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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Couez, D. G. (1985). Etude de la structure et du rôle du provirus dans la leucémogenèse par le virus de la leucémie bovine (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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Parmi de nombreux virus qui infectent les cellules animales, une famille particulière, celle des rétrovirus, est depuis des années au centre de l'activité de nombreux laboratoires.

C'est en effet en grande partie grâce à eux que l'on commence à comprendre un peu mieux la genèse de certains cancers et certains mécanismes de la différenciation cellulaire.

11 existe une autre raison de se pencher à nouveau sur les propriétés des rétrovirus : elles jettent un jour tout à fait nouveau sur l'origine d'une partie du patrimoine génétique des cellules ainsi que sur le flux d'information génétique dans les cellules d'organismes supérieurs.

Les rétrovirus sont entrés dans l'histoire scientifique vers 1908 avec la découverte, par ELLERMAN ET BANG, d'un agent

filtrable, responsable de la leucémie des poussins. Trois ans plus tard, P. ROUS montrait que le filtrat cellulaire de tumeurs de poulets pouvait induire un sarcome chez les poulets sains.

Devant l'incrédulité générale, il dut abandonner ses expériences.

Elles furent confirmées des dizaines d'années plus tard, lorsque la microscopie électronique permit de visualiser les particules virales.

Depuis ces premiers travaux, de nombreux autres virus impliqués dans diverses formes de cancer (leucémies, sarcomes, carcinomes) ont été mis en évidence dans différentes espèces animales

(rongeurs, oiseaux, félins, bovidés, primates et tout récemment 1 'homme).

Le nom des rétrovirus provient d'une caractéristique de leur

cycle végétatif : alors que l'information transite généralement

du DNA vers le RNA puis les protéines, le RNA des rétrovirus doit

être transcrit en DNA pour que l'infection ait lieu. Ce processus

inhabituel s’accomplit grâce à une DNA polymérase RNA dépendante

appelée transcriptase inverse, découverte dans le virus de sarcome

de ROUS en 1970 par D. BALTIMORE et PAR H.TEMIN.

Cette découverte est importante pour plusieurs raisons : tout d'abord, elle a mis un terme au concept selon lequel le transfert d'information génétique est unidirectionnel du DNA vers le RNA.

Elle a aussi permis l'essor des recherches en éclairant le mécanisme jusqu'alors obscur de la réplication des rétrovirus*

Elle a enfin fourni un instrument essentiel pour le développement des techniques du génie génétique. Une autre caractéristique de ces virus est l'intégration du provirus de façon colinéaire dans le DNA de la cellule hôte. Ils deviennent alors partie intégrante du génome de celle-ci et s'expriment en utilisant les systèmes

cellulaires de transcription et de traduction.

Dans la partie introductive de ce mémoire, nous essaierons de résumer les connaissances acquises sur les rétrovirus en général et sur le virus de la leucémie bovine (BLV) en particulier.

Un paragraphe sera également consacré aux virus T lymphotropes

humains (HTLVs) car ils sont apparentés à BLV.

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1. CLASSIFICATIOH DBS RETROVIRUS

Cette classification peut se faire suivant différents critères;

1.1. SUIVANT LEUR STRUCTURE MORPHOLOGIQUE

Les premières études des oncornavirus par microscopie

électronique montrent que les virions ont une structure à peu près sphérique de 100 nm de diamètre (SHARP ET AL, 1952; BERNHARD,1958).

Ils sont composés d'une coque interne renfermant un complexe ribonuclêoprotéique (RNP) et d'une enveloppe membranaire externe.

Ces études morphologiques ont permis de les classer en quatre grandes catégories, les particules de type A, B, C et D (TOOZE revu par WEIS et AL, 1982) en fonction de leur structure, de leurs propriétés biochimiques et des modalités de leur maturation

(tableau 1). Les particules de type C, les plus répandues dans la nature feront surtout l'objet de l'analyse qui suit.

1.2. _SUIVANT LEUR MODE DE TRANSMISSION (GROSS 1944-1970)

Deux types de transmission virale peuvent être observés, ce qui permet de classer les rêtrovirus en deux groupes, les

rétrovirus exogènes et les rêtrovirus endogènes :

“ la transmission verticale où les rêtrovirus endogènes sont transmis génétiquement d'une génération à l'autre par

l'intermédiaire des gamètes, sous la forme d'un DNA proviral

intégré dans toutes les cellules de l'individu.

L'expression de cette Information endogène est sous le contrôle de gènes cellulaires et est le plus souvent réprimée. Cependant, dans certaines conditions (effets d'hormones, de carcinogènes chimiques, de radiations, de l'âge, du stade de développement,••.) cette information peut être exprimée partiellement sous forme d'antigènes viraux ou complètement sous forme de particules virales.

Ce groupe ne sera pas envisagé dans ce mémoire.

“ la transmission horizontale où les rétrovirus exogènes sont transmis d'un animal à l'autre par contact. L'information génétique des virus exogènes ne fait pas partie du contenu génétique normal d'un individu. Elle est acquise après infection de cellules hôtes spécifiques et se retrouve intégrée dans le génome cellulaire sous forme provirale.

1.3. Ces rétrovirus exogènes peuvent être subdivisés en deux catégories SUIVANT LEUR PROPRIETE ONCOGENE :

A. les virus lents de B. les virus aigus de leucémies chroniques leucémies et

_______________________ sarcomes aigus________________________________________________________

Propriétés | Présence dans 1 la nature j

1

f rêquente

1 1 1 1

rare 1

Induction de | tumeurs in vivo 1 1

lente

1 1 1 1

rapide 1

Transformation |

in vitro |

1

-

I 1 1 1

+ I

Génome |

1

- oncogène

1 1 1

+ oncogène 1

Réplication | 1

compétente

1 1 1

dé f ective

Tumeurs monoclonales polyclonales

2. MORPHOLOGIE D*DNE PARTICULE VIRALE DE TYPE C

La structure d'une particule virale d'un rétrovirus de mammifère est représentée â la figure 1, suivant le modèle proposé par

BOLOGNESI en 1978. La seule différence d'une espèce virale à l'autre réside dans la taille des protéines.

La particule virale est composée de trois parties distinctes

- un complexe ribonucléoprotélque (RNP) formé par l'association du RNA viral, d'une phosphoprotéine de poids moléculaire

12000 et de la transcriptase inverse (20-70 molécules/virion).

- la capside constituée des autres protéines de structure p3 0, p15 et PIO.

” 1'enveloppe externe acquise au moment de la libération du virus par bourgeonnement à la membrane cellulaire.

Cette double membrane lipidique contient la protéine

d'enveloppe p15E tandis que la protéine majeure glycosylée, la gp70 constitue les protubérances émergeant â l'extérieur de la particule mature.

3. STRUCTURE ET ORGANISATION DU GENOME VIRAL

Le génome des rétrovirus est constitué d'une molécule de RNA dont la constante de sédimentation est 60-70 s (ROBINSON & AL, 1965).

Associés à ce génome, on trouve en plus dans la particule virale divers RNAs d'origine cellulaire : des RNAs ribosomiques 28S et 18S ainsi qu'une majorité de tRNA 4-5S dont un servira d'amorce à la transcriptase inverse lors de la réplication.

Après dénaturation, on découvre que ce RNA génomique de haut poids

moléculaire (8-10 x 10^ daltons) est formé de deux sous-unités

identiques (KONG ET AL, 1975; COFFIN ET AL, 1976), de constante de

sédimentation d'environ 30-35 S reliées entre elles par des ponts

hydrogènes du côté 5'. (Figure 2).

Parmi l'ensemble des virus animaux, les rétrovirus sont les seuls virus à avoir un génome diploide. Cet arrangement inhabituel a suscité de nombreuses hypothèses :

a) un rôle dans la réplication où certaines régions sont lues à deux reprises.

b) l'apparition de recombinaison par la formation de virions hétérozygotes (WYKE ET AL, 1975).

Un virus diploi'de qui peut s'adapter par recombinaison a un avantage sélectif sur les virus haploTdes.

c) le choix pour la polymérase de la sous-unité qui servira de modèle permettant ainsi la réparation de certains

dommages du RNA. En effet, à l'aide de deux sous-unités, la chance est plus grande d'obtenir la copie complète d'un génome malgré l'existence de lésions dans les molécules de RNA parental (COFFIN, 1979).

Les sous-unités 30-35 S possèdent toutes les caractéristiques d'un RNA messager de cellule eucaryote ;

- une structure communément dénommée "CAP" à leur extrémité 5' terminale. Le résidu terminal est méthylé à la position 2 du ribose et le 7 méthyl GTP est relié via un lien 5-5'

triphosphate donnant la structure

7 5 5 m G ppp Gm

(FURUICHI ET AL, 1975; ROSE ET AL, 1976)

- une séquence polyadénylique (Poly A) d'environ 200 nucléotides à leur extrémité 3' (GILLESPIE ET AL, 1972)

une dizaine de résidus adénosines méthylés du côté 3'

(FURUICHI ET AL, 1975)

La carte génétique de la molécule de RNA viral 35 S a pu être établie à partir du système aviaire (virus de leucémie et sarcome) grâce à une variété de techniques biochimiques et génétiques

telles que l'analyse d'oligonucléotides après traitement à la ribonucléase T1 et la visualisation au microscope électronique d'hétéroduplex entre les acides nucléiques de différentes souches de virus* De plus, de nombreux mutants, mutants par délétion ou mutants thermosensibles ont été Isolés et leur comparaison a permis de définer l'ordre des gènes viraux et leurs fonctions biologiques.

Ensuite, des techniques de plus en plus perfectionnées telles que le clonage moléculaire et le séquençage du DNA viral ont permis de déterminer les détails structuraux.

3.1. LES VIRUS LENTS (Prototype ALV, MLV)

De ces nombreuses études, il ressort que le génome d'un virus leucémogène lent est constitué de trois gènes de structure appelés gag, pol et env encadrés d'éléments régulateurs indispensables à la réplication et â l'intégration du virus. L'ordre dans le génome est le suivant :

5' CAP-R-Ug-PB(-)-L-gag-pol-env-PB( +)-U^-R-PolyA

^ : C'est une courte séquence de 17-21 nucléotides chez les virus aviaires, de 60-71 nucléotides chez les virus murins et de 230 nucléotides chez HTLV I, II et BLV, répétée aux deux extrémités du génome, (HASELTINE ET AL,

1977; STOLL ET AL, 1977). Elle est utilisée lors de la réplication pour permettre l'élongation de la fibre négative du DNA (voir cycle viral 4.2)

Un rôle complémentaire de cette région R est suggéré par les résultats de DARLIX ET AL (1979). Ils trouvent que la région du génome viral, protégée de la digestion

ribonucléasique par fixation aux ribosomes est un oligo­

nucléotide contenant une portion de la séquence R, tandis

que le site d'initiation de la traduction se trouve 300

nucléotides plus loin.

Ce résultat est compatible avec le modèle de KOZAK (1978, 1980) où les ribosomes reconnaissent et se lient seulement à l'extrémité 5' du mRNAs et initient la traduction au premier codon AVG. La protection de la séquence R par les ribosomes peut réfléter une affinité spécifique de cette séquence terminale ou simplement sa proximité de

l'extrémité 5' du génome.

IJ g : C'est une région de 80-100 nucléotides de séquence unique.

Elle semble jouer un rôle dans la terminaison de la synthèse du RNA viral (elle sera plus détaillée lors de l'étude du LTR du provirus).

PB (-) ; c'est le site d'attache de l'amorce tRNA pour la synthèse de la fibre négative du DNA. Il est

complémentaire aux 16-19 nucléotides du tRNA.

L'identification et la localisation de cette amorce tRNA varie d'une espèce virale à l'autre, (voir synthèse du DNA, section 4.2.1)

^ : C'est une séquence "Leader" de 250 à 300 nucléotides non traduite précédant la région cadante des protéines virales ( PALMITER ET AL, 1978). Les fonctions possibles de la région L sont les suivantes :

- un site donneur de "splice" pour les RNAs subgénomiques

- une participation dans la structure dimère du RNA 70s .

- un signal de reconnaissance pour l'empaquetage du RNA génomique dans les virions. Ceci a été

démontré grâce à l'étude d'un mutant aviaire

(LINIAL ET AL, 1978) contenant une petite délétion dans la région L (SHANK ET AL, 1980).

Il était incapable d'emballer son propre RNA.

- un signal de reconnaissance pour certains systèmes qui régulent l'epissage afin de maintenir une bonne balance entre la concentration du RNA génomique et des mRNAs et une région permettant la distinction entre ces espèces pour l'incorporation du RNA

génomique dans les virions.

GAG :C*est une région de 2 kb environ codant pour les protéines internes du virion possédant des sites antigéniques communs à tous les oncornavirus d'une même espèce.

La traduction de cette séquence résulte en une polyprotéine précurseur qui sera clivée ultérieurement pour générer les protéines matures (voir cycle du virus, section 4.5).

PPL ;C'est une région de 3kb environ codant pour la

transcriptase inverse. Cette enzyme possède une activité DNA polymérase RNA dépendante ainsi qu'une activité RNAse H

(MOELLING, 1974; LAI ET AL, 1978).

Cependant, les analyses nucléotidiques de génomes aviaires et murins ont montré que le potentiel codant du gêne "Pol"

est beaucoup plus large. Il a été suggéré que le surplus d'information pouvait servir à coder une endonucléase de 32 Kdaltons découverte dans les particules virales aviaires par GRANDGENETT ET AL, 1978 ou de 40 Kdaltons découverte dans

les particules murines par SHINNICK ET AL, 1981.

De plus, dans le système murin, le gêne "pol" semble coder pour une protéase de 13 Kdaltons. Cette protéine

découverte par YOSHINAKA ET AL (1977) présente de grandes homologies de taille et de séquence avec la protéase p15 du rétrovirus aviaire (SCHWATZ ET AL, 1983). Elle serait impliquée dans le clivage des protéines de structure du gène

"gag"•

La relation entre la structure génétique de la région "Pol"

et de ses différentes activités associées a pu être

exactement définie par l'étude d'un mutant de MuLV contenant une base supplémentaire dans la région codante pour la

transcriptase inverse (LEVIN ET AL, 1984).

Cette insertion introduit trois codons "stop" dans la phase de lecture du gène et donne une polymérase tronquée ayant une activité enzymatique beaucoup plus basse. La structure du gène Pol est présentée en figure 3.

Dans le génome des virus murins, le gène "pol" commence immédiatement après le codon stop TGA du gêne "gag" dans la même phase de lecture (SHINNICK ET AL, 1981).

Par contre, dans le génome des virus aviaires et félins, la séquence du gène "Pol" est localisée à une courte

distance des deux codons stop de la protéine interne p15 et est lu dans une phase différente de celle du gène gag

(SCHWARTZ ET AL, 1983; LAPREVOTTE ET AL, 1984).

La traduction de ce gène se fait de façon conjointe avec celle du gène "gag" donnant une protéine de fusion

précurseur (Pr gag-pol) de 180-200 kilodaltons qui est ensuite clivée pour donner les protéines. Les mécanismes particuliers de traduction de ce gêne seront repris en

détail dans la section 4.5.2.

ENV rc'est une région de 2 kb environ codant pour les protéines d'enveloppe du virus. Ce gène est transcrit sous forme de mRNA subgénomique épissé donnant un précurseur glycosylé qui sera ensuite clivé en deux protéines. La nature et les

fonctions de ces protéines seront analysées dans le chapitre suivant.

Les séquences nucléotidiques des virus aviaires, murins et félins ont permis de montrer que les gènes "pol" et "env" se chevauchaient et que leur lecture s'effectuait dans deux phases différentes : chevauchement de 113 nucléotides pour

les virus aviaires, 57 nucléotides pour les virus murins et 55 nucléotides pour les virus félins (SCHWARTZ ET AL, 1983;

SHINNICK ET AL, 1981).

L'analyse de variants portant des recombinalsons au niveau du gène env d'un virus aviaire a permis de diviser ce gène en trois régions selon le groupe sérologique auquel

appartient le virus (COFFIN ET AL, 1978) : une région

commune située du côté 5' (CL), une région codant pour les sites spécifiques de sous-groupe et pour laquelle on observe un maximum de divergence (S) et une région commune en

position 3' du gène (CR).

L'existence de ces régions a été déterminée par leur résistance différente à l'action de la RNase après hybridation avec des cDNAs provenant de sous-groupes différents. Les hétéroduplex suggèrent que ces régions auraient 0,6, 0,7 et 0,8 kb de Long chez les virus aviaires.

Chez les virus murins, les tailles seraient différentes ; 0,33, 0,9 et 0,87 kb (CHIEN ET AL,1978).

Il est vraisemblable que la région non homologue corresponde à la portion de la glycoprotéine concernée par la liaison avec le récepteur.

PB ( -H ) ;C'est le site d'initiation de la synthèse de la chaîne positive du DNA bien que l'amorce pour cette réaction ne soit pas connue. C'est une région riche en purines, hautement conservée parmi tous les retrovirus.

:C'est la région située entre PB(+)et R près de l'extrémité 3' du génome. Elle varie de 0,2 kb à 1 kb dans les

différents virus. Elle semble contenir le promoteur pour la transcription du génome et des structures "enhancer".

3.2. LES VIRUS AIGUS

3.2.1. Les virus aigu s_ _ non défectifs Prototype “ RSV

Le génome du virus de sarcome de ROUS contient en plus des trois gènes de structure gag, pol, env, un gène additionnel, appelé oncogène qui code pour une protéine de transformation.

s r c

La première étape importante dans la découverte des oncogènes eut lieu en 1970 lorsque Steven MARTIN identifia les mutations conditionnelles thermosensibles (Ts) qui affectaient la capacité des virus à transformer les cellules en culture.

Dans le cas du virus thermosensible du sarcome de ROUS, les cellules infectées se transformaient lorsqu'on les cultivait à une température permissive mais elles reprenaient leur état normal à température plus élevée.

La découverte de ces mutants impliquait qu'un gêne viral était nécessairement responsable de la transformation et qu'il devait s'exprimer continuellement pour assurer le maintien de l'état transformé. L'addition d'inhibiteurs de la synthèse protéique avant passage à la température permissive empêchait la

transformation cellulaire, ce qui suggéra que le facteur respon­

sable de cette transformation était une protéine instable, codée par ce gène viral muté (VOGT ET AL, 1977).

La comparaison des cartes d'oligonucléotides des RNAs de RSV sauvages et de mutants délétés (Td), défectifs pour la transformation (DUESBERG ET AL, 1970; WANG ET AL, 1975) et les analyses par microscopie électronique d'hétéroduplex entre le RNA du mutant et un cDNA représentatif du génome viral non

défectif (JUNGHANS ET AL, 1977) ont montré que le gène de trans­

formation SRC est localisé du côté 3' du génome viral.

Des expériences d'hybridation moléculaire avec une copie

radioactive de ce gêne SRC (cDNA src) ont révélé la présence d'un gène homologue dans le DNA cellulaire de tissus sains de plusieurs espèces aviaires (STEHELIN ET AL, 1976b).

Depuis, on a détecté des séquences apparentées aux gènes SRC chez la drosophile, les poissons, les mammifères et les humains, ce qui démontre la remarquable conservation de ces gènes au cours de l'évolution (SPECTOR ET AL, 1978). Cette stabilité est

vraisemblablement associée au fait que ce gène a une fonction importante dans la cellule normale. En effet, le produit de ce gène est présent dans les cellules normales en quelques exemplaires

(OPPERMANN H. ET AL, 1979).

La phylogénie de ces gènes suggère que les gènes viraux dérivent des gènes cellulaires appelés proto-oncogènes et non l'inverse. En effet, alors que les oncogènes viraux sont

généralement restreints à une souche de rétrovirus isolée à partir d'une espèce déterminée, les mêmes oncogènes cellulaires se

retrouvent dans un grand nombre d'espèces. L'homologie entre les oncogènes cellulaires et viraux est maximale pour l'espèce dont le virus est originaire (ROUSSEL ET AL, 1979).

De plus, l'analyse détaillée de la structure de ces gènes montre que les proto-oncogènes présentent une disposition en mosaique avec des exons à capacité codante séparés par des introns, séquences non codantes de longueurs très variables,

caractéristiques de gènes euraryotiques. Le nombre d'exons peut être également très différent ; on a décrit trois exons pour le gène myc mais dix exons pour les gènes c-abl ou c-fms et tous les intermédiaires sont possibles. Trois oncogènes n'ont pas d'intron et font exception à cette règle, ce sont les gènes c-mos (JONES ET

Kl H 2

AL, 1980), c ras (MC GRATH J.P., 1983 ), c ras (O'BRIEN ET

AL, 1983). Les oncogènes viraux ne représentent qu'une portion des gènes cellulaires homologues où les introns ont été supprimés.

Les gènes cellulaires ne sont donc pas directement recombinés

avec les gènes viraux. Ce sont les produits de rétrotranscription des RNA cellulaires qui contribuent à l'édification du provirus.

De là, dérive le RNA génomique viral.

Les virus de sarcome semblent acquérir leurs oncogènes par recombinaison entre un virus leucémogène et des proto-oncogènes cellulaires. Plusieurs faits expérimentaux concordent avec cette hypothèse :

1. Certains virus de sarcome ont été obtenus dans des

laboratoires, par passage de virus de leucémie dans des cellules de rongeurs (DUESBERG, 1979)

2. de longues délétions dans le gène SRC peuvent être

réparées par passage dans une cellule normale (HANFUSA

ET AL, 1977)

3 « 2.2. Les__virus aigus défectifs

Les virus aigus défectifs incluent les virus aigus de leucémie aviaire» le virus de sarcome de fujinami» le virus aviaire de

réticuloendothéliose, le virus murin d'abelson ainsi que les virus de sarcome murins et félins»

Le génome de ces virus contient une information génétique dérivée de la cellule remplaçant certains gênes viraux internes.

Au moins, une portion de l'information insérée code apparemment pour les protéines responsables de la transformation.

Le mécanisme de capture d'un oncogène cellulaire par un virus non transformant est représenté dans la figure 4 : le DNA proviral s'intégre du côté 5' d'un oncogène cellulaire dans la même orientation transcriptionnelle (B). Une délétion enlève

alors la partie 3' du DNA proviral et une partie du DNA cellulaire adjacent (C). La transcription de l'élément génétique fusionné peut commencer à partir du LTR restant et génère alors un transcrit primaire hybride de l'extrémité 5' du génome viral et des séquences c-onc (D) qui est ensuite polyadénylé et épissé (E).

Le RNA est ensuite empaqueté dans les particules virales (P) formant des dimères hétérozygotes avec du RNA viral sauvage.

Une recombinaison peut survenir durant la transcription inverse lorsque ces virions hétérozygotes entrent dans des cellules hôtes nouvelles (VARMUS, 1982).

La taille, le contenu génétique de la séquence insérée et la portion délétée du génome viral sont différents dans chacun des virus transformants défectifs (voir figure 5).

Ces virus délétés sont donc défectifs pour la réplication et ont besoin pour leur propagation d'un virus non défectif auxiliaire

("helper") qui apporte les informations complémentaires nécessaires.

L'analyse de ces virus a permis de mettre en évidence une vingtaine d'oncogènes et leurs homologues cellulaires qui ont ét' décrits dans différentes espèces de vertébrés.

Ils sont repris dans le tableau 2.

De nouveaux oncogènes ont été découverts tout récemment (communication personnelle de VAN DE HOUDE et DE VOGT).

ERIKSON ET AL (1984) ont également mis en évidence un oncogène appelé bcl-I qui pourrait être impliqué dans les leucémies et lymplomes de Burkitt des cellules B portant une translocation t (11; 14). Cet oncogène n'est homologue d'aucun des oncogènes rétroviraux connus.

Peut-être reste t'il d'autres oncogènes à découvrir?

Cependant, le nombre de ces gènes semble être limité puisqu'un même oncogène a pu être retrouvé dans des virus d'espèces

différentes, inséré à des positions variables du génome.

C'est le cas, par exemple, du gène abl isolé d'un virus murin et d'un virus félin. C'est le cas également du gène sis présent dans un virus de singe provoquant des sarcomes et dans le virus

sarcomatogène félin de la souche PI, ou du gène fps du virus

aviaire de Fujinami équivalent du gène f es présent dans différentes souches de virus sarcomatogènes. C'est le cas aussi de ras présent dans les virus sarcomatogènes de rats (souches Harvey et Kirsten) et trouvé récemment dans un virus de sarcome du chat (DE NARONHA et YOUNGREU).

4. CYCLE DE L'INFECTION VIRALE

L'infection d'une cellule par un rétrovirus n'inhibe pas les fonctions cellulaires normales et ne provoque pas la lyse de la cellule. La réplication de ces rétrovirus est un phénomène unique puisqu'il nécessite la transcription du RNA génomique en DNA

proviral puis son intégration dans le génome cellulaire. Ce cycle réplicatif comprend plusieurs étapes schématisés dans la figure 6.

4.1. ABSORPTION ET PENETRATION DU VIRUS

L'attachement du virion à la cellule est la première étape du cycle d'infection. La formation de particules virales non

infectieuses à partir de mutants délétés dans le gèn** "env"

démontre que les glycoprotéines d'enveloppe se

a la

surface du virion sont responsables de cette interaction virus-

cellule (DUESBERG ET AL, 1975).

De même, les mutants conditionnels thermosensibles affectés dans

"env" produisent des particules virales non infectieuses â tempéra­

ture restrictive (VOGT AND HU, 1977).

Ces glycoprotéines d’enveloppe interagissent spécifiquement avec des récepteurs cellulaires entraînant ainsi la fusion des membranes virales et cellulaires.

De tels récepteurs furent mis en évidence par la reconstruction in vitro de l'interaction de la glycoprotéine purifiée radioactive de MuLV avec des fibroblastes de souris (DELARCO ET AL, 1976).

Les sites de liaison saturés et comptés étaient de l'ordre de 5 ^

2x10 récepteurs par cellule. Leur présence à la surface cellulaire détermine la spécificité de l'hôte pour le virus.

Bien que la nature biochimique des récepteurs cellulaires ne soit pas connue, les techniques d'hybridation de cellules somatiques ont permis d’identifier et de localiser sur différents chromosomes de

l'hôte les gènes codant pour ces molécules (GAZDAR ET AL, 1974, OIE ET AL, 1978).

4.2. SYNTHESE DU DNA VIRAL

Le RNA viral libéré dans le cytoplasme de la cellule est transcrit en DNA viral par la transcriptase inverse. Les

mécanismes de synthèse de ce DNA ont été étudiés par différentes approches expérimentales :

- soit en utilisant la transcriptase inverse dans des systèmes reconstruits in vitro où tous les constituants ont été

définis au préalable (TAYLOR, 1977; WEINBERG, 1977)

- soit en suivant la synthèse de DNA dans les préparations de virions activés par des détergents (BALTIMORE ET AL, 1978)

- soit en caractérisant les produits de synthèse dans les cellules infectées en culture et en comparant les formes de DNA intermédiaires avec la structure bicaténaire finale.

Le modèle le plus probable de rétrotranscription a été

proposé par GILBOA ET AL (1979) (Figure 7).

Les différentes étapes sont les suivantes :

4.2.1. Synthèse de la fibre négative du DNA viral (Fig a- >d )

Cette synthèse démarre par attachement d'un tRNA à 100-150

nucléotides de l’extrémité 5* du génome viral (TAYLOR BT AL, 1975).

Ce tRNA est spécifique au rétrovirus :

- ainsi le tRNA trp est utilisé dans les virus de leucémies et sarcomes aviaires (HARADA ET AL, 1975)

- le tRNA pro est utilisé dans les virus de leucémie murine (MLV) (PETERS ET AL, 1977)

- le tRNA lys sert d’amorce dans le virus du carcinome mammaire (MMTV) (PETERS ET AL, 1980)

Comme l’allongement de la chaîne polynucléotidique se fait de 5' vers 3', la polymérase atteint rapidement l'extrémité 5' du génome. Le fragment ainsi formé est appelé '’strong-stop cDNA".

Il faut bien admettre que, pour obtenir une copie complète du RNA viral, la chaîne polydéoxyribonucléotidique en voie de synthèse doit sauter de l’extrémité 5* à l’extrémité 3’ de la même

sous-unité ou sur une sous-unité de RNA différente (JUNGHANS ET AL, 1977 ).

Ce modèle devient très vraisemblable depuis qu’on a établi l’existence d'une séquence de nucléotides identiques et de même orientation aux deux extrémités du génome (séquence R).

Cette redondance terminale du RNA viral d’abord démontrée chez le virus du sarcome de ROUS (HASELTINE ET AL, 1977) a été observée également chez les virus de leucémie aviaire (STOLL ET AL, 1977) et murins (COPFIN ET AL, 1978).

Après l'enlèvement de l'extrémité 5' du RNA par l’activité

RNAse H de la transcriptase inverse (COLLET ET AL, 1978), cette

séquence R permet un appariement du strong stop cDNA à la séquence

redondante située à l'extrémité 3' du RNA et permet ainsi à la

polymérase de continuer la transcription du génome viral.

Nous obtenons un hybride RNA-DNA dont le RNA est dégradé par l'activité RNAse H associée à la transcriptase inverse.

4.2.2. Synthèse de la fibre positive du DNA viral (Fig 7 c - -^g )

Le mécanisme d'initiation de la synthèse de la fibre positive du DNA est beaucoup moins bien connu. Celle-ci débute bien avant que l'élongation de la fibre négative ne soit terminée.

Bien que de multiples amorces peuvent être impliquées dans cette synthèse, les analyses des fibres + d'abord synthétisées in vivo et in vitro (appelées strong stop cDNA +) comprenant

et le site d'attache de l'amorce tRNA (PBS-) indiquent que l'origine d'initiation de cette fibre est localisée près de

l'extrémité 5' de la fibre- néosynthétisée entre le gène "env" et la région (KUNG ET AL, 1981; MITRA ET AL, 1979).

De plus, les études de séquences de cette région de différents rétrovirus ont révélé une grande homologie. Dans tous les cas

examinés, est flanqué par une série de purines : les DNAs de MMTV et de RSV ont une séquence identique de 10 bases (AG^AATG) considérée comme site d'amorce possible (CZERNILOFSKY ET AL, 1980;

MAJORS ET AL, 1980,1981) et les régions homologues du DNA de Mo-MLV et de MSV (AG.AATG) et du DNA de SNV (TG^AATG) sont très

similaires (DHAR ET AL, 1980; SHIMOTOHMO ET AL, 1980b).

L'extrémité 5' du strong stop cDNA + commence donc avec la séquence AATG.

Tout récemment, en utilisant un hybride DNA-RNA de 190 pb qui

contenait la séquence d'origine de la chaîne positive de MuLV,

PINSTON ET CHAMPOUX (1984) ont montré que l'activité RNAse H

associée à la transcriptase inverse est capable de générer une

amorce correct de RNA pour la synthèse de la fibre + par une

dégradation sélective du RNA modèle.

La génération de cette amorce se fait par hydrolyse endonu- cléotidique entre le résidu G et le résidu A, indiquée par la flèche dans la séquence de RNA

5• GGGGGG AAÜG...3' I

quand le RNA est hybridé au DNA au site d'initiation (PBS+).

ZI existe une autre situation dans laquelle l'activité RNAse H semble cliver une chaîne polynucléotidique portant une séquence similaire» OMER ET PARAS (1982) ont montré que l'activité RNAse H de la transcriptase inverse du virus de la myéloblastose aviaire

(AMV) peut enlever l'amorce tRNA de la chaîne négatif du strong stop cDNA par un simple clivage à la jonction entre les chaînes de RNA et de DNA.

Le fait que le DNA "strong stop +" possède des séquences PBS(-) homologues aux séquences PBS (-) du brin d'ADN {-) permet un

deuxième saut de l'ADN(+) du côté 3' à l'extrémité 5'.

L'ADN strong stop (+) sert alors de matrice à la terminaison du brin (-) et d'amorce à la synthèse du brin (+).

L'extension des 2 chaînes produit alors un DNA linéaire plus lourd que le RNA Initial avec de part et d'autre de la

molécule une longue séquence répétée appelée "long terminal repeat (LTR). (SWANSTROM R ET AL, 1981).

Ce LTR est constitué d'une séquence unique de l'extrémité 3' du RNA viral (U^), de la séquence redondante terminale (R) du génome et d'une autre séquence unique provenant de l'extrémité 5' du génome (U^) (voir figure 8).

4.2.3. Conversion du DNA bicaténaire linéaire en forme circulaire

Le DNA viral linéaire synthétisé dans le cytoplasme des

cellules infectées, migre vers le noyau (SHANK ET AL, 1978) et se

circularise.

{voir fig 8) Deux formes circulaires peuvent être observées ;

1) la plus petite ne possède qu'une seule copie du LTR et pourrait être formée par une recombinaison homologue entre les séquences redondantes terminales du DNA viral linéaire.

2} l'autre forme contient deux LTR et est sans doute formée par une simple ligation de ces extrémités.

Elle est le précurseur du provirus intégré (PANGANIBAN ET TEMIN, 1984).

4.3. INTEGRATION DU DNA VIRAL DANS LE GENOME CELLULAIRE

Bien que l'intégration du virus dans le génome cellulaire soit expérimentalement établie depuis plusieurs années (VARMUS ET AL,

1973? HILL ET AL, 1974), le mécanisme de ce phénomène est mal connu. Des études sur la structure du provirus et des séquences cellulaires adjacentes faites initialement par la méthode de transfert de Southern (HUGHES ET AL, 1978; STEFFEN ET WEINBERG,

1978? MARTIN ET AL, 1979; COHEN ET AL, 1979) et plus récemment par clonage moléculaire et séquençage du DNA (DHAR ET AL, 1980?

SHIMOTOHNO ET AL, 1980, MAJORS ET AL, 1981, HUGHES ET AL, 1981) ont permis de révéler certaines caractéristiques de ce mécanisme

d'intégration ;

4.3.1. Structure du provirus

Les provirus acquis par infection sont colinéaires avec le DNA linéaire non intégré et peuvent être dénotés

DNA cellulaire - U_-RU - gènes viraux - U_R-U_ - DNA cell

3 3 3 3

Cette structure ne peut être obtenue que si le provirus est lié au

DNA cellulaire dans une région très limitée du DNA viral

Certains provirus peuvent être délétés dans une grande partie de leur génome mais ils conservent dans la plupart des cas leurs LTRs (MARTIN ET AL, 1979; MAJORS ET AL, 1980, 1981).

Ces LTRs apparaissent être indispensables pour l'intégration.

La confirmation définitive de la structure du provirus a été apportée récemment par l'analyse nucléotidique des séquences redondantes terminales de plusieurs rétrovirus clonés. Ces résultats montrent que ;

- les tailles des LTRs peuvent être très diverses allant

de 325 pb pour RSV à 1300 pb pour le MMTV. Cette variation est due principalement aux différences de taille de qui peut avoir de 225 pb à 1200 pb.

Par contre, R contient de 16 à 79 pb sauf pour BLV et HTLV où R = 230 pb et contient de 78 à 120 pb (voir tableau 3).

- A chaque extrémité du LTR se trouve une séquence répétée inverse (IR) de 3 à 16 nucléotides (tabl.3) dont les deux premiers nucléotides sont toujours TG .... CA (JU ET AL,

1980; VAN BEVEREN ET AL, 1980; HUGHES ET AL, 1981).

Cette organisation structurale du DNA proviral est très semblable à celle d'éléments transposables de procaryotes et d'eucaryotes (TEMIN, 1980). Comme les provirus, les extrémités de Tn9 (bactérie), TY1 (levure) et copia (drosophile) forment des répétitions directes semblables aux LTRs. Aux extrémités de leur longue répétition directe, Tn9 et copia ont également des séquences inversées.

4.3.2. Site d'intégration dans le génome cellulaire

Les sites d'intégration ne présentent aucune homologie importante avec les extrémités du provirus (DHAR ET AL, 1980;

VAN BEVEREN ET AL, 1980; SHIMOTOHNO ET AL, 1980a; MAJORS ET AL,

1981). L'intégration ne s'effectue donc pas par recombinaison de

séquences homologues et elle peut se faire en de multiples enaroits

du génome cellulaire.

Au cours de l'intégration du provirus, une courte séquence

cellulaire de quatre à six paires de bases est dupliquée permettant d'obtenir une répétition directe de part et d'autre du virus

(SHIMOTOHNO ET AL, 1980a; HUGHES ET AL, 1981).

Cette duplication peut être générée par coupure du DNA de l'hôte au point d'insertion et réparation de la région monocaténaire résultante. Cette séquence dupliquée semble caractéristique de chaque virus et non de la cellule hôte suggérant que l'enzyme responsable du clivage du DNA chromosomal peut être codée par le virus lui-même. Ce genre de répétition est régulièrement observée lors de l'intégration des transposons dans un génome.

Ceci renforce encore l'hypothèse selon laquelle les rétrovirus utilisent le même mécanisme d'insertion que les transposons cellulaires. (SHAPIRO, 1979).

4.3.3. Jonction du DNA viral et du DNA cellulaire

Dans tous les cas étudiés, l'intégration du provirus dans le DNA cellulaire s'accompagne de la perte de deux bases situées aux extrémités du DNA linéaire (DHAR ET AL, 1980; MAJORS ET AL, 1981;

HUGHES ET AL, 1980). La présence de ces deux nucléotides viraux spécifiques à la jonction virus-hôte TG....CA implique que le mécanisme d'intégration agisse exactement à deux paires de bases des extrémités du DNA linéaire ou que l'endonucléase clive le DNA viral circulaire à un site spécifique.

4.4. TRANSCRIPTION DU PROVIRUS

Le provirus est transcrit par la RNA polymérase II cellulaire et le RNA viral est remanié par une variété d'enzymes cellulaires

(BISHOP ET AL, 1976; YAMAMOTO ET AL, 1980). Il est ensuite

transporté vers le cytoplasme où il s'associe soit avec les poly­

ribosomes pour servir de mRNA, soit avec les polyprotéines de structure pour servir de RNA génomique.

Cette transcription est initiée dans le LTR du côté 5' et se termine dans le LTR du côté 3' de l'ADN proviral.

Ces séquences redondantes terminales comportent tous les éléments régulateurs et activateurs de la synthèse du RNA viral.

C'est pourquoi, nous allons analyser leur structure en détail.

4.4.1. Structure du LTR

a) Les éléments régulateurs

Tous les LTRs séquencés sont organisés suivant le même schéma (figure 8). La comparaison de la séquence nucléotidique proche du site d'initiation (CAP 5') de plusieurs provirus révèle la présence dans de deux séquences communes particulières ;

- une séquence CCAAT appelée "CAT box" située à environ 75 paires de base en avant de la partie R.

- une séquence TATAAA appelée "Hogness box" ou TATA box" à environ 25-30 pb en avant de R. (JU ET AL, 1980; VAN BEVEREN ET AL, 1980; FUHRMAN ET AL, 1981; RUSHLOW ET AL, 1982).

Il semble que ces sites particuliers soient susceptibles de jouer un rôle dans l'initiation de la transcription en

positionnant la RNA polymérase II de la cellule hôte, ce qui

indiquerait que la synthèse du RNA démarre à l'extrémité 5' de R.

Cette prédiction est renforcée par plusieurs constatations;

1) L'analyse chimique des transcrits viraux de DNA cloné

de RSV synthétisés in vitro à partir d'extraits de cellules Hela (YAMAMOTO ET AL, 1980).

2) L'analyse chimique des transcrits de MLV extraits de noyaux de cellules infectées (BENZ et AL, 1980)

3) Des tests de transfection avec des recombinants contenant un LTR lié à un gêne étranger (OSKARSSON ET AL, 1980). Par exemple, l'attachement d'un LTR à un oncogène peut augmenter l'efficacité de la transformation dans certains cas, par un facteur de 3000 (BLAIR ET AL, 1980).

4) La description des séquences minimums nécessaires pour que la transcription virale commence.

Ainsi des expériences de CORDEN ET AL (1980) faites in vitro

montrent que la délétion des deux premiers nucléotides (TA)

de la séquence TATA diminue de 100 fois la transcription.

Par contre, la délétion des trois nucléotides situés derrière la séquence de Hogness n'a aucun effet.

La délétion totale de la "TATA box" empêche la transcrip­

tion de se produire. In vivo, une telle délétion n'inhibe pas la transcription mais altère la spécificité (GROSVELD ET AL, 1982). Une délétion de la "CAT box" diminue le rythme de transcription.

Une autre séquence spécifique "AATAAA" utilisée comme signal de polyadénylation se trouve également dans le LTR. Ce signal est

localisé approximativement 20 nucléotides avant le site de

polyadénylation (CA) dans les mRNAs eucaryotiques (PROUDFOOT ET AL, 1974) et est observé â une position très similaire dans le RNA

viral. Dans le DNA des virus de leucémie et sarcome aviaires, ce signal de polyadénylation est localisé juste à gauche des 20 nucléotides constituants R et est transcrit dans le RNA seulement à l'extrémité 3'. Par contre, dans le DNA des virus de leucémie et sarcome murins, R comporte 60 nucléotides. La séquence AATAAA est alors située dans R et est présente aux deux extrémités du RNA.

Un problème logistique semble alors se poser pour un tel virus : comment le système de polyadénylation peut-il distinguer les signaux du LTR 5' et du LTR 3'?

Un modèle fut alors proposé par BENZ ET AL (1980) dans lequel la formation d'un appariement stable en épingle à cheveux entre les régions U^ et R se ferait à l'extrémité 3' du RNA viral et pas à son extrémité 5'. Cette structure pourrait être un signal de reconnaissance nécessaire pour l'enzyme de polyadénylation.

b) Les séquences activatrices

Des séquences activatrices (ou "Enhancer") décrites tout

d'abord comme des éléments capables de moduler la transcription du gène de l'oursin existent également dans les gènes

d'immunoglobuline et dans un certain nombre de systèmes viraux tels que SV40, le virus du polyome, 1'adénovirus, la région U^ de

certains rétrovirus.

Ces séquences sont des éléments promoteurs eucaryotes qui augmentent l'efficacité transcriptionnelle, indépendamment de leur position et de leur orientation, et pouvant agir à des distances considérables de 10 kb) ce qui les distinguent des promoteurs classiques•

L'activateur prototype, la répétition en tandem de 72 pb de SV40 (Fig 9) a été initialement identifié comme un élément

essentiel agissant en cis, localisé plus de 100 nucléotides avant le site d'initiation des gènes viraux précoces (BENOIST ET AL, 1981; GRUSS ET AL, 1981). La délétion de cet élément réduit

l'expression précoce de l'antigène T d'un facteur 100 et abolit la viabilité virale.

L'activateur de SV40 ainsi que les séquences analogues isolés d'autres systèmes viraux sont également actifs quand on les associe à des gènes hétérologues (BANERJI ET AL, 1981). En effet, CAPECCHI

(1980) a montré qu'un fragment de DNA contenant l'origine de

réplication de SV40 associé au gène de la thymidine kinase du virus Herpès (HSV) augmente la transformation des cellules TK.

Ces séquences sont souvent retrouvées dans les différents virus sous forme de répétition en tandem de 50 à 100 paires de base

(LAININS ET AL, 1984).

Mais certains virus tels que les virus félins ne possèdent qu'une seule copie et ils restent malgré tout viables.

La signification de la duplication reste encore obscure.

Par contre, si on enlève les 20 nucléotides 5' terminaux de l'activateur, il devient non fonctionnel (WEIHER ET AL, 1983).

L'analyse nucléotidique des différentes séquences activatrices virales dévoile l'existence d'une séquence commune "GGTGTGGAAA"

appelée "core" située justement dans ces 20 premiers résidus de l'extrémité 5' (HEARING ET AL, 1983).

Ces séquences activatrices virales peuvent manifester une spécificité d'hôte et / ou de tissus (LAIMINS ET AL, 1982;

KRIEGLER ET AL, 1983)

Ainsi, le virus de polyome ne peut croître dans des cellules non différenciées de carcinome embryonnaire de souris tandis que des mutants de ce virus en sont capables» Les mutations sont

localisées dans le segment contenant l'activateur du polyome.

Pour comprendre le mécanisme par lequel cette spécificité se manifeste, SCHOLER ET GRUSS (1984) ont construit deux plasmides recombinants contenant le gène codant pour la chlororamphénicol- acétyl transférase (CAT), des éléments de contrôle

transcriptionnel identiques mais des séquences activatrices différentes : pSV^ CAT (Activateur de SV40 + CAT); pSrM^ CAT (Activateur de MSV + CAT). Ils ont titré la quantité de DNA de pSV CAT et de pSrM CAT nécessaire pour l'expression de

l'activité enzymatique CAT dans les cellules de singe (CV^) et des cellules de souris (CTV). Le DNA de pSV^-CAT a donné un plus

grand signal que le DNA de pSrM2 CAT dans les cellules CV^ et inversément.

Par des tests de compétition, ces expérimentateurs déduisent que les séquences activatrices interagissent plus efficacement avec des facteurs cellulaires de cellules homologues.

Différents modèles ont été proposés concernant le mode d'action des séquences activatrices ;

1) les activateurs produiraient un site d'entrée bidirectionnel pour la RNA polymérase II

2) les activateurs et leurs séquences flanquantes pourraient altérer la structure de la chromatine et/ou la superhélicité pour créer des régions de haute activité transcriptionnelle.

3) Les activateurs pourraient contenir des séquences agissant

comme des sites de liaison avec des facteurs cellulaires

qui augmenteraient la transcription.

c) Séquences codantes du LTR

En général, les LTRs des rétrovirus contiennent de multiples codons stop dans les trois phases de lecture et ne peuvent donc coder pour aucune protéine (TEMIN ET AL, 1981).

Une exception cependant, est observée pour le LTR du virus de la tumeur mammaire de la souris (MMTV). Ce LTR long de 1328

nucléotides (DONEHOVER ET AL, 1981) est particulièrement intéressant pour deux raisons :

- Il contient des séquences régulatrices reconnues par les récepteurs des corticoïdes. Elles permettent à la

transcription du MMTV d'être induite par les hormones glucocorticoïdes. C'est le cas lorsque le LTR du MMTV a été combiné soit au gène ras (HUANG ET AL, 1981), soit au gène de la réductase dihydrofdate (LEE ET AL, 1981), soit encore au gène de la thymidine kinase du virus d'herpès

(GRONER ET AL, 1982).

Pour définir la région exacte du LTR qui confère la

sensibilité â ces hormones, des séquences localisées du côté 5' du site d'initiation du RNA du gène chimérique LTR-TK ont été délétées. Chaque mutant délété a servi à transfecter des cellules de souris en culture et l'induction hormonale de la transcription a été testée (HYNES ET AL, 1983). De ces

résultats, il peut être conclu que les 202 nucléotides flanquant le site CAP doivent contenir la séquence qui contrôle l'induction hormonale de l'expression du MMTV.

Cette séquence semble être le site de liaison pour le

complexe hormone-récepteur après sa migration dans le noyau.

- Il contient une phase de lecture ouverte de 960 pb dans la la région U^ capable de coder pour une protéine de poids

moléculaire 36000. Cette protéine a été exprimée in vitro à partir de RNA viral et de cRNA transcrit d'un LTR cloné

(DICKSON ET AL, 1981; PETERS ET AL, 1982).

Elle a été dénommée orf (pour "open reading frame) mais n'a pu être détectée dans les cellules. Cependant, la

conservation de la séquence orf dans les LTRs testés aussi

bien endogènes qu'exogènes (PETERS ET AL, 1982) suggère que

cette protéine orf existe.

De plus, un mRNA pouvant coder pour la protéine orf a été détecté dans les cellules tumorales mammaires (WHEELER ET AL, 1983; VAN OOÏEN ET AL, 1983).

La taille du RNA est approximativement de 1,7 kb.

La fonction de la protéine orf reste hypothétique.

Elle pourrait avoir un rôle dans le cycle viral ou dans la tumorisation de la mamelle. Elle n'est pas impliquée dans la transcription du provirus contrôlée par les

glucocorticoïdes car des mutants délétés ayant perdu la phase de lecture ouverte du LTR restent encore capables de répondre à la dexamethasone (HYNES ET AL, 1983).

4.4.2. Structure et fonction des RNAs viraux intracellulaires

Les RNAs viraux ne représentent que 0,1 à 1 % des RNAs totaux de la cellule infectée et leur détection nécessite une méthode très sensible telle que l'hybridation moléculaire avec des sondes cDNAs marquées transcrites in vitro à partir du RNA viral.

L'analyse des RNAs viraux messagers dans les cellules de poulet infectées par RSV révèle trois types de RNAs messagers de polarité identiques à celles du génome viral (HAYWARD, 1977 ; WEISS ET AL,

1977) ! (voir fig 10)

• un mRNA 38S contenant les 4 gènes viraux gag, pol, env et src

- un mRNA 28S comprenant les gènes env et src

- un mRNA 21S contenant le gène src

Chacune de ces espèces est polyadénylée et possède le chapeau, les séquences et L ainsi que tout ou une partie de la région 3' du génome viral (MELLON ET AL, 1977; WEISS ET AL, 1977).

Des résultats semblables obtenus dans plusieurs autres systèmes

ont montré que les mRNAs de même taille que le génome viral et les

mRNAs subgénomiques sont détectés dans les cellules infectées par

différents rétrovirus.

Dans tous les cas, les mRNAs subgénomiques sont générés par clivage d'un mRNA de taille semblable au RNA génomique et épissage d'une séquence "leader" de 350-500 nucléotides (selon les systèmes) dérivée de l'extrémité 5' à des sites accepteurs précis, situés en amont du gène "env" (MELLON ET AL, 1977; ROTHENBERG ET AL, 1977).

4.5. TRADUCTION DU PROVIRUS

L'infection d'une cellule par les rétrovirus n'inhibe pas les synthèses protéiques cellulaires. C'est pourquoi la mise en

évidence des polypeptides viraux requiert le développement de techniques spécifiques de détection.

Les méthodes les plus utilisées sont ;

- l'emploi d'antisera spécifiques préparés contre des particules virales solubilisées, contre les différentes protéines virales purifiées ou contre les tumeurs induites dans 1'anima 1

- le marquage pendant différentes périodes de temps des protéines des cellules infectées en présence d'acides aminés radioactifs.

- la traduction des RNAs messagers viraux extraits de la cellule dans des systèmes de réticulocytes ou d'oocytes de Xénope.

4.5.1. Les produits de traduction du gène gag

Ils sont traduits du RNA messager de taille génomique (38S) en un précurseur de haut poids moléculaire (polyprotêine ) qui est ensuite clivée en protéines individuelles formant le virion.

Dans le système aviaire, le gène gag code pour une polyprotêine précurseur de 76000 daltons qui est ensuite clivée en cinq petits polypeptides constitutifs du nucléoide viral (SHAPIRO ET AL, 1976;

VOGT ET AL, 1975; SHEALY ET AL, 1980).