Le sperme des salmonidés : le point sur les connaissances. Applications à la salmoniculture

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Le sperme des salmonidés : le point sur les

connaissances. Applications à la salmoniculture

G. Maisse

To cite this version:

G. MAISSE

INRA Laboratoire de

_Physiologie

des Poissons 35042 Rennes cedex

Le sperme

des

salmonidés :

le

_point

sur

les

connaissances.

Applications

à

la

salmoniculture.

S’appuyant

depuis

l’origine

exclusivement

sur

la

fécondation artificielle

in

vitro,

la salmoniculture

est

tributaire d’une bonne

_gestion

des

_gamètes,

et

en

particulier

du

_sperme.

Une

bonne

connaissance

des

caractéristiques

ultrastructurales

et

_{physiologiques}

des

_{spermatozoïdes}

de salmonidés

permet

de

proposer

des méthodes

pour

les

manipuler,

les

conserver

et

les

congeler.

La salmoniculture est

_l’élevage

des

_poissons

de la famille des salmonidés

_qui

_comprend

trois genres : Salmo

(truite

fario et saumon

atlantique),

Salvelinus

_(ombles)

et

Oncorhyn-chus

(truite

arc-en-ciel,

saumons du

_pacifique).

En France l’essentiel de la

_production

concerne

la truite arc-en-ciel

_(environ

30 000

_tonnes)

introduite

_{d’Amérique}

du Nord au début du

siècle.

La salmoniculture est née avec la

redécou-verte de la fécondation

artificielle,

au milieu du

19ème siècle. Les

_premiers

traités de

piscicul-ture

_{(Coste 1856)}

montrent

_déjà

_{l’importance}

de la

_gestion

et de la

_manipulation

des

gamètes,

dans un

_élevage

où l’on

_pratique,

dès

l’origine,

la fécondation in vitro.

_{Aujourd’hui,}

cette

_importance

s’est accrue avec

l’apparition

de nouveaux modes de

_gestion

des

_géniteurs

et

des

_{gamètes qui}

demandent de la part du

pisci-culteur

plus

de technicité et de

_{rigueur :}

le contrôle

_{photopériodique}

de la date de

_ponte,

l’utilisation de « néomâles

_{» (génétiquement}

femelles)

pour la

production

de cohortes

« monosexe-femelle » et la

_{triploïdisation}

_pour la

_production

de

_grandes

truites stériles sont

devenus des outils

_{indispensables}

à

_l’élevage

industriel,

mais, relevant du domaine

biologi-que, ils

peuvent

être source d’échec en cas de non _respect de

règles

élémentaires.

Nous

_présentons

ici un certain nombre de

données

_qui

nous

_paraissent

essentielles à la

bonne

_{compréhension}

des

_techniques

mises en oeuvre _pour la

manipulation

et la conservation

du sperme de salmonidés.

1

/

_{Caractéristiques}

_générales

du

_sperme

Les salmonidés sont des

_poissons

à repro-duction saisonnière : en _France, la truite fario

et le saumon

_atlantique,

les seuls

_{représentants}

indigènes

de la famille dans les rivières, se

reproduisent

de novembre à février ; en

pisci-culture, les souches de truite arc-en-ciel les

plus

couramment élevées donnent des

_pontes

depuis

début octobre

_jusqu’à

fin mars. Les

oeufs de

_chaque

femelle sont

_prélevés

dans leur totalité en une seule

_{fois ;}

les mâles sont sper-miants

_pendant

deux à trois mois et

_peuvent

fournir du sperme

plusieurs

fois.

Le sperme des salmonidés est un

_liquide

blanc

laiteux,

couleur

_qui

lui a valu la

dénomi-nation de laitance

_employée

_par les auteurs

anciens

_{(Coste 1856).}

Le volume d’un

_éjaculat,

obtenu par

pression

des flancs d’un mâle

mature, varie avec la taille de l’individu et avec

l’avancement de la

_période

de

_{spermiation ;}

il

peut

dépasser

50 ml. Le nombre de

spermato-Résumé

-Une revue d’un certain nombre de travaux

_portant

sur le _sperme de salmonidé

permet

d’en

_dégager

les

_{particularités :}

l’absence

d’acrosome,

l’immobilité dans le fluide séminal liée à la

_présence

de l’ion

_potassium

dont la dilution est la

pre-mière condition de

l’activation,

la faible durée de la motilité

_qui

est due à

l’inca-pacité

de la mitochondrie à compenser

rapidement

les pertes en ATP, la

dépen-dance vis à vis des conditions de milieu

_{(température, pH,}

_oxygène).

Ces

_{caractéristiques}

entraînent un certain nombre de recommandations au

niveau de la

_pratique

_piscicole,

et la mise au

_point

de dilueurs de

fécondation,

de

Le

_{spermatozoïde}

de truite

est

_dépourvu

d’acrosome.

zoïdes _par millilitre

_{d’éjaculat}

varie de 10&dquo; à 30

x _{10&dquo;, la moyenne} se situant aux environs de 10

x 10&dquo;. Sur l’ensemble d’une saison de

reproduc-tion un mâle de 1

_{kg, prélevé}

hebdomadaire-ment, peut donner

_jusqu’à

10&dquo;

_{spermatozoïdes}

(Maisse

et al

_1988).

Le

fluide

séminal,

dans

_{lequel baignent}

les

spermatozoïdes,

représente

plus

de 80 % du volume du sperme

(Munkittrick

et Moccia

1987).

Son

_pH

varie suivant les auteurs de 7,3 à

8,3

(Baynes

et al

_1981).

Son osmolarité est

variable d’un

_éjaculat

à l’autre _pour le même

animal

_(de

moins de 100 à

_plus

de 300

mOs-moles,

Maisse et al

_1988).

Les

_principaux

ions sont Na’, K’, Ca’ ‘,

Mg’ ’

et

C1 ;

les

composi-tions

_{ioniques rapportées}

dans la littérature

varient selon les auteurs, les

espèces

et, au cours de la saison de

_{reproduction,}

en

_rapport

avec la densité en

_{spermatozoïdes (Piironen}

1985).

Les valeurs

_rapportées

par Morisawa

(1985)

(tableau

1),

montrent, que chez les

sal-monidés,

le fluide séminal se

distingue

du

plasma

sanguin

par une teneur en

_potassium

très nettement

_supérieure,

l’osmolarité étant

équivalente ; d’après

les travaux in vitro de Marshall et al

₍₁₉₈₉₎

c’est l’hormone

gonado-trope

qui

stimulerait

l’absorption

de Na’ et la

secrétion de K’ _par

_{l’épithélium}

du canal

défé-rent.

Tableau 1.

_{Composition ionique (en mM)}

et

osmolarité

_{(en MOsmoles)}

du fluide séminal et du

plasma sanguin

de la truite arc-en-ciel

_(d’après

Morisawa

1985).

fluide

plasma

séminal

_sanguin

Na- 127 146 K’ 37 3,1 Ca&dquo; 2,6 3,3

Mg··

1,5 0,9 Cl- 122 115 osmolarité 297 292

De nombreux acides aminés sont

_présents

dans le fluide

séminal,

mais leur niveau est 10 fois moindre que dans le sang

(Billard

et

Menezo

_{1984) ;}

c’est la taurine

_qui

est l’acide

aminé le mieux

_{représenté.}

La

_présence

de ces

acides aminés

pourrait

être une _composante non

négligeable

de la

_{pression osmotique,}

comme cela est le cas chez la carpe où la teneur

séminale

est 4 fois

_plus

_importante

_que celle du

sang

(Billard

et Menezo

_1984).

La concentration en

_protéines

est 20 fois moindre dans le fluide séminal que dans le sang

(Loir

et al

_1990).

De nombreuses

_protéines

ont une

_parenté

_{immunologique}

avec des

pro-téines

_{sanguines ;}

elles peuvent

provenir

du

sang, mais il n’est pas exclu que certaines soient

_{néo-synthétisées}

par les cellules de

Ser-toli et/ou les. cellules du canal

déférent ;

leurs

poids

moléculaires varient de 11 KDa à 80 KDa. D’autres

_{protéines proviennent}

des

spermato-zoïdes eux-mêmes avec en

_particulier

la 42 KDa

qui

est un des constituants

majeurs

de la

mem-brane et la 49 KDa

_qui

domine dans les

pro-téines

_{flagellaires.}

Une

_{quantité plus}

ou moins

importante

de 42 KDa dans le

_liquide

séminal

est

_{interprétée}

comme le

_témoignage

d’une

plus

ou moins

_{grande dégradation}

de la

mem-brane des

_{spermatozoïdes (Maisse}

et al

1988).

Des

_{lipoprotéines (HDL)}

en faible

_quantité

ont

été décrites et

_{pourraient jouer}

un rôle dans la

conservation de la membrane dans le canal déférent

_(Loir

et al

_1990).

2

/ Ultrastructure

du

_{spermatozoïde}

Le

_{spermatozoïde}

de truite

_(Billard

1983,

figure 1)

est constitué d’une tête de _{2,5 !} m de

long

pour 1,5 à

₂

_m de diamètre

_(ce

_qui

cor-respond

au diamètre du

micropyle

de l’oeuf _par

où il

_pénètre

au moment de la fécondation et, de ce

fait,

limite le

_phénomène

de

_polyandrie)

et d’un

_flagelle

de 25 à _{35 !} m de

long.

La tête,

occupée

essentiellement _par le _noyau, est

dépourvue

d’acrosome. La

_pièce

intermédiaire renferme une mitochondrie annulaire non

fer-mée,

dans un

_cytoplasme

très réduit.

L’axo-nème, inséré sur le centriole distal dans une

dépression

de la base du _noyau,

_comprend

9

doublets de microtubules

_{périphériques}

et 2

microtubules centraux. La membrane

flagel-laire

_présente

2 extensions

_{cytoplasmiques}

laté-rales dans

_lesquelles

des vésicules sont visibles.

3

/

_Physiologie

du

_{spermatozoïde}

3.i

/

La

_respiration

tempéra-ture

_(Robitaille

et al 1986,

figure

2 ; à 10° C là demande en 02 est d’environ 10

_!1/heure

_pour 10’°

_{spermatozoïdes.}

3.

2

/

_{L’osmorégulation}

La concentration des cations, Na’, K’,

Mg&dquo;

+

et Ca&dquo; a été étudiée pour le

spermatozoïde

de

Saumon

_atlantique

_par

_Hwang

et Idler

₍₁₉₆₉₎

(tableau

2) ;

l’observation de

_gradients

inverses

en sodium et en

_potassium

de _part et d’autre de la membrane

_suggèrent

l’existence d’un

tran-sport actif mettant en

_jeu

la Na+ - K’, ATPase. Par

ailleurs,

dans une solution

_hypotonique

le

spermatozoïde

se _comporte comme un

osmo-mètre,

l’entrée d’eau _provoque le

_gonflement,

voire

_{l’éclatement,}

de la membrane

_(Maléjac

et

al

_1990),

ce

phénomène

existe

_lorsque

la fécon-dation a lieu dans de l’eau

douce,

c’est un des

facteurs limitants pour l’obtention de résultats constants avec du _{sperme fortement dilué.}

3.

3

/ La motilité

a

/

Description

La motilité des

_{spermatozoïdes}

_peut

être étu-diée d’une manière

_globale,

à

_partir

d’une table de notation

_permettant

l’interprétation

des observations réalisées au

_microscope

(Sanchez-Rodriguez

et Billard 1977, tableau

3)

ou de

manière

plus précise

à l’aide de la

_stroboscopie

(Cosson

et

_{al 1985)}

_{qui permet}

de

_déterminer

la

fréquence

de battement du

_flagelle.

Dans une solution

saline,

le mouvement d’un

spermatozoïde

isolé suit une

_trajectoire

en

spi-rale avec une vitesse de

₂₅₀

_{m/s après}

5 s et

de

_{50 !}

_m/s

au bout de 20 s

_(Gatti

et al

_1985).

Dans les mêmes

conditions,

la

_fréquence

ini-tiale de battement du

flagelle

dépend

de la

tem-pérature

avec un maximum voisin de 60 Hz pour 20°C ; au bout de 30 à 40 secondes la

fré-quence est inférieure à 20 Hz,

puis

décline

b /

_Physiologie

de la motilité

Chez les

_poissons

marins, c’est le _passage dans un milieu

hyperosmotique (>

300

mOs-moles)

qui

provoque la mise en mouvement des

spermatozoïdes ;

c’est au contraire le _passage dans un milieu

hypoosmotique

qui

active les

spermatozoïdes

des

_poissons

d’eau douce

comme la carpe. Pour les

salmonidés,

c’est la

dilution du

_{potassium présent}

dans le fluide

séminal,

qui

entraîne

l’activation ;

l’inhibition de la motilité en

_présence

de K’ _peut être levée

par

l’adjonction

de Ca&dquo;

(Baynes

et al 1981, Tanimoto et Morisawa

_1988).

Utilisant des

blo-queurs des canaux

calciques

et

_potassiques

Tanimoto et Morisawa

(1988)

ont montré que

l’activation de la motilité est initiée par une

fuite de K‘ et une

_{pénétration}

de Ca&dquo; . Ce

phé-nomène activerait la transformation de l’ATP en

AMP-cyclique

dans la seconde suivant la

libé-ration du _sperme dans l’eau

_(Morisawa

et

Ishida 1987,

figure

4).

L’AMP-c

_endogène

joue-rait alors un rôle dans l’initiation de la motilité

(Benau

et Terner 1980, Billard 1980, Morisawa et Okuno

_1982),

_par l’activation d’une enzyme,

la

_{protéine-kinase, catalysant}

la

phosphoryla-tion d’une

_protéine

₍₁₅

_KDa)

_présente

dans

l’axonème ;

cette

_{protéine phosphorylée}

active-rait le

_flagelle

_par un mécanisme non élucidé

(Morisawa 1985).

Par

ailleurs,

le

_Magnésium

₍₅

à 10

_mM)

_joue

aussi un rôle dans le

mouve-ment des

_{spermatozoïdes}

_(Baynes

et al

_{1981) ;}

les ondulations du

_flagelle

résultent du

glisse-ment les uns sur les autres des microtubules

externes ; ce

_phénomène

est

_provoqué

_par

l’ac-tivité

_enzymatique

_(hydrolyse

de

_MgATP

₂

_-)

de la

_dynéine

19S

_(protéine

de

_grande

taille,

1250

KDa)

du bras externe des microtubules en

dou-blet,

maximum à

_pH

9

_(Gatti

et al

_1989).

La durée d’activité extrêmement courte des

spermatozoïdes

de salmonidés dans un milieu

isoosmotique

(260

mOsmoles)

est due à

l’inca-pacité

de la mitochondrie à _compenser

rapide-ment les

_pertes

en ATP : en 30 s le niveau

d’ATP chute de 3 - 4 mM à 1 mM, déficit

_qui

ne sera comblé

_qu’au

bout de 15 minutes par l’ac-tivité de la

mitochondrie ;

la motilité des sper-matozoïdes peut alors être réactivée par

l’ad-jonction

de 30 mM de Ca&dquo;

_(Christen

et al 1987,

figure 5).

Les

_pH

faibles sont nuisibles à l’activation des

_{spermatozoïdes (Baynes}

et al

₁₉₈₁₎

et

l’opti-mum _pour la durée de motilité est 9

_(Billard

et Cosson

_1988).

4

_{/ Application}

à

la salmoniculture

4.

1

/ La fécondation artificielle

A

_l’origine,

la fécondation artificielle se

prati-quait

dans de l’eau de source dont la

composi-tion

_ionique

et le

_pH

varient suivant les

lieux,

ce

_qui

entraînait des résultats variables. Par

ail-leurs,

le choc

_osmotique

_infligé

aux

spermato-zoides dans ces conditions _provoque

rapide-ment un

gonflement puis

un éclatement de la

membrane.

Billard

₍₁₉

₇₇

₎

_propose un dilueur à base de NaCI

(125 mM)

ajustant

la

_{pression osmotique}

à 250 mOsmoles et

_tamponné

_(système

Tris-Glycocolle)

à

_pH

9,

pH optimum

pour la

fécon-dation avec de forte dilutions

(Petit

et al

_1973).

Ce dilueur

_(DIA

₅₃₂₎

_permet

de diluer le

sperme au millième

₍₂

1 d’oeufs + 1 de dilueur

+ 1 ml de

_sperme),

tout en maintenant des

niveaux de fécondation très élevés

_(environ

85

% en _moyenne en

_{pisciculture).}

4.

2

/

La

conservation

du

_sperme

à

court terme

Nous avons vu _que les

_{spermatozoïdes,}

même

immobiles,

consomment de

_l’oxygène

en

quantité

non

négligeable.

Billard et

_Legendre

(1982)

ont montré _que, à 9° C, la teneur initiale du sperme en

_oxygène

₍₆

_mg/1)

chute

conservé en

_présence

d’air,

alors

qu’il

se

main-tient au moins 24 h sous

atmosphère

d’oxy-gène.

La conservation du _{sperme à} des

tempé-ratures voisines de 0° C est

_grandement

amélio-rée

_lorsqu’on

le stocke en faible

_épaisseur

sous

atmosphère d’oxygène

pur

(Stoss 1983).

Dans

ces

conditions,

Stoss et Holtz

_(1983a)

ont

conservé une fécondance satisfaisante

pendant

20

_jours

en

supplémentant

le _sperme avec de la

pénicilline

et de la

_{streptomycine.}

4.

3

/

Le

_{prélèvement}

et

l’utilisation

de

_sperme

testiculaire

L’apparition

dans les années 80 d’un

nou-veau

produit,

la truite de

grande

taille,

a

entraîné la nécessité d’élever des

_populations

« monosexe femelle » ne

_présentant

_pas les

inconvénients d’une maturation

_précoce.

L’ob-tention de telles

_populations

se fait _par

insémi-nation artificielle

_classique

d’œufs normaux,

par du sperme de

néomâles, génétiquement

femelles. Ces

_néomâles,

_produits

d’une inver-sion sexuelle artificielle

_{(Methyltestostérone}

par voie orale

pendant

les 3

premiers

mois

d’alimentation),

présentent

fréquemment

des malformations du canal

déférent,

obligeant

le sacrifice du

_géniteur

_pour la récolte du sperme. Les testicules sont alors dilacérés dans une

solution saline renfermant du

_potassium

pour maintenir

l’immobilité ;

le MMLS

_proposé

par

Billard et

_Jalabert

₍₁₉₇₄₎

sur le modèle du

fluide séminal

_peut

être utilisé : NaCl 100 mM,

KCI 28,3 mM,

MgS0

4

1,1 mM,

CaCl

2

1,8 mM,

pH

9

_(Tampon

Tris-HCI 0,02

M).

4.

4

/

La

_{cryoconservation}

du

_sperme

La

_{cryoconservation}

du _sperme fait

_appel

à

des dilueurs

_qui

doivent dans un

_premier

temps

assurer l’isoosmolarité avec le milieu

intérieur et éviter la mise en mouvement des

spermatozoïdes,

et dans un deuxième

_temps,

lors de la

_congélation

_{proprement dite,}

réduire

autant _que

_possible

la formation de cristaux de

glace

et assurer le maximum de

_protection

à la membrane des

_{spermatozoïdes.}

Le dilueur actuellement utilisé est celui de Mounib modi-fié par

Legendre

et Billard

_{(1980) :}

Sucrose 125

mM, Gluthation réduit 6,5 mM, Bicarbonate de

Potassium 100 mM, DMSO 10

_{%, Jaune}

d’Œuf

au Tellurite 10 %. Les résultats obtenus avec ce

dilueur

₍₁

vol. de _{sperme pour} 3 vol. de

dilueur ;

congélation

en boulettes de 100

_R

_I

sur

de la

carboglace ;

conservation dans l’azote

liquide)

sont variables d’un

_éjaculat

à l’autre

(Legendre

et Billard 1980, Stoss et Holtz

1983b,

Maisse et al

₁₉₈₈₎

et

_dépendent

de la

_qualité

de la membrane des

_{spermatozoïdes}

_(Malejac

et al

1990).

Un certain nombre d’indicateurs a

_priori

de

_l’aptitude

à la

_congélation

du _{sperme ont} été

proposés :

absence de 42 KDa dans le fluide

séminal

_(Maisse

et al

_1988),

_pression

_osmotique

séminale inférieure à 280 MOsmoles et

com-portement

de la membrane des

_{spermatozoïdes}

dans une solution

_{hypotonique (pourcentage}

de cellules éclatées inférieur à 10 %

après

24

heures dans une solutionà 60

_mosmoles)

(Malejac

et al

_1990).

Mais les facteurs de cette

qualité

du _sperme sont difficiles à définir avec

probablement

de nombreuses interactions, ce

qui

amène les auteurs à recommander le

mélange

de

_plusieurs

_spermes

_(Legendre

et Bil-lard

_1980).

Conclusion

Les connaissances actuellement

_disponibles

sur le _sperme de salmonidés sont suffisantes à

une

_gestion

standardisée de l’insémination

arti-ficielle

_{(prélèvement}

du _{sperme, conservation} à

court terme,

fécondation).

Cependant

la

parti-cularité de la

_ponte

_(chaque

femelle ne

_pond

naturellement

_qu’une

fois _par

_an)

rend

l’utilisa-tion de sperme

congelé

peu

attrayante

pour

l’éleveur en dessous d’une fécondance de 75 %.

Ce chiffre n’est pas encore atteint dans les conditions

_{d’exploitation (figure 6)}

et c’est dans

ce secteur _que se situe le

_principal

besoin de recherche finalisée sur le _{sperme. Nos} récents

travaux ont confirmé _que

_l’aptitude

à la

congé-lation

_dépend

de la

_qualité

de la membrane des

spermatozoïdes ;

c’est dans cette direction que

les recherches menées au Laboratoire de

Phy-siologie

des Poissons de l’INRA

s’orientent,

en

étudiant

_{plus particulièrement}

ce

_qui

dans la

spermatogénèse

peut

intervenir sur la

composi-tion

_lipidique

de la membrane des spermato-zoïdes

_(nutrition,

_température

_{d’élevage...).}

_).

Références

_{bibliographiques}

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effects of cations and pH on _motility. J. Fish Biol., 19,

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BENAU D., TERNER C., 1980. Initiation, prolongation,

and reactivation of the _motility of salmonid spermatozoa.

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