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Submitted on 3 Jun 2020
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Mise en évidence d’une activité caféoyltransférase chlorogénate-dépendante dans les racines de tomate
mycorhizées
Jonathan Negrel, Francine Javelle, Dominique Morandi
To cite this version:
Jonathan Negrel, Francine Javelle, Dominique Morandi. Mise en évidence d’une activité caféoyl- transférase chlorogénate-dépendante dans les racines de tomate mycorhizées. 3. Journées Franco- phones Mycorhizes, Sep 2012, Nancy, France. 2012, Mise en évidence d’une activité caféoyltransférase chlorogénate-dépendante dans les racines de tomate mycorhizées. �hal-02746665�
Mise en évidence d’une activité caféoyltransférase chlorogénate-dépendante dans les racines de tomate mycorhizées.
Jonathan Negrel*, Francine Javelle et Dominique Morandi * email: negrel@dijon.inra.fr UMR 1347 Agroécologie INRA, AgroSup, Université de Bourgogne
Pôle Interactions Plantes-Microorganismes ERL CNRS 6300 INRA 17 rue Sully BP 86510 21065 Dijon Cedex France
INTRODUCTION et RESUME
: Il a été rapporté récemment que la colonisation des racines de tomate par des
champignons mycorhizogènes à arbuscules provoquait une diminution significative des teneurs en acide chlorogénique (acide 5-O-caféoylquinique) de ces racines (Lo- pez-Raez et al. 2010). En essayant de vérifier ce résultat nous avons observé que lorsque des racines de tomate colonisées par Rhizophagus irregularis (précédem- ment connu sous le nom de Glomus intraradices) sont extraites par le méthanol pen- dant 48 h à 6°C, l’acide chlorogénique naturellement présent dans l’extrait est lente- ment transestérifié en methyl caféate, la réaction pouvant être suivie par HPLC. La réaction n’a lieu que lorsque les racines broyées sont laissées au contact de l’extrait hydro-alcoolique et lorsque la teneur en eau du mélange est de 15 à 35 %. Lorsque les racines sont extraites dans l’éthanol, l’acide chlorogénique est transformé en ethyl caféate dans les mêmes conditions. La réaction est aussi détectée dans les extraits de racines colonisées par Glomus mosseae. Elle peut aussi être détectée dans les extraits de racines des plantes « témoins », non colonisées, mais est de 10 à 25 fois plus faible. Par contre elle est indétectable dans les extraits des parties
aériennes, qui sont aussi riches en acide chlorogénique, et ceci que la plante soit inoculée ou pas avec le champignon.
Nos résultats montrent que la réaction de transestérification détectée dans les extraits racinaires est catalysée par une enzyme de la plante, dotée d’une activité caféoyltransférase chlorogénate-dépendante et qui conserve son activité dans les mélanges hydro-alcooliques. Cette activité caféoyltransférase est inhibée par le
PMSF. Les isomères 3- et 4-O-caféoylquinique sont également utilisés comme subs- trats mais sont moins actifs que le 5-O-caféoylquinique. L’activité est très fortement induite dans les racines de tomates mycorhizées cultivées en condition de forte défi- cience minérale. Etonnamment cette activité caféoyltransférase a aussi été détectée dans les racines mycorhizées de poireau, de sorgho et de Medicago truncatula.
La signification physiologique et biochimique de la présence de cette enzyme dans les racines est actuellement inconnue. Notre hypothèse est que l’activation du métabolisme de l’acide chlorogénique dans les racines de tomate mycorhizées pour- rait être liée à son utilisation comme précurseur d’autres composés phénoliques.
O O
OH
OH OH
HO O
HO
O
OH O
OH
OH
Acide Chlorogénique
HN
O
SERINE
COMPLEXE ACYL-ENZYME
nucléophile
HO O
OH
OH
Acide caféique
O O
OH
OH
Methyl caféate H2O MeOH
X
PMSFCONCLUSION
Bien que nous n’ayons pas détecté de diminution significative des teneurs en acide chlorogénique dans les racines de tomate mycorhizées, nos résultats confir- ment que la mycorhization provoque une activation de son métabolisme. Assez étonnamment, la transestérificaton de l’acide chlorogénique détectée au cours de l’extraction des composés phénoliques de racines de tomate mycorhizées est une réaction enzymatique catalysée par une enzyme de la plante qui reste active dans les mélanges hydro-alcooliques et qui présente une activité caféoyltransférase chlo- rogénate-dépendante lorqu’elle est placée en présence de forte concentrations
d’alcools. La signification biologique et biochimique de la présence de cette enzyme dans les racines est pour l’instant inconnue, mais on peut penser que l’activation du métabolisme de l’acide chlorogénique dans les racines de tomate mycorhizées est liée à son utilisation comme précurseur d’autres composés phénoliques. Il est pos- sible que cette enzyme corresponde à un gène de fonction inconnue dont l’activation a déjà été observée au cours des études consacrées à la symbiose mycorhizienne à arbuscules par des approches de transcriptomique ou de protéomique, ce qui devrait faciliter sa caractérisation et l’identification du ou des produits formés in vivo à partir de l’acide chlorogénique.
Matériel et méthodes.
Matériel végétal et fongique: La variété de tomate Marmande a été utilisée au cours de ce travail. Les plantes ont été cultivées sur sol d’Epoisses stérile additionné de 25% de zéolite et inoculées par G. intraradices (Agrauxine, Biorize SA) ou Glomus mosseae (BEG 12). Les plantes cultivées en chambre climatisée on été arrosées soit avec de l’eau osmosée, soit avec une solution nutritive de Long Ashton à teneur normale (P) ou réduite (P/10) en phosphate. La colonisation par le champignon a été estimée selon le protocole décrit par Morandi et al. 2005 Mycorrhiza,15, 283.
Identification du methyl et de l’ethyl caféate: Le methyl caféate formé au cours de la réaction de transetérification a été identifié par co-chromatographie (HPLC, TLC) et comparaison des spectres UV-visible et de masse (HR-ESIMS) du produit de syn- thèse. L’ethyl caféate a été identifié dans les même conditions.
Détection et quantification de la formation de methyl caféate lors de l’extraction de l’acide chlorogénique: La vitesse de transestérification de l’acide chlorogénique (Fig.
4 et 5) a été mesurée par HPLC après broyage des racines dans l’azote liquide et extraction des composés phénoliques endogènes en incubant les culots racinaires à 6°C pendant 48h en présence de d’acide chlorogénique (1 mM) dans le MeOH 70%.
Détection de l’activité caféoyltransférase dans les extraits enzymatiques: Après broyage à 4°C des racines dans un tampon 0.2 M Tris-HCl pH 7.5 contenant 1%
SDS, 10 mM ME, 1 mM EDTA et 20 g/L d’acide ascorbique l’extrait enzymatique cen- trifugé est précipité à l’acétone à – 20°C et remis en suspension dans un tampon KPi à pH 6. Cet extrait est ensuite utilisé pour mesurer l’activité en présence de MeOH 70% et d’acide chlorogénique 1 mM. La transestérification est alors suivie par HPLC à 6°C pendant 48h.
Remerciements Ce travail a bénéficié d’un financement du Conseil Régional de Bourgogne (PARI Agrale 8). Nous remercions également le Laboratoire Central d’Analyse du CNRS à Lyon pour les données de spectrométrie de masse.
Réferences
López-Ráez, J. A., Flors, V., García, J.M., Pozo, M.J., 2010. AM symbiosis alters phe- nolic acid content in tomato roots. Plant Signaling and Behavior 5, 1-3.
Fig. 1. Réaction de transestérification de l’acide chlorogénique détectée au cours de l’extraction dans le méthanol à 6°C des composés phénoliques des racines de tomate colonisées par Glomus intraradices. Une réaction analogue a lieu en présence d’éthanol.
O O
OH
OH OH
HO O
HO
O
OH O
OH
OH
MeOH
OH HO
O
HO
OH
OH
Acide quinique Methyl caféate Acide chlorogénique
Fig. 2. Analyse par HPLC des composés phénoliques des racines de tomate de plantes témoins (A et B) ou inoculées par G. intraradices depuis 1 mois (C à F).
1: Acide chlorogénique, 2: Methyl caféate, 3: Ethyl caféate A et C: analyse immédiate après extraction dans le méthanol
B et D: analyse après 48 h d’extraction dans le méthanol à 6°C E: analyse immédiate après extraction dans l’éthanol F: analyse après 48 h d’extraction dans l’éthanol à 6°C
1) L’acide chlorogénique est transestérifié au cours de l’extraction des composés phénoliques des racines de tomate mycorhizées (Fig. 1 et 2)
2) La vitesse de transestérification dépend à la fois de la mycorhization et de la nutrition minérale de la plante:
(Tableau 1 et Fig. 3 et 4)
3) La réaction de transestérification est aussi liée à la mycorhization chez d’autres espèces végétales:
(Fig. 5)
4) La réaction est catalysée par une enzyme de la tomate remarquablement stable, inhibée par le
PMSF et dont l’activité est fortement stimulée par la mycorhization (Tableau 2 et Fig.6)
Tableau 1. Paramètres de croissance et de colonisation des plants de tomate témoins (NM) et mycorhizés (Gi).
Solution nutritive
Eau LA P/10 LA
Parties aériennes NM 2.49 ± 0.47 11.3 ± 0.44 13.2 ± 0.87 (g de matériel frais) Gi 3.08 ± 0.27 13.2 ± 0.87 13.6 ± 0.64
Racines NM 1.93 ± 0.36 3.79 ± 0.36 4.47 ± 0.24
(g de matériel frais) Gi 1.68 ± 0.18 4.11 ± 0.15 3.44 ± 0.45 Colonisation par le champignon
L (%) Gi 30 ± 3.6 8.4 ± 2.8 2.2 ± 0.6
GI (%) Gi 10 ± 1.6 2.6 ± 1.1 0.49 ± 0.16
AI (%) Gi 85 ± 4.9 83 ± 11 59 ± 18
L = pourcentage de longueur racinaire colonisée par G. intraradices GI = intensité globale de la colonisation par G. intraradices
AI = pourcentage des cellules corticales contenant des arbuscules dans la partie colonisée de la racine.
Fig.3 Effets combinés de la nutrition minérale et de la mycorhization sur les teneurs en acide chlorogénique dans les parties aériennes et les racines de tomate. Les teneurs dans les plantes non mycorhizes (NM) et mycorhizées (Gi) ont été détermi- nées en HPLC 4 semaines après inoculation par G. intraradices.
A : parties aériennes B : racines
Fig.4 Effets combinés de la nutrition minérale et de la mycorhization sur la vitesse de transestérification de l’acide chlorogénique détectée dans les extraits méthanoliques de racines de tomate.
Fig. 5 Effet de la mycorhization sur la transestérification de l’acide chlorogénique dans les extraits méthanoliques de racines de différentes espèces végétales (poi- reau, sorgho, Medicago truncatula)
Tableau 2 Spécificité et inhibition de l’activité caféoyltransférase détectée dans les extraits enzymatiques de racines de tomate.
Substrat (1 mM) Activité relative
Gi NM Acide 5-O-caffeoylquinique 100 4 Acide 5-O-caffeoylquinique (enzyme dénaturée par la
chaleur) 0 0
Acide 5-O-caffeoylquinique (1 mM PMSF) 3 0
Acide 4-O-caffeoylquinique 30 1
Acide 3-O-caffeoylquinique 55 2
Ethyl caféate 1 0
Acide caféique 0 0
Fig.6
