Ségrégation et différenciation des cellules à l'origine des palpes maxillaires et des antennes de la tête adulte de drosophile

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Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier

Discipline ou spécialité : Biologie moléculaire, cellulaire et du développement

JURY

Ernesto Sanchèz-Herrero (Investigadore cientifico) Yacine Graba (DR2) François Agnès (MC) Magali Suzanne (CR) Laurence Dubois (CR) Cathy Soula (Pr) Corinne Benassayag (MC) David Cribbs(Pr)

Ecole doctorale : Biologie Santé

Unité de recherche : Centre de Biologie du Développement Directeur(s) de Thèse : Corinne Benassayag

David Cribbs

Présentée et soutenue par Gaëlle Lebreton

Le 16 juin 2008

Titre :

Ségrégation et différenciation des cellules à

l’origine des palpes maxillaires et des antennes de la

tête adulte de drosophile.

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l’ont vécu à mes côtés savent qu’elle n’aura pas été sans rebondissements. D’une certaine manière, je pense qu’il est impossible de découvrir ce monde mystérieux qu’est la recherche, de grandir scientifiquement, sans en sortir indemnes de toutes considérations sur le plan personnel. C’est un monde qui se nourrit d’idées, et qui ne survit que dans une remise en question quotidienne. Je crois y avoir trouvé une place, et même s’il est difficile de savoir ce qui nous y a conduit, il est sûr que ce chemin ne se fait pas seul, et que beaucoup de gens ont pleinement participé à cette expérience avec moi. Cette page est l’occasion de citer les personnes incontournables, qui ont rendu cette aventure si passionnante à vivre, qui sont pour moi des sources incroyables d’inspiration et de réflexion, qui m’ont accompagné et parfois guidé dans ce chemin au fil des années, qui m’ont donné l’envie et le courage d’avancer et la force de l’arpenter avec moins de difficultés.

Ayant mis en évidence l’importance de la chronologie des événements, il me semble évident de commencer par ma mère, qui m’a initié et aidé depuis bien plus longtemps que je ne m’en souvienne. Merci pour la confiance que tu m’as toujours accordée, merci de ne pas avoir cru ce prof qui t’a dit un jour « Madame, votre fille n’est pas une scientifique », merci d’avoir toujours laissé la place au doute, de m’avoir laissé faire mes propres choix, et d’être toujours là, et pleine d’amour, quand j’ai besoin de toi…On ne choisit pas sa famille, et j’estime avoir eu une chance inouïe d’être autant aimée et soutenue par les miens. Ma grand-mère est une femme incroyablement formidable, et c’est un plaisir sans fin que de ressentir les dures lois trans générationnelles quand on a pour référence quelqu’un que l’on admire profondément. Ma p’tite Nini, je ne te remercierais jamais assez, et j’aimerais que tu saches à quel point je t’aime.

Je n’en serais pas là non plus, sans cette fameuse après midi au lycée, carte de France en main, où nous avons choisi de continuer notre route sur Toulouse…merci Lolo, mon amie, d’avoir partagé cette drôle d’étape avec moi.

Merci aussi à toux ceux qui ont contribués à me faire découvrir et aimer la biologie, en particulier la biologie du développement, avec une pensée particulière pour Julian, Bernard et Christian, ainsi qu’à ceux qui m’ont ouvert les portes du laboratoire, et m’ont permis de faire cette rencontre inattendue avec une petite mouche dont j’étais loin d’imaginer la puissance et l’ampleur des préoccupations à son égard. Merci à Laurence, Mimi et Alain pour m’avoir initié, chacun à votre manière, aux joies des questions fondamentales. Ce premier pas à vos côtés m’a convaincu de l’intérêt et de l’énergie que l’on peut déployer en étant passionné. Merci à David et à Henri pour m’avoir accueilli dans leur équipe. Un petit mot à David, pour m’avoir laissé emprunter d’autres chemins que celui qui m’avait amené à vous rejoindre, je pense notamment à

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nos longues discussions sur la magie des gènes Hox…Merci pour m’avoir suivie, pour avoir appris à m’écouter et cherché à me comprendre, malgré ma fâcheuse tendance d’avoir à commencer des phrases sans les finir...

Ce monde ne serait pas si attrayant sans tous les gens qui l’animent quotidiennement, qui transmettent leur envie et leur dynamisme; au risque, une fois n’est pas coutume, de ne pas être exhaustive, je citerais notamment Daniel, Eric, les deux Bruno, François, Yannick, Phi-phi, Nathalie, Johanna...et les anciens étudiants Bertrand, Séb, Cathy et Laurent. J’en profite également pour remercier les membres de mon jury pour avoir accepté de partager cette fin d’aventure avec moi, E. Sanchèz-herrero, Y. Graba, F. Agnès, M.Suzanne, L. Dubois, et C. Soula, qui sont tous des personnes que j’estime scientifiquement, et personnellement lorsque j’ai eu l’occasion de le découvrir. Merci à celle qui poursuit dignement cette étude, Eleanor, certes tu es quelqu’un d’atypique mais aussi très attachante. Merci pour t’intéresser à ce si petit organe et aux questions qu’il a soulevé, merci pour les résultats que tu as produits et que j’ai discuté dans ce travail…cette rosace est vraiment trop jolie !!!

Certaines rencontres dans une vie sont inoubliables. Elles sont trop rares et trop riches pour passer inaperçues. Corinne, Muriel, Christian, vous avez vécu cette aventure avec moi du début à la fin, dans un quotidien sans relâche et c’est peu dire…Je vous remercie pour tout ce que vous m’avez apporté, à moi, et à cette histoire, qui l’une comme l’autre ne seraient pas ce qu’elles sont sans vous. Votre amour, votre soutien et vos conseils avisés m’ont énormément appris. Corinne, Co, Coco, autant de prénoms que de femmes que tu représentes pour moi…Tu es quelqu’un d’exceptionnel à mes yeux, ta présence, ton écoute, ton attention, ton humilité, tes mots si justes, ton esprit critique, ton amour des gens et des choses qui t’entourent, ton énergie, sont autant de raisons qui rendent les mots bien faibles pour te remercier de tout ce que tu as fait pour moi, de tout ce que tu m’as appris. Mumu, quelle joie de te connaître et d’avoir partagé tous ces petits moments et ces grandes réflexions avec toi. Tu es aussi belle que ta façon d’aimer la vie. Tu respires l’amour. J’aime cette fraîcheur et cette franchise qui te caractérisent, qui me semble être des aspects de la féminité trop souvent antinomiques …Christian, merci de m’avoir fait une grande place sur ton bureau, mais avant tout dans ton cœur, ton amour et ta tolérance me sont chers.

«Je ne sais pas où je vais, non ça je n’l’ai jamais bien su mais si vraiment je le savais, je crois bien que je n’irais plus…»

Dans les péripéties de ce parcours, il y a ceux qui sont toujours présents, de près ou de loin, qui sont devenus, après toutes ces années un équilibre indispensable à ma vie. Cyril, mon tendre ami, mon frère, aucun qualificatif n’exprimera clairement ce que tu es, as été et sera pour

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en conviendras…tu es mon ami et si tu n’es pas le meilleur, ça y ressemble beaucoup…J’aimerais être à la hauteur de nos convictions et partager encore longtemps nos discussions illuminées sur la vie, l’amour et leurs travers…Amandine, j’ai toujours du mal à considérer que je ne te connais pas depuis toujours, tu es de ces personnes, rares que l’on rencontre un jour et que l’on sait que l’on aimera toujours…j’aime à me dire qu’il nous reste des millions de choses à vivre ensemble et que l’on sera toujours disponibles l’une pour l’autre malgré nos vies parfois si farfelues… Elsa, ma belle, tu émanes tant de douceur et de tendresse que j’espère qu’au-delà de mes mots, c’est la vie qui se chargera de te remercier. Merci pour m’avoir écouté souvent longuement, et parfois même suivie dans mes nombreux délires. C’est tellement bon d’aimer les gens sans les juger. Mes amies j’apprend à vous connaître, vous qui êtes toutes si différentes, plus ou moins filles, et tellement jolies dans vos vies et riches pour ceux qui vous entourent, Laëtitia, Stéphanie, Claire la blonde, Claire la brune, Fanny, Mathilde, Yohanna, Magalie, merci pour tous ces moments de vie que l’on a partagé. Une spéciale dédicace à tous les potes qui ont un sens aïgu de la fête et des plaisirs partagés, aux choysiens Gaby, Ragga, Sergio, Jo, Fratou, à Claude, à Nico, Raffik, Filipé, Tosh, Eric. Un loooonnnng merci à mes amis de jeux, Johnjohn, Milie, Alex, Rami et reNico, qui sont toujours près de moi quand j’en ai besoin, il y a des amitiés qui marquent et qui construisent une vie.

A tous ceux de ma famille dont l’amour pour moi est une réelle source de courage et motivation, François, mes chères cousines dont je suis si fière, Manon, Sophie, ma p’tite chérie, Léa, mon grand-père, Dadi, Grégory…

A Laurent, qui aura bien du mal à saisir à quel point sa rencontre m’a redonné le goût de la vie…à tous ces moments chaudement délicieux passés en ta présence

« ne demande pas ton chemin tu risquerais de ne pas te perdre » heureusement que l’on se perd parfois sur des routes qui croisent celles des autres, il y a de ces routes que l’on aimerait croiser tous les jours.

A mon p’tit frère chéri adoré de mon cœur, nanou, que la vie te soit douce, pleine de ces rencontres et de ces aventures de chaque instant qui emplissent et embellissent nos vies. J’ai le plaisir de croire que ta vie sera à la hauteur de tes espérances, toi qui a une si forte conception du bonheur et une indulgence si grande à l’égard des autres.

Je t’aime d’un amour inconditionnel, qui ne tient compte ni du temps ni de l’espace Je suis si fière de toi

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Résumés

Résumé:

Une question fondamentale en biologie du développement est de comprendre comment les cellules s’engagent de manière coordonnée dans une voie de différenciation pour aboutir à la formation d’un organe d’une taille, d’une forme et d’une fonction spécifique. Notre laboratoire s’intéresse à la morphogenèse de la tête de la drosophile qui se forme dans sa quasi-totalité à partir des disques ima ginaux œil-antennes. Le disque d’antenne contient deux primordia, antenne et maxillaire (Mx) qui formeront les organes olfactifs de la drosophile adulte. Afin de comprendre comment ces deux groupes adjacents de cellules ségrégent et se différencient de manière distincte, nous avons engagé une étude visant à détailler les caractéristiques propres à la régionalisation et à l’identité de ce primordium.

Dès le second stade larvaire, ce territoire Mx est identifiable au sein du disque d’antenne par l’expression du gène Hox Dfd dont la limite d’expression définit une séparation clonale avec le territoire antenne. Le gène Dfd joue un rôle central dans l’organisation coordonnée de la différenciation Mx mais aussi dans l’adhésion cellulaire. Cette fonction cellulaire inattendue de Dfd participe à la formation de la frontière Ant/Mx ayant probablement des propriétés organisatrices du tissu Mx. Par ailleurs, nous avons montré que la régionalisation de ce primordium met en jeu une cascade génique relativement similaire à celle de l’antenne mais dont les différentes étapes sont chronologiquement distinctes. Dans ce tissu, les signaux de position Wg et Dpp sont activés de manière asynchrone, l’activation de Wg étant concomitante à l’entrée en pupaison. Cette activation décalée de Wg dans le temps est fondamentale à l’entrée des cellules dans un programme de différenciation Mx puisque l’activation prématurée de ce morphogène entraîne la mise en route d’un programme de différenciation antenne. Cette analyse montre que le timi ng d’activation de Wg pourrait discriminer deux identités tissulaires et révèle ainsi, un mode encore inexploré de spécification des cellules dont les mécanismes sous jacents restent désormais à découvrir. De plus, la dissection du programme génétique mena nt à la formation d’un appendice ventral méconnu a permis de mieux appréhender la diversité des appendices, et de mettre en évidence un rôle atypique des gènes sélecteurs Hox dans la formation de ce tissu.

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Abstract:

One essential question in developmental biology is how cells adopt a differentiation pathway to give an organ with a specific size, shape and function. Our laboratory study morphogenesis of the drosophila melanogaster adult head which derives essentially from the eye-antenna imaginal disc. The antennal portion of this disc contains the antennal and the maxillary primordia giving rise the two olfactory organs of the adult head. In order to understand how these two adjacent groups of cell segregate and differentiate in distinct but related organs, we described the genetic program involved in regionalisation and differentiation of the maxillary primordium compared to the antennal one.

In the second instar larvae, the Mx territory is detectable within the antennal disc by expression of the Hox ge ne Deformed (Dfd) which is concomitant with establishment of a clonal restriction between Mx and antennal fields. Dfd acts as a local organizer at the Ant-Mx boundary involved in Mx differentiation and shows functions in cells affinities.

The genetic program leading to maxillary regionalisation and identity is very similar to the antennal one, but is distinguished primarily by delayed prepupal expression of the ventral morphogen Wingless (Wg). We find that precociously expressing Wg in the larval maxillary field suffices to transform it toward antennal identity, whereas overexpressing Wg later in prepupae does not. These results thus indicate that temporal regulation of Wg is decisive to distinguishing maxillary and antennal organs. Our dissection of a novel program leading to a ventral appendage reveals that temporal regulation of signalling molecules may contribute to organ identity in as yet unexplored ways that help to create appendage diversity. Furthermore, our analysis revealed a new unexpected function of an Hox gene in cell affinities involved in organizing Mx tissue.

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ABBREVIATIONS

a1-5: segments antennaires A-P: antero-postérieur abd-A: abdominal-A Abd-B: Abdominal-B

AHR: Aryl Hydrocarbon Receptor Antp : Antennapedia

ANT-C: Complexe Antennapedia

ap : apterous

ar: arista

ara: araucan

Arm : ßcaténine/Armadillo ato : atonal

bab: bric à brac

BX-C: Complexe Bithorax

brk: brinker

CC: Capsule céphalique

caup: capaulican caps : capricious ci: cubitus interruptus

cl: griffe cos2 : costal2 ct : cut cx: coxa Cx : Cephalothorax D-V: Dorso-ventral dac: dachshund dan : distal antenna

danr : distal antenna related Dfd : Deformed

dl: delta

Dll : Distal-less

DP: disc proper

dpp : decapentaplegic

EGFR: Epidermal growth factor receptor en: engrailed

exd : extradenticle ey : eyeless

eya : eyes absent eyg : eyegone Fe: fémur fer: fernandez flp: flippase fng: fringe H: hinge- charnière hern: hernandez hh: hedgehog

Hox : gène homéotique

hth: homothorax

Iro-C: Complexe Iroquois

lab: labial

Mad: Mothers against dpp

MF: morphogenetic furrow mirr: mirror MP: membrane péripodiale msh: muscle-segment homeobox N: Notch Nt: Notum O-A: oeil-antenne omb: optomotor-blind otd: orthodenticle P-D: Proximo-Distal pb: proboscipedia Pc: Polycomb Pc-G : Groupe polycomb ptc: patched pnr: pannier put: punt pygo: pygopus rho: rhomboid rpr: reaper sal: spalt salr: spalt-related sax: saxophone

Scr: Sex combs reduced ser: serrate

sgg: shaggy/ zeste white 3 so: sine-occulis

ss: spineless-aristapedia Su[fu] : Suppressor of fused

t1-5:tarses d’une patte T1: identité prothoracique T2 : identité mésothoracique T3: identité métathoracique Ti: tibia trn: tartan tkv: thick vein toe : twin of eyegone toy : twin of eyeless

Tr: trochanter trx-G: Groupe Trithorax tsh: teashirt Ubx: Ultrabithorax vn: vein vg: vestigial W: wing- aile wg: wingless PREAMBULE... 2

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1. FORMATION DE LA TETE ADULTE A PARTIR DU DISQUE IMAGINAL ŒIL-ANTENNE: .... 6

1.A. ORIGINE EMBRYONNAIRE DU DISQUE ŒIL-ANTENNE:... 8

I-Caractérisation des segments de la tête de l’embryon:... 8

II-Origine embryonnaire des cellules de la tête de la drosophile adulte: ...12

III-Organisation du disque œil-antenne:...16

1.B.ETABLISSEMENT DE TERRITOIRES ET FORMATION DES PRIMORDIA AU SEIN DU DISQUE ŒIL-ANTENNE:...18

I-Acteurs moléculaires:...20

a) Gènes sélecteurs de l’œil et de l’antenne ...20

b) Voies de signalisations Dpp, Wg, N:...22

II) Formation des territoires œil / antenne:...22

III) Induction des primordia œil versus antenne:...24

a) Formation du primordium oeil: ...24

b) Formation du primordium antenne:...26

c) Rôle de la voie Decapentaplegic dans la formation des primordia œil et antenne:...26

IV- Induction des primordia œil versus capsule céphalique: ...30

a) Rôle de la voie Wingless dans l’induction du primordium œil versus capsule céphalique:...30

b) Répression du primordium de l’oeil: ...34

c) Rôle de la membrane péripodiale:...36

V- Rôle de la croissance:...40

a) Rôle de la voie Notch dans la prolifération du territoire oeil:...40

b) Rôle du couple Wg/Dpp dans la taille d’un territoire:...42

2. FORMATION DE FRONTIERES COMPARTIMENTALES: ...46

2.A. HISTORIQUE ET FONCTION: ...46

2.B. COMPARTIMENTATION A/P EMBRYONNAIRE DE L’AILE ET ROLE DU GENE SELECTEUR EN DANS LA FORMATION DE CETTE FRONTIERE: ...52

2.C. IDENTIFICATION DE MOLECULES D’ADHESION IMPLIQUEES DANS LA COMPARTIMENTATION D/V DU DISQUE D’AILE: ...58

2.D. EXEMPLE DE SEGREGATION NON CLONALE: FRONTIERE AILE (WING W)/NOTUM (NT):...62

2.E. COMPARTIMENTATION D/V PRECOCE DU DISQUE ŒIL-ANTENNE: ...68

2.F. COMPARTIMENTATION A/P TARDIVE DU PRIMORDIUM ANTENNE: ...76

2.G. CONCLUSION: ...82

3. LE DEVELOPPEMENT D’UNE ANTENNE: ...84

3.A. MISE EN PLACE DES AXES DU «DISQUE» D’ANTENNE...84

I) L’axe Antéro-Postérieur:...84

II) L’axe Dorso-Ventral:...86

III) L’axe proximo -distal:...88

a) Distal-less (Dll):...90

b) dachshund (dac)...92

c) homothorax (hth): ...94

3.B. ACQUISITION DE L’IDENTITE ANTENNE...98

I- Specification des domaines P/D du «disque» d’antenne versus le disque de patte...100

II- La coexpression Hth-Dll:...106

III- Cible antenne/patte communes de Hth/Dll: bric à brac (bab)...110

IV- Cibles antenne-spécifiques de Hth/Dll: ...112

a) spineless-aristapedia (ss): ... 112

b) distal antenna (dan) and distal antenna related (danr) :... 120

c) cut (ct):... 126

d) Les gènes spalt (sal)/ spalt-related (salr) et atonal (ato):... 128

IV- Le gène Hox Antennapedia (Antp):...130

3.C. CONCLUSION :...134

4. LE DEVELOPPEMENT DES PALPES MAXILLAIRES: ...138

4.A. MAXILLAIRES/ANTENNES: STRUCTURES HOMOLOGU ES?...138

4.B. LES GENES HOMEOTIQUES (HOX) ...140

I- Historique et fonction :...142

II- Régulation de l’expression...144

III- Gènes cibles: ...146

IV- Organisation d’un tissu par les gènes Hox...148

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5. PROBLEMATIQUE ...154

6. RESULTATS ...154

6.A. PUBLICATION: ...154

6.B. FONCTION DES GENES SELECTEURS PB, SS,DFD DANS LA DIFFERENCIATION DES MX:...194

I- Expression spatio-temporelle des gènes sélecteurs Mx : ...194

II- Phénotypes mutants des gènes sélecteurs Mx : ...198

III- Analyse moléculaire et cellulaire de la perte de fonction des gènes sélecteurs Mx :...200

a) Analyse des régulations croisées entre gènes sélecteurs : ... 200

b) Analyse du rôle des gènes sélecteurs dans la régionalisation : ... 202

6.C. SEGREGATION DES TERRITOIRES ET PARTAGE DES SIGNAUX AU SEIN DU DISQUE D’ANTENNE: ...208

I- Ségrégation des territoires Antenne et Mx:...208

a) Expression exclusive de Dfd et Cut et mise en place d’une frontière de restriction clonale ... 208

b) Rôle de Dfd dans l’adhésion cellulaire et la formation de la frontière:... 212

c) Fonction organisatrice de Dfd:... 214

d) Rôle de Dfd dans l’épithélium péripodial: ... 216

II- Communication entre les territoires Antenne et Mx:...218

a) Partage d’une source commune d’Hedgehog:... 218

b) Régulation temporelle de Wg dans le territoire Mx vs Ant:... 222

c) Origine des cellules engrailed+ du territoire Mx ... 224

7. DISCUSSION-PERSPECTIVES ...226

7.A. MISE EN EVIDENCE D’UN DECALAGE TEMPOREL DE WG IMPLIQUE DANS LA DISTINCTION ENTRE MX/ANT ...226

I- Paramètres régulant le décalage temporel de Wg...226

II-Lien entre décalage temporel de Wg et identité Mx:...232

III- Rôle de Wg dans l’identité: ...232

7.B. ETABLISSEMENT DE FRONTIERES DANS LE DISQUE ŒIL-ANTENNE:...236

I-Restriction clonale et séparation des territoires: ...236

II- Antagonisme de facteurs de transcription et séparation des territoires:...238

7.C. ROLE DE DFD DA NS LA FORMATION D’UNE FRONTIERE ANT/MX:...240

I- Dfd dans l’adhésion cellulaire :...240

II- Dfd dans l’organisation du territoire Mx :...244

7.D. RELATION ANTENNE-MAXILLAIRE: ...244

I- Influence de la régionalisation Ant sur la différenciation du Mx...244

II- Fonction de l’épithélium péripodial dans la formation du Mx: rôle de Dfd...248

7.E. GENES SELECTEURS ET IDENTITE MX:...250

8. COMPLEMENT BIBLIOGRAPHIQUE ...256

8.A. LA VOIE HEDGEHOG: ...256

8.B. LA VOIE DE SIGNALISATION WINGLESS: ...258

8.C. LA VOIE DE SIGNALISATION DECAPENTAPLEGIC:...260

9. MATERIEL ET METHODES :...264 9.A. STOCKS: ...264 9.B. IMMUNOLOCALISATION:...264 9.C. ANIMATIONS ET RECONSTITUTIONS 3D: ...266 10. ANNEXES...268 11. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES...279

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Sommaire des figures Figures introduction

Fig.27: Domaines d’expression suivant l’axe P/D de l’antenne:………...119

Fig.28: Régulations géniques suivant l’axe P/D de l’antenne:………..119

Fig.25:Combinatoire Hth/Dll:………...107

Fig.23: Homologies entre les segments de l’antenne et de la patte:……….99

Fig.24: Relations géniques et patrons d’expression des acteurs de l’axe P/D:………...99

Fig.20: Mise en place des axes au sein du primordium antenne: ……….…85

Fig.21: Antagonisme entre Wg et Dpp: ……….…..85

Fig.18: Compartimentation A/P et D/V du disque œil-antenne:………..…71

Fig.19: Résumé des signaux qui permettent aux cellules des clones Iro-C- de générer les dérivés ventraux du disque O-A:………...71

Fig.17: Compartimentation D/V du disque œil versus disque d’aile: ………...69

Fig.16: Ségrégation non lignage dépendante: frontière aile/notum:……….…..65

Fig.15: Ségrégation des territoires du disque d’aile selon l’axe P/D:………....61

Fig.14: Compartimentation D/V du disque d’aile. ………..…57

Fig.13: Signalisation Hedgehog active dans le compartiment A et inactive dans le compartiment P (A) et formation d’une frontière clonale invisible dans l’aile adulte (B):…...55

Fig.12: Couplage des mécanismes de lignage/ ségrégation par le gène sélecteur en et le morphogène Hh dans la compartimentation A/P du disque d’aile:………...53

Fig.11: Mise en place en place d’un centre organisateur:………...……49

Fig.10: Mise en évidence des frontières clonales par la restriction du lignage cellulaire:………..47

Fig.9: Modèle du rôle du couple Wg/Dpp dans la croissance et la spécification du disque O-A:…….43

Fig.8: Induction du primordium de la capsule céphalique dorsale: le vertex………...31

Fig.7: Ségrégation des primordia œil et capsule céphalique (CC):………..….29

Fig.6: Ségrégation des territoires et des primordia œil et antenne:………...21

Fig.5: Représentation schématique des primordia au sein des territoires œil et antennes: ………….17

Fig.4: Origine embryonnaire des cellules de la tête adulte:………....11

Fig.3: Origine embryonnaire du disque œil-antenne:……….7

Fig 2: Formation des territoires et des primordia au sein du disque oeil-antenne: ………..5

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Figures résultats-discussion

Fig. 29: Sauvetage du phénotype mutant ss- Ant>>Pattes par le gain de fonction dan:…………..121

Fig. 57 : Expression du gène Hox labial………...253

Fig. 56 : Implication de En/Hh dans la frontière Ant/Mx………..243

Fig. 55 : Expression spatio-temporelle des gènes Iro-C………....239

Fig. 54 : Transformation Mx >>Ant et formation d’une frontière Cut-Dfd: ..……….…233

Fig. 53 : Schéma récapitulatif de la cascade de différenciation Mx versus Ant ..……….231

Fig. 52 : Influence du signal Dpp sur l’expression de Dll et Ss……….227

Fig. 50 : Régulation spécifique de Wg dans le primordium Ant vs ………..223

Fig. 51 : Réactivation d’en dans les cellules antérieures Mx………...…...223

Fig. 48: Source partagée d’Hh et spécificité de réponse………..……….219

Fig. 49: Source du signal Hh et activation de Wg………..….219

Fig. 47: Rôle de Dfd dans l’épithélium péripodial………..………..…...217

Fig. 46 : Dfd et la formation d’une frontière organisatrice………..215

Fig 45: Dfd dans l’adhésion cellulaire et la formation d’une frontière clonale ………..….213

Fig. 44: Antagonisme Cut- Dfd: (2) analyse en gain de fonction………...…...211

Fig. 43: Antagonisme Cut- Dfd: (1) analyse en perte de fonction……….…...209

Fig. 41: Exclusion Cut-Dfd et définition des territoires Ant et Mx………..207

Fig. 42: Restriction clonale entre les territoires Ant et Mx ………... 207

Fig. 40 : Dfd dans la mise en place des axes Mx………...….205

Fig. 39: Analyse clonale du rôle de pb, ss et leur combinatoire dans la mise en place des axes...203

Fig. 37 : pb, ss dans la mise en place des axes A/P, P/D……….……….201

Fig. 38 : pb, ss dans la mise en place des axes D/V………..……….201

Fig. 35 : Phénotypes mutants pb, ss, Dfd ………...……….197

Fig. 36: Interactions entre les gènes sélecteurs Mx ………..……….199

Fig. 34 : Profil d’expression relatif des gènes sélecteurs Mx……….195

Fig.33 : Activation spatio-temporelle des gènes sélecteurs Mx………195

Fig.32 : Activation spatio-temporelle de ss Mx vs Ant………193

Fig. 31: Différents patrons d’expressions embryonnaires, larvaires et adultes des gènes Hox chez la Drosophile:……….141

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Préambule

1 Fig1: Origine larvaire des appendices de la drosophile adulte: les disques imaginaux

(a) Schématisation de la position des disques imaginaux dans une larve de troisième stade. Les photographies représentent respectivement un disque imaginal d’aile, d’haltère et d’une patte. (b) Schématisation du corps d’une Drosophile adulte où les divers appendices sont représentés avec un code couleur correspondant aux divers disques imaginaux dont ils dérivent. (D’après Morata G., 2001)

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Préambule

Le développement de la drosophile adulte est un processus complexe qui nécessite de nombreux mécanismes développementaux au cours desquels les cellules vont progressivement se déterminer puis se différencier de manière coordonnée pour aboutir à la morphogenèse correcte des différents tissus et organes et notamment des appendices. Les appendices de la drosophile correspondent aux structures morphologiques externes de la mouche adulte ayant des fonctions aussi diverses que la locomotion, la vision, l’olfaction, la reproduction…(Fig.1B).

L’œuf fertilisé forme une masse compacte d’environ 250 noyaux sans membrane cellulaire, regroupés au centre de l’œuf. Ces noyaux migrent ensuite à la surface de l’œuf où les premières membranes commencent à se former. Les cellules se divisent jusqu’à former une simple couche de cellules (environ 4000 cellules) entourant l’œuf, stade appelé le blastoderme. Ce blastoderme subit de complexes mouvements morphogénétiques générant plusieurs couches de cellules qui vont ensuite se segmenter. Après 24h l’œuf éclot et l’animal traverse trois stades larvaires, chacun séparé par une mue. Après ces stades larvaires, en tout 96 heures plus tard, l’animal entre en pupaison stade durant lequel il se métamorphose en une mouche adulte. L’épiderme de cet adulte se forme à partir de groupes de cellules ectodermiques spécialisées de la larve qui ne participent pas au développement larvaire. Ces groupes de cellules constituent les histoblastes et les disques imaginaux. Une paire d’histoblastes compose chaque segment abdominal et forme l’épiderme du segment correspondant chez l’adulte. L’épiderme du thorax et de la tête se forme à partir de 19 disques imaginaux (9 paires et un unique disque génital), qui portent le nom de l’appendice qui en résulte et se répartissent au niveau de la tête (disques labiaux, clypeolabraux, œil-antennes), des segments thoraciques (disques de pattes, d’ailes et d’haltère) et de la queue (disque génital) (Fig.1). Les appendices de la drosophile adulte peuvent être séparés en deux types : (i) les appendices ventraux qui regroupent les pièces buccales, les antennes, les pattes et les génitalias, (ii) les appendices dorsaux, regroupant les ailes et les haltères. Ces structures se développent donc à partir de disques imaginaux, composés de cellules spécifiées au cours de l’embryogenèse, qui acquièrent une identité au cours des stades larvaires et se métamorphosent lors du stade pupaire pour acquérir leurs formes et leurs fonctions spécifiques chez l’adulte (Morata, 2001).

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Préambule

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Notre laboratoire s’intéresse aux processus de différenciation et de morphogenèse de la tête de la drosophile qui dérive essentiellement du disque imaginal œil-antenne. La partie antenne du disque formera deux appendices adultes: les antennes et les palpes maxillaires (Mx) qui constituent les organes de l’olfaction de la mouche adulte. La formation de l’antenne met en jeu, dés les premiers stades larvaires, un mécanisme de régionalisation qui est désormais bien caractérisé. A l’inverse, le premier signe morphologique de différenciation des Mx au sein du disque d’antenne apparaît tardivement, au stade pré-pupal et son développement a été beaucoup moins étudié. Le but de ce travail est de comprendre (i) comment les cellules ségrégent du disque d’antenne et s’engagent dans une différenciation Mx. Quand et comment s’établit la séparation entre ces deux tissus? (ii) les réseaux géniques mis en jeu dans la différenciation du primordium Mx versus celui de l’antenne, à l’origine des caractéristiques propres à chacun de ces deux organes olfactifs.

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Introduction : Formation de la tête adulte à partir du disque œil-antenne Chapitre 1

5 Fig 2: Formation des territoires et des primordia au sein du disque oeil-antenne:

Chaque territoire regroupe différents primordia qui forment la quasi totalité de la tête de l’adulte

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1. Formation de la tête adulte à partir du disque

imaginal œil-antenne:

La majeure partie de la tête de la drosophile adulte dérive des disques imaginaux œil-antennes (pour revue, (Bryant, 1978)) (Fig.2). En effet, ce disque va donner naissance à quatre organes sensoriels (œil, ocelles, antenne, palpe maxillaire), ainsi qu’à la plus grande partie de la capsule céphalique (Haynie and Bryant, 1986). Dans la formation de la tête, deux autres paires de disques, les disques labiaux et les bourgeons clypeolabraux contribuent à la formation des pièces buccales, le proboscis. La formation du proboscis implique donc les trois paires de disques céphaliques, les disques labiaux formant le mediproboscis et le distiproboscis, les bourgeons clypeolabraux formant le basiproboscis (incluant le clypeus, le cibarium et le labrum), et les disques œil-antenne formant la membrane rostrale (Jurgens and Hartenstein, 1993).

Les disques labiaux et les bourgeons clypeolabraux sont de petites unités cellulaires identifiables respectivement, dés la fin de l’embryogenèse au dessous des organes sensoriels labiaux de la larve, ou seulement au troisième stade larvaire sous le squelette céphalopharyngeal de la larve (Jurgens and Hartenstein, 1993).

Dans une larve nouvellement éclose, le disque œil-antenne se situe à l’extrémité postérieure de la poche dorsale (dorsal pouch) et se compose d’environ 70 cellules. Ce disque croît mitotiquement tout au cours de la vie larvaire jusqu’environ 18h après le début de la pupaison (Postlethwait 1978). A la fin de la vie larvaire ce disque composite peut être subdivisé en deux grandes parties (Fig.2):

-une partie postérieure qui donnera l’œil, les ocelles et une partie de la capsule céphalique (notamment le vertex),

-une partie antérieure, composée des primordia de l’antenne et du palpe maxillaire, qui constituent les deux organes olfactifs de l’adulte, ainsi que le reste de la capsule céphalique (notamment la membrane rostrale).

Ces deux parties sont souvent considérées comme des unités autonomes et indépendantes l’une de l’autre au troisième stade larvaire, si bien que la partie antenne du disque est qualifiée de disque d’antenne à proprement parler, la partie œil formant le disque d’œil.

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7 Fig.3: Origine embryonnaire du disque œil-antenne

Les cellules du disque œil antenne (ead) seraient issues des segments labiaux (lb), maxillaires (mx), mandibulaires (md), antennaires (an), labraux (lr) et de l’acron (ac). Les deux autres disques qui participent à la formation de la tête, les disques labiaux (lbd) et clypéolabraux (cld) proviennent respectivement des segments labiaux et labraux. Des critères anatomiques permettent de suivre les mouvements au cours du processus d’invagination de la tête de l’embryon: le pharinx (ph), le tentorium (tnt), et le dorsal pouch (dp).

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1.A. Origine embryonnaire du disque œil-antenne:

La partie la plus antérieure du blastoderme forme la tête de l’embryon qui représente 40% de ce blastoderme. Par la suite, de nombreux mouvements morphogénétiques, communément regroupés sous le nom d’involution de la tête, réorganisent cette région de tête de telle sorte que la larve semble, en apparence, dépourvue de tête. La complexité de ces mouvements a rendu l’identification des divers primordia qui composent le disque œil-antenne beaucoup plus difficile que celle des primordia des disques thoraciques. De plus, cette région de tête de l’embryon a perdu l’organisation métamérique en segments que l’on retrouve clairement établie de l’embryon à l’adulte dans les régions du tronc de la drosophile. Ainsi, l’origine segmentale de ce disque a été extrêmement difficile à définir et reste aujourd’hui encore quelque peu obscure.

I-Caractérisation des segments de la tête de l’embryon:

Le stade phylotypique, défini par Sander en 1983, est le stade où les embryons de différentes espèces d’insectes se ressemblent le plus au vu du nombre de segments reconnaissables. Le critère le plus fiable pour reconnaître un segment est la présence d’une paire de primordia donnant naissance à des struc tures segmentairement répétées: les sacs coelomiques (mésoderme), les ganglions (système nerveux central), les invagination ectodermiques (glandes et apodèmes) et les appendices. Le plan basique d’organisation du corps qui apparaît commun à tous les insectes consiste en 6 segments de tête, 3 segments thoraciques, 11 segments abdominaux, entourés aux extrémités par deux pièces non segmentales, l’acron antérieurement et le telson postérieurement. La segmentation de la tête de la drosophile adulte est donc basée sur des études embryologiques issues de plusieurs groupes d’insectes et consiste en six segments répartis en 3 segments préoraux ou prégnathaux (Fig.3), (1) le segment labral qui porte une paire d’appendices formant le labrum, (2) le segment antennaire, qui porte une paire d’appendices sensoriels (les antennes) (3) le segment intercalaire qui ne contient pas d’appendices sauf quelques bourgeons rudimentaires dans certaines espèces, suivis de 3 segments gnathaux, (4) le segment mandibulaire (mandibules) (5) le segment maxillaire (maxillaires) (6) le segment labial (labium). Chaque segment embryonnaire peut être divisé en trois parties, une région ventrale (V) qui forme les neuromères, une région latérale (L) d’où dérivent les appendices, une région dorsale (D) qui contribue à la capsule céphalique (Jurgens and Hartenstein, 1993). Le plan basique

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d’organisation du corps est clairement établi au stade où la bandelette germinale est totalement étendue. A ce stade, la région du tronc montre les premiers signes morphologiques d’organisation métamérique en segment, alors que la région prégnathale de la tête peut être subdivisée en trois lobes: hypopharyngeal, clypeo-labral, et procéphalique. Au cours de l’invagination de la tête, les segments fusionnent et se retrouvent à l’intérieur de l’embryon, seule la région contenant le complexe sensoriel antenno-maxillaire reste à la surface.

Par ailleurs, les unités segmentales répétées peuvent aussi être détectées grâce à l’utilisation du marqueur moléculaire engrailed (en) (voir chapitre 2). en marquent le compartiment postérieur de chaque segment, du segment intercalaire de la tête au segment abdominal A9 (16 bandes). Les trois lobes gnathaux constituent des unités segmentales et sont donc marqués par trois bandes régulières d’expression d’en. Dans ces segments gnathaux les trois régions anatomiques sont clairement retrouvées mais les régions D de ces segments se rejoignent et forment une structure appelée crête dorsale (dorsal ridge) où les bandes d’en convergent et fusionnent. D’autres groupes de cellules exprimant en se situent hors de ces régions métamériques et notamment trois au niveau de la région préorale de la tête où les bandes d’en diffèrent par leur forme et leur orientation. Ainsi, le lobe hypopharyngéal contenant un groupe de cellules en+, correspondrait à la partie V et peut –être L du segment intercalaire. Le segment antennaire n’aurait pas de région V mais la région L est facilement identifiable parce qu’elle contient le primordium de l’organe sensoriel larvaire (antennal sens organ). Suivant le même critère, le lobe clypeolabral constituerait la région L du segment labral. Le segment antennaire est ma rqué par une proéminente bande d’expression d’en qui part de la base du lobe clypéolabral jusqu’à la partie antérieure de la crête dorsale. Un groupe de cellules en+ marque le lobe clypeolabral. Le large lobe procéphalique ne correspond pas à une unité métamérique mais inclurait l’acron non segmenté et un rudiment du segment antennaire marqué par un groupe petit groupe latéral de cellules en+ (head spot, (Diederich et al., 1991)). Il n’existe pas de frontière précise entre l’acron et le segment labral. Alors que des études anatomiques comparatives ont révélé que les yeux et les centres visuels du cerveau sont localisés dans l’acron, chez la drosophile, les organes visuels de la larve (Bolwig’s organ) et le lobe optique ont pour origine le complexe antennaire sensoriel. Au cours de l’involution de la tête, la zone d’expression d’en qui recouvrait la crête dorsale (région D fusionnées des segments gnathaux) se retrouve localisée sur le revêtement externe du dorsal pouch. Une partie des cellules en du segment antennaire est incorporée dans le cerveau mais la majorité d’entre elles dégénère. Cette dégénérescence tardive des cellules à des endroits précis de la tête de l’embryon est qualifiée de mort cellulaire morphogénétique tardive et

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11 Fig.4: Origine embryonnaire des cellules de la tête adulte:

(A) Répartition des cellules embryonnaires (cercles fushia) à l’origine des disques clypéolabraux (cld), labiaux (lbd) et du disque composite œil-antenne (ead). Ce dernier est formé de cellules du lobe procéphalique et du lobe ma xillaire (mx). (B) Expression des gènes Hox (labial (lab), Deformed (Dfd) et Sex combs

reduced (Scr)), et du gène à homéoboîte Distalless (Dll) dans les segments (S) et

les parasegments (PS) de la tête embryonnaire.

(C) Répartition des cellules embryonnaires dans les disques de tête au stade larvaire, (D) dans la tête adulte.

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jouerait un rôle important dans le remodelage de la forme de la tête au cours de son involution. Au troisième stade larvaire en est exprimé dans les cellules postérieures de l’antenne, au pôle postérieur de l’œil et dans la capsule céphalique au niveau des ocelles (Jurgens and Hartenstein, 1993) (voir § B)IV-a) et chapitre 2). Chez l’adulte, en s’exprime dans différentes régions de la tête et marque notamment les palpes maxillaires (chapitre 4).

II-Origine embryonnaire des cellules de la tête de la drosophile

adulte:

La composition segmentale du disque œil-antenne mature a aussi été visualisée en utilisant comme marqueurs moléculaires les patrons d’expression des gènes homéotiques (scr, (Brower, 1986), lab dfd (Chouinard and Kaufman, 1991; Diederich et al., 1991), (Fig.4). Il existe moins de disques imaginaux que de segments au niveau de la tête, ce qui pose la question de l’origine du disque composite œil antenne: provient-il d’un seul segment (auquel cas seulement trois des six segments formeraient un disque de tête) ou a-t-il une origine mixte regroupant plusieurs segments? Une lignée enhancer trap inserée dans le gène escargot (esc) permet de suivre dès le début du stade 13, les cellules destinées à former les disques imaginaux (Younossi-Hartenstein et al., 1993). Avant l’involution de la tête (fin du stade 13), les populations de cellules qui formeront les trois disques (labiaux, clypéo-labraux, œil-antennes) sont très proches les unes des autres.

Les 20-25 cellules du disque labial sont situées dans la partie latérale du segment labial, et chevauchent partiellement avec le domaine d’expression d’en (Fig.4). Le primordium des bourgeons clypéo-labraux se situe dans la partie latérale du segment labral, antérieurement au domaine d’expression d’en. Contrairement aux autres disques, il forme une partie intégrante de l’épithélium atrial pendant toute la vie larvaire.

Le disque œil-antenne se développe à partir d’un territoire relativement large occupé par la partie dorso-postérieure du lobe procéphalique et les parties D des segments gnathaux. Au début du processus d’involution de la tête, les cellules du disque œil-antenne présomptif couvrent un champ de 70 cellules environ. Ainsi, le disque œil-antenne présomptif couvre une région qui incluerait les parties D de l’acron, du segment antennaire, intercalaire et des segments gnathaux. Après l’invagination de la tête, ces cellules occupent les parties postéro-latérales du dorsal pouch qui seraient donc composées des régions D des segments de tête (en particulier des segments antennaires et maxillaires). Ces groupes de cellules allongées s’invaginent en disque œil-antenne très tardivement dans l’embryogenèse. Ce processus

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débute quand la partie postérieure du dorsal pouch est compressée suivant un axe longitudinal et entraîne des remaniements de la forme de cette structure. Les cellules du disque présomptif œil-antenne, arrangées au départ en bandes longitudinales, sont ainsi compressées en de plus petits groupes. Chaque groupe va ensuite s’invaginer à partir de la partie postérieure et latérale du dorsal pouch. Cette compression longitudinale, propre au disque œil-antenne, expliquerait ainsi comment des cellules dérivant de différents segments sont incorporées dans un petit disque.

Dans les cellules du disque présomptif œil-antenne en n’est pas exprimé et Simcox et collaborateurs ont démontré que ce disque O-A s’établit en l’absence d’activité en dans l’embryon (Simcox, 1989; Younossi-Hartenstein et al., 1993). Néanmoins, la spécification du primordium O-A semble dépendre de l’activité de wg, puisque on ne les retrouve pas dans des embryons mutants (Simcox, 1989). Au troisième stade larvaire, il existe trois zones d’expression d’en : (i) un groupe de cellules en+ le plus antérieur se localise dans la membrane péripodiale, à proximité du dorsal pouch, (ii) un groupe occupe la partie médio-antérieure du disque et recouvre les compartiments postérieurs de l’antenne et des palpes maxillaires (Morata lawrence 79), (iii) un petit groupe apparaît dans la capsule céphalique dorsale. L’étude de Younoussi-Hartenstein (1993) a permis de montrer que des cellules des portions D des segments gnathaux ainsi que des cellules du lobe céphalique (qui regroupe l’acron et le segment antennaire) sont incorporées dans le disque œil-antenne (Jurgens and Hartenstein, 1993). Bien que cette étude démontre clairement que les régions D des segments gnathaux et la région procéphalique adjacente sont réduites en un petit champ cellulaire qui formera le disque, il n’existe pas d’évidence directe de l’origine segmentaire précise des cellules contenues dans ce champ.

L’œil, l’antenne et la palpe maxillaire seraient donc issues de cellules provenant de différents territoires embryonnaire (acron, segment antennaire et maxillaire, respectivement, (revue Jurgens and Hartenstein, 1993). Cependant, il a longtemps été suggéré que ce disque pourrait provenir d’un seul segment. En 1986, Haynie et Bryant établissent une carte morphogénétique des précurseurs du disque œil antenne dans un embryon au stade blastoderme (Haynie and Bryant, 1986). Cette carte morphogénétique révèle la segmentation des précurseurs blastodermiques sur la base de leur distribution physique et suggère que ces précurseurs pourraient provenir d’un seul segment. En effet, le calcul de distances pour l’établissement de cette carte montre que ces précurseurs sont très regroupés, et sont plus proches de précurseurs du même segment que ceux de segments adjacents. De plus, d’autres

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observations amènent à penser que l’œil et l’antenne formeraient un disque unique. En effet, tout d’abord, il n’existe pas de restriction du lignage entre les cellules de l’œil et de l’antenne, puisqu’un unique clone peut inclure la palpe maxillaire, l’antenne et la partie V de l’œil, structures supposées provenir de différents segments (Baker, 1978), morata, lawrence 79). Ainsi, l’origine segmentale des cellules ne les engage pas nécessairement à former les structures apparentées aux segments embryonnaires. Ensuite, dans les expériences de transplantations, il a été montré que le fragment œil du disque est capable de régénérer la partie antenne délétée après culture in vivo (Gehring and Schubiger, 1975; Morata and Lawrence, 1979; Schubiger and Alpert, 1975), tandis que le fragment antenne peut seulement se dupliquer. Cette idée d’un disque unique alimente ansi la controverse au sujet de son origine multi-segmentale. De plus, certains contextes mutants entraînent la transformation simultanée de l’antenne en patte et de certaines régions de la tête en aile. Les disques d’ailes et de pattes T2 sont issus d’un précurseur embryonnaire commun qui va secondairement se ségréger en une partie D formant l’aile et V à l’origine de la patte. Il a donc été suggèré que ce disque O-A pourrait être l’homologue segmental des disques imaginaux mésothoraciques D et V.

III-Organisation du disque œil-antenne:

Comme les autres disques imaginaux, les disques œil-antennes sont composés de deux couches apposées de cellules épithéliales qui renferment la lumière du disque: l’épithélium du disque à proprement parler («disc proper», DP), et de la membrane péripodiale (MP). La MP joue un rôle important dans la métamorphose lors de l’évagination des disques sur le corps de l’adulte (Milner83, Fristrom93, Agnes99). Haynie et Bryant établissent par des expériences de transplantations au stade larvaire, une carte extrêmement détaillée des territoires présomptifs du disque œil antenne (annexe 1). Par ailleurs, ils montrent que la MP qui recouvre ce disque O-A n’est pas homogène sur l’ensemble du disque. La carte larvaire combinée à cette étude morphologique de la structure du disque, leur permet de montrer une localisation inattendue de certains primordia de la tête dans la membrane péripodiale de ce disque (haynie bryant86). Par la suite, les études de Cho et al (2000) et Gibson et Schubiger (2000) ont révelé que la MP du disque d’œil constitue une source de molécules signalisatrices qui contribue au patterning et à la croissance correcte des cellules du DP. Pendant le stade L2, la morphologie du disque d’œil en deux couches épithéliales adjacentes devient distincte. L’œil dérive d’une couche de cellules en colonne, le DP, et au dessus d’elles, les cellules squameuses de la MP participent à

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17 Fig.5: Représentation schématique des primordia au sein des territoires œil et antennes

Capsule céphalique (CC) ventrale (Gena) et dorsale (Vertex), Antenne (Ant), Maxillaire (Mx).

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la formation de la capsule céphalique autour de l’œil (Milner83, 84, Haynie Bryant 86, JH93). Cho et al ont montré qu’au sein du disque d’œil, les molécules signalisatrices Dpp, Wg, Hh (complément bibliographique) exprimées précocement et requises dans le patterning du disque, sont principalement exprimées dans la MP, où elles contrôlent l’expression des ligands Serrate et Delta dans le DP. Les cellules de la MP étendent des prolongements cytoplasmiques vers le DP qui seraient impliqués dans la médiation de ces signaux péripodiaux.

1.B. Etablissement de territoires et formation des primordia au

sein du disque œil-antenne:

Les disques imaginaux sont des entités développementales autonomes, comme en témoigne leur capacité à générer une partie spécifique du corps lorsqu’ils sont placés dans un environnement ectopique. Ainsi, un groupe de cellules qui exprime spécifiquement des facteurs sélecteurs et des molécules de signalisation constitue une unité qualifiée de champ morphogénétique (Mann and Carroll, 2002; Mann and Morata, 2000). Chaque disque imaginal correspond donc à un champ morphogénétique d’où émerge un primordium qui donnera naissance à un organe en particulier. Le disque œil-antenne est une exception puisque plusieurs organes sont issus de cette str ucture composite qui, comme son nom l’indique, est formée de différents champs morphogénétiques. Au sein de chaque champ cellulaire, ou territoire, plusieurs primordia vont être déterminés puis vont se différencier suivant des règles propres à l’organe formé (similaires à celles conduisant à la spécification d’un disque imaginal (voir chapitre3)) (Fig.5). Ainsi, au troisième stade larvaire (L3) deux champs morphogénétiques distincts, œil et antenne, regroupant de multiples primordia peuvent être identifiés moléculairement et morphologiquement. De ce fait, ce disque est souvent considéré comme deux disques séparés à ce stade. Au sein du disque d’œil, une partie des cellules se différencie en ommatidies suivant un processus dynamique débutant au pôle postérieur de l’œil. Les autres cellules autour de ce primordium œil formeront les diverses parties de la capsule céphalique (CC) entourant l’œil adulte: la CC dorsale constituant le vertex, la CC ventrale formant le gena, et la CC localisée dans la membrane péripodiale (Fig.5). Le disque antenne participe également à la formation de la cuticule des autres régions de la tête (notamment la membrane rostrale) et contient les deux primordia des organes olfactifs de l’adulte, antennes et maxillaires (Fig.5). Alors que les mécanismes qui contrôlent la séparation du disque en deux territoires œil et antenne, ainsi que la subdivision des primordia au sein du

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disque d’œil commencent à être étudiés, l’analyse de la subdivision des primordia contenus dans le disque antenne a été abordée pour la première fois, dans ce travail.

Ce disque O-A constitue donc un exemple représentatif du développement de plusieurs organes à partir d’un tissu, situation répandue dans le règne animal. Alors que de nombreuses études ont permis de mi eux caractériser les mécanismes qui gouvernent la spécification des organes, les mécanismes responsables de la singularisation de primordia distincts à partir du groupe commun de cellules du disque œil-antenne commencent à peine à être détaillés. Ces études convergent vers un modèle impliquant deux mécanismes: (i) établissement de territoires cellulaires distincts par restriction progressive de compétences spécifiques et (ii) induction des primordia organes-spécifiques.

I-Acteurs moléculaires :

a) Gènes sélecteurs de l’œil et de l’antenne

Ce n’est que récemment que le rôle des gènes sélecteurs connus de l’œil et de l’antenne a été analysé dans ces processus précoces de définition de territoires et d’apparition des primordia. Les régulateurs transcriptionnels Eyeless (Ey), Twin of eyless (Toy), Eyes absent (Eya), Sine oculis (So), et Dachshund (Dac) sont des sélecteurs du développement de l’œil, alors que Homothorax (Hth), Extradenticle (Exd), and Distal-less (Dll) fonctionnent comme sélecteurs du développement de l’antenne (voir chapitre 3) (Bonini et al., 1993; Casares and Mann, 1998; Cheyette et al., 1994; Lecuit and Cohen, 1997; Mardon et al., 1994) (Quiring et al., 1994). Seuls ou en combinaison, ces facteurs sont capables d’induire ectopiquement des yeux (Ey, Toy, Eya, Eya/So, Dac) ou des antennes (Hth/Dll) dans d’autres disques imaginaux (Bonini et al., 1997; Dong et al., 2000; Gehring, 2002; Halder et al., 1995; Pignoni et al., 1997; Punzo et al., 2004; Shen and Mardon, 1997). L’étude du profil d’expression dynamique de ces facteurs au cours des stades larvaires précoces a permis de corréler leur expression avec l’identité d’un territoire cellulaire ou l’émergence d’un primordium. De cette manière, il a été montré que la première définition des territoires œil et antenne du disque (Dominguez and Casares, 2005; Kenyon et al., 2003; Kumar and Moses, 2001) est établie tardivement au cours du deuxième stade larvaire (L2), parallèlement à la formation des primordia.

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21 Ces deux processus se déroulent de manière parallèle et progressive

au cours des stades larvaires précoces.

Fig.6: Ségrégation des territoires et des primordia œil et antenne (A) Ségrégation des territoires œil et antenne

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b) Voies de signalisations Dpp, Wg, N:

En conjonction avec ces facteurs sélecteurs, certaines voies de signalisation sont impliquées dans la détermination des territoires et l’établissement des primordia au sein du disque œil-antenne. Les voies de signalisation initiées par les ligands Decapentaplegic (Dpp/TGFb), Wingless (Wg/Wnt) et Notch (N) sont connues pour jouer un rôle dans de nombreuses étapes du développement de la drosophile et des vertébrés et notamment dans la spécification et la croissance des disques imaginaux (chapitre 2, 3). Cependant, une fois encore la plupart des études moléculaires concernant le disque œil-antenne se sont intéressées au rôle de ces signaux dans les processus tardifs de différenciation de l’œil ou de l’antenne, et non à leur rôle dans le patterning précoce du disque. Ce n’est que récemment que leurs profils d’expression précoce ont permis d’appréhender leurs fonctions dans ces processus (Dominguez and Casares, 2005; Kenyon et al., 2003; Kumar and Moses, 2001).

II) Formation des territoires œil / antenne:

Le disc O-A regroupe un petit nombre de cellules au premier stade larvaire (L1) qui ne montre pas de différence claire dans leur patron d’expression génique. Au premier stade larvaire, toutes les cellules du disque O-A expriment les sélecteurs Ey, Toy, Hth et Exd (Fig.6A) (Dominguez and Casares, 2005; Kenyon et al., 2003; Kumar and Moses, 2001). Toy induit la transcription d’Ey, et leurs profils d’expression sont donc très similaires (Czerny et al., 1999). Deux autres gènes apparentés à Pax6, eyegone (eyg) et twin of eyegone (toe), s’expriment dans les cellules embryonnaires à l’origine du disque œil-antenne (Aldaz et al., 2003; Jang et al., 2003; Jun et al., 1998) puis s’éteignent en L1 et leur expression redémarre en fin L2 (Chao et al., 2004; Dominguez et al., 2004). Les changements d’expression d’Ey au cours du stade L2 sont les premiers événements qui reflètent la séparation du disque en deux territoires œil et antenne. Au début du stade L2, l’expression d’Ey diminue dans la partie antérieure du disque et disparaît complètement quelques heures plus tard de cette région correspondant à la partie antenne du disque. Ainsi, au cours du stade L2, deux domaines, pourvu ou non de la protéine Ey correspondent respectivement aux territoires œil (Ey+) et antenne (Ey-) (Fig.6A). Le facteur de transcription Cut est requis tardivement dans le développement de l’antenne (chapitre 3), mais son patron d’expression précoce en fait un bon marqueur du territoire antenne. En effet, l’expression de Cut débute au milieu du stade L2 dans les cellules où l’expression d’Ey s’est éteinte. A la fin du stade L2, l’expression de Cut

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s’étend à toutes les cellules du territoire antenne suivant un patron complémentaire et exclusif de celui d’Ey (Fig.6A). Ces patrons d’expression laissent supposer qu’il existe un antagonisme entre Ey et Cut, et que leur répression mutuelle est nécessaire à la ségrégation des deux champs cellulaires.

Une étude récente a en effet montré que la surexpression de Cut dans des clones inhibe de manière cellulaire autonome l’expression d’Ey (Duong et al., 2008). Ce résultat suggère que la réduction de l’expression d’Ey au second stade larvaire résulte de l’augmentation de Cut à ce stade. Dans cette étude, ils mettent en évidence que la surexpression d’un seul gène, le gène Dip3 (ey>>Dip3), transforme spécifiquement l’œil en antenne, transformation peu commune. Ce gène appartient à une famille de 14 homologues (facteurs de transcription à domaine MADF/BESS) ne permettant pas d’analyser sa perte de fonction. Dans cet événement de tranformation œil>>ant, Dip3 induit l’expression de cut dans le territoire œil, et réprime l’expression d’ey. Les auteurs montrent que la surexpression directe de cut dans le territoire œil (ey>>cut), est suffisante pour transformer partiellement l’œil en antenne. Ainsi, en plus d’être un marqueur précoce du territoire antenne, cut joue un rôle prépondérant dans l’identité de ce territoire.

III) Induction des primordia œil versus antenne:

Parallèlement à la formation des territoires œil et antenne, d’autres gènes agissent au sein de ce contexte prédefini pour induire la formation des primordia organes spécifiques, en déclenchant les cascades géniques nécessaires à leur spécification (et en bloquant ainsi les compétences de ce territoire).

a) Formation du primordium oeil:

Au cours du stade L2, pendant la ségrégation des territoires œil et antenne, l’expression du facteur nucléaire Eya débute dans la région postérieure du territoire œil (Fig.6B) (Kenyon et al., 2003). Eya appartient à un groupe de facteurs communément appelés « gènes rétinaux précoces » (Pichaud et al., 2001). Ce groupe inclu So (Cheyette et al., 1994; Serikaku and O'Tousa, 1994) et le facteur nucléaire Dac (Mardon et al., 1994). L’interaction physique de ces facteurs est requise pour l’initiation de la différenciation de la rétine au début du stade L3 qui débute au pôle postérieur de l’œil et suit une vague de différenciation organisée le long du sillon morphogénétique (MF). L’expression de eya et de so est indépendamment activée par ey/Pax6 (Halder et al., 1998; Punzo et al., 2002). Leur

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coexpression précoce au début du stade L2 atteste de la formation d’un primordium œil à ce stade puisqu’elle permettrait de verrouiller la compétence «œil» des cellules du territoire (Thomas and Zipursky, 1994). Les travaux de Kenyon et collaborateurs, ont montré que l’expression d’Eya débute plus précocement que celle de So ou de Dac au début du stade L2 et représente donc l’indication la plus précoce de la formation du primordium de l’œil (Fig.6B) (Kenyon et al., 2003).

b) Formation du primordium antenne:

L’induction d’un primordium antenne est reflétée par l’apparition du gène selecteur Dll (chapitre 3). En opposition avec des études précédentes (Kumar and Moses, 2001) Kenyon et collaborateurs ne détectent pas l’expression de Dll en L1 ni en début de L2 dans le disque œil-antenne. L’expression de Dll ne débute qu’à la moitié du stade L2 dans le domaine d’expression de Cut (Fig.6B) (Kenyon et al., 2003). L’expression tardive de Dll reflète donc la formation du primordium de l’antenne qui représente un événement secondaire à la définition d’un territoire antenne. Cette activation de Dll dans le territoire antenne conduit à sa coexpression avec le facteur Hth présent dans l’ensemble du disque depuis le stade L1. Cette coexpression est un événement clé dans la spécification des cellules de l’antenne (Casares and Mann, 1998; Dong et al., 2000) (voir chapitre 3).

Dll apparaît dans le territoire antenne qui est défini par l’absence de la protéine Ey. Il a été montré que Ey est capable de réprimer Dll (Kurata et al., 2000) et que cette répression est médiée par l’homéodomaine du gène ey (Fig.6B) (Punzo et al., 2001). Par ailleurs, Ey est requis pour l’identité et le développement de l’œil au moins en partie en empêchant l’apoptose des cellules (Czerny et al., 1999; Halder et al., 1998; Halder et al., 1995; Quiring et al., 1994). Or, en absence d’Ey et en empêchant la mort cellulaire, Punzo et collaborateurs ont montré que Dll est activé dans le territoire œil, entraînant la formation d’une antenne ectopique qui remplace l’œil (Punzo et al., 2004). Ainsi, le modèle actuel propose qu’Ey confère une compétence œil aux cellules qui se restreint progressivement permettant l’acquisition d’une compétence antenne en L2.

c) Rôle de la voie Decapentaplegic dans la formation des primordia œil et

antenne:

La voie de signalisation Decapentaplegic (Dpp; morphogène de la famille BMP) montre un profil spatio-temporel très dynamique dans le disque O-A au cours des stades

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précoces. Cette signalisation Dpp joue un rôle important dans la formation des primordia de l’œil et de l’antenne (Chen et al., 1999; Curtiss and Mlodzik, 2000; Diaz-Benjumea et al., 1994). En effet, tout d’abord l’expression de Dpp corrèle parfaitement avec les domaines d’émergence des primordia, reflétée par l’expression d’Eya et de Dll (Fig.6B). Au début du stade L2, Dpp apparaît dans la région postérieure de l’œil, au même moment que l’induction d’Eya (Cho et al., 2000; Kenyon et al., 2003). A la moitié du stade L2, un nouveau domaine d’expression s’établit dans le territoire antenne juste avant le début de l’expression de Dll, mais après la restriction de Cut et Ey en deux territoires (Kenyon et al., 2003). Une combinaison allélique mutante réduisant la fonction de Dpp à tous les stades larvaires n’affecte ni l’expression d’Ey ni celle de Cut, suggérant fortement que cette separation du disque en deux territoires distincts ne nécessite pas la signalisation Dpp (Chen et al., 1999; Kenyon et al., 2003). A l’inverse, cette combinaison hypomorphique, ou des clones mutants pour mad (mothers against dpp), un effecteur de la signalisation Dpp (Raftery et al., 1995; Sekelsky et al., 1995) (voir complément bibliographique), induisent une réduction ou une absence de Eya, So et de Dac (Chen et al., 1999; Curtiss and Mlodzik, 2000; Wiersdorff et al., 1996). De même, l’activation de Dll dans le territoire antenne nécessite la signalisation Dpp (Diaz-Benjumea et al., 1994; Lecuit and Cohen, 1997). En utilisant une combinaison d’allèles thermosensible, Kenyon et ses collaborateurs ont montrés que l’activation d’Eya et de Dll, respectivement au début ou à la moitié du stade L2, est dépendante de la signalisation Dpp qui apparaît spécifiquement à ces stades. Les expériences gain de fonction montrent que Dpp est aussi suffisant pour induire l’expression d’Eya dans le territoire œil (Kenyon et al., 2003) et de Dll dans le territoire antenne (Diaz-Benjumea et al., 1994). En conclusion, Dpp ne contrôle pas la séparation des territoires œil et antenne mais fonctionne au sein d’un territoire empreint d’un contexte spécifique de facteurs sélecteurs, en induisant indépendamment la formation de deux primordia distincts, œil et antenne. En présence d’Ey, le signal Dpp entraîne l’activation d’Eya et non celle de Dll (Kurata et al., 2000). Dans ce sens, il a été montré que l’activation de Eya par Dpp est potentialisée par la présence d’Ey (Chen et al., 1999). L’absence d’Ey dans le territoire antenne au moment où apparaît Dpp dans ce tissu, permet l’activation de Dll et la formation d’un primordium antenne. Cette fonction précoce de Dpp peut être analogue à celle de Wg dans la spécification des territoires du disque d’aile au stade L2 (Ng et al., 1996).

Duong et al, postulent qu’au moins trois conditions doivent être réunies pour permettre une transformation œil>>antenne (induite par Dip3) efficace: (i) la répression des gènes du primordium de l’œil, (ii) l’activation des gènes du primordium de l’antenne, (iii) l’intersection Wg/Dpp nécessaire à la formation de l’axe P/D de l’antenne (voir chapitre 3 et §V-b)) (Duong

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29 Fig.7: Ségrégation des primordia œil et capsule céphalique (CC)

(A) Antagonisme entre les facteurs Wg et Dpp dans l’induction respective des primordia CC et œil.

(B) Rôle d’Hth dans la restriction des compétences œil et dans la régulation ventrale de wg.

(C) Induction des primordia œil et CC respectivement dans les cellules du disque proprement dit (DP) et dans les cellules de la membrane péripodiale (MP).

Les cellules MP et DP expriment toutes ey mais seules celles du DP expriment tsh . L’expression de tsh et ey est uniforme dans le DP au début de la spécification du primordia œil (à gauche, prés du pôle postérieur) puis ces deux gènes sont éteints dans les cellules différenciées (postérieures au sillon morphogénétique (MF))