Étude du rôle tissu-spécifique des gènes Hoxa5 et Yy1
dans le développement du système respiratoire de la souris
Mémoire
Kim Landry-Truchon
Maîtrise en biologie moléculaire
Maître ès sciences (M.Sc.)
Québec, Canada
iii
Résumé
Les gènes Hox sont essentiels au développement des organismes, étant impliqués, entre autres, dans l'identité cellulaire le long de l'axe antéropostérieur de l'embryon, la spécification des squelettes axial et appendiculaire, la formation du système nerveux et l'organogenèse. Le gène Hoxa5 est indispensable au développement du système respiratoire, puisque les souris mutantes présentent un taux important de mortalité liée à une détresse respiratoire à la naissance. La détection de la protéine HOXA5 dans le mésenchyme du tractus respiratoire ainsi que dans les motoneurones de la région phrénique du système nerveux central nous a mené à étudier la contribution spécifique du gène Hoxa5 dans chaque composante susceptible d'influencer le développement pulmonaire. À l'aide d'une approche d'inactivation conditionnelle, nous avons démontré que la perte de fonction de Hoxa5 dans le mésenchyme affecte le développement trachéal, ainsi que la différenciation épithéliale et la croissance pulmonaire. Aussi, la mutation dans les motoneurones résulte en une hypoplasie pulmonaire ainsi qu'en une innervation et une musculature anormales du diaphragme, des défauts permettant de reproduire la mortalité néonatale obsevée chez les souris Hoxa5-/-. L'expression du gène Hoxa5 est contrôlée par plusieurs séquences
régulatrices, dont un responsable l'expression dans les systèmes respiratoire et digestif. Le facteur de transcription Yin Yang 1 (YY1) lie cette séquence et il est impliqué directement dans la régulation de l'expression du gène Hoxa5 dans le poumon. YY1 est exprimé de manière ubiquitaire et peut agir en tant qu'activateur ou répresseur transcriptionnel dépendamment du contexte en recrutant différents coactivateurs ou corépresseurs transcriptionnels. La perte d'expression mésenchymale de Yy1 mène à un phénotype pulmonaire similaire à celui des souris Hoxa5-/- causant la mort à la
naissance. Nous avons étudié comment l'inactivation spécifique de Yy1 dans l'épithélium pulmonaire, à l'aide de l'approche d'inactivation conditionnelle, influence le développement pulmonaire. La mutation épithéliale de Yy1 résulte en une mortalité à la naissance causée par une détresse respiratoire, des anneaux de cartilage désorganisés, une différenciation altérée ainsi qu'une absence de formation de l'arbre bronchial menant à une dilatation des voies respiratoires similaire à ce qui est observé chez les patients souffrant de malformations congénitales cystiques du poumon, telle que le blastome pleuropulmonaire (PPB). Nos résultats démontrent le rôle crucial de YY1 dans la morphogenèse pulmonaire et identifie les souris mutantes pour le gène Yy1 comme un modèle potentiel permettant d'étudier les méchanismes génétiques du PPB.
v
Abstract
Hox genes encode transcription factors governing complex developmental processes including the anteroposterior patterning of the embryo axis, the specification of the axial and appendicular skeletons as well as the formation of the nervous system and several organs. In the respiratory system, the role of Hoxa5 is critical since the loss of Hoxa5 function causes death at birth of a high proportion of mutant pups due to respiratory distress. HOXA5 protein expression in the mesenchyme of the respiratory tract and in the phrenic motor neurons of the central nervous system led us to address the specific contribution of Hoxa5 in each component to lung development. Using a conditional gene targeting approach, we demonstrated that the genetic ablation of Hoxa5 function in the mesenchyme established the importance of Hoxa5 in trachea development, lung epithelial cell differentiation and lung growth. In parallel, the specific deletion of Hoxa5 in motor neurons resulted in abnormal innervation of the diaphragm, altered diaphragm musculature and lung hypoplasia which are responsible for the neonatal lethality observed in null mutants. Thus, this confirms that a defective diaphragm mainly contributes to impair survival at birth.
Hoxa5 expression is under the control of many regulatory elements, one of which is responsible for Hoxa5 expression in the respiratory and digestive tracts. Yin Yang 1 (YY1) is a multifunctional zinc-finger-containing transcription factor that plays crucial roles in numerous biological processes by selectively activating or repressing transcription, depending upon promoter contextual differences and specific protein interactions. We have shown that YY1 regulates Hoxa5 expression in the lung by binding to the lung-specific regulating sequence. However, the mesenchymal loss of Yy1 function causes a lung phenotype similar to the one observed in Hoxa5
-/-mutants including neonatal mortality. We then studied how the epithelial-specific inactivation of Yy1 impacts on lung development. The Yy1 epithelial mutation resulted in neonatal death due to respiratory failure. It impaired tracheal cartilage formation, altered cell differentiation, abrogated lung branching and caused airway dilation similar to that seen in human congenital cystic lung diseases, such as the pleuropulmonary blastoma (PPB). Together, our data demonstrate the crucial requirement for YY1 in lung morphogenesis and identify Yy1 mutant mice as a potential model for studying the genetic basis of PPB.
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Table des matières
Résumé ... iii
Abstract ... v
Table des matières ... vii
Liste des tableaux ... ix
Liste de figures ... xi
Liste des abréviations ... xi
Remerciements ... xvii
CHAPITRE 1 : Introduction ... 1
1.1 Les gènes Hox ... 1
1.1.1 Les gènes Hox chez les mammifères ... 2
1.1.1.1 Régulation des gènes Hox ... 3
1.1.1.2 Les fonctions des gènes Hox ... 7
1.2 Le gène Hoxa5 ... 10
1.2.1 Patron d'expression chez la souris... 10
1.2.2 Fonctions du gène Hoxa5 ... 11
1.2.2.1 Transformations squelettiques ... 11
1.2.2.2 Le système nerveux central (SNC) ... 18
1.2.2.3 L'organogenèse ... 19
1.2.3 Régulation de l'expression du gène Hoxa5 ... 22
1.2.2.1 Le facteur de transcription Yin Yang 1 (YY1) ... 23
1.3 Le système respiratoire ... 26
1.3.1 Les structures du système respiratoire ... 26
1.3.2 Le développement trachéal et pulmonaire chez la souris ... 26
1.3.3 Le développement du diaphragme chez la souris ... 37
1.3.3.1 Les facteurs de régulation myogénique (MRFs) ... 44
1.3.3.2 Structure et protéines contractiles du muscle squelettique ... 47
1.3.4. Les forces physiques et le développement pulmonaire ... 49
1.4 Objectifs du projet ... 55
CHAPITRE 2 : HOXA5 plays tissue-specific roles in the developing respiratory system ... 59
Avant-propos ... 61
viii
Introduction ... 65
Material and methods... 67
Results ... 69
Discussion ... 107
Acknowledgments ... 115
References ... 116
Suplementary material ... 123
CHAPITRE 3 : Epithelial inactivation of Yy1 abrogates lung branching morphogenesis ... 127
Avant-propos ... 129
Abstract ... 131
Introduction ... 133
Materials and methods ... 134
Results ... 137 Discussion ... 161 Acknoledgments ... 170 Competing interests ... 170 Author contributions ... 170 Funding ... 170 References ... 171 Supplementary material ... 179
CHAPITRE 4 : Adaptation de la réponse respiratoire chez les souris mutantes Hoxa5 ... 195
4.1 Contexte ... 195
4.2 Matériels et méthodes ... 196
4.3 Résultats ... 196
CHAPITRE 5 : Discussion & Conclusion ... 201
5.1 Hoxa5 et le développement du système respiratoire ... 201
5.1.1 Les fonctions du gène Hoxa5 selon son site d'expression ... 201
5.1.1.1 L'épithélium pulmonaire ... 201
5.1.1.2 Le mésenchyme trachéal, pulmonaire et le diaphragme ... 201
5.1.1.3 Les neurones moteurs... 204
5.2 Le facteur de transcription YY1 régule Hoxa5 ... 206
ix
Liste des tableaux
CHAPITRE 2 Table 2.1 ... 75 Table 2.2 ... 77 Table 2.3 ... 78 Table 2.4 ... 78 Table 2.S1 ... 123 Table 2.S2 ... 124 CHAPITRE 3 Table 3.1 ... 140 Table 3.2 ... 161 Table 3.S1 ... 180 Table 3.S2 ... 181 Table 3.S3 ... 182
xi
Liste de figures
CHAPITRE 1
Figure 1.1: Représentation schématique des complèxes Hox chez la drosophile et la souris ... 5
Figure 1.2 Schéma représentant les unités transcriptionnelles du gène Hoxa5 ... 13
Figure 1.3 Expression des différents transcrits du gène Hoxa5 dans un embryon entier de souris au jour embryonnaire 12.5 ... 15
Figure 1.4 Résumé des phénotypes retrouvés chez les souris Hoxa5-/- comparativement aux spécimens contrôles ... 17
Figure 1.5 Représentation schématique des différentes séquences régulatrices au niveau du locus Hoxa5 identifiées par transgenèse chez la souris ... 25
Figure 1.6 Représentation schématique du développement du système respiratoire de la souris... 29
Figure 1.7: Représentation simplifiée du processus de ramification pulmonaire chez la souris ... 33
Figure 1.8: Représentation schématique du muscle du diaphragme de la souris ... 39
Figure 1.9: Représentation schématique du développement du diaphragme chez la souris ... 41
Figure 1.10: Schéma descriptif d'un sarcomère ... 51
Figure 1.11: Schéma simplifié des gènes responsables de l'établissement de l'hétérogénéité musculaire dans le diaphragme de souris ... 53
CHAPITRE 2 Figure 2.1: HOXA5 protein distribution and Hoxa5 gene expression in the respiratory tract and diaphragm ... 71
Figure 2.2 Cre recombinase specificity and efficiency of the Hoxa5 deletion by the ShhCre ,Dermo1Cre and Olig2Cre alleles in the developing respiratory system ... 73
Figure 2.3. No overall phenotype is observed following epithelial Hoxa5 inactivation... 75
Figure 2.4. Loss of Hoxa5 mesenchymal function causes abnormal cartilage ring patterning of the trachea ... 81
Figure 2.5. Hoxa5 acts in a cell-autonomous manner in the mesenchyme to control SOX9 spatial expression ... 83
Figure 2.6. Both Hoxa5 mesenchymal and motor neuron inactivations cause lung hypoplasia ... 85
Figure 2.7. Hoxa5 mesenchymal and motor neuron mutations differentially influence lung development ... 89
Figure 2.8. Abnormal diaphragm innervation pattern in Hoxa5 motor neuron mutants ... 91
Figure 2.9. Expression analysis of Ephrin-A and EphA genes in diaphragm from Hoxa5 mutants .... 93
Figure 2.10. Muscular defects of the diaphragm in surviving adult mice carrying the Hoxa5 motor neuron mutation ... 97
xii
Figure 2.12. Hoxa5 motor neuron inactivation impacts on the thickness of the diaphragm ... 101
Figure 2.13. Hoxa5 motor neuron inactivation causes muscle atrophy ... 103
Figure 2.14. Less proliferating cells are observed in the diaphragm from Hoxa5 mutants ... 105
Figure 2.15. Expression analysis of myogenic regulation factors in the developing diaphragm ... 109
Figure 2.16. Expression analysis of myosin heavy chain isoforms in the developing diaphragm ... 111
CHAPITRE 3 Figure 3.1 Yy1 is crucial for lung branching morphogenesis ... 139
Figure 3.2. YY1 controls lung epithelial proliferation and apoptosis, patterning and airway myofibroblast differentiation ... 143
Figure 3.3. Abnormal cartilage ring patterning and epithelial cell differentiation in the trachea of Yy1flox/flox;Shh+/Cre embryos ... 145
Figure 3.4. Epithelial Yy1 inactivation affects Fgf10 and Shh expression ... 149
Figure 3.5. Yy1 inactivation in the developing lung endoderm with the Nkx2-1- Cre transgenic mouse line causes cyst formation ... 153
Figure 3.6. Addition of rmSHH partially rescues the airway smooth muscle cells and the apoptotic defects in Yy1flox/flox;Shh+/Cre lung explants ... 155
Figure 3.7. YY1 expression in congenital cystic lung diseases ... 157
Figure 3.8. Loss of Dicer function in the developing lung epithelium phenocopies the lung defects of Yy1 mutants ... 159
Figure 3.9. Yy1flox/flox;TgNkx2-1-Cre mice present characteristics of an evolving type I pleuropulmonary blastoma-like phenotype ... 163
Figure 3.10. Model for the action of YY1 during lung branching morphogenesis ... 167
Figure 3.S1. Cre recombinase specificity and efficiency of the Yy1 deletion by the ShhCre allele in the developing lung ... 185
Figure 3.S2. Reduced epithelial proliferation and increased apoptosis in lungs from Yy1flox/flox;Shh+/Cre mutants ... 187
Figure 3.S3. YY1 can activate Shh expression in transactivation assays ... 189
Figure 3.S4. Abnormal epithelial differentiation and increased cell proliferation in lungs from E18.5 Yy1flox/flox;Tg+/Nkx2-1Cre embryos ... 191
Figure 3.S5. Differential gene expression in lungs from E14.5 Yy1flox/flox;Shh+/Cre and Dicerflox/flox;Shh+/Cre embryos ... 193
CHAPITRE 4 Figure 4.1: Spirogramme comparant le cycle respiratoire moyen des spécimens Hoxa5flox/flox, Hoxa5flox/flox;Dermo1+/Cre et Hoxa5flox/flox;Olig2+/Cre en conditions normale et hypoxique ... 199
xiii
Liste des abréviations
ANT-C: complexe antennapedia B-HLH: Basique-Hélice-Boucle-Hélice
BPP: blastome pleuropulmonaire («pleuropulmonary blastome») BX-C: complexe bithorax
C: cervicale Ca: caudale
E : jour embryonnaire (ex: E18.5)
ECM: matrice extracellulaire («extracellular matrix»)
FBMs: mouvements respiratoires fœtaux («fetal breathing-like mouvements») FGF10: «Fibroblast growth factor 10»
HD: hernie diaphragmatique HGF: «Hepatocyte Growth Factor» HOM-C: complexe homéotique kb: kilobases
L: lombaire
LMC: colonne motrice latérale miARNs: micro-ARNs («micro-RNA») MRFs: facteurs de régulation myogénique Mrf4: «Myogenic factor 6 (herculin)» Myf5: «Myogenic factor 5»
MyHC: chaînes lourdes de myosine («myosin heavy chain») MyHC-emb: isoforme de myosine embryonnaire
MyHC-neo: isoforme de myosine neonatale (ou périnatale) MyLC: chaînes légères de myosin («myosin light chain») MyoD: «Myogenic differenciation 1»
Myog: Myogenin (myogenic factor 4) P: jour post-natal (ex: P5)
pb: paires de base PcG: Polycomb
PMC: colonne phrénique
PPFs : plis pleuropéritonéaux («pleuroperitoneal folds») pv: prévertèbre
S: sacrale
SNC: système nerveux central SHH: «Sonic-Hedgehog»
ST: septum transverse («septum transversum») T: thoracique
Te: temps d'expiration Ti: temps d'inspiration TrxG: Trithrax
VT: volume courant VT/Ti: débit inspiratoire Ve: ventilation minute
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xvii
Remerciements
C'était il y a déjà trois ans de cela que je me présentais au laboratoire, l'air ridicule et insécure dans mon complet-cravate dépareillé, pour y passer une entrevue de stage avec la Dre Lucie Jeannotte au Centre de Recherche sur le Cancer de l'Université Laval. Malgré mon manque d'expérience, la Dre Jeannotte m'accepta dans son laboratoire où j'ai par la suite poursuivi aux études graduées. C'est pourquoi je tiens à remercier du fond du coeur la Dre Jeannotte de m'avoir accordé sa confiance, là où tous les autres ont balayé ma candidature du revers de la main, due à ce système ne favorisant que l'élitisme. Je lui serai éternellement reconnaissant pour les nombreuses connaissances et capacités que j'ai acquis durant mes études. J'estime avoir reçu une formation de qualité supérieure dans le domaine de la biologie moléculaire du développement chez la souris. Je la remercie également de m'avoir inculqué une démarche scientifique rigoureuse et de m'avoir permis de développer ma confiance en moi. Lucie fut toujours émerveillée par nos résultats, nos idées et nos hypothèses. Le nombre incalculable de fois où j'ai pu entendre : "C'est excitant!", ou encore: "On est excité! Mais on va attendre les résultats avant de se retrousser le poil des jambes!" Merci de m'avoir permis d'apprendre dans un milieu aussi stimulant.
Je tiens également à remercier les membres du laboratoire: Nicolas Houde, Dr Félix-Antoine Bérubé-Simard et le Dr Olivier Boucherat pour avoir pris part à ma formation, ainsi que les membres du laboratoire du Dr Jean Charron: Rifdat Aoidi, Valérie Nadeau, Laurent Beuret, Julie Plante et Émilie Pic. Je veux remercier spécialement Nicolas Houde et Rifdat Aoidi avec qui j'ai pu forger une amitié solide. Je vous remercie pour votre soutien éternel et votre bonne humeur. Vous m'avez accompagné tout au long de ce parcours, parfois tumultueux, sans quoi je n'aurais jamais pu y arriver sans vous. Ne sous-estimer jamais votre importance à mes yeux. Merci également pour votre humour, c'est toujours un plaisir de dire plein de niaiseries avec vous. Je vais enfin pouvoir dire que mon mémoire a "Toute e'l dedans fenit"!
Je souhaite également remercier mes évaluateurs: le Dr Marc-Étienne Huot et le Dr Richard Kinkead d'avoir accepté d'évaluer mon travail. Un merci spécial au Dr Kinkead et son assistante de recherche, Stéphanie Fournier, pour la merveilleuse collaboration portant sur les expériences de respiration. Merci encore d'avoir effectué l'analyse rapide des résultats pour que je puisse les inclure dans mon manuscrit.
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Merci également aux Drs Jeremy Dasen et Polyxeni Philippidou pour leur collaboration. Je m'en voudrais de ne pas prendre le temps de remercier mes amis: Pierre-Carmain, Tomy, Étienne, Julien, Jean-Philippe, Anthony, Yan, Yan-Érik, Mathieu, David, Nelson, Christopher, Félix, Pascal, Philippe, Nassim, Valérie, Angie, Cora, Cynthia. Merci pour votre amitié et de faire partie de ma vie. Votre support tout au long de ces années est ce qui m'a permis de continuer. Merci pour tous ces fou-rires qui m'ont permis de décocher lorsque j'en avais besoin.
Merci à tous les membres de ma famille, mon frère Nicolas, ma grand-mère Colette et bien sur, mes parents André et Brigitte. Papa, Maman, ces dernières lignes vous sont consacrées. Malgré que ces quelques mots ne rendront jamais justice à l'égard que j'ai pour vous, je veux vous remercier pour tout. Si je suis la personne que je suis aujourd'hui c'est grâce à vous. Depuis toujours vous m'avez accompagné dans la vie. Malgré mes choix, parfois incertains, vous avez toujours cru en moi et ne m'avez jamais forcé à rien. Merci de m'avoir soutenu et réconforté encore et encore dans les moments plus difficiles. Les mots me manquent pour vous faire part de ma gratitude et pour vous dire à quel point je vous aime.
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CHAPITRE 1 : Introduction
Le développement de l’organisme implique plusieurs processus complexes, dont la spécification des axes embryonnaires (antéro-postérieur, dorso-ventral et droite-gauche) et l'organogenèse. Ces processus sont définis par l’expression spatio-temporelle spécifique de gènes, permettant ainsi aux différentes structures de l’organisme de se développer correctement. Parmi les multiples gènes impliqués, on retrouve la famille des gènes homéotiques (Hox) codant pour des facteurs de transcription qui sont essentiels, entre autres, au modelage du squelette axial et appendiculaire, ainsi qu'à la morphogenèse des systèmes respiratoire, digestif et urogénital de même que des structures glandulaires. Cette introduction portera d'abord sur les fonctions des gènes Hox chez les mammifères, leur organisation en complexes et la régulation de leur expression. Une attention particulière sera accordée au gène Hoxa5, le gène d'intérêt de mon projet, et ses différentes fonctions dans le développement chez la souris et plus précisément, dans le développement du système respiratoire. Les différentes composantes du système respiratoire seront également présentées ainsi que les principaux mécanismes moléculaires impliqués lors de la formation du poumon.
1.1 Les gènes Hox
Les gènes Hox ont été initialement identifiés chez la drosophile (Drosophila melanogaster) au début des années 1900 alors que furent observées des anomalies chez les mouches adultes causées par différentes mutations. En effet, ces mouches présentent des transformations homéotiques, caractérisées par des régions de l'organisme qui adoptent l'identité d'une structure ou d'un organe qui est normalement formé ailleurs dans l'organisme (Rezsohazy et al., 2015). Par exemple, les mouches possédant des mutations de perte de fonction pour le gène Antennapedia (Antp) présentent une paire de pattes à la place des antennes. Aussi, des mutations dans les séquences régulatrices du gène Ultrabithorax (Ubx) résultent en une mouche possédant quatre ailes plutôt que deux, puisque le troisième segment thoracique possédant les haltères, adopte l'identité du deuxième segment thoracique avec les ailes (Mark et al., 1997). En tout, il existe huit gènes Hox chez la drosophile localisés sur le troisième chromosome et organisés en deux complexes, soit Antennapedia (ANT-C) et Bithorax (BX-C) constituant le complexe homéotique (HOM-C) (McGinnis &
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Krumlauf, 1992). Le complexe ANT-C regroupe les gènes labial (lab), proboscipedia (pb), Deformed (Dfd), Sex combs reduced (Scr) et Antennapedia (Antp), tandis que le complexe BX-C regroupe les gènes Ultrabithorax (Ubx), Abdominal-A (Abd-A) et Abdominal-B (Abd-B) (Figure 1.1). Chez la drosophile, on retrouve une relation de colinéarité spatiale entre la position relative de chacun des gènes Hox à l'intérieur de son complexe respectif et celle des segments dont ils contrôlent l'identité le long de l'axe antéropostérieur. Additionellement à la colinéarité spatiale retrouvée chez la drosophile, une relation de colinéarité temporelle existe chez les mammifères. Ainsi, les gènes situés en 3' des complexes seront exprimés plus tôt et dans les segments les plus antérieurs, tandis que ceux situés en 5' le seront plus tard et dans les segments les plus postérieurs (Aubin & Jeannotte, 2001). Grâce aux multiples études moléculaires effectuées sur les gènes Hox, il a été démontré que ces gènes partagent une séquence commune de 183 paires de bases (pb) appelée la boîte homéo (McGinnis & Krumlauf, 1992). Cette séquence code pour un domaine conservé de 61 acides aminés appelé l'homéodomaine qui possède un motif de type hélice-tour-hélice. Ce motif est responsable de l'interaction des gènes Hox avec l'ADN, leur conférant ainsi la caractéristique de facteurs de transcription ayant la capacité d'activer ou de réprimer différents réseaux de gènes en aval (Rezsohazy et al., 2015). Il a également été démontré par des études d'homologie de séquence que l'homéodomaine est, entre autres, conservé chez les vertébrés, tel que l'homme et la souris (McGinnis et al., 1984).
1.1.1 Les gènes Hox chez les mammifères
Les gènes Hox présentent plusieurs caractéristiques démontrant une forte conservation lors de l'évolution. En effet, des homologues des gènes de sélection homéotique de la drosophile ont été retrouvés dans pratiquement toutes les espèces animales étudiées, des cnidaires et nématodes jusqu'aux mollusques et aux mammifères (Alberts et al., 2011). Premièrement, chez toutes ces espèces les gènes Hox partagent une ressemblance sur le plan structural, c'est-à-dire qu'ils sont organisés en complexes similaires à ceux retrouvés chez les insectes, reflétant ainsi leurs relations phylogéniques ainsi que l'existence de contraintes évolutives appliquées au niveau de ces complexes (Duboule, 2007; Mallo & Alonso, 2013). Deuxièmement, au niveau moléculaire, ces derniers codent tous pour des facteurs de transcription à domaine homéo (Gehring et al., 1994). Troisièmement, en terme de fonction, ils fournissent des contributions similaires chez la plupart des
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espèces animales et peuvent dans certains cas substituer la fonction d'un gène orthologue puisqu'entre autres, une étude a révélée que le gène Hox-4.2 (HOXD4) humain peut remplacer son homologue Dfd chez la drosophile (McGinnis et al.,1990). Chez les mammifères, les gènes Hox sont également impliqués dans l’identité cellulaire le long de l’axe antéropostérieur. Ils sont essentiels à la spécification du squelette axial, au développement du système nerveux central (SNC) ainsi que dans les différents processus d’organogenèse via le contrôle de différents processus cellulaires incluant la différenciation, la prolifération, la migration et l'apoptose (Aubin & Jeannotte, 2001; Sánchez-Herrero, 2013).
Chez la souris, on retrouve 39 gènes Hox regroupés en quatre complexes, soit HoxA, HoxB, HoxC et HoxD, qui sont chacun situé sur un chromosome différent, soit les chromosomes 6, 11, 15 et 2 respectivement (Figure 1.1). Les gènes Hox sont également classés en treize groupes paralogues selon la conservation de leur séquence protéique. Due à cette conservation, chaque groupe paralogue est ainsi associé à un gène homéotique orthologue chez la drosophile, puisqu'ils proviennent d'évènements de duplication au cours de l'évolution. Chez les mammifères, comme chez la drosophile, la relation entre la position d'un gène Hox dans son complexe et la frontière antérieure de son domaine d'expression est conservée. En plus de cette colinéarité spatiale, on y retrouve également une relation semblable sur le plan temporel. Ainsi, les gènes situés vers l’extrémité 3’ des complexes s’expriment plus tôt lors du développement que ceux situés à l’extrémité 5', générant ainsi des domaines d'expression restreints qui se chevauchent (Aubin & Jeannotte, 2001). À des moments et endroits précis le long des axes embryonnaires, il y aura donc des variations dans les niveaux et domaines d'expressions des gènes Hox. De cette façon, le profil d'expression des différentes protéines HOX présentes dans une région donnée sera responsable de l'établissement d'un code développemental appelé "code Hox" qui modulera les caractéristiques morphologiques spécifiques à cette région (Kessel & Gruss, 1990). L'organisation en complexe des gènes Hox est fondamentale pour la régulation spatio-temporelle précise de ces gènes dans le développement embryonnaire.
1.1.1.1 Régulation des gènes Hox
Plusieurs processus sont impliqués dans la régulation précise des gènes Hox lors du développement en contrôlant l'initiation, l'établissement et le maintien de leur expression. D'abord, ces gènes peuvent être sous le contrôle des protéines HOX, qui sont elles-mêmes impliquées dans
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Figure 1.1: Représentation schématique des complexes Hox chez la drosophile et la souris. La section du haut du schéma représentant les deux complexes ANT-C et BX-C des gènes homéotiques de la drosophile. La section du bas illustre les quatres complexes des gènes Hox chez la souris, HoxA, HoxB, HoxC et HoxD localisés sur les chromosomes 6, 11, 15 et 2, respectivement. Chaque gène Hox est aligné en fonction de son groupe paralogue ainsi que de son orthologue chez la drosophile. La flèche noire représente le sens de la transcription ainsi que la relation de colinéarité temporelle et spatiale de l'expression de ces gènes en fonction de leur position dans le complexe. (tiré de Aubin et Jeannotte, 2001).
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les processus d'autorégulation, via leur propre produit protéique, et de régulation croisée qui permet de définir les limites des domaines d'expression de ces gènes. Un exemple de régulation croisée s'observe chez la drosophile alors que le gène Antp est exprimé dans la région postérieure de l'embryon dans un contexte de mutation du gène Ubx. L'expression postérieure du gène Antp est donc réprimée par Ubx dans les régions postérieures (Hafen et al., 1984). Dans certains cas, les gènes Hox adjacents peuvent partager leurs séquences promotrices ou être en compétition pour les mêmes séquences régulatrices (Sharpe et al., 1998). Il existe aussi des séquences activatrices agissant en cis, pouvant être spécifiques à un gène Hox donné. Le remodelage de la chromatine joue également un rôle important dans la régulation spatio-temporelle, principalement via sa décondensation graduelle de l'extrémité 3' vers 5' des complexes Hox permettant ainsi l'activation des gènes Hox selon le principe de colinéarité (Noordermeer et al., 2013). D'autres facteurs agissant sur le remodelage de la chromatine régulent le maintien des domaines d'expression des différents gènes Hox en effectuant des modifications post-traductionnelles des histones. Ces modifications sont imposées par deux principaux groupes de protéines: les protéines du groupe Polycomb (PcG) impliquées dans la répression transcriptionnelle en appliquant une marque de triméthylation sur la lysine 27 de l'histone H3 et les protéines du groupe Trithorax (TrxG), qui sont responsables du maintien de l'activité transcriptionnelle via l'acétylation de la lysine 9 et la méthylation de la lysine 4 de l'histone H3. Le maintien des limites des domaines d'expression des gènes Hox est donc dépendant, entre autres, de la fine régulation produite par ces deux groupes de protéines (Fujimura et al., 2006). Certains facteurs de transcriptions exprimés ubiquitairement, tel que le facteur Yin Yang 1 (YY1), peuvent aussi moduler l'expression des gènes Hox dépendamment du contexte. À ce jour, le rôle de YY1 dans la régulation des gènes Hox est associé à la répression des gènes Hoxb4, Hoxd4, HOXB13, HOXD11 et HOXD12 et à l'activation des gènes Hoxb7 et Hoxa5 (Gilthorpe et al., 2002; Meccia et al., 2003; Kobrossy et al., 2006; Ren et al., 2009; Woo et al., 2010; Bérubé-Simard et al., 2014). Le facteur YY1 sera décrit plus en détails à la section 1.2.2.1 ainsi qu'au chapitre 3. D'autre part, l'expression des gènes Hox le long de l'axe antéropostérieur s'effectue, entre autres, via la réponse aux morphogènes tels l'acide rétinoïque (RA), Transforming Growth Factor Beta (TGF-β), Bone Morphogenic Protein (BMP), Fibroblast Growth Factor (FGF) et la voie Wnt. Parmi les régulateurs transcriptionnels ayant été identifiés, on retrouve les protéines à homéodomaine CDX qui sont impliquées dans l'intégration du signal produit par le RA, les FGFs et la voie Wnt, afin de moduler correctement les domaines d'expression des gènes Hox (Subramanian et al., 1995; Charité
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et al., 1998; Houle et al., 2000; Pilon et al., 2007; Nordström et al., 2006). Il existe un gradient opposé de RA et de FGF, de ce fait le signal RA active les gènes Hox en 3', soit des groupes paralogues 1 à 5, tandis que le signal FGF est responsable de l'activation des gènes plus caudaux, soit des groupes paralogues 6 à 9 (Bel-Vialar et al.,2002). Par ailleurs, la régulation par le RA se produit aussi directement grâce aux récepteurs RA (RAR) qui, une fois activés, vont se lier à des éléments de réponse à l'acide rétinoïque (RAREs) présents à l'intérieur des complexes Hox (Dupé et al., 1997).
1.1.1.2 Les fonctions des gènes Hox
Les gènes Hox codent pour des facteurs de transcription possèdant diverses fonctions, notamment lors de l'établissement du squelette axial, du développement du système nerveux central (SNC) et de l'organogenèse. La formation du squelette axial se produit grâce, entre autres, aux actions combinées des différents gènes Hox qui agissent afin de spécifier les différentes vertèbres (Mallo et al., 2010). La colonne vertébrale de la souris est composée de sept vertèbres cervicales (C), treize thoraciques (T), six lombaires (L) quatre sacrales (S) et une trentaine de caudales (Ca). De plus, il a été démontré que les mutants de perte de fonction pour les gènes Hox se caractérisent principalement par des transformations homéotiques d'antériorisation, tandis que les mutants de gain de fonction présentent plutôt des postériorisations (Pollock et al., 1995). D'ailleurs, il existe une redondance fonctionnelle partielle entre les membres d'un même groupe paralogue puisque les phénotypes observés chez des mutants composés, qui possèdent les mutations de plusieurs gènes d'un même groupe paralogue, sont en général plus prononcés que ceux observés chez les simples mutants (McIntyre et al., 2007). Grâce aux différentes études effectuées chez les souris mutantes pour différents gènes Hox, il a été possible de classifier les fonctions de ces gènes dans l'établissement du squelette axial en trois groupes selon leurs phénotypes squelettiques. En effet, il semble que les gènes Hox des groupes paralogues 1 à 4 sont impliqués dans la spécification de la tête, les paralogues 5 à 8 spécifient le tronc et les paralogues 9 à 13 forment la partie caudale. Par ailleurs, les membres des groupes paralogues 9 à 13 sont responsable de la formation normale des membres (Zakany and Duboule, 2007), bien que d'autres gènes, tel que le gène Hoxa5, soient aussi importants (Aubin et al., 2002b).
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En plus d'avoir un rôle dans la spécification du squelette axial, les gènes Hox sont essentiels à plusieurs processus d'organogenèse. En effet, les différents phénotypes observés lors de l'inactivation des gènes Hox sont retrouvés dans tous les organes de l'organisme en fonction de leur position relative aux domaines d'expression des gènes mutés le long de l'axe antéropostérieur. La mutation des gènes des groupes paralogues 1 à 3 a montré que ces derniers sont impliqués dans la formation de différentes structures osseuses, cartilagineuses et glandulaires au niveau des régions cervicales et thoraciques supérieures (Stein et al., 1996; Manley and Capecchi, 1998). Par exemple, bien que les simples mutants soient normaux, les doubles mutants Hoxa1/Hoxb1 présentent des défauts au niveau du thymus et des glandes parathyroïdes (Rossel & Capecchi, 1999). Pour leur part, les souris Hoxa3-/- n'ont pas de thymus ni de glandes parathyroides et présentent des
anomalies au niveau du système cardiovasculaire ainsi que des problèmes d'ossification et de cartilage dans les régions du cou (Manley and Capecchi, 1998). Le gène Hoxa5 est également impliqué dans le développement de la glande thyroïde (voir section 1.2.3).
Ensuite, l'expression de plusieurs gènes Hox est retrouvée au niveau du système respiratoire, notamment les gènes des groupes paralogues 1 à 8 (Herriges et al., 2012). En général, les mutations des gènes Hox exprimés dans le poumon en développement ne provoquent pas de phénotype apparent, suggérant qu'il existe une redondance fonctionnelle entre ces différents gènes (Cardoso, 1995). En effet, une étude appuyant cette hypothèse porte sur les doubles mutants Hoxa1/Hoxb1 alors que ces derniers présentent des poumons plus petits avec des variations dans le nombre de lobes pulmonaires (Rossel & Capecchi, 1999). En fait, il semble que seule la mutation du gène Hoxa5 provoque une mortalité périnatale causée par une dysmorphogenèse des structures respiratoires. Par ailleurs, les mutants Hoxb5 présentent des défauts de ramification pulmonaire (Volpe et al., 1997, 2000a, 2000b). Les souris doubles mutantes Hoxa5/Hoxb5 quant à elles, présentent un phénotype plus prononcé comparativement aux simples mutants Hoxa5 et Hoxb5, démontrant un autre exemple de redondance fonctionnelle entre deux gènes Hox exprimés dans le poumon en développement (Boucherat et al., 2013). Une étude récente effectuée chez les triples mutants Hoxa5;Hoxb5;Hoxc5 a démontré une implication du complexe Hox5 dans la régulation de la signalisation Wnt2/2b-Bmp4 essentielle au développement pulmonaire (Hrycaj et al., 2015). Les triples mutants Hox5 développent une hypoplasie pulmonaire sévère avec une ramification pulmonaire altérée. Les mutants Hox5 présentent également une différenciation épithéliale afffectée
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au niveau de des pneumocytes types I et II. Les fonctions du gènes Hoxa5 dans le développement trachéal et pulmonaire seront décrites en détails dans la section 1.2.3.
Il a été démontré que les gènes Hoxa4, Hoxc4, Hoxa5, Hoxd12, Hoxa13 et Hoxd13 ont un rôle à jouer dans le développement du système digestif, car ils agissent à différents niveaux le long du tractus gastro-intestinal selon leur position relative à l'intérieur des complexes (Aubin & Jeannotte, 2001). L'invalidation du gène Hoxc4 mène à une mortalité périnatale attribuable à des malformations du muscle lisse de l'oesophage empêchant l'animal de se nourrir correctement (Boulet & Capecchi, 1996). Des mutations des gènes Hoxd12, Hoxa13 et Hoxd13 quant à elles vont provoquer des malformations dans des régions plus distales du tube digestif. Par exemple, les simples mutants Hoxd12 et Hoxd13 possèdent des défauts au niveau de la couche musculaire du rectum (Kondo et al., 1996). De plus, chez les doubles mutants Hoxa13/Hoxd13, la séparation des tractus urogénital et digestif ne se produit pas, ce qui est causé par l'absence du septum urorectal (Warot et al., 1997).
La morphogenèse du tractus urogénital est également sous le contrôle des gènes Hox, soit par différents membres des groupes paralogues 10, 11 et 13. En effet, l'inactivation des gènes Hoxa10, Hoxa11, Hoxd11, Hoxa13 et Hoxd13 cause la stérilité chez les mutants (Aubin & Jeannotte, 2001). Chez les mâles Hoxa10-/- et Hoxa11-/-, la stérilité est provoquée par une malformation dans la
jonction de l'épididyme et du canal déférant (ou spermiducte), tandis que chez les femelles Hoxa10-/-,
il y a une transformation homéotique d'une partie de l'utérus qui adopte les caractéristiques de l'oviducte (Benson et al., 1996; Hsieh-Li et al., 1995; Rijli et al., 1995). De plus, les mutants Hoxa13
+/-/Hoxd13-/- mâles présentent une hypoplasie des vésicules séminales et du corps caverneux, tandis
que les femelles présentent une fusion entre l'uretère et le vagin (Warot et al., 1997). Finalement, au niveau du tractus urinaire, il a été démontré un rôle important des gènes Hoxa11 et Hoxd11, puisque les doubles mutants présentent une agénésie des reins pouvant être complète chez les spécimens les plus affectés (Davis et al., 1995). Aussi, chez les triples mutants Hox11, il y a perte de l'induction métanéphrique précoce, soit l'absence de formation du bourgeon de l'urêtre (Wellik et a.,l 2002). Par ailleurs, le développement de plusieurs autres organes incluant la glande mammaire, la peau ainsi que le SNC est influencé par les gènes Hox.
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1.2 Le gène Hoxa5
1.2.1 Patron d'expression chez la souris
Cette section de l'introduction est consacrée au gène Hoxa5, sur lequel porte mes travaux de maîtrise. Le laboratoire du Dre Lucie Jeannotte s’intéresse principalement à l'étude des différentes implications de ce gène au cours du développement chez la souris, notamment lors de l’organogenèse. En effet, ce gène est aussi un modèle pour l'étude de la régulation des gènes Hox compte tenu de sa position au centre du complexe HoxA et de ses rôles essentiels durant l'embryogenèse. Le gène Hoxa5 code pour un facteur de transcription de 270 acides aminés se liant à l'ADN grâce à sa boîte homéo. Chez l'embryon, le gène Hoxa5 est exprimé dans le tube neural, dans la colonne prévertébrale, de la 3e (pv3) jusqu'à l'extrémité caudale, ainsi que dans la
composante mésenchymale de plusieurs organes incluant la trachée, le poumon, l’estomac, l'intestin, la glande mammaire, le thymus, l'ovaire et les reins (Aubin et al., 1997; Aubin et al., 1998; Boucherat et al., 2009). Il existe plusieurs transcrits qui sont produits au niveau du locus Hoxa5, soit de 1.8, 5.0, 9.5 et 11 kilobases (kb) (Coulombe et al., 2010). Un promoteur proximal génère le transcrit de 1.8kb qui est initialement détecté vers le jour embryonnaire 8.25 (E8.25) au niveau des somites 5-7 et du tube neural (Larochelle et al., 1999). Quatre longs transcrits Hoxa5 englobant le transcrit de 1.8kb, soit deux de 5kb, un de 9.5kb et un de 11kb sont produits plus tardivement, vers E8.75, par deux promoteurs distaux, soit celui du gène Hoxa6 et celui situé en 3' du gène Hoxa7 (Coulombe et al., 1999). La Figure 1.2 montre un schéma du locus Hoxa5 et des trois promoteurs impliqués dans la production des différents transcrits. Grâce à l'emploi de sondes d'ARN différentes, soit une première reconnaissant tous les transcrits et une deuxième ne reconnaîssant que les longs transcrits, il a été possible de montrer le patron d'expression différentiel des transcrits Hoxa5 par hybridation in situ. Ainsi, à E12.5, l'expression du transcrit de 1.8kb est retrouvée dans la colonne prévertébrale avec son expression la plus antérieure au niveau de pv3, alors que les longs transcrits possèdent une limite antérieure de leur expression correspondant à pv10 (Larrochelle et al., 1999). Les limites d'expression des différents transcrits sont illustrées à la Figure 1.3. Donc, il semble que les longs transcrits du gène Hoxa5 soient exprimés plus tard durant l'embryogenèse ainsi que dans des structures plus postérieures que le transcrit majeur de 1.8kb. De plus, le profil d'expression de la protéine HOXA5 a été révélé par immunohistofluorescence via l'utilisation d'un anticorps dirigé contre cette dernière (illustré à la Figure 2.1). Les domaines d'expression de la protéine HOXA5 et du
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transcrit de 1.8kb se superposent dans la colonne prévertébrale, entre pv3 et pv10, ainsi que dans le mésenchyme de plusieurs organes dont la trachée, le poumon, l’estomac, l'intestin, la glande mammaire, le thymus et les reins, supportant ainsi l'idée selon laquelle le transcrit de 1.8kb, qui correspond spécifiquement aux deux exons du gène Hoxa5, serait bel et bien responsable à lui seul de la production de la protéine HOXA5 (Coulombe et al., 2010).
1.2.2 Fonctions du gène Hoxa5
Deux lignées de souris mutantes pour le gène Hoxa5 ont été générées au laboratoire. La première possédant une insertion au niveau du domaine homéo d'une cassette de sélection pour la néomycine ce qui interrompt la protéine et détruit toute possibilité de liaison à l'ADN (Jeannotte et al., 1991; 1993). Par ailleurs, aucune protéine HOXA5 n'est produite par l'allèle nul (Coulombe et al., 2010). La seconde lignée est produite par la délétion conditionelle de l'exon 2 qui contient le domaine homéo, grâce au système Cre/loxP (Tabariès et al., 2007). La caractérisation des phénotypes des souris Hoxa5-/- a permis de démontrer qu'elles présentent un taux élevé de mortalité à la naissance.
En effet, les souris mutantes ont les poumons affaissés et on peut détecter la présence d'air dans le système digestif (Jeannotte et al., 1993; Aubin et al., 1997). Il existe également des variations au niveau du taux de mortalité chez les souris mutantes selon la souche de la lignée. Les souris «outbred» possèdent le taux de mortalité le plus faible de 50% tandis que lorsque la mutation est dans un environnement génétique 129/SvEv ou C57BL/6, le taux de mortalité est de 72% et 100%, respectivement (Aubin et al., 1998). Les différentes études effectuées avec ces souris mutantes ont permis de mettre en évidence plusieurs fonctions du gène Hoxa5 lors de l'embryogenèse qui seront décrits dans cette section (Figure 1.4)
1.2.2.1 Transformations squelettiques
Les souris Hoxa5-/- présentent une variété de transformations homéotiques du squelette aux
niveaux cervical et thoracique supérieur. Ces malformations se retrouvent essentiellement entre les vertèbres C3 et T2, correspondant au patron d'expression du transcrit majeur de 1.8kb ainsi que de la protéine HOXA5 (Coulombe et al., 2010). D’une part, on observe des antériorisations, telle l’absence du tuberculum antérieur sur la 6e vertèbre cervicale qui adopte une identité ressemblant à
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Figure 1.2 Schéma représentant les unités transcriptionnelles du gène Hoxa5. Les loci Hoxa5, Hoxa6 et Hoxa7 sont illustrés dans la partie supérieure, suivi d'une représentation schématique du court transcrit de 1.8kb et des formes plus longues de 5.0kb, 9.5kb 11kb produits par les promoteurs proximal (P) et distaux (D1 et D2). La protéine HOXA5 est représentée par un trait ondulé vert, la protéine HOXA6 par un trait ondulé orange et une protéine HOXA5 potentielle de plus grande taille produite par un ATG situé dans la région intergénique Hoxa5-Hoxa6 est illustrée par un trait ondulé bleu. (tiré de Coulombe et al., 2010).
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Figure 1.3 Expression des différents transcrits du gène Hoxa5 dans un embryon entier de souris au jour embryonnaire 12.5. (I) Profil d'expression obtenu avec la sonde d'ARN détectant les 5 transcrits du gène Hoxa5. L'expression est détectable au niveau du SNC, de la colonne prévertébrale et des membres. (J) Profil d'expression obtenu avec la sonde d'ARN ne détectant que les longs transcrits. Par comparaison, on peut déduire que la limite d'expression antérieure du transcrit de 1.8kb dans le SNC se situe au niveau du myencéphale tandis que celle des longs transcrits est plus postérieure à la jonction entre le myencéphale et le tube neural (illustré par la tête de flèche ouverte). Au niveau de la colonne prévertébrale, la limite antérieure d'expression du transcrit de 1.8kb se situe au niveau de pv3, tandis que celle des longs transcrits se situe à pv10 (tel qu'illustré par la pointe de flèche noire). Finalement, seulement le transcrit de 1.8kb est exprimé au niveau de la ceinture scapulaire (flèche noire). (tiré de Larochelle et al., 1999)
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Figure 1.4 Résumé des phénotypes retrouvés chez les souris Hoxa5-/- comparativement aux
spécimens contrôles. Dans le sens anti-horaire: Au niveau du squelette axial, les souris mutantes présentent, entre autres, une absence du tuberculum antérieur sur C6 (flèche blanche) ainsi qu'une côte ectopique sur C7 (flèche noire). La ceinture scapulaire est également affectée, soit par la réduction de la taille ou l'absence de l'acromion chez les souris mutantes. Dans le système digestif, l'estomac présente une réduction de l'épaisseur de l'épithélium ainsi qu'une hypertrophie de la sous-muqueuse. Le colon proximal, quant à lui, possède des villi plus courts, une distribution anormale des cellules à mucus (tête de flèche noire), une hypertrophie de la sous-muqueuse et des altérations au niveau de la spécification des types cellulaires. Les femelles mutantes présentent une tendance à former des kystes ovariens lors du vieillissement. De plus, ces femelles présentent également des altérations au niveau des glandes mammaires, soit des alvéoles plus petits ainsi que la présence de gouttelettes lipidiques, observable à l'intérieur des fenêtres de la figure. Au niveau du système respiratoire, les poumons sont affaissés à la naissance et la trachée possède un diamètre réduit pouvant aller à l'occlusion complète dans les cas les plus prononcés. Finalement, à E18.5 les souris Hoxa5-/- présentent une désorganisation des follicules de la glande thyroïde accompagnée d'une
distribution anormale de la thyroglobuline. (tiré de la thèse de Ph.D. de Félix-Antoine Bérubé Simard, 2014 et modifiée à partir de l'article Boucherat et al., 2009).
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ectopiques sur la 7e vertèbre cervicale, qui adopte alors une identité s’apparentant aux vertèbres
thoraciques possédant une paire de côtes (Jeannotte et al., 1993). Les antériorisations sont provoquées par des mutations de perte de fonction et se caractérisent par une région, ou segment, de l'organisme qui adopte l'identité d'une région plus antérieure et inversement pour les postériorisations provoquées par des mutations de gain de fonction. Outre les malformations du squelette axial, des anomalies sont également présentes au niveau du squelette appendiculaire, soit l'élaboration de la ceinture scapulaire qui présente un raccourcissement ou l'absence de l'acromion (Aubin et al., 2002).
1.2.2.2 Le système nerveux central (SNC)
Hoxa5 est impliqué dans le développement du SNC, puisqu'il est exprimé, entre autres, au niveau des neurones moteurs constituant la colonne motrice latérale (LMC) qui développent les axones responsable de l'innervation dans des membres. Hoxa5 est également exprimé dans les neurones de la colonne phrénique (PMC) qui développent les axones du nerf phrénique, responsable de l'innervation du diaphragme (voir section 1.3.3) (Dasen et al., 2005; Philippidou et al., 2012). Le gène Hoxc5 est également exprimé dans les neurones du PMC. De plus, les souris Hoxc5-/- ne
présentent pas de phénotype apparent contrairement à ce qui est observé chez les souris Hoxa5-/-
qui présentent un taux de mortalité élevé à la naissance. Le groupe du Dr. Jeremy Dasen à New York avec lequel nous collaborons, a entrepris l'étude des souris portant une mutation spécifique du gène Hoxa5 dans les neurones moteurs, à l'aide de la lignée de souris Olig2Cre, dans un environnement génétique Hoxc5-/-. Cette étude a démontré que les souris doubles mutantes
(Hoxa5flox/flox;Hoxc5-/-;Olig2+/Cre) présentent une détresse respiratoire à la naissance causée par des
défauts d'innervation du diaphragme par le nerf phrénique (Philippidou et al., 2012). Ces études sur le gène Hoxa5 ont été effectuées dans une situation où le gène Hoxc5 est également muté. Dans le cadre de mon projet de maîtrise, j'ai effectué la caractérisation du phénotype des simples mutants du gène Hoxa5 inactivé au niveau du PMC afin de bien discriminer son rôle spécifique dans les neurones moteurs (voir section 1.4 ainsi que le chapitre 2).
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1.2.2.3 L'organogenèse
Plusieurs glandes et organes sont affectés par la perte d'expression du gène Hoxa5. Par exemple, les souris Hoxa5-/- présentent des malformations au niveau de la glande thyroïde avec la
présence de follicules thyroïdiens plus petits et désorganisés qui contiennent une distribution anormale des dépôts de thyroglobuline, le précurseur des hormones thyroïdiennes T3 et T4. Ces défauts s'apparentent fortement aux caractéristiques d'une hypothyroïdie et pourraient expliquer, en partie, le fait que les souris Hoxa5-/- survivantes sont généralement de taille plus petite et présentent
un retard dans l'ouverture des yeux ainsi que dans le redressement des oreilles (Aubin et al., 2001; Meunier et al., 2003). Bien que les souris mutantes soient fertiles, les femelles sont incapables de nourrir convenablement leurs petits puisqu'elles présentent des problèmes au niveau de leurs glandes mammaires. En effet, la caractérisation des souris Hoxa5-/- a révélé des changements au
niveau de la prolifération et la différenciation de l'épithélium des glandes mammaires. Puisque Hoxa5 n'est qu'exprimé qu'au niveau du stroma et que la perte de son expression mène à une accélération du développement lobulo-alvéolaire de l'épithélium de la glande mammaire, ceci démontre que le gène Hoxa5 est impliqué dans la communication mésenchyme-épithélium (Garin et al., 2006). Hoxa5 est également exprimé au niveau des ovaires des femelles, de façon dynamique puisqu'elle varie en fonction du cycle œstral, de l'âge et l'état gestationnel. La perte de fonction du gène Hoxa5 mène à une puberté précoce et un déreglement du cycle oestral chez les femelles. De plus, lors du vieillissement des souris Hoxa5-/-, on observe une hausse de la formation de kystes ovariens
provenant de l'épithélium de surface des ovaires. La formation de kystes ainsi que le dérèglement du cycle œstral suggèrent un problème au niveau de la transition épithéliale-mésenchymale, appuyé par la diminution d'expression de certains marqueurs connus comme étant impliqués dans ce processus, tels le «Epidermal Growth Factors Receptor» (EGFR) et les ligands amphiréguline et bétacelluline (Gendronneau et a., 2012).
Tel que mentionné précédemment, Hoxa5 est exprimé dans le système digestif. L'expression est détectable à partir de E9.0 au niveau de l'intestin primitif antérieur, incluant l'estomac en devenir. Au fur et à mesure du développement, un gradient rostro-caudal croissant s'installe dans l'estomac, observable dès E11.0 (Aubin et al., 2002a). De plus, son expression est retrouvée dans la composante mésenchymale du futur intestin, pour ultimement être restreinte au niveau du système nerveux entérique vers E17.5, selon un gradient proximo-distal décroissant du duodénum jusqu'au
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colon (Aubin et al., 1999). L'inactivation du gène Hoxa5 chez la souris mène à des défauts morphologiques de l'estomac et des problèmes fonctionnels de l'intestin. En effet, les souris Hoxa5
-/-présentent un amincissement de l'épithélium stomacal, une hypertrophie de la sous-muqueuse et une hyperplasie des cellules à mucus (Aubin et al., 2002a). L'intestin des souris mutantes quant à lui, présente des villi plus courts, une distribution anormale de cellules à mucus, une hypertrophie de la sous-muqueuse ainsi qu'une réduction de l'activité de certaines enzymes digestives (Aubin et al., 1999). Toutefois, l'activité enzymatique redevient normale chez les souris mutantes après le sevrage. La cause de mortalité chez les souris Hoxa5-/- provient d'une détresse respiratoire à la
naissance, causée par une morphogenèse pulmonaire anormale. Le développement pulmonaire sera décrit plus en détails à la section 1.3.2. La perte de fonction du gène Hoxa5 provoque une forte désorganisation trachéale, caractérisée par une diminution de la lumière trachéale pouvant aller jusqu’à l’occlusion complète chez les spécimens les plus affectés ainsi qu'une désorganisation de l'épithélium trachéal qui prend une apparence stratifiée plutôt que pseudostratifiée (Aubin et al., 1997). Il y a une réduction du nombre d’anneaux de cartilage ainsi qu’une disposition anormale de ce dernier qui ne s’étend pas aussi dorsalement que chez les spécimens contrôles. Le larynx, composé des cartilages cricoïde et thyroïde, est également affecté chez les souris mutantes. Le cartilage thyroïde est celui qui est normalement le plus gros. Par contre, chez les souris Hoxa5-/-, le cricoïde
est toujours plus large résultant de sa fusion avec les premiers anneaux de cartilage (Aubin et al., 1997). Les spécimens mutants présentent également une dysmorphogenèse pulmonaire. Ces perturbations morphologiques s'observent dès E12.5, par la présence d'une désorganisation du mésenchyme, principalement au niveau des cellules entourant les bronches secondaires. À E15.5, il y a diminution de la ramification des bronches qui mène à une réduction du nombre d'acini pulmonaires, se répercutant également en une morphologie pulmonaire plus compacte à E18.5. Cette apparence plus compacte se caractérise en fin de gestation par une hypoplasie pulmonaire, tel que révélée par le ratio du poids du poumon par rapport au poids de l'embryon, qui est significativement réduit chez les souris Hoxa5-/- (Boucherat et al., 2013b). Au point de vue
moléculaire, ces malformations au niveau des bronches s'associent à une augmentation de l'expression de N-myc chez les souris Hoxa5-/-. N-myc code pour un facteur de transcription
important dans le processus de ramification bronchial. Le surfactant pulmonaire et les protéines associées SP-A (Sftpa1), SP-B (Sftpb), SP-C (Sftpc) et SP-D (Sftpd) sont essentiels au
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développement pulmonaire en synthétisant les protéines du surfactant pulmonaire permettant ainsi de réduire la tension superficielle dans le poumon (Zhou et al., 1996). L'absence ou une diminution de la production de ces protéines par les pneumocytes de type II résulte en une détresse respiratoire (Boucherat et al., 2013a). Tel que démontré par des études d'immunohistochimie et de RT-qPCR, les spécimens Hoxa5-/- montrent une réduction significative de l'expression des protéines SP causée
aussi par une baisse de l'expression des gènes Nkx2.1 et Foxa2, qui codent pour deux activateurs transcriptionnels impliqués dans l'ontogenèse pulmonaire ainsi que dans l'expression des protéines du surfactant (Aubin et al., 1997; Boucherat et al., 2009). En effet, à la naissance les poumons des souris Hoxa5-/- sont affaissés et présentent une production diminuée de la protéine SP-B, une baisse
du nombre de pneumocytes type I ainsi qu'une réduction du nombre de cellules endothéliales qui semblent également trappées dans le mésenchyme plus compact (Boucherat et al., 2013b). Finalement, en fin de gestation la perte de fonction du gène Hoxa5 s'accompagne de défauts d'innervation du diaphragme causés par une réduction de l'arborisation du nerf phrénique ainsi qu'une diminution du nombre de contacts synaptiques au niveau du muscle diaphragmatique (Phillipidou et al., 2012).
Une certaine proportion de souris Hoxa5-/- survivent jusqu’à l’âge adulte, ces dernières sont
fertiles et d’apparence normale. Tel que décrit à la section 1.3.2, l'alvéogenèse se produit après la naissance entre les jours 5 et 30, alors qu'il y augmentation de la surface pulmonaire nécessaire aux échanges gazeux. Les souris Hoxa5-/- survivantes présentent une réduction de cette surface
d'échanges suite à une altération du processus de septation, causée par la perte de migration des myofibroblastes alvéolaires, menant ainsi à un élargissement des espaces aériens (Mandeville et al., 2006; Boucherat et al., 2013b). Ce phénotype n'est pas causé par une augmentation de l'apoptose. Par contre, une diminution de la prolifération a été observée aux jours postnataux 0 (P0) et P5, suivi d'une augmentation à P15 et P31, suggérant une certaine capacité des poumons à récupérer. De plus, les souris Hoxa5-/- compensent la perte de surface d'échanges gazeux par une augmentation
de leur fréquence respiratoire (Kinkead et al., 2004). Il est également observé chez les souris Hoxa5 -/- adultes une désorganisation de l'épithélium pulmonaire caractérisée par une métaplasie des
cellules à mucus. Ce phénotype est causé par une transdifférenciation anormale des cellules de Clara (Club) en cellules à mucus provoquée par l'augmentation de l'activité de la voie NOTCH. Ceci rappelle le phénotype des patients souffrant d'une maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC)
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(Boucherat et al., 2012; 2013b). L'ensemble de ces résultats démontre également que le gène Hoxa5 est important au niveau de la communication mésenchyme-épithélium puisqu'il est exprimé au niveau du mésenchyme pulmonaire, alors que la plupart des phénotypes affecte l'épithélium sous-jacent.
1.2.3 Régulation de l'expression du gène Hoxa5
L'ensemble des données présentées à la section 1.2.2 démontrent le rôle essentiel du gène Hoxa5 à plusieurs niveaux durant l'embryogenèse. Plusieurs transcrits sont associés au locus Hoxa5, nécessitant une régulation fine de leur expression tout au long du développement. À ce jour, plusieurs mécanismes de régulation des gènes Hox ont été découverts, notamment grâce aux travaux effectués avec des souris transgéniques ou d'autres modèles d'études tel que la drosophile. Ainsi, des études chez la drosophile ont déterminé que la protéine produite par le gène Pho, l'orthologue de Yy1, est capable d'interagir avec d'autres protéines au niveau d'un élément régulateur du gène Src, l'orthologue du gène Hoxa5 (Mohd-Sarip et al., 2002; Rappailles et al., 2005). Par ailleurs, il a été démontré au laboratoire que Yy1 est un régulateur transcriptionnel du gène Hoxa5 (Bérubé-Simard et al., 2014). Pour ce qui est des études effectuées avec des souris transgéniques, des délétion successives des séquences flanquantes du gène Hoxa5 chez la souris ont été générées au laboratoire et ont permis d'identifier quatre régions régulatrices pouvant diriger l'expression du transgène Hoxa5/LacZ (Figure 1.5). Ainsi, une séquence de 604 pb, nommée élément BSC («Brachial spinal cord»), a été identifiée en amont du promoteur proximal et dirige l'expression du transgène dans la région brachiale du SNC entre E11 et E13 (Zakany et al., 1988). Un second élément a été identifié, soit l'élément Temporel qui correspond à une séquence située en amont de l'élément BSC englobant une partie du second exon du gène Hoxa6 et pouvant, comme son nom l'indique, récapituler l'expression précoce du transcrit de 1.8kb lors du développement (Larochelle et al., 1999). Troisièmement, l'élément MES («Mesodermal enhancer sequence») d'une longueur de 2.1kb situé en aval du gène Hoxa5 est en mesure de diriger l'expression du transcrit de 1.8kb au niveau des bourgeons de membres ainsi que dans les tractus digestif et urogénital (Larochelle et al., 1999). Il a également été démontré que l'élément MES possède des sites de liaison pour les protéines CDX responsables de l'établissement de la frontière postérieure du gène Hoxa5 (Tabariès et al., 2005). Finalement, l'élément Poumon/Intestin a été identifié à proximité du gène Hoxa4 et est impliqué dans l'expression coordonnée des gènes Hoxa4 et Hoxa5 au niveau des systèmes respiratoire et digestif (Moreau & Jeannotte, 2002). Il a été démontré par des expériences de
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transgenèse, ChIP («Chromatine Immunoprecipitation») et de EMSA («Electrophoretic Mobility Shift Assay») que l'élément Poumon/Intestin possède des sites de liaison pour le facteur de transcription YY1 (Bérubé-Simard et al., 2014).
1.2.2.1 Le facteur de transcription Yin Yang 1 (YY1)
YY1 est un facteur de transcription à doigt de zinc exprimé de manière ubiquitaire dans l'organisme. Il possède différents domaines protéiques impliqués entre autres, dans les interactions protéine-protéine et la liaison à l'ADN. YY1 agit en tant qu'activateur ou répresseur transcriptionnel dépendamment du contexte en recrutant différents coactivateurs ou corépresseurs transcriptionnels (Lee et al., 1995; Yang et al., 1996a; Rezai-Zadeh et al., 2003; Cai et al., 2007; Ko et al., 2008). Grâce à son rôle dans la régulation d'une multitude de gènes, YY1 est impliqué dans divers processus biologiques incluant la prolifération et la différenciation cellulaire, l'inactivation du chromosome X, la tumorigenèse et le développement (Donohoe et al., 2007). Chez la souris, la perte complète de fonction du gène Yy1 résulte en une mortalité lors de l'implantation de l'embryon (Donohoe et al., 1999). Les mutants possédant un allèle hypomorphe de Yy1 peuvent se développer jusqu'à la naissance. Par contre, ces études ont révélé l'importance du dosage du gène Yy1 puisque les souris Yy1floxneo/- qui n'expriment que 25% de la quantité totale de la protéine meurent à la
naissance de problèmes respiratoires s'apparentant à celui des souris Hoxa5-/- (Affar et al., 2006).
Afin d'évaluer la fonction du gène Yy1 sur l'expression du gène Hoxa5 au niveau du mésenchyme pulmonaire, des souris portant un allèle conditionnel pour Yy1 ont été croisées au laboratoire avec des souris exprimant la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur Twist2 (Dermo1Cre, Yu et al.,
2003). Cette étude a révélé que les souris Yy1flox/flox; Dermo1+/Cre présentent un phénotype similaire à
celui des Hoxa5-/-, soit une mortalité importante à la naissance, une apparence plus compacte des
poumons en fin de gestation ainsi qu'une réduction de certains types cellulaires épithéliaux, démontrant que la perte d'expression mésenchymale de Yy1 mène à des altérations de l'épithélium pulmonaire (Bérubé-Simard et al., 2014). Dans cette même étude, il a également été démontré que YY1 était capable de se lier spécifiquement à des séquences régulatrices du gène Hoxa5, correspondant à l'élément Poumon/Intestin. Finalement, ces résultats nous ont menés à étudier le rôle du gène Yy1 spécifiquement au niveau de l'épithélium pulmonaire. Les résultats sont présentés au chapitre 3.
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Figure 1.5 Représentation schématique des différentes séquences régulatrices au niveau du locus Hoxa5 identifiées par transgenèse chez la souris. Le schéma du haut représente les loci Hoxa5 et Hoxa6 ainsi que certains sites de restriction. Les boîtes blanches correspondent aux exons des gènes, les grises aux régions codantes et les noires aux domaines homéo. Tem., Temporal; BSC, Brachial Spinal Cord; MES, Mesodermal Enhancer Sequence; Poum./Int., Poumon/Intestin. A, AccI; B, BglII; RI, EcoRI; RV, EcoRV; H, HindIII; S, SacI; Xb, XbaI; Xh, XhoI. Les panneaux du bas montrent l'expression du transgène Hoxa5/LacZ placé sous le contrôle des différents éléments régulateurs. De gauche à droite: l'élément Temporel (orange) capable de diriger l'expression du transgène Hoxa5/LacZ à partir de E8.5 dans les somites 5 à 7, le BSC (vert) au niveau de la partie brachiale du tube neural à E12.5, le MES (rouge) dans le mésenchyme de différents organes situés entre pv3 et pv10 ainsi que dans les bougeons de membres et le tractus urogénital, puis l'élément poumon/intestin (bleu) dirigeant l'expression du transgène dans les systèmes respiratoire et digestif. g, intestin; h, coeur; lu, poumon; s, estomac. (tirée de la thèse de Ph.D. de Sébastien Tabariès, 2006)
25 Hoxa5 Hoxa6 H Xh H B RI B S Xh RV A RI RI B BSC MES 0.5 kb Xb Xb Xb Poum/Int. Hoxa5 Hoxa6 H Xh H B RI B S Xh RV A RI RI RI RI B BSC MES 0.5 kb Xb Xb Xb Poum/Int. Temp.
