’ils se couchent sur le ventre avec pattes postérieures écartées et cyanosées, et enfin ils se rangent les uns à côté des autres. Au bout de la 40éme min.
La mort intervient de la 24éme à la 72èmeheure. Au-delà du 4ème jour, les rats ayant survécu, redeviennent normaux avec disparition de tous signes.
L’étude biochimique comme paramètre de la fonction hépatique montre une augmentation de l’activité d’enzyme sérique d’ALP, et une diminution de l’activité de LDH, AST, ALT. Les enzymes transaminases sont considérées comme indicateurs de dommage des tissus, les modifications dans les tissus hépatiques peuvent être expliquées par la diminution des taux des paramètres l’ALT, AST. Cette diminution de l'activité enzymatique du foie a été accompagnée par une diminution du glucose. D'autre part, les données montrent une augmentation significative (P ≤ 0,05) des concentrations sériques de triglycérides, du cholestérol, de la créatinine et de la bilirubine chez le rat traité avec une dose unique de chlorpyrifos par rapport au témoin. Les animaux traités par le pesticide ont eu une hypoglycémie légère. L’effet du CPF fut accompagné d'une diminution du gain de poids corporel qui a conduit à une perte de poids corporel à la fin de l'expérience.
III.4.4. Effets du chlorpyrifos chez les rats in vivo
a. Toxicité aigue
Les signes d’intoxication chez les rats étaient compatibles avec l’inhibition du cholinestérase et inclus l'inactivité, la salivation accrue, une posture voûtée, paralysie flasque, diarrhée, vomissements, exophtalmie, respiration laborieuse, tremblements, coloration oculaire et larmoiement. L’activité de cholinestérase cérébrale était inhibée. Une Réduction du poids corporel et de la consommation de nourriture a été observée chez les animaux.
-44-
Chapitre III
b. Poids corporel
Résultats
Le suivi de la variation de la masse corporelle des animaux au cours de l’expérience de toxicité subaiguë a démontré qu’il y a une diminution significative du poids comparativement aux témoins.
300 250 200 150 100 50 0
Série1
0 1 2 3 4 5 6 7
Figure 11 : Variation du poids corporel des rats traités dans les conditions de toxicité subaiguë avec la dose de 24mg/kg.
c. Le poids absolu des organes
L’examen des organes des rats révèle une augmentation du poids absolu du foie, du rein des testicules comparativement aux témoins néanmoins on note une diminution du poids des ovaires par rapport aux témoins.
d. Masse relative des différents organes
La variation de la masse relative des différents organes chez les rats témoins et traités avec la dose 1/5de la DL50, montre une augmentation significative de la masse relative des reins, poumons, foie. On a enregistré aussi une augmentation significative de la masse relative des testicules. Cependant, une diminution significative au niveau des ovaires, cœur et cerveau a été constatée.
e. Masse relative du foie :
Augmentation de la masse relative du foie chez les femelles plus que chez les mâles comparativement aux témoins.
Chapitre III
f. Masse relative du cerveau :
Résultats
Diminution significative de la masse relative du cerveau chez les rats traités comparativement aux témoins.
g. Masse relative des testicules :
Augmentation significative de la masse relative des testicules par rapport aux témoins.
h. Masse relative des ovaires :
Diminution significative de la masse relative des ovaires chez les rats traités comparativement aux témoins.
i. Masse relative reins :
Augmentation significative de la masse relative des reins par rapport aux témoins.
j. Masse relative poumons :
Augmentation significative de la masse relative des poumons par rapport aux témoins.
k. Masse relative de la rate :
Légère augmentation de la masse relative de la rate chez les femelles comparativement aux témoins.
l. Masse relative du cœur :
Diminution significative de la masse relative du cœur chez les rats traités comparativement aux témoins.
Les paragraphes (e f g h i j k l) Correspondent aux figures ABCDEFGH ci après :
-46-
Chapitre III
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
A
Dose (mg/kg)
C
Dose (mg/kg)
E
Dose (mg/kg)
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0 15
10
5
0
1.5
1.0
0.5
0.0
B
Dose (mg/k g)
D
Dose (mg/kg)
F
Dose (mg/k g)
Résultats
Chapitre III
0.20
0.15 0.10
0.05 0.00
G
Dose (mg/kg)
4
3
2
1
0
H
Dose (mg/k g)
Résultats
Figure 12 : Variations des valeurs de la masse relative des organes pour la dose1/5de la DL50 au cours du traitement aiguë avec le chlorpyrifos. Les valeurs sont les moyennes ± SEM. Selon le test d’ANOVA ; (P≤0.05). Groupes : A (masse relative de la rate), B (masse relative du foie), C (masse relative des reins) D (masse relative du cœur), E (masse relative des poumons), F (masse relative du
cerveau) G (masse relative des ovaires), (masse relative des testicules). La dose D0 : témoin ; D1 les groupes traités avec la dose : 96 mg/kg de chlorpyrifos.
III.4.5. Effets sur les paramètres biochimiques
Les études sériques effectuées sur les rats traités par chlorpyrifos montrent une diminution significative des taux des paramètres suivants : Urée,des transaminases (ALAT, ASAT) glycémie, AURI ALB/GLOB et HDL par rapport aux groupes témoins D0. Toutefois, les résultats des rats traités présentent une élévation significative des taux des paramètres suivants : ALB2, BILTS, cholestérol, créatine, triglycéride, LDL, Une augmentation significative de l’activité phosphatase alcaline (ALP) et des taux (TP) total protéines a été observée comparativement au groupe témoin D0.
On trouvera dans les figures et tableau 5 dessous les principales constantes biochimiques ainsi que les résultats issus de la variabilité des constantes sanguines.
-48-
Chapitre III Résultats
Tableau 5 : Analyses biochimiques des rats après traitement aigue par le chlorpyrifos et avec les doses D0(0 mg/kg), D1(96 mg/kg). Les données sont exprimées par moyenne ± S.E.M. (P≤0.05).
Tests biochimiques AURI mg/l ALAT U/L ALB2 g/L ALB/GLOB g/L
ALP2L U/L ASAT U/L BILTS mg/l
CHOL g/l CREJ2 mg/l
GLUC3 g/L HDLC3 g/l LDL-C g/l
TP2 g/L TRIGL g/l
D0 16 ± 5,52 38,75 ± 14,11
48,8 ± 2,23 1,88 ± 0,19 103,86 ± 24,8 100,8 ± 25,84 0,58 ± 0,26 0,88 ± 0,11 7,4 ± 0,8 1,94 ± 0,38 0,61 ± 0,09 0,04 ± 0,01 75,44 ± 5,96 0,48 ± 0,14
D1 8,5 ± 3,33 30,92 ± 7,04 49,58 ± 7,99 1,66 ± 0,47 137,8 ± 45,48
91 ± 14,90 0,81 ± 0,28 0,90 ± 0,19 7,46 ± 1,69 1,92 ± 0,51 0,53 ± 0,12 0,05 ± 0,02 79,3 ± 13,93
0,82 ± 0,33
Figure 13 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration de l’acide urique et la créatine chez les rats Wistar.
Chapitre III Résultats
Figure 14 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les paramètres biochimiques chez les rats Wistar.
Figure 15 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur la phosphatase alcaline et l’albumine chez les rats Wistar.
Figure 16 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur LDL chez les rats Wistar.
-50-
Chapitre III Résultats
Figure 17 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les activités de protéines sériques totales, de l'aspartate aminotransférase (ASAT), la phosphatase alcaline (ALP) chez les rat Wistar.
III.5. Effets sur les paramètres hématologiques
Un tube hématocrite est enfoncée dans l’angle postérieur ou antérieur de l’œil, perfore la paroi du sinus caverneux; le sang monte par capillarité dans le tube ainsi le sang est récupéré au moment de l’euthanasie des rats après 6 semaines de traitement par gavage au chlorpyrifos. Les résultats hématologiques obtenus sont illustrés dans le tableau 6 et révèlent les observations ci-après :
Une augmentation significative du volume globulaire moyen (MCV), hémoglobine, (HGB) de la teneur corpusculaire en hémoglobine (MCH) et de la concentration globulaire moyenne en hémoglobine (MCHC) est observée. On a enregistré aussi une diminution significative des taux des globules rouges : RBC, des hématocrites : HCT, des plaquettes : PLT, et des taux des globules blanc WBC (Wight Blood Cells). Cependant la concentration du volume plaquettaire moyen (MPV) ne montre pas de différence significative par rapport aux témoins. D'autre part, les résultats montrent une augmentation significative (P ≤ 0,05) des concentrations sériques des triglycérides, du cholestérol, de la créatinine et de la bilirubine chez les rats traités avec une dose unique de chlorpyrifos par rapport au témoin.
Chapitre III Résultats
Tableau 6 : Paramètres hématologiques des rats traités dans les conditions de la toxicité aiguë par chlorpyriphos et avec les doses D0 (0 mg/kg), D1 (96 mg/kg). Les données sont exprimées par
moyenne ± S.E.M. (P≤0.05)
Tests hématologiques RBC (106/mm3)
MCV (3µm) HCT (%) PLT (103/mm)
MPV (3µm) WBC (10 3/mm3)
HGB (g/dl) MCH (p g) MCHC (g/dl)
D0 8, 09 ± 0, 46 51, 48 ± 1, 47
41,64 ± 2,45 859, 4 ± 410, 96
7 ± 0, 23 7, 02 ± 1, 29 13,86 ± 0,93 17,14 ± 0, 93 33, 32 ± 1, 02
D1 7, 88 ± 1, 09 52, 58 ± 5, 47
40,91 ± 3,99 747, 05 ± 205, 52
7, 09 ± 0, 29 7, 6 ± 1, 56 14,02 ± 1,00 18, 21 ± 3, 21 34, 49 ± 1, 93
Figure 18 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les paramètres hématologiques chez le rat Wistar.
-52-
Chapitre III Résultats
Figure 19 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les paramètres; hématocrites : HCT, MCV (volume globulaire moyen), MCHC (concentration globulaire moyenne en hémoglobine) chez le rat Wistar.
Figure 20 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les plaquettes PLT chez le rat Wistar.
IV. Toxicité subaiguë
Dans les conditions de la toxicité subaiguë induite par le chlorpyrifos (CPF), les seuls signes cliniques observés chez les rats traités, sont des diarrhées et une faiblesse (manque de vivacité), On a noté une baisse du poids corporel des rats mâles traités au cours de la cinquième semaine, cette diminution pourrait être expliquée par une réduction de la consommation des aliments, mais aussi à une diminution de la quantité de nourriture absorbée.
Les échantillons de sérum ont été évalués pour les concentrations de glucose, protéines totales (TP), l'albumine, les électrolytes (Na +, K +, Cl ¯ ), l'urée, la créatine et les activités de
Chapitre III Résultats
l'aspartate aminotransférase (AST), alanine aminotransférase (ALT), la phosphatase alcaline (ALP).
L’effet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration sérique des électrolytes est comme suit :
Une légère diminution (p> 0,05) de la concentration en ions sodium Na + dans le groupe traité comparativement au groupe témoin. Toutefois, la concentration en ions potassium K + a légèrement augmenté dans le groupe traité comparativement au groupe témoin. Cependant, une baisse de la concentration en ions Cl¯ a été observée dans le groupe traité par rapport au groupe témoin.
Figure 21 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration d'électrolytes sérique chez les rats Wistar.
L’effet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration sérique de glucose se manifeste par une diminution significative (p <0,01) de la concentration du glucose sérique a été observée dans le groupe traité par rapport au groupe témoin.
Figure 22: Effet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration de glucose sérique chez les rats Wistar.
-54-
Chapitre III
L’effet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration sérique des protéines :
Résultats
Aucun changement significatif (p> 0,05) sur la concentration sérique en protéine total n’a été constaté chez les rats traité. Néanmoins une diminution significative (p> 0,05) de la concentration sérique en albumine a été observée dans le groupe traité par rapport aux témoins.
Figure 23 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les protéines sériques totales, l'albumine chez les rat Wistar.
L’effet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration d'urée sérique :
Augmentation significative (p <0,05) de la concentration d'urée sérique dans le groupe traité par rapport au groupe témoin.
Figure 24 : Effet de chlorpyrifos (CPF) sur la concentration d'urée sérique chez les rats Wistar.
L’effet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration de créatinine sérique :
Augmentation significative (p> 0,05) de la concentration de créatinine sérique dans le groupe traité par rapport au groupe témoin.
