La transgenèse animale et ses applications

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To cite this version:

Louis Houdebine. La transgenèse animale et ses applications. Productions animales, Institut National de la Recherche Agronomique, 1998, 11 (1), pp.81-94. �hal-02694968�

animale

et ses applications

La transgen•se consiste ˆ ajouter, remplacer ou inactiver un g•ne particulier. Cette technique permet des progr•s considŽrables dans la connaissance du fonctionnement des g•nes et des mŽcanismes qui gouvernent les fonctions biologiques. Ses applications potentielles pour produire des mŽdicaments, des vaccins, des protŽines alimentaires ou en amŽlioration gŽnŽtique sont tr•s vastes, mais encore limitŽes en raison de son cožt et de la difficultŽ de sa mise en Ïuvre.

RŽsumŽ

La transgen•se animale a ŽtŽ rŽalisŽe avec succ•s pour la premi•re fois il y a 17 ans. De nombreuses utilisations de cette technique existent pour la recherche fondamentale. Elles consistent ˆ ajouter, ˆ inactiver ou ˆ remplacer spŽcifique- ment des g•nes dans les gŽnomes des animaux. Ces expŽriences apportent une moisson dÕinformations incomparables sur le fonctionnement du gŽnome et sur les mŽcanismes de rŽgulation des fonctions biologiques. De nombreux mod•les animaux sont Žgalement obtenus pour lÕŽtude de maladies humaines. La produc- tion de protŽines recombinantes dans le lait dÕanimaux transgŽniques est en passe de devenir une rŽalitŽ industrielle. Le transfert de certains organes (cÏur, rein, poumon...) et cellules (pancrŽas, foie) de porcs transgŽniques ˆ lÕesp•ce humaine est un objectif qui ne para”t plus inaccessible. Les applications de la transgen•se pour lÕamŽlioration des productions animales sont encore ˆ peu pr•s inexistantes.

Elles se cantonnent essentiellement ˆ lÕobtention de mod•les pour des Žtudes de g•nes et de fonctions biologiques particuli•res. La difficultŽ et le cožt de la trans- gen•se chez les animaux domestiques sont une des causes essentielles de la len- teur des applications dans ce domaine. Toutefois, le transfert de g•ne dans des cellules fÏtales cultivŽes suivi de leur transfert dans des ovocytes ŽnuclŽŽs devrait contribuer grandement ˆ amŽliorer cette situation. La transgen•se appli- quŽe directement aux animaux dÕŽlevage pour obtenir de nouvelles lignŽes ayant des caractŽristiques gŽnŽtiques intŽressantes a toutes les chances de sÕimposer dans les annŽes qui viennent. La transgen•se ne saurait toutefois se substituer aux autres techniques (sŽlection gŽnŽtique, vaccination, ma”trise de la reproduc- tion...) qui elles-m•mes font de rapides progr•s pour amŽliorer la production ani- male. La transgen•se doit plut™t •tre considŽrŽe comme une technique supplŽ- mentaire pour amŽliorer les productions animales.

Les techniques de gŽnie gŽnŽtique, qui sont nŽes pour lÕessentiel il y a maintenant 20 ans, ont commencŽ ˆ se populariser et ˆ envahir les laboratoires il y a un peu plus de 10 ans.

Les perspectives qui se sont alors ouvertes ont paru grandioses et un nouveau mot, les bio- technologies, a ŽtŽ crŽŽ pour saluer le dŽbut de cette •re nouvelle. Ceci a conduit ˆ annon- cer la rŽalisation quasi imminente de projets tr•s profitables pour la mŽdecine et lÕagricul- ture. Cette premi•re pŽriode dÕeuphorie, par- fois caractŽrisŽe par une assez grande na•vetŽ et surtout par une certaine mŽconnaissance de ce quÕest la complexitŽ des organismes vivants, a ŽtŽ suivie dÕune phase de relative

dŽpression. Tout paraissait dŽcidŽment bien plus compliquŽ que ce que lÕon avait imaginŽ, en particulier dans le domaine animal. Un rythme de croissance plus rŽaliste a permis depuis de progresser lentement mais sur des bases plus solides qui commencent ˆ porter leurs fruits dans la plupart des domaines.

Il y a cinq ans environ, les biotechnologies animales avaient pu •tre classŽes en plu- sieurs rubriques faisant appel ˆ des tech- niques ou des interventions sur les animaux de plus en plus complexes, laissant prŽvoir un ordre chronologique probable des rŽalisations dans ce domaine (Houdebine 1991). Les inter- ventions faisant appel au transfert de g•nes chez les animaux nÕont donnŽ ˆ ce jour quÕun nombre tr•s rŽduit dÕapplications agrono- miques. Toutefois, la vaccination gŽnŽtique, qui consiste ˆ protŽger dŽfinitivement les ani- maux contre telle ou telle maladie par le transfert dÕun g•ne appropriŽ, est un objectif qui nÕest pas du tout hors de portŽe. La modi- fication de la composition du lait des animaux domestiques par la transgen•se ne para”t pas non plus inaccessible. La modification des fonctions physiologiques des animaux par le transfert de g•ne est un complŽment puissant ˆ la sŽlection gŽnŽtique. Les rŽalisations dans ce domaine sont encore tr•s peu nombreuses et elles nÕappara”tront que lentement. La com- plexitŽ des fonctions biologiques elles-m•mes et, partant, le manque de g•nes candidats rŽellement intŽressants, ainsi que la difficultŽ relative pour obtenir des animaux transgŽ- niques domestiques sont les causes essen- tielles de cette lenteur.

La transgen•se animale a maintenant 17 ans. Il est intŽressant de tenter de faire le bilan de cette technique appliquŽe aux ani- maux dÕintŽr•t agronomique. Ceci doit nous Žclairer et nous aider ˆ mieux orienter nos efforts et nos investissements.

1 / Les techniques de transgen•se

Une protŽine peut •tre produite ˆ partir dÕun g•ne Žtranger par des bactŽries, des levures, des cellules animales en culture ou des animaux transgŽniques, pour •tre ŽtudiŽe ou pour •tre utilisŽe comme agent thŽrapeu- tique. Un g•ne peut •tre transfŽrŽ in vivo dans les seules cellules somatiques et on pro- c•de alors ˆ une thŽrapie gŽnique. Le g•ne peut Žgalement •tre transfŽrŽ dans les cel- lules germinales, on obtient alors des lignŽes dÕanimaux transgŽniques (figure 1).

La transgen•se consiste ˆ ajouter un g•ne Žtranger au gŽnome dÕun organisme vivant ou au contraire ˆ remplacer tr•s prŽcisŽment un g•ne endog•ne par un autre g•ne. Cette der- ni•re opŽration, qui implique la mise en Ïuvre dÕun processus de recombinaison homo- logue, peut conduire en pratique ˆ lÕinactiva- tion ou ˆ la mutation dÕun g•ne chez lÕanimal.

Elle permet tout aussi bien de remplacer un g•ne donnŽ par un tout autre g•ne. Dans tous les cas, le succ•s de ces opŽrations est tr•s intimement liŽ aux techniques de la reproduc- tion.

1^.1 / LÕaddition de g•nes

Les spermatozo•des mis au contact dÕune solution dÕADN puis utilisŽs pour rŽaliser des fŽcondations peuvent vŽhiculer les g•nes jus-

quÕau futur embryon et permettre lÕobtention dÕanimaux transgŽniques. Cette approche sÕest avŽrŽe possible chez le poulet, le poisson z•bre ainsi que chez la vache et le porc. Les taux dÕanimaux transgŽniques obtenus Žtaient toutefois faibles voire tr•s faibles et les transg•nes Žtaient dans la majoritŽ des cas profondŽment remaniŽs (Schellander et Brem 1997, Squires et Drake 1997). Contre toute attente, les spermatozo•des de mouton mis au contact dÕune solution dÕADN ont per- mis dÕobtenir des embryons transgŽniques avec un rendement relativement ŽlevŽ et sans remaniement apparent des transg•nes (San- chez-Putida et al, rŽsultats non publiŽs). Cette approche tr•s simple mŽrite dÕ•tre examinŽe de mani•re plus approfondie.

Plusieurs expŽriences rŽcentes sugg•rent fortement que les spermatozo•des et leurs prŽ- curseurs peuvent Žgalement •tre utilisŽs dÕune autre mani•re pour transfŽrer des g•nes. Il a ŽtŽ rŽcemment montrŽ que des cel- lules prŽcurseurs des spermatozo•des, isolŽes ˆ partir de testicules de souris et m•me de rat, pouvaient achever leur maturation dans des testicules adoptifs de souris jusquÕˆ deve- nir parfaitement fonctionnels (Clouthier et al 1996). Il est par ailleurs possible de procŽder avec succ•s ˆ des fŽcondations in vitro en injectant les cellules prŽcurseurs des sperma- tozo•des, les spermatocytes, dans le cyto- plasme dÕovocytes. Il est parfaitement conce- vable de transfŽrer des g•nes, y compris par recombinaison homologue, pendant la culture

Figure 1. Les différentes utilisations du décodage des gènes isolés. Le transfert de gènes dans des cellules ou des organismes entiers permet l’étude des mécanismes de l’expression génétique, la production de protéines recombinantes, la thérapie génique et cellulaire et la transgenèse.

Gène isolé

Promoteur Région transcrite

- Etudes fondamentales

- Production de la protéine

(Étude et utilisation pharmaceutique de la protéine)

- Etudes fondamentales du gène et des effets de la protéine - Production de la protéine

- Etudes fondamentales - Vaccination

- Thérapie génique

- Greffe d'organes - Thérapie cellulaire - Organes bioartificiels

- Etudes fondamentales - Production de protéine (lait, sang)

- Création de modèles pour des études biomédicales - Préparation d'animaux donneurs d'organes - Obtention d'animaux résistants aux maladies - Obtention d'animaux ayant des caractéristiques génétiques améliorées Transfection

dans des cellules en culture

Transfection in vivo : - Infection par des vecteurs viraux - Injection dans le muscle - Biolistique

- Endocytose dirigée - Injection de complexes ADN-liposomes

Transgenèse : - Microinjection - Infection par des facteurs viraux - Utilisation de cellules ES avec ou sans

recombinaison homologue Transcription

dans un système acellulaire

Bactéries Cellules

d'eucaryotes

des cellules prŽcurseurs des spermatozo•des.

Ceci nŽcessite toutefois au minimum que ces cultures soient bien ma”trisŽes ce qui nÕest pas le cas actuellement.

La technique de transfert de g•nes la plus utilisŽe est la microinjection directe du g•ne Žtranger dans les pronoyaux des embryons au stade une cellule lorsque cela est possible (comme cela est le cas chez les mammif•res) ou dans le cytoplasme (chez les vertŽbrŽs infŽrieurs et les invertŽbrŽs). La microinjec- tion directe de g•ne reste peu efficace et donc tr•s onŽreuse chez les gros animaux. Il est maintenant devenu possible chez la vache, le mouton et la ch•vre de produire ˆ un cožt rŽduit des embryons au stade une cellule totalement in vitro, ˆ partir dÕovocytes isolŽs dÕovaires collectŽs dans les abattoirs (Crozet

1997). Les embryons peuvent alors subir la microinjection de g•ne, puis •tre cultivŽs in vitro jusquÕau stade blastocyste, pour •tre ensuite transfŽrŽs dans des femelles adop- tives (figure 2). La ma”trise de ces techniques contribue ˆ amŽliorer la reproduction des ani- maux et ˆ rendre plus aisŽe la transgen•se.

Des travaux rŽcents autorisent ˆ penser que lÕensemble de ces techniques peuvent mainte- nant •tre Žgalement appliquŽes au porc (M.A.

Sirard et al, rŽsultats non publiŽs).

Les vecteurs viraux qui sont en cours de mise au point pour la thŽrapie gŽnique appli- quŽe ˆ lÕesp•ce humaine sont susceptibles de transfŽrer des g•nes dans les embryons. Les vecteurs rŽtroviraux ont en effet cette pro- priŽtŽ mais leur utilisation relativement dŽli- cate ne para”t justifiŽe que pour les oiseaux

Le transfert de g•ne peut avoir lieu dans les gam•tes m‰les, dans lÕembryon au stade une cellule ou dans des cellules dont le noyau sera

transfŽrŽ dans un ovocyte ŽnuclŽŽ.

Figure 2. Les différentes utilisations possibles des gamètes, des embryons et des cellules embryonnaires pour transférer des gènes aux animaux. Les gènes étrangers peuvent être en principe introduits dans des gamètes mâles avant la fécondation. La microinjection d’ADN dans un des pronuclei des embryons au stade une cellule est actuellement la seule méthode utilisée en routine. L’utilisation de cellules totipotentes permet en principe d’ajouter ou de remplacer des gènes par recombinaison homologue et d’engendrer des animaux chimères mosaïques pour le transgène à la première génération. La technique de clonage permet en principe l’addition et le remplacement de gène dans des cellules embryonnaires fœtales ou adultes et l’obtention d’animaux portant les informations génétiques exogènes.

Adulte

Transgénique Adulte Foetus

Nouveau-né

Adulte Foetus

Nouveau-né

Lignée de cellules multipotentes Testicule

Transfert de noyau Spermatides

Ovaire Maturation in vitro

Adulte Foetus

Nouveau-né

Transgénique Chimère

transgénique, mosaïque Transfert de gène

ciblé ou non

Spermatogonies cultivées

Embryon une cellule

Morula

Blastocyste

Ovocyte Ovocyte énucléé

Transfert de gène par microinjection

Blastomères Diagnostic génétique

Cellules primordiales germinales (PGC)

Blastomères immortalisés

Transfert de gènes ciblé ou non ES - EG Lignée de cellules totipotentes Spermatozoïde

Microinjection

Adulte Foetus

Nouveau-né

Transgénique cloné Cloné,

transgénique Foetus

Nouveau-né

Adulte Foetus

Nouveau-né Fécondation

Transfert de gène

chez lesquels la microinjection nÕest gŽnŽrale- ment considŽrŽe que comme tr•s difficilement praticable (Ronfort et al 1997). Des mises au point rŽcentes indiquent toutefois que la microinjection dÕADN dans les embryons prŽ- coces de poulet suivie dÕun dŽveloppement ex vivo, permet dÕobtenir un rendement tr•s acceptable dÕanimaux transgŽniques (H. Sang et al, rŽsultats non publiŽs).

Les vecteurs adŽnoviraux sont connus pour infecter efficacement la plupart des cellules, m•me au repos. Ces gŽnomes viraux sont tou- tefois normalement maintenus ˆ lÕŽtat auto- nome dans leurs cellules h™tes. Un travail rŽcent vient de montrer que des embryons de souris dŽbarrassŽs de leur zone pellucide sont infectables par les adŽnovirus qui sÕint•grent ensuite avec une frŽquence relativement Žle- vŽe (20 %) (Tsukui et al 1996). Les vecteurs adŽnoviraux sont bien ma”trisŽs et leur utili- sation a priori possible chez les animaux domestiques ouvre des perspectives intŽres- santes.

1.2 / Le remplacement de g•ne

LorsquÕun fragment dÕADN est introduit dans une cellule il peut se recombiner tr•s prŽcisŽment avec un g•ne de lÕh™te ˆ condition que de longs segments du g•ne Žtranger et du g•ne ciblŽ aient une sŽquence identique. Ce processus de recombinaison homologue qui conduit en pratique au remplacement dÕun g•ne cellulaire par un g•ne Žtranger est rare dans les cellules de mammif•res (au maxi- mum dans 0,1 % des cas). Il fait appel ˆ un processus naturel de rŽparation de lÕADN et il ne peut se produire que si lÕADN cellulaire se rŽplique et donc seulement dans des cellules en division. Le remplacement de g•ne par un g•ne Žtranger au niveau dÕun animal entier nÕest par ailleurs possible que si les cellules qui ont subi le processus de recombinaison homologue peuvent •tre utilisŽes pour engen- drer un organisme entier et donc donner nais- sance ˆ un animal dans des conditions nor- males. Deux approches pour procŽder ˆ un remplacement de g•ne sont actuellement pos- sibles.

a / Utilisation de cellules totipotentes pour engendrer des animaux chim•res

LÕune de ces approches consiste ˆ utiliser des cellules totipotentes qui, apr•s avoir ŽtŽ introduites dans un embryon prŽcoce, peuvent participer ˆ son dŽveloppement complet.

LÕanimal obtenu est alors une chim•re puis- quÕil est formŽ ˆ partir des cellules provenant de deux animaux diffŽrents. Dans le meilleur des cas, les cellules ajoutŽes ˆ lÕembryon et ayant subi au prŽalable la modification gŽnŽ- tique, participent ˆ la formation des gam•tes.

La modification gŽnŽtique est alors transmise ˆ la descendance qui est homog•ne pour la mutation.

Des lignŽes de cellules totipotentes peuvent

•tre obtenues ˆ partir des embryons prŽcoces.

On les appelle alors des cellules ES (embryon- naires souches). DÕautres lignŽes ayant des caractŽristiques ˆ peu pr•s semblables peu- vent •tre obtenues ˆ partir des cellules pri- mordiales germinales (PGC). Ces cellules sont alors appelŽes EG (embryonnaires germi- nales).

Chez la souris, plusieurs lignŽes de cellules ES ont ŽtŽ Žtablies. JusquÕˆ ce jour lÕutilisa- tion de cellules ES, et donc le remplacement dÕun g•ne, nÕest possible que chez la souris.

Pour des raisons inconnues, en effet, chez les autres esp•ces, les cellules embryonnaires cultivŽes se diffŽrencient rapidement et deviennent incapables de participer ˆ la for- mation de chim•res germinales. Chez les oiseaux, il a ŽtŽ possible dÕobtenir des chi- m•res porteuses de g•nes Žtrangers ˆ partir de cellules embryonnaires (Thoraval et al 1994, Etches et al 1997). Des expŽriences rŽcentes montrent Žgalement que des lignŽes de cellules totipotentes fonctionnelles ont pu

•tre utilisŽes avec succ•s chez le poulet (Pain et al1996).

Plusieurs publications ont montrŽ que les cellules germinales primordiales (PGC) pou- vaient •tre cultivŽes sous forme de lignŽes et participer, comme les cellules ES, au dŽvelop- pement dÕanimaux chim•res (Donovan et al 1997). La manipulation de ces cellules ne para”t pas aisŽe et elle reste possible essen- tiellement chez la souris. Des cellules ES ainsi que des cellules EG (lignŽes totipotentes dŽrivŽes des cellules germinales primordiales) ont toutefois ŽtŽ obtenues rŽcemment chez le porc. Ces cellules ont donnŽ naissance ˆ des animaux chim•res. La transmission germi- nale du nouveau gŽnome ainsi acquis nÕa pas ŽtŽ dŽmontrŽe ˆ ce jour (Anderson 1996).

b / Utilisation de cellules

multipotentes ou somatiques pour engendrer des animaux clonŽs Chez la plupart des esp•ces, les cellules embryonnaires cultivŽes pendant plusieurs semaines ont perdu leur totipotence. Elles sont partiellement diffŽrenciŽes et qualifiŽes de multipotentes. Ces cellules sont devenues progressivement incapables de participer au dŽveloppement dÕembryons chim•res.

La technique de clonage des animaux dans sa version classique consiste ˆ introduire un noyau de cellule embryonnaire non cultivŽe dans le cytoplasme dÕun ovocyte ŽnuclŽŽ. Il est gŽnŽralement admis que les cellules embryon- naires cultivŽes et devenues multipotentes et, a fortiori, les cellules somatiques diffŽrenciŽes ne peuvent assurer le dŽveloppement complet dÕun embryon reconstituŽ par transfert de noyau. Une Žtude systŽmatique a dŽmontrŽ que des cellules multipotentes de mouton maintenues ˆ lÕŽtat de quiescence en retirant le sŽrum de leur milieu de culture sont capables de donner naissance ˆ des agneaux apr•s transfert dans le cytoplasme dÕovocytes ŽnuclŽes (Campbell et al 1996). La m•me approche expŽrimentale a Žgalement dŽmon- trŽ que des cellules fÏtales ainsi que des cel-

lules somatiques prŽlevŽes chez des animaux adultes peuvent donner naissance ˆ des agneaux (Wilmut et al 1997). Le laboratoire dÕEdimbourg qui a mis au point ces tech- niques a rŽcemment dŽmontrŽ que des fibro- blastes fÏtaux de moutons ayant re•u in vitro un g•ne Žtranger par les techniques clas- siques de transfection peuvent donner ainsi naissance ˆ des agneaux transgŽniques. Le rendement de la technique de clonage utilisŽ est relativement faible. Il appara”t toutefois dÕores et dŽjˆ que lÕaddition de g•ne est plus facile par ce procŽdŽ que par la technique classique de microinjection dans les pronuclei des embryons. Cet ensemble de techniques doit pouvoir •tre Žtendu rapidement aux autres ruminants domestiques ainsi quÕau lapin et au porc. Le remplacement de g•ne par recombinaison homologue peut avoir lieu en principe dans nÕimporte quel type de cel- lules cultivŽes. Le transfert du noyau de ces cellules doit donc permettre de remplacer des g•nes tr•s spŽcifiquement chez toutes les esp•ces chez lesquelles le clonage ˆ partir de cellules somatiques est possible.

2 / Les applications de la transgen•se

La possibilitŽ dÕajouter, de muter ou de reti- rer un g•ne dans un animal entier offre aux expŽrimentateurs des possibilitŽs sans prŽcŽ- dent. Les animaux transgŽniques sont deve- nus des outils irrempla•ables pour Žtudier le fonctionnement des g•nes et les mŽcanismes qui gouvernent les fonctions biologiques. Il est m•me parfois judicieux de crŽer des animaux spŽcifiquement pour des Žtudes particuli•res, par exemple de toxicologie (voir lÕarticle de Pineau 1998, dans ce numŽro).

LÕINRA est actuellement en France la seule structure qui permet de rŽaliser des expŽri- mentations, comme la transgen•se, sur les animaux domestiques de grand format. Cette situation conf•re ˆ cet institut des devoirs. Il se trouve ainsi sollicitŽ par les autres insti- tuts de recherche et par lÕindustrie pharma- ceutique pour obtenir des mod•les animaux destinŽs ˆ rŽaliser des Žtudes biomŽdicales, ˆ prŽparer des protŽines recombinantes et ˆ tenter de modifier des organes de porcs desti- nŽs ˆ la greffe chez lÕhomme. Des lapins transgŽniques permettant dÕŽtudier lÕathŽro- sclŽrose (Duverger et al 1997) et le Sida (Dunn et al 1995) ont ainsi ŽtŽ obtenus.

LÕINRA est Žgalement impliquŽ dans des recherches qui visent ˆ rendre les organes de porc tolŽrables par lÕhomme. Ces projets impliquent le transfert de g•nes Žtrangers chez le porc (Malassagne et al 1996).

La modification du lait destinŽ ˆ la consom- mation humaine ou animale est un objectif rŽalisable dont lÕenjeu est important. Les pro- jets sont de trois types. Le lait peut •tre modi- fiŽ en tant que nourriture classique (Mercier et Vilotte 1997). Il peut Žgalement •tre com- plŽmentŽ par des protŽines qui ne sÕy trouvent

pas naturellement. Ces protŽines peuvent contribuer ˆ protŽger le tractus digestif des consommateurs contre des agents pathog•nes.

Le lait est par ailleurs devenu une source de protŽines dÕintŽr•t pharmaceutique.

La lutte contre les maladies reste un souci constant dans les Žlevages. La transgen•se peut apporter des solutions originales qui sont discutŽes plus loin. La lutte contre le virus de la septicŽmie hŽmorragique chez le lapin et la truite para”t possible par ces tech- niques.

LÕamŽlioration des fonctions biologiques essentielles (reproduction, croissance muscu- laire, etc.) peut Žvidement en principe •tre obtenue par la transgen•se. La mŽconnais- sance des g•nes impliquŽs et le cožt de la transgen•se limitent encore la mise en Ïuvre de tels projets.

2.1 / La lutte contre les maladies

LÕŽradication et la sŽlection gŽnŽtique sont deux moyens pour lutter contre certaines maladies. La vaccination est un autre moyen qui peut bŽnŽficier dÕune mani•re considŽ- rable des apports du gŽnie gŽnŽtique (voir lÕarticle de Eloit 1998, dans ce numŽro).

Des peptides obtenus par synth•se chi- mique ou des protŽines obtenues apr•s trans- fert du g•ne codant pour un antig•ne vacci- nant dans des cellules appropriŽes (bactŽries, levures, plantes, cellules animales) peuvent conduire ˆ lÕobtention de vaccins efficaces et parfaitement sžrs. Des observations rŽcentes ont montrŽ que des extraits de plantes et m•me des plantes enti•res transgŽniques syn- thŽtisant un antig•ne viral connu pour •tre actif par voie orale Žtaient capables dÕinduire la formation dÕanticorps et une certaine pro- tection contre le virus chez des souris (Mason et al1996). Cette expŽrience ouvre des perpec- tives intŽressantes pour la vaccination en masse et ˆ des prix tr•s bas chez lÕhomme et chez les animaux. Une telle mŽthode nÕest Žvi- demment exploitable que dans le cas o• un antig•ne a un pouvoir vaccinant par voie orale.

a / Vaccination par lÕADN nu

Des expŽriences rŽalisŽes en partie fortuite- ment ont montrŽ, contre toute attente, que de lÕADN nu sous forme plasmide (ie molŽcule dÕADN circulaire) Žtait capable de pŽnŽtrer dans les cellules musculaires apr•s simple injection de la solution dÕADN. Cet ADN peut se maintenir pendant au moins un an et diri- ger la synth•se en continu de la protŽine cor- respondante, ce qui conduit ˆ la formation dÕanticorps contre cette protŽine. Cette obser- vation a ŽtŽ rŽpŽtŽe de nombreuses fois avec toutes sortes de variantes. Un traitement nŽcrosant prŽalable du muscle est souvent nŽcessaire pour favoriser la pŽnŽtration de lÕADN (Ladenheim 1995). Des pistolets utili- sant des billes dÕor ou de platine chargŽes dÕADN (biolistique) ou de simples jets ˆ haute vitesse dÕADN en solution permettent Žgale-

Il est possible de fabriquer des vaccins en modifiant

les g•nes des microorganismes pathog•nes, mais on peut aussi envisager de transfŽrer ˆ lÕanimal des g•nes de rŽsistance aux maladies.

ment de mani•re particuli•rement simple de faire pŽnŽtrer des g•nes Žtrangers dans les tissus animaux et dÕinduire la formation dÕan- ticorps (Furth et al 1995). LÕinjection simulta- nŽe dÕun plasmide codant pour lÕinterleukine 2 stimule localement le syst•me immunitaire et vient ainsi renforcer notablement la pro- duction dÕanticorps (Kumar et Sercarz 1996).

Des injections intradermiques dÕADN sont Žgalement tr•s efficaces (Davis et al1996).

Une des caractŽristiques de cette mŽthode est la qualitŽ de la rŽponse immunitaire, qui semble le plus souvent impliquer tr•s forte- ment les mŽcanismes cellulaires de dŽfense (Kumar et Sercarz 1996). CÕest semble-t-il la mani•re dont sont prŽsentŽs les antig•nes, par la cellule qui contient lÕADN Žtranger, qui conditionne la qualitŽ de la rŽponse.

Plusieurs probl•mes restent ˆ rŽsoudre avant que cette mŽthode ne devienne une pra- tique courante dans les Žlevages. Il faut tout dÕabord noter que les rŽponses aux injections dÕADN, m•me si elles ont ŽtŽ obtenues par de nombreux laboratoires, sont variables. Une standardisation de la mŽthode est indispen- sable pour quÕelle soit rŽellement exploitable.

Un autre probl•me concerne la biosŽcuritŽ.

Les plasmides utilisŽs ne prŽsentent pas de risques particuliers. Il est toutefois nŽcessaire que lÕADN injectŽ ne se retrouve pas dans les tissus destinŽs ˆ la consommation humaine ni dans les cellules germinales. LÕutilisation dÕARNm codant pour des antig•nes plut™t que dÕADN pourrait rŽsoudre le probl•me car ils sont instables dans les cellules. Encore faut-il

prouver quÕils sont aussi efficaces que lÕADN, que leur prix de revient est acceptable et que leur manipulation nÕest pas trop dŽlicate.

b / Vaccination gŽnŽtique

Le vocable de vaccination gŽnŽtique regroupe toute une sŽrie de techniques qui reposent sur la transgen•se. Elles consistent ˆ transfŽrer aux animaux des g•nes qui conf•- rent de mani•re dŽfinitive une rŽsistance constitutive ou induite ˆ des maladies don- nŽes. Ces g•nes de rŽsistance agissent indŽ- pendamment du syst•me immunitaire et lÕef- fet de protection nÕest donc pas au sens strict le rŽsultat dÕune vaccination.

Les g•nes de rŽsistance peuvent •tre des g•nes naturels identifiŽs chez les individus dÕune esp•ce animale naturellement rŽsis- tants ˆ la maladie. Ces g•nes peuvent Žgale- ment •tre ceux qui codent pour des anticorps monoclonaux, sŽcrŽtŽs ou non (intracorps) (Jones et Marasco 1997), qui se lient ˆ lÕagent pathog•ne et lÕinactivent. Les produits de cer- tains g•nes peuvent interfŽrer avec les mŽca- nismes de rŽplication des virus. CÕest le cas des g•nes Ç enveloppe È pour les rŽtrovirus.

LÕenveloppe surproduite par la cellule occupe le rŽcepteur du virus et emp•che ainsi sa liai- son et son entrŽe dans la cellule (Salter et Crittenden 1989). Les protŽines de capside surproduites par les cellules perturbent la for- mation des particules virales. Les ARN anti- sens et les ribozymes peuvent annihiler ou dŽtruire les ARNm viraux. Les ARN antisens peuvent Žgalement dans certains cas former des triples hŽlices avec lÕADN et inhiber la transcription du g•ne ainsi ciblŽ. La surpro- duction dÕune sŽquence dÕARN viral ayant un r™le clef (la sŽquence liant lÕARN polymŽrase virale par exemple) peut servir de leurre pour les protŽines virales qui se fixent massive- ment sur le leurre et dŽlaissent les ARN viraux (figure 3).

Les applications de ces mŽthodes aux ani- maux domestiques sont ˆ peu pr•s inexis- tantes. Les mises au point sont si lourdes et onŽreuses que peu de tentatives ont ŽtŽ conduites jusquÕˆ leur terme. Les rŽsultats obtenus avec les syst•mes mod•les et chez les plantes ne laissent que peu de doute sur la puissance de ces techniques.

2.2 / La sŽcrŽtion de protŽines recombinantes dans le lait

Le lait reprŽsente 30 % des protŽines consommŽes par les pays riches. Pour cette raison, la lactation a depuis longtemps fait lÕobjet dÕŽtudes diverses tendant ˆ augmenter la production laiti•re et ˆ amŽliorer la qualitŽ du lait. Ces Žtudes vont de la sŽlection gŽnŽ- tique ˆ la physiologie en passant par la patho- logie et la nutrition. La sŽlection gŽnŽtique a ˆ la fois conduit ˆ des augmentations tr•s importantes de production et au changement de composition du lait. LÕutilisation de lÕhor- mone de croissance (BST) est susceptible dÕaugmenter rapidement et de mani•re souple (anticorps)

(intracorps)

Gène d'enveloppe

Gène pour : - ARN antisens - Ribozyme - Leurre

Gène de capside

AAAA AAAA AAAA AAAA AA AA AA AA AAA AAA A

A A

AA AA AA AA AA

Figure 3. Les différentes stratégies possibles pour inhiber la propagation d’un virus par vaccination génétique et plus généralement d’inhiber l’expression d’un gène cellulaire. La surexpression de certains gènes viraux (enveloppe, capside...) peut perturber l’infection ou l’assemblage des particules virales. Les produits de divers gènes (anticorps, ARN antisens, ribozyme, leurre...) peuvent inhiber une étape de la multiplication du virus.

la production dÕun lait de bonne qualitŽ chez toutes les races de ruminants domestiques sans en altŽrer significativement la composi- tion. Les Žtudes de nutrition permettent dÕop- timiser lÕexpression des meilleurs patrimoines gŽnŽtiques et de tirer le meilleur parti de lÕac- tion des hormones. Les pathologies de la glande mammaire restent un probl•me prŽoc- cupant qui tend ˆ sÕaccentuer avec lÕaugmen- tation de la productivitŽ des animaux.

Les techniques de gŽnie gŽnŽtique ont per- mis ces derni•res annŽes dÕisoler puis dÕŽtu- dier les g•nes des principales protŽines du lait des animaux domestiques. La ma”trise de ces techniques ouvre des perspectives intŽres- santes qui redonnent au lait une nouvelle importance. La connaissance dŽtaillŽe des structures des g•nes des protŽines du lait per- met dŽsormais une sŽlection prŽcise et relati- vement simple des all•les les plus intŽressants (Grosclaude et al 1994). Elle va Žgalement autoriser des approches totalement nouvelles dont les retombŽes devraient •tre tr•s sub- stantielles. La possibilitŽ dŽsormais devenue une rŽalitŽ dÕexprimer une protŽine Žtrang•re dans le lait va conduire ˆ la mise en Ïuvre de nouveaux projets qui sont de trois types diffŽ- rents : 1) la modification des composants natu- rels du lait, 2) lÕaddition de nouveaux compo- sants dans le lait destinŽs ˆ la consommation humaine ou animale 3) la production de pro- tŽines ayant un intŽr•t pharmaceutique ou vŽtŽrinaire. Tous ces projets reposent sur les m•mes principes techniques (figures 4 et 5).

a / Modification des composants naturels du lait

La composition du lait des animaux domes- tiques, tel quÕil nous est prodiguŽ par la nature, nÕest pas idŽale dans tous les cas pour la consommation humaine. La sŽlection gŽnŽ- tique va permettre de bŽnŽficier de meilleurs all•les mais Žvidemment pas de modifier fon- damentalement la composition du lait. Il est bien connu quÕune proportion importante de lÕhumanitŽ ne tol•re pas le lactose et quÕun certain nombre de personnes prŽsentent des allergies ˆ la β-lactoglobuline et ˆ certaines casŽines. La composition du lait des rumi- nants domestiques nÕest par ailleurs pas opti- mum pour la transformation du lait par lÕin- dustrie laiti•re. Des projets visant ˆ optimiser la composition des laits sont ainsi en cours de rŽalisation (Mercier 1986, Vilotte et Mercier 1997).

La suppression du lactose du lait a pu •tre obtenue chez la souris. Le remplacement du g•ne de lÕα-lactalbumine par un homologue mutŽ et inactif a supprimŽ lÕactivitŽ lactose synthŽtase et, partant, la synth•se du lactose (Stinnakre et al 1994, Stacey et al1995). Il a m•me ŽtŽ possible de remplacer le g•ne de lÕα- lactalbumine de souris par son homologue humain (Stacey et al1994). Ce g•ne Žtranger fonctionne parfaitement bien, au point m•me de sÕexprimer ˆ un taux plus ŽlevŽ que le g•ne de souris, respectant ainsi le statut du g•ne chez les deux esp•ces. La suppression du g•ne de lÕα-lactalbumine est en rŽalitŽ un procŽdŽ

LÕinactivation ou le remplacement de g•nes des protŽines du lait permettent dŽsormais de modifier sa composition, notamment en faisant produire ˆ lÕanimal des protŽines qui ne sÕy trouvent pas naturellement.

Région régulatrice

Région codante Gène hybride

Souris Lapine Truie Brebis Chèvre Vache Lait

Protéine recombinante

Gène de protéine du lait Gène étranger

Microinjection dans l'embryon Figure 4. La sécrétion d’une protéine

recombinante dans le lait après transfert d’un gène étranger. Une construction de gène comprenant le promoteur d’un gène d’une protéine du lait et le gène d’intérêt est microinjecté dans l’embryon.

Le gène étranger intégré se transmet à toutes les cellules de l’organisme et à ses descendants.

Ils s’expriment spécifiquement dans le lait des femelles en lactation.

Figure 5. L’inactivation du gène de l’α-lactalbumine de souris. Un gène délété analogue à celui de la souris vient remplacer le gène sauvage par recombinaison homologue dans des cellules embryonnaires souches (ES). Ces cellules, réintroduites dans un embryon précoce, participent à la formation de l’organisme qui se voit doté du gène muté. Les gènes neo et HSVTK codent pour des protéines qui permettent respectivement le tri des cellules résistantes à la généticine et sensibles au gancyclovir. Cette double sélection permet d’éliminer les cellules qui ont intégré le gène par un processus de

recombinaison hétérologue.

AAAAA

gène de l'α −lactalbumine

HSVTK HSV-neor

(vecteur pour la transgenèse ciblée)

gène de l'α −lactalbumine muté et inactivé

+

(ADN génomique)

(ADN génomique)

AAA AAA

trop efficace. LÕabsence de lactose se traduit en effet par un dŽficit dÕeau qui rend le lait difficilement sŽcrŽtable. LÕattŽnuation du taux de sŽcrŽtion du lactose par lÕutilisation dÕARN ou de ribozymes dirigŽs contre lÕARN de lÕα- lactalbumine est possible (LÕHuillier et al 1997).

Une augmentation de la sŽcrŽtion de casŽine κ est susceptible de changer la taille et la stabilitŽ des micelles de casŽines et dÕaugmenter ainsi la masse et la qualitŽ de la p‰te ˆ fromage. Le clonage et lÕexpression du g•ne de la casŽine κde ch•vre et de vache ont ŽtŽ obtenus chez la souris (Persuy et al1995, Gutierrez et al 1996). A titre de mod•le, la surexpression du g•ne de la casŽine κde lapin chez des lapins transgŽniques est Žgalement en cours de rŽalisation (Bšsze et al 1996).

Cette approche peut permettre de prŽvoir ce que lÕon obtiendra chez des ch•vres transgŽ- niques surexprimant leur propre g•ne de la casŽine κ.

Dans le m•me ordre dÕidŽe, un lait enrichi en casŽine-β donne une p‰te ˆ fromage de meilleure qualitŽ. Le g•ne de la casŽine-β a ŽtŽ isolŽ et il sÕexprime de mani•re abondante chez des souris (Persuy et al 1992). Il peut donc •tre transfŽrŽ ˆ des ch•vres pour tenter de surproduire cette protŽine.

Il est Žgalement concevable de modifier quelques acides animŽs dans certaines casŽines pour augmenter leur sensibilitŽ aux protŽases et accŽlŽrer ainsi la maturation de la p‰te ˆ fromage.

La modification de certaines enzymes de la glande mammaire peut conduire ˆ un change- ment des composŽs non protŽiques du lait.

CÕest le cas du g•ne de lÕα-lactalbumine qui contr™le la synth•se du lactose mais aussi de lÕacŽtyl-CoA carboxylase et de la Æ₂dŽsatu- rase dont la surexpression peut induire un changement de la composition des lipides du lait.

Dans le m•me ordre dÕidŽe, il est intŽres- sant de noter que lÕexpression dÕun transg•ne contenant le promoteur du g•ne WAP de souris et lÕADNc de la glycosyltranfŽrase humaine, dans la glande mammaire de souris se traduit par une modification de la glycosy- lation des protŽines ainsi que par une sŽcrŽ- tion dÕoligosaccharides dont la synth•se chi- mique est tr•s complexe et dont les activitŽs biologiques sont potentiellement tr•s intŽres- santes (Prieto et al1995).

La modification de la composition du lait par transgen•se est donc possible. Elle implique lÕaddition, lÕinactivation ou la substi- tution dÕun g•ne par un autre. Ces techniques sont ma”trisŽes pour lÕessentiel chez la souris mais chez aucune autre esp•ce (Mercier et Vilotte 1997). LÕinactivation ou le remplace- ment dÕun g•ne par un autre nÕest en effet possible ˆ lÕŽchelle dÕun organisme animal entier que si lÕon dispose des cellules embryonnaires dans lesquelles peut avoir lieu une recombinaison homologue et qui sont capables de rŽgŽnŽrer dÕune mani•re ou dÕune autre un animal entier. Les succ•s dans ce

domaine nÕarrivent donc que lentement et ce dÕautant plus que, m•me en cas de succ•s dans les opŽrations de gŽnie gŽnŽtique, il fau- dra un laps de temps relativement grand pour Žvaluer lÕensemble des effets des nouveaux g•nes et assurer leur diffusion dans les trou- peaux dÕŽlevage.

b / Addition de composants nouveaux dans le lait destinŽ ˆ la consommation humaine et animale

Une opŽration plus volontaire peut consis- ter ˆ ajouter dans le lait des protŽines qui ne sÕy trouvent pas normalement, ces protŽines pouvant ou non •tre naturellement prŽsentes dans le lait selon les esp•ces animales. CÕest le cas de la lactoferrine humaine qui peut

•tre sŽcrŽtŽe dans le lait de vache gr‰ce au transfert du g•ne correspondant (Krimpen- fort et al 1991). Cette opŽration a pour but essentiel dÕajouter au lait de vache une pro- tŽine importante du lait humain. La lactofer- rine est en effet une protŽine transporteuse de fer. Elle peut donc apporter du fer aux nourrissons (ou aux petits animaux) mais aussi rŽduire le taux de fer circulant. La lac- toferrine (comme la transferrine) est en effet sŽcrŽtŽe dans un Žtat o• elle nÕest pas com- pl•tement chargŽe en fer. Elle capte donc avi- dement le fer libre et rŽduit ainsi tr•s nota- blement le dŽveloppement des bactŽries donc la croissance dŽpend de cet ion mŽtallique.

La lactoferrine pourrait donc assurer une protection du tractus digestif des nourris- sons. Si les effets de la lactoferrine ont ŽtŽ bien ŽtudiŽs in vitro, ils ont bien moins connus in vivo. Cette protŽine est par ailleurs sensible ˆ la chaleur, lÕindispensable pasteurisation du lait destinŽ ˆ la consom- mation humaine risque donc dÕen annuler les effets.

Dans le m•me ordre dÕidŽe, le g•ne de la transferrine de lapin a ŽtŽ clonŽ (ThŽpot et al, rŽsultats non publiŽs). Ce g•ne est tr•s forte- ment exprimŽ dans la glande mammaire de lapin tout au long de la lactation (Puissant et al1994) alors quÕil ne lÕest quÕˆ la parturition et au sevrage chez les rongeurs et pas du tout semble-t-il chez les autres esp•ces. La lapine nÕallaite naturellement ses petits quÕune fois par jour sans souffrir particuli•rement de mammites. LÕaccumulation du lait pendant 24 heures est pourtant une situation idŽale pour dŽclencher des infections bactŽriennes dans la glande mammaire. Le transfert du g•ne de la transferine de lapin chez le porc permettrait peut-•tre de protŽger la glande mammaire chez cette esp•ce animale, dÕap- porter aux porcelets le fer que le lait de leur m•re ne leur donne pas spontanŽment et de protŽger le tractus digestif des m•mes porce- lets contre certaines infections bactŽriennes.

DÕautres protŽines protectrices comme le lysozyme humain peuvent Žgalement •tre pro- duites dans la glande mammaire de vache.

Leurs effets rŽels ne sont actuellement pas connus.

Plus gŽnŽralement, rien ne sÕoppose ˆ ce que des anticorps monoclonaux soient sŽcrŽ- tŽs en masse dans le lait. Cette expŽrience a ŽtŽ rŽalisŽe avec succ•s par plusieurs groupes.

Ces anticorps peuvent •tre humanisŽs dans leur partie variable et •tre pleinement actifs chez lÕhomme. Ils peuvent appartenir aux dif- fŽrentes catŽgories dÕanticorps (IgG, IgA...) et avoir des effets inhibiteurs sur le dŽveloppe- ment de divers agents pathog•nes. De tels laits pourraient ainsi possŽder des effets pro- tecteurs significatifs contre des virus et des bactŽries du tractus digestif dont p‰tissent lÕesp•ce humaine aussi bien que les animaux.

Un certain nombre dÕantig•nes sont actifs par voie orale. Leur prŽsence ˆ lÕŽtat de pro- tŽines recombinantes dans des plantes trans- gŽniques induit la formation dÕanticorps et une protection immunitaire chez des souris qui ont absorbŽ ces plantes par voie orale (Mason et al1996). Le lait dÕanimaux transgŽ- niques pourrait contenir de tels antig•nes et donc constituer un vaccin dans certains cas.

Toutes ces perspectives tendent ˆ faire du lait une nourriture-mŽdicament ou alicament.

Les rŽalisations dans ce domaine seront rela- tivement lentes dans la mesure o• elles ne peuvent que rŽsulter dÕune longue Žtude des effets des protŽines recombinantes et aussi en raison des investissements importants que nŽcessite le transfert de g•nes chez les ani- maux domestiques.

c / Production de protŽines

ayant un intŽr•t pharmaceutique ou vŽtŽrinaire

De mani•re assez attendue cÕest la produc- tion de protŽines dÕintŽr•t pharmaceutique qui est le plus avancŽ des trois types projets. Cette production ne nŽcessite en effet que relative- ment peu dÕanimaux et elle est potentielle- ment la source de retours financiers ŽlevŽs. A lÕheure actuelle plus de 50 protŽines Žtran- g•res ont ainsi ŽtŽ produites dans le lait et, pour autant, aucune nÕest encore sur le mar- chŽ. Le dŽroulement des choses depuis environ 6-7 ans lorsque lÕidŽe dÕutiliser la glande mam- maire comme fermenteur vivant sÕest imposŽe, a ŽtŽ relativement rapide. Mener ˆ bien de tels projets supposait que soit ma”trisŽ un certain nombre de techniques. Le premier probl•me concerne les promoteurs des g•nes capables de diriger la synth•se dÕune protŽine Žtrang•re dans la glande mammaire. En effet, ˆ lÕheure actuelle essentiellement cinq promoteurs sem- blent exploitables : ceux des g•nes des casŽines αS1et βdes ruminants, de la β-lacto- globuline, de la WAP (Whey Acidic Protein) des rongeurs et surtout de lapin et de lÕα-lac- talbumine humaine. Les autres promoteurs actuellement isolŽs ne fonctionnent quÕˆ un taux trop faible pour permettre dÕenvisager aussi aisŽment une exploitation industrielle (Houdebine 1994 et 1995).

La glande mammaire ne proc•de pas tou- jours de mani•re satisfaisante aux matura- tions post-traductionnelles des protŽines et ce dÕune mani•re peu prŽvisible. Ainsi, lÕα1-anti-

trypsine et lÕantithrombine III humaines syn- thŽtisŽes par la glande mammaire de la bre- bis et de la ch•vre ne sont pas compl•tement glycosylŽes. LÕantithrombine III nÕa en parti- culier pas tous les acides sialiques ˆ lÕextrŽ- mitŽ des cha”nes glycidiques latŽrales.

La protŽine-C nÕest que tr•s partiellement clivŽe par les enzymes de la cellule mammaire de truie pour former les sous-unitŽs qui com- posent la molŽcule fonctionnelle. Le transfert du g•ne de la furine placŽ sous la dŽpendance du promoteur du g•ne WAP de souris, permet la maturation compl•te de la protŽine (Drews et al 1995). La glande mammaire peut donc

•tre modifiŽe par transgen•se pour optimiser ses capacitŽs ˆ synthŽtiser des protŽines recombinantes fonctionnelles.

La superoxydedismutase humaine produite dans le lait de lapins transgŽniques est active, sous forme dimŽrique, normalement glycosy- lŽe et associŽe ˆ lÕion cuivre (Stršmqvist et al 1997).

La plupart des protŽines recombinantes produites ˆ ce jour sont destinŽes ˆ lÕhomme.

Elles sont de ce fait le plus souvent actives chez les animaux qui peuvent en p‰tir. Ainsi, le g•ne de lÕhormone de croissance humaine (Devinoy et al1994) associŽ au promoteur du g•ne de la WAP de lapin sÕexprime suffisam- ment en dehors de la glande mammaire pour perturber la croissance et la reproduction des animaux. De m•me, le g•ne de lÕŽrythropo•Ž- tine humaine dans les m•mes conditions alt•re gravement la santŽ des lapins (Mas- soud et al1996). Certaines protŽines ne peu- vent donc pas •tre produites par ce procŽdŽ.

Les protŽines produites dans le lait le sont ˆ un prix 50 fois infŽrieur ˆ celles produites dans des fermenteurs cellulaires classiques qui sont par ailleurs peu souples dans leur fonctionnement en comparaison des animaux.

La mŽthode para”t donc sÕ•tre imposŽe. Les cellules animales en culture et les plantes transgŽniques peuvent toutefois •tre plus intŽressantes dans certains cas.

LÕINRA est impliquŽ dans cette recherche non typiquement agronomique. La production de protŽines recombinantes ayant un intŽr•t vŽtŽrinaire nÕa encore ŽtŽ que peu tentŽe jus- quÕˆ maintenant. Cet Žtat de choses vient sans doute du manque de projets rŽellement pertinents mais aussi du fait que les protŽines doivent •tre produites ˆ un cožt tr•s bas pour avoir quelque chance dÕ•tre utilisŽes pour les animaux contrairement ˆ celles destinŽes ˆ lÕesp•ce humaine. On peut mentionner que des expŽriences visant ˆ produire lÕhormone de croissance bovine chez des vaches transgŽ- niques sont actuellement rŽalisŽes en Pologne avec une construction de g•ne obtenue ˆ lÕINRA de Jouy-en-Josas. La prŽparation dÕhormones gonadotropes animales est Žgale- ment envisagŽe. Ce savoir-faire acquis doit logiquement •tre transfŽrŽ ˆ des partenaires industriels. Il para”t raisonnable de penser que la mŽthode, m•me au moment de son plein dŽveloppement, ne concernera au mieux quÕune fraction assez nŽgligeable des animaux dÕŽlevage.

Actuellement plus de 50 protŽines Žtrang•res dÕintŽr•t pharmaceutique ont pu •tre produites dans le lait de diffŽrentes esp•ces.

2.3 / AmŽlioration gŽnŽtique par la transgen•se

La cartographie des gŽnomes constitue un apport dŽcisif ˆ plus dÕun titre. LÕutilisation des marqueurs gŽnŽtiques, essentiellement les microsatellites, est envisagŽe dans les schŽmas de sŽlection (voir lÕarticle de Boi- chard et al1998, dans ce numŽro). Les mar- queurs gŽnŽtiques donnent Žgalement la pos- sibilitŽ dÕaccŽder aux g•nes responsables des effets biologiques souhaitŽs. La pratique, maintenant bien Žtablie dans le domaine mŽdical, qui consiste ˆ rechercher systŽmati- quement des g•nes responsables de maladies hŽrŽditaires ou acquises ne peut toutefois laisser planer aucun doute sur la difficultŽ de lÕentreprise mais aussi sur la puissance de la mŽthode.

La connaissance prŽcise dÕun g•ne permet dÕen Žtudier les effets physiologiques. Dans le meilleur des cas, le g•ne peut sÕavŽrer avoir un r™le-clef dans le contr™le dÕune fonction biologique et son transfert dans les animaux pour en amŽliorer leurs performances agrono- miques peut alors •tre justifiŽ. La complŽ- mentaritŽ des techniques de la reproduction et de la sŽlection appara”t ici clairement.

LÕensemble des opŽrations montrŽes dans la figure 6 montre lÕinterpŽnŽtration idŽale de ces techniques. Ce schŽma est dŽjˆ une rŽalitŽ pour un certain nombre de plantes chez les- quelles la transgen•se ainsi que le clonage sont aisŽment rŽalisables. LÕamŽlioration rŽcente des techniques de clonage chez les animaux domestiques devrait rendre la trans- gen•se beaucoup plus exploitable.

Il ne fait pas de doute que la cartographie des gŽnomes va conduire ˆ lÕidentification puis ˆ lÕisolement de nouveaux g•nes dÕintŽr•t agronomique. Cette approche puissante ne va pas pour autant devenir la seule source de g•nes inconnus. LÕidentification et lÕisolement complets dÕun g•ne sur la base des informa- tions obtenues ˆ partir de marqueurs micro- satellites sont des opŽrations si lourdes quÕelles ne seront certainement pas justifiŽes dans bien des cas, contrairement ˆ ce que lÕon fait dans le domaine mŽdical. LÕŽtude clas- sique des fonctions biologiques doit logique- ment rester une dŽmarche essentielle pour lÕidentification de g•nes potentiellement intŽ- ressants pour des applications agronomiques.

Des expŽriences encore peu nombreuses mais concluantes ont montrŽ que de longs fragments dÕADN contenus dans des vecteurs de type P1, BAC (bacteria artificial chromo- some), YAC (yeast artificial chromosome) (qui contiennent de 100 ˆ 1 000 kilobases dÕADN) et MAC (mammalian artificial chromosome qui peuvent contenir des fragments de chro- mosomes de tr•s grande taille) peuvent •tre directement utilisŽs pour transfŽrer des g•nes aux animaux. Des souris et des lapins trans- gŽniques ont ainsi pu •tre obtenus. Le rende- ment des microinjections est toutefois en gŽnŽral plus faible lorsque des grands frag- ments dÕADN sont utilisŽs. La dŽmonstration quÕun fragment de gŽnome contenu dans un YAC contient un g•ne intŽressant ne suffira pas dans beaucoup de cas pour justifier lÕob- tention dÕanimaux transgŽniques ˆ partir de ce fragment. Le vecteur a en effet toutes les chances de contenir plusieurs g•nes dont cer- tains peuvent •tre indŽsirables. La simple supplŽmentation dÕun gŽnome animal par un g•ne ˆ lÕŽtat natif peut de plus sÕavŽrer nÕ•tre suivie dÕaucun effet particulier. LÕŽtude du g•ne lui-m•me et de ses effets biologiques prŽ- cis est le plus souvent indispensable et il serait tr•s imprudent dÕen faire lÕŽconomie.

En effet, beaucoup de g•nes ont plusieurs fonctions dans lÕorganisme et les fonctions bio- logiques sont contr™lŽes par une multitude de g•nes qui interf•rent de mani•re complexe.

Un g•ne peut par ailleurs nÕavoir dÕintŽr•t en tant que transg•ne que sÕil est surexprimŽ dans tel ou tel tissu ˆ tel ou tel moment de la vie de lÕanimal. LÕidentification et lÕisolement dÕun g•ne doivent donc le plus souvent •tre suivis dÕautres Žtapes qui sont rŽsumŽes dans la figure 7. Ensuite seulement, la transgen•se peut sÕavŽrer justifiŽe chez lÕanimal dÕintŽr•t agronomique.

Les interactions entre les g•nes sont trop complexes pour que les effets biologiques rŽsultant de lÕintroduction dÕun g•ne Žtranger dans un gŽnome puissent •tre totalement prŽ- visibles. Les actions dÕun transg•ne dŽpen- dent par ailleurs inŽvitablement du fond gŽnŽtique de lÕh™te. LÕinsertion dÕun fragment dÕADN Žtranger dans un site inconnu dÕun gŽnome peut perturber plus particuli•rement le fonctionnement dÕun g•ne qui se trouve dans ce site ou dans son voisinage. LÕobserva- tion des nombreuses souris transgŽniques Cartographie des génomes animaux

Marqueurs génétiques

Gènes

Animaux

nouveau-nés Sélection

génétique Transgenèse

- Résistance aux maladies - Amélioration quantitative et qualitative des produits animaux Embryons

Clonage des

embryons Elevage

Production d'embryons in vitro

- Production de protéines recombinantes

- Modification de la composition du lait - Obtention de modèles pour des études médicales et pharmacologiques - Production d'organes pour la xénogreffe

Etude des fonctions biologiques

Figure 6. L’utilisation coordonnée de la cartographie des génomes, des techniques de la reproduction et de la transgenèse.