Contrôle post transcriptionnel des transcrits des auto-antigènes induits par AIRE dans le thymus

Texte intégral

(1)Contrôle post transcriptionnel des transcrits des auto-antigènes induits par AIRE dans le thymus Clotilde Guyon. To cite this version: Clotilde Guyon. Contrôle post transcriptionnel des transcrits des auto-antigènes induits par AIRE dans le thymus. Immunologie. Université Sorbonne Paris Cité, 2016. Français. �NNT : 2016USPCB138�. �tel-02180587�. HAL Id: tel-02180587 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-02180587 Submitted on 11 Jul 2019. HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of scientific research documents, whether they are published or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.. L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés..

(2) THESE UNIVERSITÉ Paris Descartes Pour l’obtention du titre de Docteur en Sciences de la Vie Spécialité Immunologie École Doctorale CD2I/BioSPC Présentée et soutenue publiquement par : Clotilde Guyon Le lundi 31 octobre 2016. CONTROLE POST TRANSCRIPTIONNEL DES TRANSCRITS DES AUTO-ANTIGENES INDUITS PAR AIRE DANS LE THYMUS. JURY Docteur Jean-Christophe ANDRAU Docteur Carole Guillonneau Docteur Matthieu Giraud Docteur Magali Irla Docteur Bruno LUCAS Docteur Benoît SALOMON. (examinateur) (rapporteur) (directeur de thèse) (rapporteur) (examinateur) (examinateur).

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(4) . À ma maman, Puisse ce grain de sable se transformer en pierre.. " Je suis de ceux qui pensent que la science a une grande beauté. [...] Sans la curiosité de l'esprit, que serions-nous ? Telle est bien la beauté et la noblesse de la science : désir sans fin de repousser les frontières du savoir, de traquer les secrets de la matière et de la vie sans idée préconçue des conséquences éventuelles. " Marie Curie.

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(6) . REMERCIEMENTS Comme le travail de thèse n’est rarement le travail que d’une seule personne, je tiens tout d’abord à remercier toutes les personnes de mon équipe avec qui j’ai travaillé durant ces 4 années et qui ont permis l’aboutissement de cette thèse. Un grand merci aux membres de mon jury d’avoir accepté de juger mes travaux. À mes rapporteurs (rapporteuses ?) les Dr Magali Irla et Dr Carole Guillonneau, merci d’avoir pris le temps de lire cette thèse (au mois d’août en plus !) et surtout pour vos précieux conseils qui m’ont permis de compléter et parfaire ma prose. Merci également à mes examinateurs, le Dr Bruno Lucas, le Dr Jean-Christophe Andrau et le Dr Benoît Salomon pour l’intérêt qu’ils ont porté à mon travail en acceptant de faire partie de mon jury. Un immense merci à mon directeur de thèse. Matthieu, il est difficile de trouver les mots pour exprimer toute ma gratitude envers toi pour m’avoir appris ce qu’est être un bon scientifique. Grâce à toi j’ai appris à être rigoureuse, à ne pas lâcher à la première difficulté, à garder la motivation et la détermination même dans les moments compliqués. Tu possèdes cette merveilleuse capacité à voir le bon côté des gens, tu sais les valoriser et les exhorter à se surpasser. Tu es un scientifique excellent et passionné, et je suis très fière d’être ta première étudiante. Je m’estimerais heureuse si je deviens la moitié du chercheur que tu es. Je te souhaite plein de réussites et de bonheur pour la suite. L’éducation ne fonctionne qu’à l’instant où le maître pour transmettre ce qu’il sait, transmet non pas un contenu, que l’élève pourrait rejeter comme une contrainte, mais une méthode qui dissout les défauts de quelqu’un dans leur acceptation. C’est en étant fidèle à ce qu’ils peuvent faire qu’ils se surpassent, c’est en ayant l’humilité de leurs limites qu’ils les repoussent indéfiniment. Raphaël Enthoven. Je remercie vivement l’équipe de Jakub Abramson de l’institut Weizmann pour les collaborations fructueuses que nous avons faites. J’ai été très heureuse de faire ma thèse à l’institut Cochin, où l’ambiance entre les équipes et avec les plateformes est excellente. Merci à tous pour cet environnement de travail de qualité et agréable.. - 5 -.

(7) . Merci à toute l’équipe de « Hardy les petits » qui m’a accueillie avec bienveillance en 2011 et qui m’a montré ce qu’était de travailler dans une ambiance joviale. Les pots que l’on a pu faire me manquent. Je suis désolée de ne pas citer tout le monde, mais vous êtes dans mon cœur.. À l’équipe de choc de la pièce FRANKLIN de l’animalerie, respectivement : Clotilde, Otilia, Matthieu et Assetou : un grand merci pour tout ce que vous avez fait pour moi, pour m’avoir aidé avec mes petites pépètes. Une autre équipe de choc m’a été indispensable, celle de la plateforme Cybio et plus particulièrement Emmanuelle et Karine. Merci pour les quizz musicaux et les karaokés dans le L2. Merci d’avoir répondu à mes appels paniqués de 22h : « Allo les filles, j’ai encore un souci sur l’ARIA ». À très vite pour des soirées mojitos. Merci beaucoup à Sandrine et Philippe dont les discussions m’ont permis de remettre les choses en perspective. Pierre, merci de m’avoir fait confiance et de m’avoir donné le goût de la bioinfo. Geekette power ! Je pense bien à vous, tous mes co-thésards : Léa, Stefou, Lloyd, Olivier, Stan,…. Pour vous c’est (presque) bientôt la fin également ! Et pour les autres : Agathe, Sara, et Francine bon courage pour les 2 à 3 ans qu’il vous reste. Je ne suis pas loin si besoin. Merci à l’équipe Allanore-Giraud, pour tout : les discussions, les fou-rires, les délires et les craquages et surtout de m’avoir supporté (même si vous étiez bien contents de mes pâtisseries). Vous m’avez vu grandir et j’ai beaucoup appris avec chacun d’entre vous. Dans un joyeux désordre : Gagou, Olivia, Muriel, Anne, Nada, Sonia, Cam, Barbie, Sara, Virginie et Francie, merci les filles ! Pour toi Mirika : ‫בי התמיכה על ותודה ךידידות על לך תודה‬. ‫לחברת הפכת כי אותך לפגוש מזל לי היה‬ ‫אמת‬. ‫והמדע העוגות בין‬, ‫לצחוק מה על הרבה לנו יש‬. ‫אביב בתל אותך לראות מקווה אני‬ ‫אחד יום‬. ‫מאפים יחד לגלות ונוכל בפריז חמה פנים קבלת תקבלי תמיד את בנתיים‬ ‫חדשים‬. Tu as partagé ces 4 ans avec moi Nada, ma co-bureau et ma co-labo, mais tu sais que tu es devenue bien plus que ça. Entre petite(s) bière(s) de fin de journée, congrès, mariages et quelques manips quand même, nous aurons été bien occupées. La suite ne sera pas pareille sans toi… À la fin j’aurais (presque) arrêté le red bull-like ! J’en garde quand même sous le coude pour les jours où « on est QUE mardi ! ».. - 6 -.

(8) . Ma petite Barbichou, j’ai gagné une autre amie précieuse dans cette aventure. Merci de tout ce que tu m’as apportée, pour tes conseils et ton écoute dans les moments difficiles. Ce serait trop long de tout raconter, sache seulement que je suis très heureuse que tu ais été là avec moi. Vivement notre prochaine sortie Primark + Burger King qui sera surement plus détendue !. Il y a des gens auprès de qui tout vous semble facile. Des gens qui meublent le désert, avec un sourire et trois mots. Qui vous apportent un sentiment de complicité immédiate, quelque chose de fraternel, d'évident. Les encombrants - Marie-Sabine Roger C’est pour toi ma Greluchette, plus qu’une rencontre, ç’a été des retrouvailles. J’ai de la chance que tu fasses partie de ma vie. Merci pour tout. Spéciale dédicace à ton mari chéri, que j’adore et qui voulait être cité ;-) . Cette histoire a commencé avec toi Petit Œil et 6 ans après, nous re-voilà. Docteurs… Qui l’eut cru ?! C’est aussi grâce à toi que j’en suis là, merci. À toute ma famille et à ma belle-famille, merci pour votre affection, qui m'est indispensable pour avancer. Merci de m’avoir soutenue même si vous ne compreniez pas toujours tout (non Papa je ne donne pas des souris à manger à des Pythons !). J’oublie probablement de citer des personnes dont l’aide m’a été appréciable, qu’elles veuillent bien m’en excuser. Enfin, à toi mon amour, merci de m’avoir soutenue et surtout supportée durant ces 4 années. Je ne sais pas si j’y serai parvenue sans toi. Merci d’avoir cru en moi même lorsque moi je n’y croyais plus. Merci pour ta patience sans limite. Merci d’être là, merci d’être toi et puisse la vie nous apporter de nouvelles aventures palpitantes (mais peut-être moins stressantes).. - 7 -.

(9) . RESUME La tolérance immunologique assure le maintien de l’intégrité des organismes contre les pathogènes tout en respectant les constituants du soi. La dérégulation de ce mécanisme entraîne la survenue de maladies autoimmunes qui touchent de 5 à 10% de la population générale. Un mécanisme clé de la tolérance immunologique est la délétion clonale des lymphocytes T auto-réactifs après qu’ils ont reconnu leur antigène spécifique au cours de leur maturation dans le thymus. Il a été montré qu’un vaste répertoire d’autoantigènes est exprimé par les cellules épithéliales médullaires du thymus (mTECs) sous l’action de la protéine AIRE (AutoImmune Regulator). Les études présentées dans ce travail participent à améliorer la compréhension du fonctionnement de AIRE. Au-delà de la fonction de transactivation de AIRE, nous avons montré, avec le reséquençage à haut débit (RNAseq) des mTECs, que les transcrits des autoantigènes induits par AIRE ont des extrémités 3’UTRs courtes associées à l’utilisation des sites de polyadénylation (pA) alternatifs. Nous avons identifié par analyse de données de CLIPseq une fixation préférentielle du complexe de terminaison de la transcription au niveau des pAs alternatifs des gènes sensibles à AIRE. Nous avons également mis en évidence l’interaction de AIRE au complexe de terminaison de la transcription. Parmi plusieurs partenaires de AIRE associés à ce complexe, nous avons montré par interférence d’ARN et RNAseq le rôle de CLP1 dans le choix des pAs alternatifs. De plus nous montrons que CLP1 est le seul membre du complexe de terminaison à être préférentiellement exprimé dans les mTECs matures. Fonctionnellement, nous avons mis en évidence une stabilité plus importante pour les transcrits des autoantigènes induits par AIRE en bloquant la transcription des mTECs ex-vivo par traitement à l’Actinomycine D. Nous montrons également l’existence d’un raccourcissement 3’UTR général dans les mTECs matures par rapport aux mTECs immatures et autres tissus de la souris, auquel se combine le raccourcissement spécifique des gènes dépendant de AIRE. Après avoir identifié par des analyses de Gene Ontology une activité cellulaire exacerbée dans les mTECs matures vs immatures, nous confirmons l’activité transcriptionnelle exacerbée des mTECs matures in-vivo grâce à l’incorporation de 5Ethynyl Uridine (EU) dans les ARN néosynthétisés après injection intrathymique. Le raccourcissement des transcrits des auto-antigènes associé à leur stabilité accrue suggère qu’ils échappent à la répression transcriptionnelle médiée par les microARNs. Ce travail a permis d’identifier les bases moléculaires de la régulation post-transcriptionnelle des autoantigènes dans le thymus. Dans l’étude faite en collaboration avec l’équipe de Jakub Abramson du laboratoire Weizmann, démontre que Sirt1, une désactylase ADN dépendante, est. - 8 -.

(10) . exprimé de façon abondante dans les mTEC AIRE+ et ce grâce à l’utilisation de profil d’expression génétique, de cytométrie en flux et d’analyses d’immunoblot de différents types cellulaires thymiques. De plus lorsque Sirt1 est inactivé, dans les lignées germinales et des lignées TEC, l’expression des gènes AIRE dépendants diminuent et donc avec elle la tolérance immune induite par AIRE. La capacité désacétylase de Sirt1 est nécessaire pour l’expression des gènes induits par AIRE dans les mTECs. Sirt1 cible surement d’autres molécules nucléaires, impliquées dans la voie de AIRE. Elle pourrait avoir un rôle plus étendu dans la régulation du système immunitaire et être présent à la périphérie. Cette étude a mis en évidence un rôle important de Sirt1 dans la tolérance centrale dans le thymus à travers la régulation des gènes induits par AIRE. Les résultats d’une autre collaboration avec Jakub Abramson et Erez Y. Levanon montrent quant à elle que la portée de la diversité du répertoire des autoantigènes est médiée par l’épissage alternatif et des mécanisme d’édition de l’ARN grâce à la ré-analyse de données de reséquençage à haut débit des mTECs. Cependant AIRE ne joue pas un rôle prépondérant étant donné le peu de différences entre les résultats des données des mTECs WT et AIRE-KO. Cette étude dévoile la présence d’une régulation supplémentaire de l’induction des auto-antigènes qui permet de mettre en place une tolérance au soi complète et très similaire à ce qu’il se passe en périphérie.. - 9 -.

(11) . TABLE DES MATIERES. REMERCIEMENTS. - 5 -. RESUME. - 8 -. TABLE DES MATIERES. - 10 -. INTRODUCTION. - 12 -. 1.. Tolérance immune 1.1. Les lymphocytes T 1.2. La sélection positive 1.3. La sélection négative. - 12 - - 13 - - 15 - - 16 -. 2.. AIRE 2.1. Structure et fonction des domaines de AIRE 2.2. Expression de AIRE 2.3. Le Rôle de AIRE dans la tolérance immune 2.3.1. AIRE et la tolérance centrale 2.3.2. AIRE et la tolérance périphérique 2.3.2.1. AIRE joue un rôle dans la génération de LT régulateurs 2.3.2.2. Expression de AIRE dans les organes lymphoïdes secondaires 2.4. AIRE est un activateur de la transcription. - 19 - - 19 - - 20 - - 21 - - 21 - - 21 - - 21 - - 23 - - 24 -. 3.. Transcription/production 3.1. Production des auto-antigènes et la levée de la pause de la polymérase 3.2. Partenaires moléculaires de AIRE 3.2.1. Partenaires identifiés grâce à un crible physique 3.2.2. Partenaires de AIRE identifiés grâce à un crible fonctionnel 3.2.3. Les modifications post traductionnelles de AIRE. - 28 - - 28 - - 29 - - 29 - - 33 - - 33 -. 4.. Transcription / Maturation (Caractérisation de la transcription) 4.1. Expression des autoantigènes 4.1.1. Épissage alternatif 4.1.2. 3’UTR 4.1.2.1. Clivage alternatif et polyadénylation 4.1.2.2. Modification de la taille des 3’UTRs 4.1.2.3. Mécanismes moléculaires contrôlant la taille 4.1.2.4. Fonction 4.2. Les microARNs 4.2.1. Production des microARNs 4.2.2. Les microARNs et AIRE. - 35 - - 35 - - 35 - - 37 - - 37 - - 38 - - 40 - - 47 - - 50 - - 50 - - 54 -. 5.. Développement de la lignée des mTECs 5.1. Les mTECs au sein du thymus 5.2. Les progéniteurs 5.3. Différenciation des cTECs et mTECs. - 56 - - 56 - - 56 - - 57 -. - 10 -.

(12) . 5.4. 5.5.. Maturation des mTECs Les mTECs matures négatives pour AIRE. RESULTATS. - 58 - - 60 -. - 62 -. 1. Les transcrits dépendant de AIRE ont des régions 3’UTRs raccourcies et montre une stabilité accrue dans le thymus. - 62 - 1.1. Introduction - 62 - 1.2. Résultats - 62 - 1.3. Conclusion - 64 - 1.4. Publication n°1 (en preparation) - 65 - 2. La désactylase Sirt1 est un régulateur essentiel pour l’induction de la tolérance immune médiée par AIRE - 119 - 2.1. Introduction - 119 - 2.2. Résultats - 119 - 2.3. Conclusion - 121 - 2.4. Publication n°2 - 121 - 3. L’édition de l’ARN et l’épissage alternatif augmentent la diversité de la presentation du soi dans les mTECs. - 145 - 3.1. Introduction - 145 - 3.2. Résultats - 145 - 3.3. Conclusion - 146 - 3.4. Publication n°3 - 147 -. DISCUSSION. - 183 -. 1.. AIRE induit l’expression d’auto-antigènes plus courts. - 183 -. 2.. Sirt1 régule l’activité de AIRE. - 186 -. 3.. L’épissage alternatif est accru dans les mTECs. - 188 -. 4.. Perspectives. - 189 -. BIBLIOGRAPHIE. - 190 -. ANNEXE. - 197 -. - 11 -.

(13) . INTRODUCTION. 1. Tolérance immune. La tolérance immune permet au système immunitaire de ne pas attaquer les constituants du soi, nos organes. La réponse immune consiste en une combinaison fine entre la tolérance au soi et l’immunité dirigée contre les pathogènes. Lorsqu’un changement intervient et favorise l’une ou l’autre, que ce soit dû à une absence de réponse (immunodéficience) ou une réponse inappropriée ou excessive (autoimmunité ou allergie), la résultante est souvent pathologique. L’une des maladies auto-immunes la plus connue est le diabète de type 1. Les cellules du système immunitaire, qui participent à la défense de notre corps, apprennent à discriminer le soi du reste. Lorsque ce mécanisme d’apprentissage est perturbé, ces cellules chargées de nous protéger se retournent contre nos propres organes. La tolérance centrale constitue le mécanisme de la mise en place du contrôle de cette auto-immunité. Elle se met en place dans le thymus qui a pour fonction de contrôler le développement des lymphocytes T (LT) et de les éduquer au soi en leur présentant un répertoire complet de nos auto-antigènes. (1) La tolérance centrale s’effectue en plusieurs étapes : la sélection positive et ensuite la sélection négative. Les progéniteurs des LT sont produits dans la moelle osseuse puis vont migrer et terminer leur maturation dans le thymus. Dans cet organe ils vont être en contact avec les protéines du soi, les auto-antigènes qu’ils vont apprendre à « reconnaître » (sélection positive) et à ne pas attaquer (sélection négative).. - 12 -.

(14) . Cortex. Capsule Subcapsular epithelial cell Thymocyte. Medulla. Trabecule. Cortical epithelial cell Macrophage Medullary epithelial cell B cell. Blood vessel. Dendritic cell. Figure 1 Figure 1: compartiments cellulaires du thymus et les interactions entre les différents types cellulaires, tiré de Kyewski et Klein (2006). Les LT immatures vont être en contact avec les auto-antigènes présentés par ces cellules présentatrices d’antigènes (CPA) dans le cortex pour la sélection positive et dans la médulla pour la sélection négative.. 1.1. Les lymphocytes T Les LT dérivent de cellules souches hématopoïétiques qui sont des cellules dédifférenciées, capables d’auto-renouvèlement. La différenciation de ces cellules souches va permettre de générer trois types de lignées cellulaires : les érythrocytes, les leucocytes et les myélocytes. En se différenciant, elles vont notamment perdre la capacité de s’auto-renouveler. La leucopoïèse va produire quant à elle les lymphocytes B et T. C’est une étape importante dans la mise en place du système immunitaire adaptatif.. - 13 -.

(15) . Figure 2: Hématopoièse, tiré de www.eBioscience.com. - 14 -.

(16) . Les cellules progénitrices des lymphocytes B vont rester dans la moelle osseuse pour leur maturation tandis que celles des lymphocytes T vont migrer dans le thymus pour terminer leur maturation (d’où leur nom B pour « Bone Marrow » : moelle osseuse et T pour Thymus). Chaque type cellulaire a en effet besoin d’un microenvironnement particulier pour poursuivre sa maturation. Les LT sont caractérisés par différents cluster de différenciation (CD) qui apparaissent de façon coordonnée dans le temps, notamment CD4, CD8, CD44 et CD25. (2) Dès qu’ils entrent dans le thymus, les précurseurs des lymphocytes T ne possèdent aucun cluster de différenciation et sont alors appelés double négatifs (DN) en rapport avec CD4 et CD8 qui vont définir les futures populations de lymphocytes T matures. Ces cellules entrent dans le thymus au niveau de la jonction entre le cortex et la médulla (fig1) (3) et passent les stades « DN » les uns après les autres : DN1 (CD44+/CD25−), DN2 (CD44+/CD25+) et DN3 (CD44−/CD25+). Le stade DN3 se déroule lorsque les cellules arrivent dans la zone subcapulaire (fig1). C’est à cette étape que se produit le réarrangement du TCR (T Cell Receptor) avec les loci γ, δ et β. Le TCR est la partie du LT qui, en association avec le CMH II (complexe d’histocompatibilité II), va reconnaître le complexe protéine-CMH pour être ensuite activé. Deux lignées émergent du réarrangement du TCR : les cellules γ/δ qui vont former un complexe avec le CD3 : γ/δ/CD3 et les cellules α/β composées d’un complexe CD3/β et de la chaîne pré-TCR α. Les LT γ/δ n’expriment ni CD4, ni CD8 mais possèdent bien un TCR. En revanche, ils n’ont pas besoin de CMH pour reconnaître des antigènes. Ils jouent un rôle dans le système immunitaire inné grâce à leur localisation dermique, mais également dans la défense anti-tumorale grâce à leur fonction cytotoxique. (4)(5). La lignée α/β va continuer sa progression dans le thymus et permettre l’expression des co-recepteurs CD4 et CD8. Les cellules repassent de l’épithélium subcapulaire au cortex et vont pouvoir subir les sélections positive et négative pour devenir des lymphocytes T matures.. 1.2. La sélection positive Une fois engagées dans la lignée des T, les cellules vont subir une vingtaine de divisions, principalement durant l’état le stade DN qui s’étend sur environ deux semaines. Cette expansion importante de la réserve des précurseurs entraine la génération de 5*107 LT chaque jour. Cependant il est estimé que seulement 1 à 2*106 LT matures sortent du thymus et sont relâchés dans la circulation chaque jour. La perte de plus de 95% des thymocytes illustre le processus de sélection strict qui forme le répertoire des LT. Les LT α/β, double négatifs pour les marqueurs CD4 et CD8 reviennent donc. - 15 -.

(17) . dans le cortex et vont commencer le réarrangement du locus α, c’est le stade DN4 (CD44−/CD25−). Ils deviennent alors double positifs DP (CD4+/CD8+) mais ils possèdent toujours un pré-TCRα. La progression dans le cortex et la mise en contact avec des peptides du soi va permettre le réarrangement du locus α et c’est seulement lorsque l’association d’un TCRα et du TCRß forme un récepteur au CMH (chargé avec une molécule du soi, un auto-antigène) que cela va permettre à la cellule d’être sélectionnée. (6) En fonction du CMH que le TCRα/β va lier, deux types de lymphocytes vont être générés en fonction de la perte du marqueur CD4 ou CD8. Si c’est le CMH de classe I qui interagit avec le TCR alors les cellules vont perdre le CD4 et garder le CD8, tandis que s’il y a interaction avec le CMH de classe II les cellules vont garder le CD4 et perdre le CD8. Cela va entrainer l’expression de signaux qui vont permettre aux cellules de survivre à long terme, de migrer dans la médulla et de terminer leur différenciation en LT matures. Cependant si les LT au stade DN4 ne peuvent pas se lier à une molécule du CMH (I ou II) via leur TCR en un certain laps de temps (4 jours) ou si l’affinité est trop faible, ils seront éliminés par apoptose. (2)(1). 1.3. La sélection négative La sélection négative ou délétion clonale permet l’élimination des LT autoréactifs. Elle a lieu dans la médulla où les lymphocytes LT en cours de différenciation migrent après la sélection positive. À cette étape ils sont simples positifs SP CD4+CD8- ou CD4-CD8+ et pas complètement matures. La médulla est composée principalement de cellules médullaires épithéliales (mTEC) et de cellules dendritiques qui vont présenter aux LT immatures des peptides d’auto-antigènes via les molécules du CMH (I ou II). Ces deux types cellulaires correspondent à des cellules présentatrices d’antigènes (APC) et sont essentiels pour la sélection négative. Les mTECs ont été montrées capables d’exprimer des gènes qui sont normalement exprimés à la périphérie.(7) Etant donné le faible nombre de mTECs, les lymphocytes en cours de maturation doivent pouvoir être capable de "scanner" toutes les APCs afin d’entrer en contact avec le répertoire complet des autoantigènes. Les cellules dendritiques (DCs pour Dendritic Cells) se composent de trois sousensembles : les DCs CD8+ conventionnelles (cDCs) qui représentent environ 50% de toutes les DCs, les Sirpα+ DCs qui représentent 20% de la population des DCs et les DCs plasmacytoïdes (pDCs). Les cDCs se développent à partir d’un précurseur thymique distinct de celui des LT. En revanche, les Sirpα+ DCs et pDCs se développent à l’extérieur du thymus mais y migrent par la suite, via les vaisseaux sanguins ; cependant leurs tissus d’origine restent inconnus. Les DCs acquièrent des. - 16 -.

(18) . auto-antigènes via trois voies différentes. La première est spécifique des mTECs (cellules médullaires épithéliales) qui expriment des auto-antigènes induits notamment par AIRE. Les DCs sont capables de phagocyter les mTECs en cours apoptose, d’internaliser leurs auto-anti-antigènes et de les présenter aux LT en cours de maturation. La deuxième voie se fait via le sang. En effet les Sirpα+ DCs sont enrichis dans l’espace périvasculaire cortico-médullaire et autour des petits vaisseaux ce qui les rend perméables aux antigènes circulants. (8) La troisième voie se déroule au niveau des tissus périphériques où il a été montré que les Sirpα+ DCs et pDCs acquièrent des auto-antigènes qu’ils vont présenter aux LT en développement lorsqu’ils migrent dans le thymus.(9) La présentation des auto-antigènes par les DCs joue un rôle dans la sélection négative des lymphocytes CD4+ tandis que leur importance pour celle des CD8+ semble moins bien comprise. (9) Si les LT ont une affinité trop forte pour les peptides du soi, ils sont éliminés par apoptose. Les mécanismes de cette sélection négative ne sont pas encore totalement élucidés mais plusieurs facteurs jouant un rôle important ont été mis en évidence comme Grb2, JNK et p38 dans la voie des MAP kinases, CD28. Seulement 5% des lymphocytes vont réussir la sélection négative avant d’être relâchées dans le système circulatoire, complètement matures. (1)(2)(10) Ce sont les lymphocytes SP exprimant des niveaux élevés de CD24 qui vont être sensibles à sélection négative. Ces cellules sont décrites comme « semi-matures » étant donné qu’elles deviennent apoptotiques lorsqu’elles réagissent à un antigène, contrairement aux cellules CD24low qui prolifèrent après la rencontre avec les antigènes. La régulation négative de CD24 par les cellules SP coïncide avec une reprogrammation des lymphocytes en fonction de leur réponse au complexe CMHpeptide (CMHp). Il est possible que les deux sélections (positive et négative) soient séquentielles. Les lymphocytes en développement reconnaissent le complexe CMHp via leur TCR, soit avec une faible affinité et cela conduit à la sélection positive, soit avec une forte affinité pour la sélection négative. Cependant la façon dont le TCR fait la différence n’est pas encore bien comprise. Il existe deux théories sur la façon dont l’affinité entre le TCR et le ligand influe sur la sélection thymique. La première concerne la quantité de TCR interagissant avec le CMHp. Selon cette théorie l’affinité dépendrait seulement du nombre de récepteurs présents à la surface de la cellule. Ainsi une affinité importante se reflèterait par une surface plus importante occupée par les récepteurs sur les thymocytes. Ceux-ci comptent alors le nombre d’interactions et lorsqu’il est suffisant les thymocytes recevraient le signal de sélection négative. Ce système prédit qu’une faible dose de peptides ayant une forte affinité se lieraient à seulement peu de TCR, ce qui induirait la sélection positive. Cependant ceci n’a jamais été vérifié expérimentalement. La deuxième théorie concerne le temps de fixation des peptides à forte affinité : plus le ligand CMHp a une forte affinité pour le. - 17 -.

(19) . TCR, plus il y reste fixé longtemps. Ainsi un seul récepteur peut déterminer l’affinité d’un ligand en fonction du temps de fixation : un temps court indique une faible affinité ce qui induirait un set de signaux précoces tandis qu’un temps de fixation long indique une forte affinité ce qui induirait des signaux TCR précoces et tardifs. Cette dernière idée est connue comme la relecture cinétique.(11) Le signal transduit via le TCR pour induire la sélection semble suffisant mais des études ont été menées pour savoir s’il était unique ou s’il était accompagné d’un second signal. In-vitro, plusieurs molécules ont été identifiées avec un effet dans la délétion clonale comme CD28, CD5 et CD43. Toutefois l’analyse d’animaux déficients pour ces gènes ne montre pas de changement dans la sélection négative et les animaux ne développent pas d’auto-immunité. L’une des interprétations possibles est que ces molécules de co-stimulation sont importantes mais redondantes et que la perte de l’une d’entre elle n’affecte pas leur fonction globalement. Il est également possible que ces molécules ne soient pas nécessaires pour la délétion des lymphocytes ayant une forte affinité pour le ligand CMHp, mais elles seraient plus importantes pour les lymphocytes qui expriment des TCRs avec une plus faible affinité pour le CMHp. Une autre molécule impliquée dans la sélection négative est le CD40 ligand (CD40L). Une absence de cette molécule entraine une déficience dans la délétion clonale. Une expérience sur des souris chimériques montre que l’expression de CD40L n’est pas nécessaire dans toutes les cellules pour avoir un effet sur tout le thymus. Le blocage de la sélection négative par déficience de CD40L est incomplet et cette déficience retarderait seulement la mise en place de la sélection négative.(12). - 18 -.

(20) . 2. AIRE Auto-Immune Regulator : AIRE est une protéine importante exprimée principalement dans les mTECs du thymus. AIRE est un activateur de la transcription dont le mode d’action diffère de celui des facteurs de transcription classiques. La fonction principale de AIRE est d’induire l’expression d’un très large panel d’auto-antigènes dans les mTECs afin que ces dernières puissent assurer la sélection négative des lynphocytes T auto-réactifs en cours de maturation.. 2.1. Structure et fonction des domaines de AIRE Le gène AIRE est situé sur le chromosome 21 chez l’homme et sur le chromosome 10 chez la souris. La protéine qu’il code se compose de 545 acides aminés et de plusieurs domaines : HSR (Homogenously Staining Region) qui est le domaine d’homodimérisation protéique, NLS (Nuclear Localization Signal): le domaine de localisation nucléaire, SAND (nommé après différentes protéines : Sp100, AIRE-1, NucP41/75, DEAF-1): le domaine de liaison à l’ADN, PHD 1 et 2 (Plant HomeoDomain) des motifs en doigts de zinc qui sont des domaines de régulation de la transcription et PRR (Pattern Recognition Receptors) qui est une région caractéristique de facteurs de transcription.. CARD LXXLL. LXXLL. SAND. PHD1. PRR LXXLL. PHD2 LXXLL. Figure 3: AIRE et ses domaines tiré de Chan et al (2015). La présence de motifs en doigts de zinc et de régions riches en proline suggère que AIRE est une protéine de la régulation de la transcription (13). Le domaine SAND est connu pour être un composant de plusieurs modificateurs transcriptionnels associés à la chromatine (avec des fonctions très différentes) mais également pour être un composant de régulateurs transcriptionnels chez les plantes. Bien que AIRE se lie à l’ADN, on ignore encore comment cette fixation s’effectue du fait que le domaine SAND ne contienne pas le domaine canonique KDKW. L’interaction de AIRE à l’ADN ne se ferait pas par la reconnaissance de motifs particuliers comme le font les facteurs de transcription classiques. (14). - 19 -.

(21) . Les deux domaines PHD sont associés à des fonctions d’activation de la transcription ainsi que de modulation de la chromatine. PHD1 se lie de façon préférentielle aux résidus H3K4 non méthylés caractéristiques de la chromatine condensée et de gènes peu exprimés. Cette interaction permettrait à AIRE de cibler, dans les mTECs, des gènes peu transcrits incluant ceux qui codent pour des protéines spécifiques de tissus périphériques : PTAs (Peripheral Tissue Antigens) . Le domaine PHD2 sert de site de fixation ou d’adaptateur pour un ou plusieurs complexes multi protéiques qui pourraient notamment jouer un rôle dans la levée de la pause de la polymérase et stimuler l’élongation de la transcription (15)(16) (17). Le domaine HSR (ou CARD) se situe au niveau de la partie N-terminale de AIRE. Bien que CARD ait été identifié pour recruter et activer les caspases pendant l’apoptose, on sait maintenant que ce domaine est impliqué dans une plus grande palette de fonctions telles que la réponse inflammatoire ou l’homo- et l’hétérodimérisation de AIRE via des interactions homotypiques. Ces interactions permettent d’orienter les protéines et d’activer des protéines effectrices. De nombreuses mutations de AIRE localisées dans le domaine CARD ont été identifiées et sont responsables de la maladie autoimmune humaine APECED (autoimmune polyendocrinopathy-candidiases- ectodermal dystrophy), appelée également APS-1 (autoimmune polyglandular syndrome type 1). (18)(19)(20) APECED est une maladie monogénique rare causée par des mutations du gène AIRE (20). Elle est caractérisée principalement par la présence d’atteintes autoimmunes multiples comme une candidose mono-cutanée chronique, une hypoparathyroïdie et une insuffisance surrénale. Cependant le diagnostic a été étendu étant donné que la plupart des patients présentent également un grand nombre d’autres maladies auto-immunes comme le diabète de type 1, la thyroïdite, l’alopécie ou encore l’hépatite. Cette maladie se manifeste tôt, avant l’âge de 10 ans. Bien que rare, APECED est plus présente chez les finlandais, les juifs iranniens et les sardes où elle peut toucher une personne sur dix mille. (21). 2.2. Expression de AIRE Il a été montré que AIRE est exprimé dans le thymus et en moindre proportion dans certains organes lymphoïdes secondaires. (22) Au sein du thymus, c’est dans les mTECs qu’on retrouve en grande majorité AIRE mais également dans les cellules dendritiques, bien qu’en très faible quantité. En effet une étude a pu détecter AIRE dans les cellules dendritiques grâce à des analyses PCR très sensibles, à des niveaux très faibles : les quantités de transcrits y sont dix fois inférieures par rapport à celles dans les mTECs. L’expression de AIRE dans les DCs, par ailleurs indétectable en cytométrie en flux, ne permet d’induire ni l’expression de PTAs ni la tolérance. - 20 -.

(22) . immunologique. (23) Concernant les ganglions lymphatiques, il a été montré que des cellules stromales expriment des PTAs sans que cette expression soit aussi étendue que dans les mTECs. De plus, les niveaux des transcrits AIRE y sont très faibles et la quantité de protéine n’a pas pu être évaluée. (24) AIRE a également été détecté à de très faibles niveaux dans le cœur, la rate, le foie fœtal, les poumons et les testicules, nonobstant le fait que d’autres études rapportent des résultats contradictoires. (23) Néanmoins, AIRE est essentiel dans la gonadogénèse et son invalidation entraine une infertilité chez la souris (animaux AIRE Knock-Out (KO)) ou chez l’homme pour les patients atteints d’APECED. (25). La restriction de l’expression de AIRE dans les mTECs peut sous-tendre un rôle dans la fonction des mTECs, notamment dans la maturation des LT et plus particulièrement dans leur sélection négative. (22)(23). Pour étudier l’effet de AIRE sur l’autoimmunité un modèle murin mimant expérimentalement la maladie APECED a été mis en place par invalidation du gène AIRE (souris AIRE-KO). (26). 2.3. Le Rôle de AIRE dans la tolérance immune 2.3.1. AIRE et la tolérance centrale. C’est avec les multiples atteintes auto-immunes de la maladie APECED que le rôle de AIRE dans la mise en place de la tolérance immune a été suspecté et cela a été confirmé grâce à l’étude des souris AIRE-KO. Ces animaux subissent de multiples atteintes auto-immunes dirigées contre différents organes, à noter la présence d’infiltrats inflammatoires et d’auto-anticorps. (22) (25). De même il a été démontré, grâce à des puces d’expression de mTECs isolées de souris WT et AIRE KO, que c’est AIRE qui permet l’expression des PTAs de façon ectopique dans le thymus et plus particulièrement dans les mTECS. (27). Un lien a ainsi pu être établi entre AIRE et le contrôle de l’expression des PTAs dans les souris AIRE KO où la perte de cette expression est associée à un défaut de développement des LT .(14) L’absence de AIRE permet aux LT auto-réactifs de migrer à la périphérie où leur présence est corrélée avec l’apparition de maladies auto-immunes. (28) (29) De façon intéressante, une étude récente suggère que les lymphocytes B thymiques sont également capable d’exprimer AIRE bien qu’en très faible quantité et participeraient aussi à la sélection négative des LT auto-réactifs. (30). 2.3.2. AIRE et la tolérance périphérique 2.3.2.1.. AIRE joue un rôle dans la génération de LT régulateurs. AIRE entraine l’expression des auto-antigènes dans le thymus et la sélection négative des LT auto-réactifs. Qu’en est-il du rôle AIRE dans la sélection positive des. - 21 -.

(23) . LT régulateurs (Treg) ? Les lymphocytes Treg correspondent à une sous population de LT CD4+ définie par le marqueur CD25+. Le facteur de transcription Foxp3 est fondamental pour le développement des Treg et permet également de discriminer cette population cellulaire. Ces cellules sont retrouvées à la périphérie trois jours après la naissance (chez les souris) et leur nombre augmente rapidement pour atteindre le niveau adulte (5 à 10% des LT CD4+) en trois semaines. Les Treg proviennent soit du thymus (Treg naturels) soit de la différenciation de LT naïfs suite à une stimulation par des antigènes rencontrés à la périphérie (Treg inductibles ou iTreg). Les Treg permettent de contrôler la réponse immune des LT effecteurs face aux antigènes ainsi que l’ampleur de cette réponse. (31)(32) Différents groupes de recherche ont montré que la population des Treg reste similaire dans la rate, les ganglions lymphatiques et le thymus chez les souris AIREKO. De même les niveaux de Foxp3 (le facteur de transcription qui est un régulateur fonctionnel majeur des Treg) étaient similaires entre les souris WT et AIRE-KO. (28)(33) Des souris double KO pour AIRE et Foxp3 présentent un phénotype plus sévère que les simples KO. (34) Cependant les patients ayant des mutations dans le gène AIRE ont un nombre réduit de Treg et des expériences de suppression de la réponse immune par les Treg in vitro révèlent des défauts qui laissent supposer un rôle de AIRE dans le développement des Treg. Chez les patients atteints d’APECED l’absence fonctionnelle de AIRE s’accompagne d’une présence accrue de LT autoréactifs à la périphérie qui vont s’engager dans des réactions auto-immunes non contrôlées par des Treg dont le développement est probablement altéré par l’absence de AIRE fonctionnel. (35) Pour préciser l’effet de AIRE sur les Treg, un système transgénique d’expression de l’hémaglutinine sous le contrôle du promoteur de AIRE a été utilisé et a permis d’obtenir un premier aperçu de la capacité des Treg à être sélectionnés par des antigènes induits par AIRE dans les mTECs. (36) Par la suite une autre étude a démontré clairement le rôle de AIRE dans la sélection des Treg. En effet l’absence de AIRE entraine la disparition des antigènes spécifiques des Treg. (37) Une analyse des TCRs portés par les Treg a également été effectuée in vivo à l’aide d’une chaine ß du TCR fixée sur le locus endogène Tcra. Ainsi des différences entre les répertoires TCR de ces souris mutées versus des souris WT ont été observées, révélant que AIRE est capable d’affecter les TCRs les moins présents à la surface des Treg, ceux ayant la fréquence la plus faible. (38) Malchow et al (39) ont montré que AIRE était capable d’agir sur la tolérance périphérique en supprimant les LT CD4+ auto réactifs du compartiment de LT et en induisant leur différenciation en Treg Foxp3+. En l’absence de AIRE ces LT autoréactifs, qui deviennent normalement des Treg, sont déviés dans le compartiment des LT conventionnels. Ces cellules, appelées Trogue, ne sont pas sensibles aux Treg classiques puisqu’elles sont retrouvées en grande quantité dans la prostate. L’équipe de Van Meerwijk & Romagnoli (40) a montré qu’une déficience de AIRE entraine, in vivo, une défaillance dans la fonction d’une sous-population de Treg (CD8+CD28low) qui joue un rôle important dans l’homéostasie immune des. - 22 -.

(24) . intestins. Pourtant les Treg provenant de souris WT et AIRE KO ont des phénotypes et des profils transcriptionnels identiques, tout comme leur activité suppressive et leur production d’IL10 (in vitro). L’effet observé dans les les souris AIRE KO serait dû à une modification fine du répertoire des Treg soit dans le thymus, soit à la périphérie. L’équipe de Van Meerwijk & Romagnoli (41) a également montré in vivo que les Treg se trouvant à la périphérie, non seulement retournent dans le thymus (chez la souris et l’homme), mais aussi empêchent la différenciation de nouveaux Treg en inhibant l’Interleukine 2 (chez la souris seulement mais ce mécanisme peut être extrapolé à l’homme). Ceci montre que le développement des Treg est contrôlé par un feedback négatif des Treg fonctionnels et activés qui reviennent dans le thymus. Il s’agit de la première mise en évidence directe d’un retour d’une population dans son organe d’origine pour inhiber ses précurseurs cellulaires. Cela pourrait permettre d’enrichir le répertoire des Treg périphériques en cellules « utiles ». Ce mécanisme permettrait également de transmettre dans le thymus des informations sur l’immunorégulation à la périphérie et à la réponse centrale de pouvoir s’adapter.. 2.3.2.2.. Expression de AIRE dans les organes lymphoïdes secondaires. AIRE est exprimé dans les organes lymphoïdes secondaires et une étude a mis en évidence sa possible implication dans la mise en place de la tolérance périphérique. (42) Les auteurs ont analysé des DCs CD11+b et CD11+c provenant de souris AIRE KO et WT, et ont montré que chez les souris AIRE KO les DCs activaient les LT naïfs de façon plus importante que chez les souris sauvages. Grâce à des puces d’expression ils ont pu identifier 68 gènes sur-exprimés dans les DCs des souris AIRE KO. Parmi ces gènes, l’expression augmentée de VCAM-1 a été remarquée et pourrait contribuer à l’amélioration de la présentation des auto-antigènes chez les DCs. Une autre étude a montré que les cellules stromales CD45- des ganglions lymphatiques expriment AIRE ainsi que certains PTAs. (24) Cependant leur rôle n’est pas encore certain même s’il est possible d’imaginer un rôle de AIRE dans la tolérance périphérique similaire à celui qu’il a dans la tolérance centrale. Les eTACs (extra-thymic Aire-expressing cells) ont été identifiées par Gardner et al. dans les organes lymphoïdes secondaires comme étant capables d’exprimer AIRE. Elle dérivent de la moelle osseuse et sont caractérisées par l’expression des protéines de surface : MHCII, EpCAM et l’absence ou la faible expression de CD45, CD80 et CD86, les distinguant ainsi des DC classiques. Bien que présent en quantité faible dans les eTACs, AIRE a pu être détecté dans par immunofluorescence, à la limite du seuil de détection. Ainsi, il semblerait que les eTACs soient les principales cellules exprimant AIRE à la périphérie. Ces dernières sont par ailleurs capable de présenter des antigènes de façon directe aux LT CD4+ et d’induire leur prolifération.(43). - 23 -.

(25) . Gardner et al ont montré que les eTACs (extra-thymic Aire-expressing cells) jouent un rôle dans la tolérance immune en inactivant les LT CD4+ auto-réactifs grâce à un mécanisme qui ne nécessite pas l’intervention des Treg. Les eTACs partagent quelques caractéristiques avec les mTECs comme la capacité à exprimer et présenter des PTAs AIRE-dépendant. Toutefois le répertoire des PTAs AIREdépendant exprimés dans les eTACs est considérablement réduit par rapport à celui des mTECs, ce qui suggère une régulation différente de la transcription induite par AIRE dans les eTACs. (44). 2.4. AIRE est un activateur de la transcription AIRE contrôle l’induction de la tolérance immune contre les PTAs à des niveaux différents : à travers leur expression promiscuitaire dans le thymus, l’efficacité de leur présentation par les mTECs aux LT en cours de maturation, et par le fait que AIRE entraine l’apoptose des mTECs matures favorisant la cross-présentation des auto-antigènes par d’autres types cellulaires comme les cellules dendritiques. Il a été montré dans un modèle de tumeurs de prostate que AIRE jouerait un rôle dans la mise en place de la population de Treg (ou nTreg pour Treg naturels). Ce mécanisme pourrait s’appliquer à d’autres types de tumeurs, ce qui sera à confirmer par des études ultérieures. AIRE est également impliqué dans l’expression des chimiokines CCL17/CCL22 et CCL19/CCL21 (dont les récepteurs sont CCR4 et CCR7), qui permettent la migration des LT immatures dans la médulla afin qu’ils subissent l’étape de sélection négative.(45). - 24 -.

(26) . Cellule T CD4+ ou CD8+. nTreg. Sélection négative. Induction des cellules nTreg Ag 2 Ag 1. Ag 3 Expression des antigènes spécifiques de tissus périphériques (TRA). CMH Migration des cellules T dans la médulla. mTEC Aire+ Cross-présentation de TRA Différenciation des mTEC. Régulation de l’expression de chimiokines CCL21 CCl19 CCL17 CCL22. Cellule dendritique. XCL1 Localisation des cellules dendritiques dans la médulla. Figure 4: résumé des rôles de AIRE Noëlla Lopes, Pierre Ferrier, Magali Irla 2015. Grâce à des analyses de puces d’expression, il a été montré que AIRE était capable d’induire l’expression d’un nombre de gènes dans le thymus cinq à dix fois plus importante que ce que l’on a l’habitude d’observer pour des facteurs de transcription classiques. Cette étendue d’action de AIRE est en contradiction avec le fait que son action puisse être dépendante de sa fixation sur des motifs d’ADN spécifiques au niveau du promoteur des gènes. Il est en effet difficile d’imaginer que AIRE puisse se fixer spécifiquement sur des milliers de promoteurs qui présentent des structures très différentes et qui signent des spécificités cellulaires très variées. (27) Les gènes régulés par AIRE sont regroupés en clusters sur le génome. Ce système est utilisé par des facteurs de transcription classiques, où un seul facteur peut déclencher la transcription d’un grand nombre de gènes regroupés en cluster. Dans le cas de l’activation par AIRE, on trouve sur un même cluster des loci qui sont induits, d’autres réprimés et certains non affectés. (27) (46) De plus, la signature transcriptionnelle de AIRE diffère d’un type cellulaire à un autre. En effet, la comparaison des différents types cellulaires dans lesquels AIRE est exprimé (les mTECs, les ganglions lymphatiques et les îlots ß du pancréas) montre une faible superposition des sets de gènes induits par AIRE. (44) (47) L’expression des PTAs dans les mTECs est indépendante de celle qui s’effectue dans leurs tissus d’expression à la périphérie. De plus les sites d’initiation de la. - 25 -.

(27) . transcription et les facteurs de transcription utilisés dans les mTECs sont différents de ceux utilisés à la périphérie. (48) L’influence de AIRE sur l’expression des PTAs dans les mTECs ne se résume pas à un simple système ouvert/fermé. Son effet est plutôt quantitatif étant donné que les PTAs sont tout de même exprimés lorsque AIRE est absent. (49) Il faut également prendre en compte le fait que certains PTAs ne sont pas impactés par AIRE. (27)(22)(46)(47) Il a été montré grâce à des analyses de RNAseq que AIRE impacte l’expression d’environ 4000 gènes codant pour des PTAs dans le thymus de souris. Des expériences de chromatine immunoprécipation suivie de reséquençage (ChIP seq) ont montré que ces gènes, en plus d’être associés aux histones H3K4 hypométhylées (marques répressives de la transcription), sont associés à d’autres marques répressives comme les histones H3K27 triméthylées. Le séquençage single cell de 190 mTECs matures a permis de mettre en évidence que les PTAs qui tendent à être exprimés faiblement au niveau de l’ensemble de la population cellulaire, le sont beaucoup plus au niveau des cellules individuelles, mais de façon moins fréquente. (50). Il a été également montré que les mTECs individuels n’expriment qu’une partie du répertoire des PTAs dépendant de AIRE. (51) Des expériences de PCR sur des cellules mTECs individuelles ont pu mettre en évidence que l’expression des PTAs est stochastique avec une expression monoallélique. (52) (48) Par ailleurs, une comparaison des profils d’expression des mTECs provenant de souris individuelles révèle une variabilité interindividuelle plus importante de l’expression des transcrits des PTAs dépendant de AIRE que de celle des autres transcrits de la cellule. En revanche, cette variabilité n’est pas observée dans les tissus périphériques d’expression des PTAs. Le niveau de variation de leur expression dans les mTECs murins est important, de l’ordre de dix fois entre les extrêmes. Une variabilité similaire a été observée dans les thymus humains même si les résultats sont plus difficiles à interpréter à cause de l’âge et de la diversité des facteurs génétiques et environnementaux des individus étudiés.(53) D’un point de vue mécanistique, cette forte variabilité suggère que l’expression des PTAs au niveau des cellules individuelles du thymus est aléatoire. Ce caractère aléatoire pourrait jouer un rôle important dans la survenue des maladies auto-immunes. (17) L’ensemble de ces éléments ne sont pas en faveur d’un mode d’action de AIRE similaire à celui d’un facteur de transcription classique. AIRE n’influencerait pas directement l’expression des gènes en se fixant sur leurs promoteurs, mais plutôt exercerait une pression négative ou positive sur des programmes d’expression déjà. - 26 -.

(28) . en place dans les mTECs en interagissant avec les protéines impliquées dans la régulation de ces programmes, au niveau de la chromatine des gènes ciblés. .. - 27 -.

(29) . 3. Transcription/production 3.1. Production des auto-antigènes et la levée de la pause de la polymérase AIRE est responsable de la production d’une partie des auto antigènes dans le thymus. Ces auto-antigènes sont présentés aux LT pour les éduquer au soi et éviter l’auto-réactivité. Mais comment AIRE peut-il jouer sur cette production ? Bien que le mécanisme d’action de AIRE reste mystérieux, plusieurs études ont mis à jour quelques éléments de réponses. (27) AIRE interagit indirectement avec l’ADN grâce à son domaine PHD1 et se lie à la chromatine via la lysine 4 de l’histone H3 non méthylée (H3K4Me0). Cette marque histone est connue pour être associée à des régions très peu exprimées, ainsi cette fixation spécifique permettrait de concentrer AIRE au niveau des régions peu actives de la chromatine. L’un des mécanismes qui permet l’expression des antigènes du soi peu exprimés est la levée de la pause de la polymérase II (Pol II). En effet ce mécanisme est connu dans le cas de gènes peu exprimés ou ayant besoin d’une réponse rapide à un stimulus. (54) L’initiation de la transcription a bien lieu, la Pol II commence l’élongation sur environ 50pb puis s’arrête sous l’action d’un facteur de régulation négative de la transcription tel que DSIF (DRB Sensitivity-Inducing Factor) ou bien NELF (Negative Elongation Factor). Ce système de pause de la polymérase existe dans de nombreux systèmes et types cellulaires. Une étude sur le génome entier de la drosophile a permis d’identifier des centaines de gènes impactés par la pause de la polymérase, répartis à travers le génome. Une analyse de ces gènes par Gene Ontology a mis en évidence une sur-représentation de gènes répondant à des stimuli. Les auteurs ont également trouvé des gènes impliqués dans le développement, la différenciation cellulaire et la communication cellulaire, ce qui inclus des gènes engagés dans la signalisation Toll, MAP-Kinase et les voies de signalisation de réponse immune. (54) C’est le recrutement de P-TEFb qui va phosphoryler DSIF, le transformant en un activateur de la transcription, et NELF, ce qui va le déloger de la Pol II et permettre l’élongation de la transcription. Il a été montré que l’activité de AIRE dans les mTECs est associée à la levée de la pause de la polymérase. Le modèle choisi est celui où AIRE est attiré au niveau des régions riches en Pol II, soit par une grande quantité de facteurs inhibiteurs (DSIF et/ou NELF) soit par les régions hypométhylées de la chromatine H3K4Me0. Ensuite AIRE recrute des facteurs d’élongation de la transcription qui permettraient la levée de la pause de la polymérase et donc la reprise de la transcription. (55) Ce modèle permet de mieux comprendre la façon dont AIRE induit l’expression d’autant de gènes différents et pourquoi ce sont les PTAs qui sont ciblés de façon préférentielle.. - 28 -.

(30) . Toutefois d’autres mécanismes peuvent expliquer l’induction des PTAs par AIRE, notamment ceux associés à ses partenaires fonctionnels qui confèreraient à AIRE, par exemple, la possibilité de contrôler la formation du complexe d’initiation de la transcription ou de favoriser la formation et l’exportation des transcrits de ses gènes cibles. Une telle implication multiple est en accord avec l’idée que les différentes étapes de la transcription : initiation, élongation, terminaison et maturation ne s’effectuent pas de manière séquentielle mais de concert. (56). 3.2. Partenaires moléculaires de AIRE AIRE ne se lie pas directement à l’ADN. C’est un activateur transcriptionnel plutôt qu’un facteur de transcription classique qui se lie à l’ADN et joue directement sur l’activation ou l’inhibition de l’expression génique de ses cibles. En effet, AIRE recrute et agit en synergie avec différents partenaires moléculaires afin de permettre l’expression des auto-antigènes.. 3.2.1. Partenaires identifiés grâce à un crible physique. Abramson et al (2009) (57) ont réussi grâce à des expériences de coimmunoprécipitation et de spectrométrie de masse, à mettre en évidence des interactions entre AIRE et différentes molécules impliquées dans des mécanismes transcriptionnels comme la maturation des pré-ARNm, de liaison à la chromatine ou encore de transport nucléaire.. - 29 -.

(31) . C pre-mRNA processing. transcription DDX5. PARP1. FACT. RuvBL2. PCNA Gemin5. POLR2B MYBBP. snrpB. DDX17 TOP2A NOP56. POLR2A DNA-PK. MCM2. EFTUD2. MCM5 MCM6. snrpD3 MSH6. Histone. SFRS2. 2ac. Histone 3. Aire PABPC1. NASP MSH2. SFRS1 SFRS3 SMC1. Cq1BP NUP93. RAD21. XPO1 TRIM28. XPOT KPNB1. RanBP9. nuclear transport. Histone 2bo. RanBP2 IPO7. LMNB1. SMC3. CHD6. chromatin binding/structure. Figure 5: réseau d’interaction des protéines associées à AIRE réalisé par interaction pull-down, schéma tiré de Abramson et al (2009). L’interaction de AIRE avec DNA-PK (DNA-dependent protein kinase) a notamment été montrée dans cette étude ainsi que dans un autre travail (58) DNA-PK est une enzyme dépendante de l’ADN qui possède une activité catalytique kinase dirigée contre des protéines sérine/thréonine (ciblant les extrémités -OH des résidus sérines et thréonines) pour les phosphoryler. Il a été montré que DNA-PK est au centre d‘un complexe de protéines (DNA-PK, PARP-1, TOP2a, FACT, Ku80, Ku70 and H2AX) qui favorisent l’élongation de la transcription et qui forment un super-complexe multimoléculaire avec AIRE. Les auteurs ont démontré que DNA-PK est nécessaire pour l’expression des PTA dépendant de AIRE in vivo grâce au modèle murin SCID caractérisé par une forme tronquée de DNA-PK. (57) Comme cette kinase est essentielle pour la formation du TCR et le réarrangement des gènes d’immunoglobuline, la différenciation des lymphocytes B et T est supprimée. Ainsi les thymus de ces souris sont généralement petits et possèdent peu de mTECs. Après avoir contourné cette problématique en transplantant de la moelle osseuse de souris WT aux souris SCID afin qu’elles puissent reconstituer leurs thymus, ils ont pu évaluer le rôle de DNA-PK dans la régulation de l’expression des PTAs. Malgré la présence de mTECs et de AIRE (à des niveaux comparables à ceux observé chez des souris WT), l’expression des PTAs dépendant de AIRE a chuté drastiquement, montrant l’implication de DNA-PK dans leur induction. Ils ont également caractérisé le complexe qui inclus AIRE et DNA-PK in vitro par co-immunoprécipitation et identifié H2AX, Ku80 et Ku70 ainsi que TOP2a, PARP1 et Ku80. Des tests. - 30 -.

(32) . fonctionnels ont révélé que la plupart de ces protéines sont impliquées dans la régulation de l’expression des gènes endogènes médiée par AIRE. Il a aussi été montré que AIRE pouvait entrainer les cassures doubles brins initiées par TOP2a et que cela avait pour effet de recruter et d’activer de nombreux membres de ce complexe comme DNA-PK, Ku80, PARP-1, et H2AX, ainsi que d’autre molécules associées à AIRE comme PARP-1, SMC1, TRIM28, MSH2/6 et RUVBL2. TOP2A joue un rôle important dans la transcription et l’avancée de la polymérase puisqu’il casse l’ADN double brin ce qui permet un certain relâchement des tensions des super hélices de l’ADN et donc à la polymérase d’avancer sur l’ADN relâché. (59)(60) Un système similaire a été proposé pour DNA-PK avec son activité de phosphorylase au cours de la réparation de l’ADN, ce qui permettrait un relâchement de la chromatine et donc une transcription plus efficace. DNA-PK agit de concert avec PARP-1 et FACT. Ce complexe entrainerait l’activation de la transcription en déplaçant des histones devant les polymérases en élongation. (61) D’autres analyses montrent une interaction entre AIRE et des molécules impliquées dans le pré-processing des ARNm, comme des hélicases, des constituants du spliceosome. (57) Le modèle d’induction par AIRE proposé (fig 3) est le suivant : AIRE se fixe aux régions de la chromatine hypométhylées en H3K4(62)(63). Au niveau de ces régions, AIRE interagit avec TOP2A et inhibe son activité de cassure de l’ADN simple brin. Les cassures simple brin se transforment en cassures doubles brins avec le passage de la machinerie transcriptionnelle. Ces cassures doubles brins activent DNAPK/Ku80, PARP-1 et d’autres protéines associées à AIRE (TRIM28, le complexe cohesine, RUVBL2, …), ceci dans un but premier de réparer l’ADN. Ces protéines associées à AIRE (DNA-PK, TOP2, PARP-1, FACT et Ku) font également partie du « complexe d’éviction » et vont alors permettre la levée de dimères d’histones devant la Pol II et ainsi favoriser l’élongation de la transcription des gènes ciblés par AIRE. (64)(57). - 31 -.

(33) . Nuclear speckle pre-mRNA processing factors Aire. Nuclear matrix pre-mRNA P PP P P P. DNA-PK. RNA-PII. FACT Aire Top2a. PARP1 Ku80 H2AX. H3K4me0. H3K4me0. Chromatin. Figure 6: schéma d'un modèle de régulation médiée par AIRE tiré de Abramson et al 2009, il existe d’autres modèles de mécansimes d’action de AIRE impliquant d’autres protéines non représentées ici, comme PTEFb ou HNRPL. Après être arrivé dans le noyau, AIRE se localise préférentiellement au niveau des régions de la chromatine peu transcrites, en se liant aux histones hypométhylées. Au sein de ces régions AIRE interagit avec TOP2a pour entrainer des cassures doubles brins de l’ADN ce qui active DNA-PK ainsi que d’autres partenaires. Plusieurs partenaires de AIRE (incluant DNA-PK et TOP2a) peuvent également participer au « complexe d’éviction » qui ôte les dimères H2A-H2B se situant devant la Pol II permettant la poursuite de l’élongation de la transcription et améliorant son efficacité. Un autre complexe contenant AIRE entrainerait l’accumulation d’ARNm matures. - 32 -.

(34) . en réactivant la Pol II bloquée à l’extrémité 5’ en supprimant les transcrits dont l’initiation n’était pas correcte et/ou en stabilisant les pré-ARNm ayant une demiecourte via l’épissage alternatif. 3.2.2. Partenaires de AIRE identifiés grâce à un crible fonctionnel. D’autres résultats obtenus grâce à un criblage par ARN interférence (ARNi), ont pu mettre en évidence l’implication dans le mode d’action de AIRE d’un grand nombre de molécules avec des rôles notamment dans l’élongation de la transcription et l’épissage alternatif. Une représentation importante des molécules impliquées dans l’élongation de la transcription a permis de confirmer cette hypothèse et de préciser le mécanisme d’un groupe de protéines plus spécifiquement impliquées dans la levée de la pause de la polymérase. Le modèle proposé est le suivant : AIRE interagit avec le petit ARN 7SK et la protéine HEXIM1 qui forment avec CDK9 le complexe P-TEFb inactif. C’est la dissociation de HEXIM1-7SK de CDK9 qui va rendre le complexe P-TEFb actif et permettre la phosphorylation de la PolII qui s’engage alors dans une élongation transcriptionnelle productive. La liaison entre AIRE et l’ARN 7SK nécessite la présence de la protéine HNRNPL qui joue un rôle important dans l’épissage alternatif. HEXIM1-7SK contient le complexe P-TEFb inactif au niveau de la polymérase bloquée sur le promoteur des gènes. Grâce à des interactions avec d’autres partenaires moléculaires, AIRE va pouvoir stimuler la libération de HEXIM1-7SK et donc permettre d’activer P-TEFb qui lève alors le blocage de la polymérase.. 3.2.3. Les modifications post traductionnelles de AIRE. Il a été montré que AIRE interagissait avec CBP (Cyclic AMP response element Binding Protein), un co-activateur transcriptionnel. C’est le premier partenaire de AIRE à avoir été mis en évidence. CBP est co-localisé avec AIRE dans le noyau (65) et permet d’améliorer, d’accroitre la transcription des cibles de AIRE. CBP est aussi une acétylase qui est capable d’ajouter des groupe acétyles à AIRE au niveau de son domaine SAND (66). L’acétylation de AIRE a été montré comme réduisant l’activité transcriptionnelle induite par AIRE et augmentant son instabilité et sa dégradation. (66) La sirtuine 1 (SIRT1) est une désacétylase qui contrôle un grand nombre de fonctions physiologiques, telles que le développement du métabolisme, la fertilité et le vieillissement. Dans les mTECs nous avons montré que SIRT1 jouait un rôle dans la régulation des transcrits dépendant de AIRE. (19) L’étude à laquelle j’ai collaborée et qui est présentée dans ce travail montre que SIRT1 est fortement exprimé dans le thymus et plus particulièrement dans les mTECs. L’inactivation de SIRT1 dans ces cellules entraine l’augmentation de l’acétylation de AIRE et par conséquence une. - 33 -.